产酸梭状芽胞杆菌及使用它生产挥发性脂肪酸的方法

摘要

产酸梭状芽胞杆菌及使用它生产挥发性脂肪酸的方法，本发明公开了一种分离的酪丁酸梭菌DSM27751以及一种生产挥发性游离酸的方法，所述方法包括在培养基中培养具有DSM27751的基因型特性的微生物；向微生物提供至少一种底物，所述底物包括选自CO和CO

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）DSM27751及使用它生产挥发性游离酸的方法。 

背景技术

合成气体（“合成气”）是以一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO₂）和氢气（H₂）为主要组分的一种燃料气体混合物。合成气可以通过天然气的蒸汽重整或各种有机材料，如生物质、有机废物、煤、石油、塑料或其它含碳材料的气化而制备。 

目前已经开发了可将合成气转化成各种燃料和化学品的催化工艺，例如甲烷、甲醇、甲醛、乙酸和乙醇。而其中微生物也被用于将合成气转化成燃料和化学品。例如，通过产乙酸的梭状芽胞杆菌微生物如Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahlii、Clostridium carboxidivorans和Clostridium ragsdalei将合成气转化成液体燃料和化学品。 

微生物中的厌氧细菌，如来自梭菌（Clostridium）属的细菌，可透过如图1所示的乙酰辅酶A生化途径（也被称为Wood-Ljungdahl通路）从CO、CO₂和H₂生产乙醇。 

用于转化合成气的微生物工艺通常被称为合成气发酵。相比于化学催化工艺，合成气发酵工艺可在较低的温度和压力下进行，具有更高的反应特异性，并且不需要特定的CO和H₂比。 

然而，仍然需要不断发现和开发其它能够通过合成气发酵来生产化学品或生物燃料的微生物。特别是，可在不同类型的底物上生长，同时还可提供良好的目的产物产率的细菌种类。 

发明内容

本公开内容的一个实施例提供一种分离的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）DSM27751，其适于将合成气或主要含有CO和/或CO₂的气体混合物转化成诸如丁醇的燃料和/或诸如挥发性脂肪酸（例如，丁酸）的化学品。例如，在一些实施例中，本文所公开的细菌可将CO和/或CO₂转化为挥发性脂肪酸，如甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸以及它们的混合物。 

本公开内容的另一个实施例提供一种生产挥发性脂肪酸，如甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸以及它们的混合物的工艺，包括：在包含至少一种碳源的培养基中培养具有DSM27751的基因型特性的微生物，向微生物提供一底物（substrate），其中该底物包括至少一种选自CO和CO₂的碳源，以及从培养物中回收挥发性游离酸。本发明的其它目的和优点将在下面的描述中阐述，并且部分地从本说明书中显而易见，或者可以通过实践本发明而知晓。本发明的目的和优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合实现及获得。 

应该理解的是，前面的一般描述和下面的详细描述都是示例性和说明性的，而并不限制本发明所主张的权利范围。 

附图说明

附图并入说明书中并构成本说明书的一部分，附图示出本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。 

图1示出微生物的Wood-Ljungdahl途径。 

图2A和2B示出按实施例1所述将DSM27751在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中培养48小时后采取液体样品的HPLC谱。 

图3A示出按实施例1所述在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中培养18小时后的各种DSM27751产物的浓度。 

图3B示出按实施例1所述在含有5g/L葡萄糖和5g/L乳酸盐的CGM培养基中培养36小时后的各种DSM27751产物的浓度。 

图4示出按实施例2所述的不同稀释比的DSM27751和ATCC25755在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中的生长速度。 

图5示出不同稀释比的DSM27751和ATCC25755在含有5g/L葡萄糖和5g/L乳酸盐的CGM培养基中的生长速度。 

图6示出如实施例2所述的DSM27751和ATCC25755的丁酸盐产率、葡萄糖消耗率和乳酸盐消耗率。 

图7示出如实施例2所述的DSM27751和ATCC25755中的鞭毛蛋白基因的序列比较。 

图8示出按实施例3所述在培养DSM27751且提供包括10％的H₂、20％的CO、20%的CO₂和50％的N₂的合成气的培养基中的（A）OD₆₀₀，（B）甲酸盐浓度，（C）乙酸盐浓度，（D）丙酸盐浓度，和（E）丁酸盐浓度的变化。 

图9示出按实施例3所述在培养DSM27751且提供包括10％的H₂、20％的CO、20%的CO₂和50％的N₂的合成气的培养基中培养24小时后取出的液体样品的HPLC谱。 

具体实施方式

下面，将参照附图更详细地描述示例性实施例，以使本技术领域的普通技术人员很容易地理解。本发明的概念可以通过各种形式实施，而不限于该示例性的实施例。 

参照本发明的示例性实施例进行详细说明，其示例在附图中示出。尽可能在整个附图中使用相同的附图标记表示相同或类似的部件。 

本文所用的术语“酸”既包括羧酸也包括相关的羧酸根阴离子。在发酵液中酸与羧酸盐的分子比取决于该体系的pH值。 

术语“挥发性游离酸”是指具有6个或更少的碳原子的碳链的脂肪酸。例如，挥发性脂肪酸包括甲酸（甲酸盐）、乙酸（乙酸盐）、乳酸（乳酸盐）、丙酸（丙酸盐）和丁酸（丁酸盐）。 

厌氧细菌物种 

本发明提供了一种分离的厌氧细菌物种，其能够从相对常见的底物中生产挥发性游离酸。在一些实施例中，所公开的细菌产生诸如甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸及其混合物的挥发性脂肪酸。在一些实施例中，本文所公开的细菌可生产选自甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、丙酸盐、丁酸盐及其混合物的盐。 

在一些实施例中，所公开的分离的厌氧细菌物种涉及产酸梭状芽孢杆菌-酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum），其包括SEQ ID NO：1所示的16S rRNA序 列，或与SEQ ID NO：1具有至少80％、例如85％、90％、95％和98％的同一性的任何核苷酸序列。 

在一些实施例中，所公开的分离的厌氧细菌物种是分离的酪丁酸梭菌ITRI04001，其于2013年9月12日保藏在德国微生物保藏中心，地址：德国不伦瑞克（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany），保藏编号为DSM27751。 

在一些实施例中，分离的厌氧细菌物种是具有DSM27751的基因型特性的分离的酪丁酸梭菌的生物纯培养物。 

在一些实施例中，分离的厌氧细菌物种包括用于从合成气生产挥发性脂肪酸的关键酶的编码基因的至少两组序列：一组编码从合成气合成乙酰-CoA，另一组编码生产挥发性脂肪酸，如甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸以及它们的混合物。乙酰-CoA途径的酶包括甲酸脱氢酶、甲酰基-THF合成酶、次甲基四氢叶酸环化水解酶（methenyl-THF cyclohydrolase）、次甲基四氢叶酸脱氢酶（methenyl-THF dehydrogenase）、亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene-THF reductase）、甲基转移酶和CO脱氢酶/乙酰-CoA合酶。 

编码用于生产甲酸、乙酸、乳酸、丙酸和丁酸的基因序列如下： 

对于甲酸或甲酸盐的合成：pfl（SEQ ID NO：11），pflA（SEQ ID NO：12），pflD（SEQ ID NO：13）。 

对于乙酸或乙酸盐的合成：pta（SEQ ID NO：14），ack（SEQ ID NO：15），ctf（SEQ ID NO：16）。 

对于乳酸或乳酸盐的合成：ldh（SEQ ID NO：17-19），dldh（SEQ ID NO：20）。 

对于丙酸或丙酸盐的合成：pct（SEQ ID NO：21，22）。 

对于丁酸或丁酸盐的合成：thl（SEQ ID NO：23），hbd（SEQ ID NO：24，25），crt（SEQ ID NO：26，27），bcd（SEQ ID NO：28），ptb（SEQ ID NO：29），bdhA（SEQ ID No：30）。 

在一些实施例中，分离的酪丁酸梭菌的生物纯培养物包括如SEQ ID NO：1-30所示序列，或者与SEQ ID NO：1-30所示序列具有至少80％，如85％、90％、95％和98％同一性的序列。 

这里公开的分离的厌氧细菌物种可以通过本领域已知的用于培养厌氧菌 的任何培养基、底物、条件及方法进行培养。 

例如，所公开的分离的厌氧细菌物种可以在厌氧条件下培养。“厌氧条件”是指在气相时氧气（O₂）的水平低于百万分之0.5份（0.5ppm）。此外，作为例子，可以在包括选自葡萄糖、木糖、果糖、乳酸盐和乙酸盐中至少一种碳源的梭状芽孢杆菌生长培养基（CGM）中培养DSM27751。 

生产挥发性脂肪酸的方法

本文公开的分离的厌氧细菌物种，如DSM27751，具有在厌氧条件下从包括例如CO+H₂或H₂+CO₂或CO+H₂+CO₂的底物生产挥发性脂肪酸的能力。CO或CO₂可提供碳源而H₂或CO可提供电子源用于生产挥发性脂肪酸的反应。 

因此，本发明还提供一种生产挥发性游离酸的工艺，包括： 

在培养基中培养具有DSM 27751的基因型特性的微生物； 

向微生物提供一底物（substrate），其中该底物包括至少一种选自CO和CO₂的碳源；和 

回收至少一种游离的挥发性游离酸。 

在一些实施例中，培养基不包括葡萄糖、木糖、果糖、乳酸盐或乙酸盐。 

在一些实施例中，培养基包含选自葡萄糖、木糖、果糖、乳酸盐和乙酸盐中至少一种的碳水化合物。 

在一些实施例中，所述至少一种底物还包括至少一种选自N₂和H₂的气体。 

在一些实施例中，所述至少一种底物包括CO和H₂。 

在一些实施例中，所述至少一种底物包括CO₂和H₂。 

在一些实施例中，所述至少一种底物包括CO、CO₂和H₂。 

在一些实施例中，至少一种底物是“废”气如合成气、炼油厂废气、产钢废气、自热重整的天然气以及气化的煤。 

在一些实施例中，所述至少一种底物是合成气。 

合成气可由任何已知的来源提供。在一个实施例中，合成气可源自含碳材料的气化。气化涉及生物质在受限制的氧气供应下的部分燃烧，产生的气体会主要包括CO。 

在一些实施例中，适用于本文所公开的方法的合成气含有CO、CO₂、H₂和N₂。 

在一些实施例中，合成气可含有CO，其相对于合成气的总摩尔数是在10％到100％范围的量。例如，相对于合成气中的总摩尔数，合成气可以包括从20％到90％，从30％至80％，或从40％到70％的CO。 

一般而言，合成气可以气态添加到发酵反应中。然而，本公开内容不限于在这种状态下添加到底物中。例如，用合成气饱和液体，并将该液体加入到生物反应器中。 

在一些实施例中，合成气可补充其它来源的气体，以改变提供给细菌的气体组分（例如，CO、CO₂、和/或H₂）的浓度。例如，合成气可补充更高水平的CO（例如，钢厂废气富集CO）气体以富集CO的水平。 

为了细菌的生长以及进行CO-至-挥发性游离酸的代谢反应，除了合成气以外，培养基还可以补充有适于细菌生长的额外的营养物或成分。因此，除了所述至少一种额外的碳源，用于培养细菌的培养基中还可以包括足以使细菌生长的维生素、盐、提取物和/或矿物质。 

在一些实施例中，生产挥发性游离酸的工艺可在发生所需发酵（例如，CO至挥发性游离酸）的条件下进行。为了确保在液相中的CO不受限，并且使产物浓度最大以及避免产物抑制，应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH值、培养基的氧化还原电位、搅拌速度（如果使用连续搅拌罐式反应器）、接种量、最大气体底物浓度。 

本文所公开的工艺可以在能够使底物与一种或多种微生物接触的任何合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌罐式反应器（CSTR）、固定化细胞反应器、气升式反应器、气泡塔型反应器（BCR）、膜反应器如中空纤维膜生物反应器（HFMBR）或滴流床反应器（TBR）、整体式生物反应器或回路反应器。另外，在本发明的一些实施例中，生物反应器可以包括基本生长反应器和二级发酵反应器，在基本生长反应器中培养微生物，在二级发酵反应器中提供来自生长反应器的发酵液，并且产生大部分的发酵产物（如挥发性脂肪酸）。 

在一些实施例中，发酵将持续进行直到在培养基中产生所需水平的挥发性脂肪酸。或者，当达到一定产率时，例如由于，细菌废物的积聚，底物可 利用性的降低，产物的反馈抑制，活菌数的减少，或由于本领域技术人员已知的任何原因，使得所需产物的生产速率下降时，可以停止生产。此外，除去用过的培养基（包括任何液体产物），同时持续补充新鲜培养基的连续培养技术是已知。 

发酵将产生含有挥发性游离酸，以及细菌细胞如DSM27751的发酵液。 

可以通过任何已知的方法，如沉淀法、萃取法（例如，有机溶剂液-液萃取）、吸附、透析（例如，电渗析）、离子交换和压力驱动的膜分离方法将游离的挥发性游离酸从典型的水性发酵液中移出。例如，方法可参阅Schügerl K.，2000Biotechnol Adv.18:581-599.;Yang,S.-T.and Lu,C.(2013)Extraction-Fermentation Hybrid(Extractive Fermentation),in Separation and Purification Technologies in Biorefineries,UK.doi:10.1002/9781118493441.ch15，但不限于此。 

例如，沉淀已被广泛用于回收富马酸和乳酸，富马酸和乳酸当以它们的钙盐的形式存在时具有低的溶解度。作为实例，传统的发酵过程产生乳酸钙沉淀物，然后可以收集乳酸钙并重新酸化，从而回收乳酸。 

作为另一个实例，可以使用脂族胺，如Alamine336（三-辛/癸胺； Cognis，辛辛那提，俄亥俄州，美国）或其它不与水混溶的溶剂，通过提取来回收并纯化存在于发酵液中的丁酸。 

其它实施例将通过本领域技术人员考虑本发明的说明书并实践本文所公开的发明而显而易见。本说明书和实施例旨在被认为是示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求所指示。 

实施例 

培养基 

在下面的表格中示出所使用的强化梭菌培养基（RCM）和梭状芽孢杆菌生长培养基（CGM）的组成。 

实施例1-酪丁酸梭菌DSM27751的生产 

从台湾收集来自奶牛的原料乳样品，并随后在70℃加热10分钟。冷却至室温后，将样品与补充有20％乳酸钠的强化梭菌培养基（RCM）混合，然后在37℃于厌氧条件下培养。 

为了分离梭状芽胞杆菌细菌种，使用对16S rRNA序列特异的一对引物（正向：GCGGCGTGCYTAAYACATGC，和反向：GGGTTGCGCTCGTTGCRGGA），利用基于PCR的检测法来评价样品。当在样本中检测到预期大小的PCR产物时，然后对样品进行连续稀释，并在含5g/L葡萄糖和5g/L乳酸钠的梭状芽孢杆菌生长培养基（CGM）琼脂上铺平板。在37℃的厌氧条件下培养平板，直至出现菌落。从CGM琼脂平板上挑取单菌落，并使用对16S rRNA序列特异的一对引物（正向：GCGGCGTGCYTAAYACATGC，和反向：GGGTTGCGCTCGTTGCRGGA），利用基于PCR的检测法进行分析。对PCR产物进行测序并通过NCBI网站 上的Basic Local Alignment Search Tool进行分析。 

DSM27751的特性 

在CGM琼脂平板上生长的DSM27751菌落出现不规则边缘，呈棕黄色，以及中心微微凸起。 

当在显微镜下观察时，DSM27751出现运动性并可展现芽孢形态。 

对DSM27751的16S rRNA基因序列（SEQ ID NO：1）的系统进化分析表明DSM27751属于酪丁酸梭菌。DSM27751和酪丁酸梭菌25755(“ATCC25755”)对于16S rRNA基因序列共享约99％的序列相似性。 

在37℃，厌氧条件下在含有5g/L葡萄糖、木糖、果糖、乳酸盐或乙酸盐的CGM培养基中培养DSM27751。通过测量在波长为600nm的光密度（即，OD₆₀₀）来监测生长。72小时后，在所有类型的培养基中都观察到DSM27751生长。因此，可以使用葡萄糖、木糖、果糖、乳酸盐或乙酸盐作为碳源培养DSM27751。 

将DSM27751铺于含有不同浓度的各种抗生素的RCM琼脂上，然后在37℃，厌氧条件下培养72小时。在含有安普霉素（25微克/毫升）、大观霉素（250微克/毫升）、链霉素（500微克/毫升）或卡那霉素（25微克/毫升）的琼脂平板的表面上观察到DSM27751菌落。 

在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中培养DSM27751，每24小时取液体样品，并用HPLC进行分析。图2A和2B示出在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中培养DSM2775148小时后所取的液体样品的HPLC谱。HPLC谱表明产生了丁酸盐、乙酸盐、乳酸盐和丙酸盐。 

图3A示出在37℃，厌氧条件下，在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中培养18小时后，各DSM27751产物的浓度。 

图3B示出在37℃，厌氧条件下，在含有5g/L葡萄糖和5g/L乳酸盐的CGM培养基中培养36小时后，各DSM27751产物的浓度。 

实施例2-DSM27751与Clostridium tyrobutyricum van Beynum and Pette(25755)的比较 

生长速率 

在RCM培养基中培养DSM27751和25755至对数生长中期。取出培养样品并以不同的稀释比例接种到含有（1）5g/L葡萄糖，或（2）5g/L葡萄糖和5g/L乳酸盐的CGM培养基中。通过测量在600nm的OD值来监测DSM27751或25755的生长。 

图4示出了在含有5g/L葡萄糖的CGM培养基中，按1:100的比例稀释的DSM27751的生长速率高于按1:50的比例稀释的ATCC25755。 

图5示出在含有5g/L葡萄糖和5g/L乳酸盐CGM的培养基中，按1:100的比例稀释的DSM27751生长速率高于按1:25或1:50的比例稀释的ATCC25755。 

丁酸生产 

将生长至静止期的DSM27751和ATCC25755以相同的稀释比例接种到含有8g/L乳酸盐和5g/L葡萄糖的CGM培养基中，在37℃，厌氧条件下培养。培养24小时后，取出培养基的样品，通过HPLC测量丁酸盐、葡萄糖和乳酸盐的浓度。 

图6示出DSM27751和ATCC25755的丁酸盐产率、葡萄糖消耗率和乳酸盐消耗率。这些数据表明，在含有8g/L乳酸盐和5g/L葡萄糖的CGM培养基中，DSM27751比ATCC25755展现出更高的葡萄糖消耗速率和更高的丁酸盐产率。 

鞭毛蛋白基因 

对DSM27751的鞭毛蛋白基因的两个片段进行测序，并与ATCC25755的相关序列进行比较。DSM27751和ATCC25755关于片段(22-293)共享约92％的序列同一性并且关于片段(958-1119)共享约91％的序列相似性。参见图7。 

实施例3-使用合成气发酵DSM27751 

使用DSM27751来进行的合成气发酵是在含有50mL CGM培养基的200mL气密瓶中进行，pH为6.0，没有任何碳水化合物。发酵过程中提供给DSM27751的唯一的碳源来自含有10％H₂、20％CO、20％CO₂和50％N₂ 的合成气，其在瓶顶部空间被加压至20psi。所有实验都在37℃，100rpm的旋转振荡器上进行。在0、24、48和62小时培养时间从培养基中取样，并用HPLC（Agilent1100系列，带Aminex HPX-87H（300mm x7.8mm）柱）进行分析。 

图8示出以提供含有10％H₂、20％CO、20％CO₂和50％N₂的合成气的培养基培养DSM2775162小时，其培养基中（A）OD₆₀₀值（B）甲酸盐浓度，（C）乙酸盐浓度，（D）丙酸盐浓度，和（E）丁酸盐浓度的变化。 

图9示出以提供含有10％H₂、20％CO、20％CO₂和50％N₂的合成气的培养基培养DSM2775162小时，其培养基中取出的液体样品的HPLC谱。 

本领域的技术人员在本领域中，依所公开的实施例可以做出各种修改和变化将是显而易见的。本说明书和实施例被认为仅仅是示例性的，真正专利范围乃由所附权利要求及其等同物所所界定。