刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法

摘要

本发明公开了一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法，特点是刺参BPI基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法为根据与BPI基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长；刺参BPI蛋白序列如SEQIDNO.2所示，其N端蛋白结构域序列如SEQID NO.3所示；用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参BPI蛋白的N端结构域；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是对副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌具有明显的杀菌作用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法。

背景技术

杀菌通透性增强蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）是嗜中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMNs）分泌的一种阳离子抗菌糖蛋白，具有选择性杀伤革兰氏阴性细菌（gram-negative bacteria，G^-）和中和内毒素等功能。BPI作为机体自身抗菌系统的一种产物，是迄今为止唯一被认为同时具有杀菌和中和内毒素两种功能的抗菌物质。研究发现BPI的N端片段具有与BPI同等的功能。BPI N端富含阳离子，能与内毒素的毒性成分类脂质A区域特异结合进而改变细菌细胞壁的通透性而杀死细菌。随着研究的深入，研究者发现BPI除具有杀菌和中和内毒素外，还具有抗革兰氏阳性菌和真菌，中和肝素，促进补体活化，以及抗血管生成和免疫调节等多种生物学功能，在机体内被称为“超级抗生素”。

目前，对BPI生物学功能的研究主要集中在人及其他哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中的研究相对甚少，BPI蛋白活性分析仅见于大黄鱼和牡蛎中。而此类抗菌物质的出现，不但为临床抗感染治疗提供了新的“武器”，而且为解决日趋严重的细菌耐药问题提供了新的思路。因此，深入研究主要水产养殖品种免疫防御机制，利用水产养殖动物自身抗菌物质，这样为解决海水养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展具有重要意义。

刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由病原菌引发的疾病严重制约了该产业的健康和持续发展。目前在生产中大多使用抗生素和水体消毒剂防治，但抗生素的大量使用诱导致病菌产生耐药性，导致抗生素失效，水体消毒剂往往对刺参有较大的刺激作用。因此，构建水产动物抗菌肽基因表达工程菌，进而产业化高产量且价格低廉的生产天然抗菌药物已迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法，表达的重组杀菌通透性增强蛋白N末端产物对副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌具有明显的杀菌作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种刺参BPI基因，该基因具有SEQID NO.1所示的cDNA序列。该序列全长2208 bp，包括1455 bp的开放阅读框，编码484个氨基酸，5’非编码区长395 bp，3’非编码区长358 bp， 具有多聚腺苷酸信号，mRNA末端不稳定信号以及序列末端含有典型的polyA尾（通常位于mRNA上的150-200个腺苷酸残基）。

2、上述刺参BPI基因的克隆方法，根据与BPI基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：

（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码BPI基因的EST序列（Pengjuan Zhang, Chenghua Li, Lin Zhu, Xiurong Su, Ye Li, Chunhua Jin, Taiwu Li. De Novo assembly of the sea cucumber Apostichopus japonicus hemocytes transcriptome to identify miRNA targets associated with skin ulceration syndrome. Plos ONE 2013. 8(9):e73506.），选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；

（2）RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：TTCAAAGCACAAAACAACCCGTC，3’上游特异性引物2：TGGGTGTCATCTTTTGAAGGTGT；5’下游特异性引物1：GCACTGTTGATGAGGTAGTCGCT，5’下游特异性引物2：GTGTCCGCAGTAAGGAGTAATCT，扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA；

（3）RACE扩增获取刺参BPI基因全长序列，具体步骤如下：

a．总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集体腔细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL，  4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；

b．3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript? RTase试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR 扩增，取PCR产物1 ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增，得到3’端目的条带；

c．5’-RACE扩增：将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增5’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5’下游特异性引物1和扩增5’接头引物进行PCR 扩增，取PCR产物1 ul作为模板，再用5’下游特异性引物2和扩增5’接头引物进行PCR扩增得到5’端目的条带；

d．将扩增产物3’端目的条带和5’端目的条带用凝胶回收试剂盒（百泰克）回收，回收产物与载体pMD18-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参BPI基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示。

上述RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，10×PCR缓冲液（不含Mg²⁺）2.5 μL，浓度25 mM的MgCl₂  2.0 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

3、一种刺参BPI基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为54.323 KDa，等电点为5.58，其中编码序列的1-21位为信号肽序列，编码序列的29-242位为N端结构域，编码序列的257-462位为C端结构域，含有两个半胱氨酸（Cys)，形成1个分子内二硫键。

4、一种刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质，该蛋白质具有SEQID NO.3所示的氨基酸序列。

5、一种重组刺参BPI基因工程菌的构建方法，设计PCR引物，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参BPI蛋白的N端结构域，即权利要求6所述的刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质；将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-BPIN；对重组质粒pET28a（+）-BPIN进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。具体步骤如下：

（1）BPI蛋白质N末端结构域克隆及重组蛋白的构建与表达

a．总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集血细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL，4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；

b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参编码BPI蛋白N端结构域的基因序列（氨基酸序列如SEQIDNO.3所示）即如下所示：

含BmH I位点BPI上游扩增引物：CGGGATCCCGAATCACTCCCAACGGATTTCG

含Not I位点BPI下游扩增引物：TTGCGGCCGCATGGCCAGTTGCATAAACCTCCC

c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液（不含Mg²⁺ ）2.5 μL，浓度25 mM的MgCl₂  2.0 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的上游引物含BmH I位点BPI上游扩增引物 1.0 μL，浓度10 μM 的下游引物含Not I位点BPI下游扩增引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水15.3 μL ；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

d．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（百泰克）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD18-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；

e．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmH I和Not I（New England Biolabs，NEB）限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在600bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-BPIN重组质粒；

f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-BPIN，转化到表达宿主BL21（DE3）（Novagen公司）获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物；

（2）重组蛋白的纯化与复性

a．蛋白纯化：将100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000 rpm离心10 min，去上清液，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次12000 rpm离心20 min ，取上清液；取1 mL Ni-NTA Sefinose^TM Resin（上海生工，编号：BSP033）上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与上柱的Ni-NTA Sefinose^TM Resin混合，4 ℃混匀1 h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，洗脱10次后；加入1 mL变性蛋白洗脱液浸泡10 min ，收集洗脱液，重复洗脱5次，收集每次洗脱液合并，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行鉴定，获得目的蛋白重组刺参BPIN末端结构域蛋白；

b．蛋白复性：将纯化后的重组刺参BPIN末端结构域蛋白分别用透析液Buffer1、透析液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6-18h，最后，4 ℃ 12000r/min离心30 min，收集沉淀，即为重组刺参BPI基因工程菌，溶解至所需的浓度，保存于-20 ℃备用。

上述步骤（2）中，

所述的包涵体洗涤液配方为：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；

所述的包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；

所述的杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，2 M咪唑，pH=7.9；

所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5。

所述的透析液Buffer1配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，3 M尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

所述的透析液Buffer2配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，1 M 尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

所述的透析液Buffer3配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，50 mL甘油，定容于1 L，pH=7.9。

6、一种重组刺参BPI基因工程菌的应用，其表达的重组杀菌通透性增强蛋白具有制备抑制副溶血弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌抗生素药物方面的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首先公开了刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法，其利用基因工程技术，通过3’端cDNA快速扩增（3’-RACE）以及5’端cDNA快速扩增（5’-RACE）的方法，首次从刺参中克隆得到了BPI基因cDNA序列，同时对刺参BPI N端蛋白质进行重组质粒的构建和表达，获得了一株具有杀菌活性的重组杀菌通透性增强蛋白基因工程菌（pET28a（+）-BPIN），表达产物经体外活性检测，发现重组刺参杀菌通透性增强蛋白具有高效的杀灭水产致病菌弧菌属副溶血弧菌，哈维氏弧菌，以及阳性致病菌藤黄微球菌的作用，对研制新型高效抗生素替代药物具有重要价值，可以作为绿色疾病制剂在刺参病害防治中发挥作用。

附图说明

图1为刺参重组杀菌通透性增强蛋白的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为未诱导重组蛋白包涵体，2为诱导3 h重组蛋白包涵体，3为诱导6 h重组蛋白包涵体，4为纯化后重组蛋白；

图2为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对副溶血弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重组蛋白质量浓度20 ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1（无菌培养基），5、6为阴性对照组2（透析液）；

图3为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对副溶血弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重组蛋白质量浓度40 ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1（无菌培养基），5、6为阴性对照组2（透析液）；

图4为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重组蛋白质量浓度20 ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1（无菌培养基），5、6为阴性对照组2（透析液）；

图5为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用效果图，图中1、2为重组蛋白质量浓度40 ug/牛津杯，3、4为阴性对照组1（无菌培养基），5、6为阴性对照组2（透析液）；

图6为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对藤黄微球菌的抑制作用效果图，图中1-3为重组蛋白质量浓度20 ug/牛津杯，4-6为阴性对照组1（无菌培养基）；

图7 1-3为重组蛋白质量浓度20 ug/牛津杯的阴性对照组2（透析液），4-6为重组蛋白质量浓度40 ug/牛津杯的阴性对照组2（透析液）；

图8为刺参重组杀菌通透性增强蛋白对藤黄微球菌的抑制作用效果图，图中1-3为重组蛋白质量浓度40 ug/牛津杯，4-6为阴性对照组1（无菌培养基）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

BPI基因克隆与序列分析

（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码BPI基因的EST序列（Pengjuan Zhang, Chenghua Li, Lin Zhu, Xiurong Su, Ye Li, Chunhua Jin, Taiwu Li. De Novo assembly of the sea cucumber Apostichopus japonicus hemocytes transcriptome to identify miRNA targets associated with skin ulceration syndrome. Plos ONE 2013. 8(9):e73506.），选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；

（2）RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：TTCAAAGCACAAAACAACCCGTC，3’上游特异性引物2：TGGGTGTCATCTTTTGAAGGTGT；5’下游特异性引物1：GCACTGTTGATGAGGTAGTCGCT，5’下游特异性引物2：GTGTCCGCAGTAAGGAGTAATCT，扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA；

（3）RACE扩增获取BPI基因全长序列，具体步骤如下：

a．总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集体腔细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL，  4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；

b．3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript? RTase试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物Adaptor3进行PCR 扩增，取PCR产物1 ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物Adaptor3进行PCR得到3’端目的条带；

c．5’-RACE扩增：将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增5’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5’下游特异性引物1和扩增5’接头引物Adaptor5进行PCR 扩增，取PCR产物1 ul作为模板，再用5’下游特异性引物2和扩增5’接头引物Adaptor5进行PCR得到5’端目的条带；

    d．将上述扩增产物用凝胶回收试剂盒（百泰克）回收，回收产物与载体pMD18-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到全长序列；

其中，RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，10×PCR缓冲液（不含Mg²⁺）2.5 μL，浓度25 mM的MgCl₂  2.0 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的Adaptor 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

最终得到的刺参BPI基因cDNA序列如SEQID NO.1所示，该序列全长2208 bp，包括1455 bp的开放阅读框，编码484个氨基酸，5’非编码区长395 bp，3’非编码区长358 bp， 有多聚腺苷酸信号，mRNA末端不稳定信号以及序列末端含有典型的polyA尾；刺参BPI基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，该蛋白分子量为54.323 KDa，等电点为5.58，其中编码序列的1-21位为信号肽序列，编码序列的29-242位为N端结构域（氨基酸序列如SEQID NO.3所示），编码序列的257-462位为C端结构域，含有两个半胱氨酸（Cys)，形成1个分子内二硫键。

 具体实施例二

重组刺参BPI基因工程菌的构建方法

1、BPI蛋白质N端结构域克隆及重组蛋白的构建与表达

    a、总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集血细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL，4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；

    b、cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参编码BPI蛋白N端结构域的基因序列（氨基酸序列如SEQID NO.3所示），即如下所示：

含BmH I位点BPI上游扩增引物：CGGGATCCCGAATCACTCCCAACGGATTTCG

含Not I位点BPI下游扩增引物：TTGCGGCCGCATGGCCAGTTGCATAAACCTCCC

    c、PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液（不含Mg²⁺ ）2.5 μL，浓度25 mM的MgCl₂  2.0 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM 的下游引物1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：15.3 μL ；扩增条件：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

    d、PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（百泰克）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD18-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的阳性克隆质粒；

e、重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmH I和Not I（New England Biolabs，NEB）限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在600bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-BPIN重组质粒；

f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-BPIN，转化到表达宿主BL21（DE3）（Novagen公司），获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物；

2、重组蛋白的纯化与复性

  a、蛋白纯化：将每100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000 rpm离心10 min，去上清液，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次12000 rpm离心20 min ，取上清液；取1 mL Ni-NTA Sefinose^TM Resin（上海生工，编号：BSP033）上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与之前上柱的Ni-NTA Sefinose^TM Resin混合，4 ℃混匀1 h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，洗脱10次后；加入1 mL变性蛋白洗脱液浸泡10 min ，收集洗脱液，重复洗脱5次，收集每次洗脱液合并，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行鉴定，获得重组刺参BPIN末端结构域蛋白（图1，箭头所示即为目的蛋白）；

b、蛋白复性：纯化后的重组刺参BPIN末端结构域蛋白分别用透析液Buffer1、透析液Buffer2、透析液Buffer3透析，每步透析6-18h，最后，4 ℃ 12000r/min离心30 min，收集沉淀，即为重组刺参BPI基因工程菌，溶解至所需的浓度用于抑菌活性分析。

上述包涵体洗涤液配方为：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；

上述包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；

上述杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，2 M咪唑，pH=7.9；

所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5。

上述透析液Buffer1配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，3 M尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

上述透析液Buffer2配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.614 g还原型谷胱甘肽，0.0122 g氧化型谷胱甘肽，2 M咪唑，1 M 尿素，50 mL甘油，50 ul 吐温-20，定容于1 L，pH=7.9；

上述透析液Buffer3配方为：1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，50 mL甘油，定容于1 L，pH=7.9。

 具体实施例三

刺参重组蛋白的抑菌活性分析

（1）将4种受试阴性菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），灿烂弧菌（Vibrio splendidus），溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）接种于2216E液体培养基（胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1 g/L，pH=7.6）于28 ℃，150 r/min培养至OD₆₀₀=1.0，取100 ul菌液涂平板（琼脂12 g/mL）；

（2）将受试阳性菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus）接种于营养琼脂液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5g/L，pH=7.3±0.1）于35 ℃，150 r/min培养，将菌液与营养琼脂固体培养基（琼脂15 g/L）混合倒平板，菌液浓度1×10⁷cfu/mL；

（3）采用改良琼脂平板扩散法（牛津杯）测定重组杀菌通透性增强蛋白抑菌活性，每种受试菌设置阴性对照组1（无菌培养基）、阴性对照组2（透析液）和重组蛋白实验组，在上述所述平板中放置无菌牛津杯（直径0.8 cm），依次向每个牛津杯中加入不同质量浓度20 ug/牛津杯、40 ug/牛津杯具体实施例三构建所得的重组刺参BPI基因工程菌以及相等体积阴性对照组1（无菌培养基）、阴性对照组2（透析液），藤黄微球菌实验组于35 ℃培养12 h，其他受试菌实验组于28 ℃培养12 h，结果显示，具体实施例三构建所得的重组刺参BPI基因工程菌对2株水产病原菌副溶血弧菌（图2和3，重组蛋白质量浓度为20 μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为2.21 ± 0.11 cm，重组蛋白质量浓度为40 μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为2.55 ± 0.15 cm）和哈维氏弧菌（图4和5，重组蛋白质量浓度为20 μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为1.63 ± 0.12 cm，重组蛋白质量浓度为40 μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为2.14 ± 0.32 cm）以及阳性菌藤黄微球菌（图6-8，重组蛋白质量浓度为20 μg/牛津杯对藤黄微球菌的抑菌直径为0.93 ± 0.02 cm，重组蛋白质量浓度为40 μg/牛津杯对藤黄微球菌的抑菌直径为1.21 ± 0.02 cm）具有较为明显的抑制作用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。