筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片及其应用

摘要

本发明公开了一种筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片及其应用。本发明提供鉴定或辅助鉴定苹果锈果类病毒属类病毒的探针，由35条探针组成，所述35条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-35。还提供了筛查苹果锈果类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对苹果锈果类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片可用于苹果锈果类病毒属类病毒的检疫鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查苹果锈果类病毒 属类病毒的芯片及其应用。

背景技术

苹果锈果类病毒属类病毒（Apscaviroid）属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科 （Pospiviroidae），根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of  Viruses,ICTV）第八次分类报告，该属包括苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid， ASSVd）、苹果凹类病毒(Apple dimple fruit viroid，ADFVd)、柑桔曲叶类病毒(Citrus  bent leaf viroid，CiBLV)、澳洲葡萄类病毒（Australian grapevine viroid，AGVd）、柑桔 类病毒III(Citrus viroid III,CiVd III)、葡萄黄点类病毒1(Grapevine yellow speckle  viroid 1,GYSVd-1)、葡萄黄点类病毒2(Grapevine yellow speckle viroid 2,GYSVd-2)及 梨疱状溃疡类病毒(Pear blister canker viroid，PBCVd)等8种类病毒。该属的类病毒可 侵染苹果、梨、桃子、柑橘及葡萄等多种重要的果树。其代表种苹果锈果类病毒侵染 苹果可引起苹果锈果病导致果实变扁、花脸、畸形和裂果，是苹果生产中毁灭性的类 病毒病害之一；可通过种子、嫁接及介体昆虫传播，在果园中传播速度快，能够在植 株间通过根接传播，目前尚无有效的药物防止该病的发生；苹果树一旦染病,病情逐 年加重并成为全株永久性病害，必须清除病株才能控制病害的蔓延；它会使苹果果实 商品价值大大降低，这不但严重影响果农收入，同时也制约了我国苹果产业的健康发 展，是国内检疫对象；近年来，该类病毒扩展蔓延迅速，技术人员跨区域跨果园嫁接、 修剪作业，更加重了其传播和发展。葡萄黄点类病毒则导致葡萄病株叶片黄色斑点或 形状不规则的黄色班块，造成葡萄大量减产。梨疱状溃疡类病毒危害梨树，导致其产 量和品质下降，严重时可引起果树急剧衰退，提早枯死而绝收，给果树生产带来很大 的影响。该属中等梨疱状溃疡类病毒是2007年发布的《中华人民共和国进境植物检疫 性有害生物名录》中的检疫性有害生物。

由于本属具有潜在新发检疫性类病毒的可能，而目前用于该属类病毒检测的方法 如指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、核酸斑点杂交技术及分子生物学技术等只能 对该属已知类病毒进行特异性检测，对于未知及新发的类病毒监测无能为力，所以容 易造成危险性类病毒漏检并传播扩散，进而导致巨大的经济损失和不良的社会影响。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定苹果锈果类病毒属类病毒的探针 组。

本发明提供鉴定或辅助鉴定苹果锈果类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针35 共35条探针组成，所述探针1-探针35的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-35。

上述探针中，所述苹果锈果类病毒属类病毒为苹果锈果类病毒、苹果凹类病毒、 柑桔曲叶类病毒、澳洲葡萄类病毒、柑桔类病毒III、葡萄黄点类病毒1、葡萄黄点类 病毒2或梨疱状溃疡类病毒。

本发明的另一个目的是提供一种筛查苹果锈果类病毒属类病毒的基因芯片。

本发明提供的筛查苹果锈果类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在 片基表面得到的基因芯片。

在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是 博奥生物有限公司晶芯微阵列基片,产品目录号:420022。

在上述基因芯片中，所述苹果锈果类病毒属类病毒为苹果锈果类病毒、苹果凹类 病毒、柑桔曲叶类病毒、澳洲葡萄类病毒、柑桔类病毒III、葡萄黄点类病毒1、葡萄 黄点类病毒2或梨疱状溃疡类病毒。

本发明的第三个目的是提供一种筛查苹果锈果类病毒属类病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。

上述试剂盒还包括用于扩增所述苹果锈果类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所 述引物对具体为引物对1或引物对2；

所述引物对1由序列表中序列36和序列表中序列37所示的DNA分子组成（用 于扩增苹果锈果类病毒）；

所述引物对2由序列表中序列38和序列表中序列39所示的DNA分子组成（用 于扩增柑橘类病毒III）；

所述苹果锈果类病毒属类病毒为苹果锈果类病毒或柑橘类病毒III。

上述探针组、上述基因芯片或上述试剂盒在如下1）-4）中的应用，也是本发明 保护的范围：

1）鉴定或辅助鉴定苹果锈果类病毒属类病毒；

2）制备鉴定或辅助鉴定苹果锈果类病毒属类病毒产品；

3）鉴定或辅助鉴定待测植物感染苹果锈果类病毒属类病毒；

4）制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染苹果锈果类病毒属类病毒产品。

上述应用中，所述苹果锈果类病毒属类病毒为苹果锈果类病毒、苹果凹类病毒、 柑桔曲叶类病毒、澳洲葡萄类病毒、柑桔类病毒III、葡萄黄点类病毒1、葡萄黄点类 病毒2或梨疱状溃疡类病毒；所述待测植物为苹果、柑桔、葡萄或梨。

本发明的第四个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测植物感染苹果锈果类病毒属 类病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；

2）将步骤1）得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，

若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于 3.0，则待测植物感染或候选感染苹果锈果类病毒属类病毒。

上述方法中，步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以上述的试剂盒中 的所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标 记，得到标记后产物；

步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；

在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；

所述至少一条所述探针为上述探针组中的任意一条；

所述组织为叶片；

所述苹果锈果类病毒属类病毒、所述引物对和所述待测植物如下1）或2）：

1）所述苹果锈果类病毒属类病毒为苹果锈果类病毒，所述引物对为所述引物对1； 所述待测植物为苹果；

2）所述苹果锈果类病毒属类病毒为柑桔类病毒III，所述引物对为所述引物对2； 所述待测植物为柑桔。

本发明的实验证明，本发明提供的筛查苹果锈果类病毒属类病毒芯片中的探针具 有苹果锈果类病毒属类病毒属水平上的高兼容性和属内的特异性，所需的样品量少， 一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直 观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对苹果锈果类病毒属类病毒的核苷酸序列 进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。 本发明的苹果锈果类病毒属类病毒芯片可用于苹果锈果类病毒属类病毒的检疫鉴定。

附图说明

图1为苹果锈果类病毒属类病毒筛查芯片探针点阵示意图（10×12）

图2为应用苹果锈果类病毒样品验证苹果锈果类病毒属类病毒筛查芯片的结果

图3为应用柑橘类病毒III样品验证苹果锈果类病毒属类病毒筛查芯片的结果

图4为筛查芯片灵敏度检测结果

图5为PCR灵敏度检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片的制备

1、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计

从美国国立生物技术信息中心（NCBI）及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下 载类病毒属全基因组及核酸序列；去除90%以上长度与其它序列有95%相似度的核酸 序列；以5个碱基作为间隔，连续提取所有40mer的核酸序列；以40%≤GC含量≤60%、 单个碱基含量≤50%、连续重复碱基数目≤4，且无大于6个碱基的发卡结构为标准对 核酸序列进行筛选，并在NCBI数据库中进行同源性比较以保证所获得探针的特异性。

根据上述原则设计了苹果锈果类病毒属类病毒的35条探针（探针1-探针35），其核 苷酸序列分别依次为序列表中的序列1-35所示。

可以人工合成上述35条探针。

2、芯片的制备

将上述1得到的35条探针分别用点样缓冲液（博奥生物有限公司晶芯芯片点样 液,产品目录号:440010）溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复3点点在醛基化玻 璃片基芯片（博奥生物有限公司晶芯微阵列基片,产品目录号:420022）上，每点约 0.25nL，点直径约180μm，点间距为300μm，点样均匀度的标准方差为15％。将芯片 点有探针的一面在65℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自 然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。 将芯片放在42℃预热，0.5％SDS清洗10min。将芯片转移到42℃预热蒸馏水中清洗 2min。把芯片放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，以去除芯片表面的液体， 获得筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片。

筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片如图1所示，图1中1-35为苹果锈果类病毒 属类病毒筛查芯片探针1-35（对应序列1-35），Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交 阳性质控，NC为杂交阴性质控。

实施例2、筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片的应用

一、筛查芯片检测样品

1、用于检测的样品总RNA提取

1）取感染苹果锈果类病毒的苹果叶片（苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid，记 载在：苹果锈果类病毒的几种提取方法及RT-PCR检测灵敏度的比较.植物保护,2006, 32(2):95-97.，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。）和感染柑橘类病毒III的柑橘 叶片（柑橘类病毒III拉丁名Citrus viroid III.记载在：柑橘类病毒的分子鉴定与分型. 中国农业科学,2008,41(9):2670-2677，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。）各 0.1g样品，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5mL离心管中，然后加入1mL的 Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；

2）4℃，12000rpm离心10min，将上清液转入一新的1.5mL离心管中；

3）加0.5mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置15min；4℃，12000rpm离心15min；

4）将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温 保持15min；

5）4℃，12000rpm离心10min；倒掉上清液，加入75%的冷乙醇洗涤沉淀，然 后4℃，12000rpm离心5min，弃乙醇；

7）沉淀室温下充分干燥后，溶于40μL双蒸水（DEPC处理）中，-20℃保存备用， 得到总RNA。

2、样品标记与杂交

将上述得到的总RNA反转录得到cDNA。

PCR扩增，即在0.2mL的反应管中加入cDNA产物2μL、上游引物0.5μL（终浓度为 0.5mmol/L）、下游引物0.5μL（终浓度为0.5mmoL/L）、dNTP Mix（10mmol/L）0.5μL、 Taq酶（5U/μL）0.5μL、PCR缓冲液（10×）2μL及DEPC-H₂O 14μL，然后按照PCR反 应程序进行扩增。

上下游引物由分别用于扩增苹果锈果类病毒或柑橘类病毒III的引物对组成。

上述用于扩增苹果锈果类病毒的引物对包括

上游引物：5’-GGTAAACACCGTGCGGTCCC-3’（序列36）；

下游引物：5’-GGGAAACACCTATTGTGTTT-3’（序列37）；

其PCR反应程序为：94℃5min;94℃30s、54℃30s、72℃30s;共30个循 环;72℃延伸10min。

上述用于扩增柑橘类病毒III的引物对包括

上游引物：5’-GGCAGCTAAGTTGGTGACGC-3’（序列38）；

下游引物：5’-TTCGTCGACGACGACAGGTA-3’（序列39）；

其PCR反应程序为：95℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃30s;共35个循 环;72℃延伸10min。

Klenow酶标记体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入PCR产物5μL，9N随 机引物（invitrogen，Cat.No.48190-011）（100μmol/L）2μL及H₂O 12μL，95℃变性3 min，冰浴5min。然后向反应管中加入10×Klenow酶缓冲液2.5μL，dNTP（2.5mmol/L） 2μL，cy3-dCTP 0.5μL（Amersham,Cat.No.PA 53021终浓度为5nmol/L），klenow酶（5 U/μL）1μL。37℃反应1.5h，70℃变性5min，冰浴5min，得到标记样品。

杂交：体系为16μL，包括2.4μL SSC（终浓度3×）、0.32μL SDS（终浓度0.2％）、 4μL甲酰胺（终浓度25%）、1.6μL Denhardt’s（Ameresco，Cat.No.E717，终浓度5×） 和标记样品7.68μL。95℃变性3min，冰浴5min，瞬时离心。将杂交液加到芯片上，盖 玻片盖好，42℃水浴杂交过夜（12h），分别得到杂交后的芯片（苹果锈果类病毒）和 杂交后的芯片（柑橘类病毒III）。

3、洗涤、扫描

清洗体系及程序如下：

先将洗液I、II放在微波炉中预热到42℃，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交 后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片 清洗后，放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，除去芯片表面的液体，分别得 到待检测芯片（苹果锈果类病毒）、待检测芯片（柑橘类病毒III）。

将上述待检测芯片（苹果锈果类病毒）、待检测芯片（柑橘类病毒III）置于扫描 仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度及背景强度等数据。

使用博奥生物公司LuxScan 3.0芯片扫描仪从芯片中提取数据，探针的信号值为探 针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与 背景值中位值的比值。

若至少一条所述探针的信号值≥600且信噪比≥3，判为阳性（为苹果锈果类病毒 属类病毒感染）；探针的信号值＜600且信噪比＜2，判为阴性（不为苹果锈果类病毒属 类病毒感染）；其余情况判为可疑，判为可疑，需重复验证。

图2、图3的探针排列与图1相同，苹果锈果类病毒属类病毒探针均为1-35。

苹果锈果类病毒的结果如图2所示，探针1、4、5、6、9所在位置的信号值分别为 6642、48016、14567、1892及5453，均大于600；信噪比分别为19、330、41、6及16， 均大于3，说明本发明可以检测苹果锈果类病毒属类病毒的苹果锈果类病毒；

柑橘类病毒III的结果如图3所示，探针2、3所在位置的信号值分别为14093、8598 均大于600；信噪比分别为34、20，均大于3，说明本发明可以检测苹果锈果类病毒属 类病毒的柑橘类病毒III；

上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂 交信号强，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。

二、筛查芯片与PCR检测灵敏度比较

准确称取0.1g感染苹果锈果类病毒的苹果组织，提取总RNA，分别用于苹果锈果 类病毒属类病毒筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的RNA均进行10⁰、10¹、10²和10³倍梯度稀释。

芯片检测的方法同上述的一，结果如图4所示，图4的探针排列与图1相同，其中A： 10¹稀释；B：10²稀释；C：10³稀释；A中探针1、4、5、6、9所在位置的信号值分别为 1152、3155、2692、1058、991，均大于600；信噪比分别为4、9、8、4、4，均大于3， 所以将探针1、4、5、6、9判为阳性。B中探针6所在位置的信号值分别为723，大于600； 信噪比为9，可以判定探针6为阳性。C无信号。因此，苹果锈果类病毒属类病毒筛查 芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为10²。

PCR检测的引物为

上游引物：5’-GGTAAACACCGTGCGGTCCC-3’；

下游引物：5’-GGGAAACACCTATTGTGTTT-3’，

上述引物中方框内碱基为保护碱基，斜体碱基为酶切位点BamHI碱基，下划线碱 基为苹果锈果类病毒序列。

PCR检测的结果如图5所示，1：10⁰稀释；2：10¹稀释；3：10²稀释；4：10³稀释； 5：空白对照；M：Marker DL2000，可以看出，10⁰、10¹和10²稀释模板均得到355bp 的产物（苹果锈果类病毒Genbank号HQ840722的第1-330位核苷酸），待检对象的最高 稀释倍数为10²。

因此，苹果锈果类病毒属类病毒筛查芯片检测灵敏度与PCR方法灵敏度相当。