用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法

摘要

本发明涉及用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法，尤其涉及检测结肠直肠癌特异性标志物基因的方法，该基因在结肠直肠癌细胞中被特异性地甲基化，从而为诊断结肠直肠癌提供信息。用于检测甲基化的所述创造性方法和用于诊断结肠直肠癌的所述创造性组合物、试剂盒以及核酸芯片的应用，使得在转化早期诊断结肠直肠癌成为可能，从而能够在早期诊断结肠直肠癌。另外，所述创造性方法使结肠直肠癌能以与传统方法相比更准确而快速的方式有效地诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志 物基因的甲基化的方法，尤其涉及检测结肠直肠癌特异性标志物基因的方法， 该基因在结肠直肠癌细胞中被特异性地甲基化，从而为诊断结肠直肠癌提供信 息。

背景技术

即便是在医学科学进步的当今时代，癌症患者，尤其是实体瘤患者（不同 于血液癌患者）的5年生存率也低于50%，且全部癌症患者中的大约2/3都在 晚期确诊，并且几乎全都在癌症诊断后的两年内去世。癌症治疗中这样的糟糕 结果不仅是治疗方法的问题，还归因于早期癌症诊断、晚期癌症的确诊以及对 癌症治疗后癌症患者的后续追踪的不易。

目前的临床实践中，经病史询问、身体检查和临床评估，如果疑似患有癌 症，再以放射线检测和内窥镜检查，之后才通过组织活检确诊为癌症。然而， 只有当癌细胞数量超过十亿，且癌直径大于1cm时，通过现有的临床实践诊 断癌症才是可能的。这种情况下，癌细胞已经具备了转移能力，并且其中至少 半数已经转移。同时，用于监测由癌症直接或间接产生的物质的肿瘤标志物被 用于癌症筛查，但它们由于准确性有限会造成干扰，因为其中多达半数的肿瘤 标志物甚至在癌症存在的情况系下也表现为正常，却经常在甚至未患癌症的情 况下表现为阳性。另外，主要用于癌症治疗的抗癌剂具有只在癌体积较小时才 有效的问题。

癌症难以诊断和治疗的原因在于，癌细胞的高度复杂性和可变性。癌细胞 过度且持续生长，侵害周围组织，并转移至远端器官，导致死亡。尽管有免疫 机制的攻击或抗癌治疗，癌细胞依然存活，持续发展，且最适于存活的细胞群 选择性繁殖。癌细胞是具有高度生存力的活体，它的发生是由大量基因的突变 所致。为使一个细胞转变成癌细胞，并发展成临床可检测的恶性癌瘤块，必须 发生大量基因突变。因此，为了从根本上诊断和治疗癌症，需要基因水平的治 疗途径。

近来，人们积极地尝试遗传分析技术来诊断癌症。最简单的典型方法是用 PCR检测血液中ABL：BCR融合基因（白血病的遗传特征）的存在。该方法 准确率超过95%，且在使用这一简单易行的遗传分析来诊断和治疗慢性粒细胞 白血病后，该方法还被用于结果评估和后续研究。然而，该方法的缺陷在于， 其只能用于某些血液癌。

此外，还尝试过另一种方法，其中使用RT-PCR和印迹技术来检测癌细胞 表达基因的存在，从而诊断血细胞中癌细胞的存在。然而，该方法的缺点在于， 它只能用于一些癌症，包括前列腺癌和黑色素瘤，且假阳性率高。另外，该方 法中难以标准化检测和读取，其效用也有限（Kopreski,M.S.et al.,Clin.Cancer  Res.,5:1961,1999;Miyashiro,I.et al.,Clin.Chem.,47:505,2001）。

近来，人们积极地尝试了使用血清或血浆中DNA的基因检测方法。这是 一种检测癌症相关基因的方法，所述癌症相关基因分离自癌细胞并释放入血液 中，并在血清中以游离DNA形式存在。据发现，实际癌症患者血浆中DNA 的浓度是正常人的5-10，这些增加的DNA大多数由癌细胞释放。利用这些分 离自癌细胞的DNA，分析癌症特异性基因的异常，例如突变、缺失以及原癌 基因（oncogene）和肿瘤抑制基因的功能缺失，可以诊断癌症。在这方面，人 们已有积极的尝试，通过检测血清中突变K-Ras原癌基因、p53肿瘤抑制基因 和p16基因的启动子甲基化，以及微卫星的标记和不稳定性，用以诊断肺癌、 头颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌及肝癌(Chen,X.Q.et al.,Clin.Cancer Res.,5:2297, 1999;Esteller,M.et al.,Cancer Res.,59:67,1999;Sanchez-Cespedes,M.et al., Cancer Res.,60:892,2000;Sozzi,G.etal.,Clin.Cancer Res.,5:2689,1999)。

同时，在除血液之外的样品中也能检测到癌细胞的DNA。在一种已尝试 的方法中，通过基因或抗体测试来检测肺癌患者的痰或支气管肺泡灌洗液中癌 细胞或原癌基因的存在(Palmisano,W.A.et al.,Cancer Res.,60:5954,2000; Sueoka,E.et al.,Cancer Res.,59:1404,1999)。另外，已有检测结肠和直肠癌患 者粪便中原癌基因的存在(Ahlquist,D.A.et al.,Gastroenterol.,119:1219-27, 2000)和检测尿液和精液中启动子甲基化异常(Goessl,C.et al.,Cancer Res., 60:5941,2000)的其他方法的尝试。然而，为了准确地诊断导致大量基因异常并 表现出各种癌症不同的突变特征的癌症，需要一种以准确且自动化的方式同时 分析大量基因的方法。然而，上述方法尚未建立。

因而，最近提出了通过检测DNA甲基化来诊断癌症的方法。当某基因的 启动子CpG岛高度甲基化时，该基因的表达沉默(silenced)。这被解释为该基 因丧失功能的主要机制，即便活体中所述基因的蛋白质编码序列并无突变。另 外，这也被分析为是导致人类癌症中一些肿瘤抑制基因功能丧失的因素。因此， 对肿瘤抑制基因启动子CpG岛的甲基化分析非常有助于癌症研究。已有通过 例如甲基化特异性PCR（下文中称为“MSP”）或自动碱基测序的方法来分 析所述启动子CpG岛的甲基化，并将分析结果用于癌症诊断和筛查的积极尝 试。

相当数量的疾病是由基因异常造成的，而基因异常最常见的形式是基因编 码序列的改变。这种遗传性改变称为突变。当任何基因中发生突变时，该基因 编码的蛋白质的结构和功能发生改变，导致异常和缺失，并且该突变的蛋白质 会引起疾病。然而，特定基因的表达异常也会引起疾病，即便所述基因中并未 发生突变。这其中一个典型的例子是甲基化，其中甲基偶联至基因的转录调控 区域，即所述启动子CpG岛的胞嘧啶碱基，这种情况下，所述基因的表达沉 默。这就是所谓的表观遗传变化（epigenetic change）。这种变化传递给后代， 导致相关蛋白质以与突变相同的方式表达缺失。最典型地，癌细胞中肿瘤抑制 基因由于启动子CpG岛的甲基化而表达沉默，导致癌变(Robertson,K.D.et al., Carcinogensis,21:461,2000)。

对于癌症确诊而言，重要的是不仅检测突变基因，而且检测该基因发生突 变的机制。之前的研究集中于编码序列中的突变，即微观变化，例如点突变、 缺失和插入，或宏观的染色体异常。然而，近年来，表观遗传变化据报导与这 些突变同等重要，所述表观遗传变化的典型例子是所述启动子CpG岛的甲基 化。

哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了A，C，G和T外还有第五种碱基， 即5-甲基胞嘧啶，其中甲基偶联到所述胞嘧啶环的第5个碳上（5-mC）。5-mC 总是只与CG二核苷酸中的C偶联（5'-mCG-3'），这常被标识为CpG。CpG 的C通常由于偶联着甲基而被甲基化。这种CpG的甲基化抑制了基因组中重 复序列，例如Alu或转座子，的表达。另外，这种CpG是哺乳动物细胞中表 观遗传变化最频发的位点。这种CpG的5-mC经天然脱氨成为T，因而哺乳动 物基因组中的所述CpG仅表现出1%的频率，远远低于正常频率(1/4x 1/4=6.25%)。

CpG异常集中的区域被称为CpG岛。所述CpG岛是指长度在0.2-3kb， C+G含量超过50%，且CpG比例高于3.75%的位点。人类基因组中约有45,000 个CpG岛，大多见诸于调控基因表达的启动子区域。实际上，CpG岛存在于 占人类基因约50%的管家基因（housekeeping gene）的启动子上(Cross,S.et al., Curr.Opin.Gene Develop.,5:309,1995)。

同时，正常人的体细胞中，这种管家基因启动子位点的CpG岛是未甲基 化的，而印记基因（imprinted gene）和失活的X染色体上的基因被甲基化， 使所述基因在发育过程中不表达。

致癌过程中，甲基化见诸于启动子CpG岛中，并限制相应基因的表达。 特别地，如果甲基化发生在肿瘤抑制基因的启动子CpG岛中，所述基因调控 细胞周期或凋亡，修复DNA，参与细胞粘着和细胞间相互作用，和/或抑制细 胞侵袭和转移，则这种甲基化以与编码序列的突变相同的方式阻断了所述基因 的表达和功能，从而促进了癌症的发生发展。另外，由于衰老所述CpG岛中 还会发生部分甲基化。

一个有趣的事实是，在基因突变会导致先天癌症的癌症发展但所述基因的 突变不会发生在获得性癌症中的情况下，所述基因的启动子CpG岛的甲基化 代替了突变。典型的例子包括所述基因的启动子甲基化，例如获得性肾癌 VHL(von Hippel Lindau)、乳腺癌BRCA1、结肠直肠癌MLH1以及胃癌E-CAD。 另外，所有癌症中的约半数均发生了p16启动子甲基化或Rb突变，而其余癌 症则表现出p53突变或p73、p14及类似基因的启动子甲基化。

一个重要的事实是，启动子甲基化引起的表观遗传变化导致了遗传变化 （即，编码序列突变），并且癌症的发展被所述遗传和表观遗传变化的结合共 同推进。例如在MLH1基因中，存在如下情况：在结肠直肠癌细胞中MLH1 基因的一个等位基因由于基因突变或缺失而功能丧失，而剩下的一个等位基因 由于启动子甲基化而不发挥功效。另外，如果MLH1，即一种DNA修复基因， 的功能由于启动子甲基化而丧失，则其他重要基因的突变发生有助于促进癌症 的发展。

大多数癌症表现出与CpG有关的三种共性，即，肿瘤抑制基因的启动子 CpG岛的高度甲基化，剩余CpG碱基位点的低甲基化（hypomethylation）， 以及甲基化酶即DNA胞嘧啶甲基转移酶（DNMT）的活性增加(Singal,R.& Ginder,G.D.,Blood,93:4059,1999;Robertson,K.etal.,Carcinogensis,21:461, 2000;Malik,K.&Brown,K.W.,Brit.J.Cancer,83:1583,2000)。

当启动子CpG岛被甲基化时，相应基因的表达被阻断的原因并未清楚地 建立起来，但据推测是因为甲基化CpG结合蛋白（MECP）或甲基化CpG结 合域蛋白（MBD）以及组蛋白去乙酰化酶与甲基化的胞嘧啶相结合，从而造 成染色体的染色质结构改变和组蛋白改变。

究竟启动子CpG岛甲基化是直接造成癌症的发展，还是作为癌症发展后 的次生变化仍然未确定。然而，明确的是，肿瘤相关基因的启动子甲基化是癌 症的重要指标，并因而能用于许多应用，包括癌症的诊断和早期检测、癌症发 展风险的预估、癌症预后、治疗后的后续检查以及对抗癌治疗反应的预估。近 来，人们进行了积极尝试，检查血液、痰、唾液、粪便或尿液中的肿瘤相关基 因的启动子甲基化，并将检查结果用于各种癌症的诊断和治疗(Esteller,M.et  al.,Cancer Res.,59:67,1999;Sanchez-Cespedez,M.et al.,Cancer Res.,60:892, 2000;Ahlquist,D.A.et al.,Gastroenterol.,119:1219,2000)。

为了使利用启动子甲基化的癌症诊断的准确性最大化，根据各个阶段分析 癌症的发展，并区分根据癌症和老化发生的变化，需要能够准确分析启动子 CpG岛的所有胞嘧啶碱基的甲基化的检查。目前，该检查的标准方法是亚硫 酸盐基因组测序法，其中，样品DNA经亚硫酸氢钠处理，待检测靶基因的CpG 岛的所有区域通过PCR扩增，接着分析扩增区域的碱基序列。然而，这种检 查的问题在于，一定时间内能被检查的基因或样品数量有限。另外的问题在于， 自动化很难，且需要大量的时间和费用。

在约翰·霍普金斯大学医学院（Johns Hopkins School of Medicine）、MD 安德森癌症中心（the MD Anderson Cancer Center）、柏林夏丽忒大学医学院 （Charité-Berlin）等中，关于癌症相关基因的启动子甲基 化的研究开展活跃。由此获得的基础数据通过DNA甲基化协会（DMS）互相 交换，并存储于MethDB(http://www.methdb.de)中。同时，EpiGenX Pharmaceuticals公司目前正开发与CpG岛甲基化相关的治疗剂，而 Epigenomics公司目前正致力于研究通过使用不同的技术，例如DNA芯片和 MALDI-TOF来检测启动子甲基化，以将启动子甲基化应用于癌症诊断。

相应地，本发明的发明者们付出了大量的努力来开发有效的结肠直肠癌特 异性甲基化标志物，该标志物使癌症和癌变风险的早期诊断以及癌症预后的预 测成为可能。结果，本发明的发明者们发现，SDC2(NM_002998,多配体蛋白 聚糖2（Syndecan2)),SIM1(NM_05068,单意同源物1（Single-minded homolog 1)(果蝇)以及SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3 （Sortilin-related VPS10domain containing receptor 3）)的基因在结肠直肠癌细 胞中被特异性甲基化，且利用这些基因作为生物标志物，通过检测甲基化程度， 可以诊断结肠直肠癌，由此完成了本发明。

发明内容

本发明的一个主要目标是提供一种结肠直肠癌特异性的甲基化生物标志 物，所述标志物在结肠直肠癌细胞中特异性甲基化，并能有效地用于结肠直肠 癌诊断，以及所述标志物在为结肠直肠癌的早期诊断提供信息中的用途。

本发明的另一个目标是一种检测SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2), SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇)以及SORCS3(NM_014978,分拣蛋白 相关的含VPS10域的受体3)基因的甲基化的方法，所述基因的甲基化为结肠 直肠癌特异性的甲基化生物标志物，以及利用同样的方法来诊断结肠直肠癌的 试剂盒和核酸芯片。

为了实现上述目标，本发明提供了一种检测用于结肠直肠癌诊断的结肠直 肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法，所述方法包括步骤：

（a）制备包含DNA的临床样品；以及

（b）检测所述临床样品DNA中的至少一个如下基因的CpG岛的、或者 所述至少一个基因的启动子CpG岛的甲基化：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

本发明还提供了一种用于诊断结肠直肠癌的组合物，所述组合物包含至少 一个如下基因的CpG岛、或者所述至少一个基因的启动子CpG岛：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

本发明提供了一种通过检测结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基 化以诊断结肠直肠癌的方法，所述方法包括步骤：

（a）制备包含DNA的临床样品；以及

（b）如果所述临床样品DNA中的至少一个如下基因的CpG岛或所述至 少一个基因的启动子CpG岛被检测为甲基化，则诊断所述临床样品为结肠直 肠癌或结肠直肠癌进展期（progression stage）：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

本发明还提供了至少一个如下基因的CpG岛或所述至少一个基因的启动 子CpG岛在结肠直肠癌诊断中的用途：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

本发明还提供了用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，其包含：用于扩增包含至 少一个如下基因的CpG岛的、或者所述至少一个基因的启动子CpG岛的片段 的PCR引物对；以及

用于对通过所述引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)

本发明还提供了用于诊断结肠直肠癌的核酸芯片，所述芯片上固定有探 针，所述探针能与包含至少一个如下基因的CpG岛的、或者所述至少一个基 因的启动子CpG岛的片段在严格的条件下杂交：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)

本发明的其他特征和实施方式将在后面详细的说明和所附权利要求书中 更加明确。

附图简要说明

图1是显示通过CpG微阵列从正常人和结肠直肠癌患者尿液细胞中发现 甲基化生物标志物的过程的示意图。

图2是显示从所述结肠直肠癌微阵列数据中筛选结肠直肠癌特异性高度 甲基化基因的过程的示意图。

图3是显示通过焦磷酸测序检测结肠直肠癌细胞系和正常人结肠直肠组 织中的7个生物标志物候选基因的甲基化程度的结果图表。

图4是显示通过焦磷酸测序检测结肠直肠癌组织和相邻正常组织中3个甲 基化生物标志物的甲基化程度的结果图表。

图5是显示通过ROC曲线分析检测3个结肠直肠癌甲基化生物标志物的 灵敏性和特异性，以评价所述生物标志物诊断结肠直肠癌的能力的结果图表。

图6显示了通过甲基化特异性PCR来证实正常人和结肠直肠癌患者的排 泄物组织中SDC2生物标志物基因的甲基化结果（圆圈：甲基化特异性PCR 产物）。

发明的最佳实施方式

除非另有限定，本文所用的所有技术和科技术语与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的意思相同。总的来说，本文所用的术语众所周知，并 为本领域所通用。

本发明的特征在于，将SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2),SIM1 (NM_05068,单意同源物1)(果蝇)以及SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的 含VPS10域的受体3)基因的CpG岛用作生物标志物，所述CpG岛在结肠直 肠癌细胞中被特异性甲基化。

一方面，本发明致力于一种用于诊断结肠直肠癌的组合物，所述组合物包 含至少一个如下基因的CpG岛或所述至少一个基因的启动子CpG岛：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

在本发明中，所述CpG岛可以位于所述基因的内含子区域内。这里，所 述SDC2基因的内含子区域可位于距离转录起始位点+681到+1800核苷酸（nt） 之间，并可包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。另外，所述SORCS3基因的内 含子区域可位于距离转录起始位点的+851到+2000核苷酸（nt）之间，并可包 含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

而且，所述CpG岛可以位于所述基因的启动子区域。这里，所述SIM1 基因的启动子区域可位于距离转录起始位点-1500到-501核苷酸（nt）之间， 并可包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

在本发明中，筛选到在正常人和结肠直肠癌患者之间表现出甲基化程度差 异最大的7个生物标志物候选基因，这些基因中，SDC2,SIM1和SORCS3基 因被证实能够用于诊断结肠直肠癌。根据本发明的用于筛选甲基化标志物基因 的方法包含步骤：（a）从转化细胞和非转化细胞中分离基因组DNA；（b） 将所述分离的基因组DNA与甲基化DNA结合蛋白反应，从而分离出甲基化 DNA；以及（c）扩增所述甲基化DNA，将所述扩增后的DNA与CpG微阵列 杂交，接着选取在所述正常细胞和所述癌细胞之间表现出甲基化程度差异最大 的基因，从而确定甲基化标志物基因。

上述用于筛选生物标志物基因的方法能够发现在结肠直肠癌中，以及在进 展成结肠直肠癌的组织的不同异常发育阶段中的差别化甲基化基因。所述筛选 出的基因能够用于结肠直肠癌筛查、风险评估、预后、疾病鉴定、疾病阶段诊 断以及治疗靶标选取。

鉴定在结肠直肠癌中被甲基化的基因以及在结肠直肠癌不同阶段的异常， 使得在早期以准确而有效的方式诊断结肠直肠癌成为可能，并允许对多基因进 行甲基化分析（profiling），以及鉴定用于治疗性干预的新靶标。此外，根据 本发明的甲基化数据可与其他非甲基化相关的生物标志物检测方法联合使用， 以获得更准确的结肠直肠癌诊断体系。

根据本发明的方法，通过确定来自样品的一个或多个核酸生物标志物的甲 基化阶段，可以诊断不同阶段或时期的结肠直肠癌的进展。通过将分离自处于 结肠直肠癌各阶段的样品的核酸的甲基化阶段与分离自无结肠直肠组织细胞 增殖异常的样品中的一个或多个核酸的甲基化阶段进行比较，能够检测所述样 品中结肠直肠癌的特定阶段。这里，所述甲基化阶段可以是高度甲基化。

在本发明的一个实施方式中，核酸可以在基因调控区域被甲基化。在另一 个实施方式中，通过检测基因调控区域外的甲基化，可以早期诊断与细胞转化 相关的基因，因为甲基化是从基因外部向内部发展的。

在本发明的另一个实施方式中，利用甲基化标志物基因能够早期诊断有可 能形成结肠直肠癌的细胞。当证实为在癌细胞中被甲基化的基因在临床上或形 态上看似正常的细胞中被甲基化时，这就表明所述看似正常的细胞在向癌症发 展。因此，通过检测看似正常的细胞中的结肠直肠癌特异性基因的甲基化，可 以在早期诊断结肠直肠癌。

使用本发明的甲基化标志物基因允许检测样品中结肠直肠组织的细胞增 殖异常（发育异常）。所述检测方法包括将包含至少一种分离自对象的核酸与 至少一种能够测定所述核酸甲基化状态的试剂接触。所述方法包括检测至少一 种核酸中的至少一个区域的甲基化，其中所述核酸的甲基化不同于无异常生长 （发育异常的进程）的结肠直肠细胞样品中的相同核酸区域的甲基化状态。

在本发明的另一个实施方式中，组织发展成结肠直肠癌的可能性可以通过 检查在结肠直肠癌中被特异性甲基化的基因的甲基化，以及测定有可能发展成 结肠直肠癌的组织的甲基化频率来评估。

因此，另一方面，本发明致力于一种用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直 肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法，所述方法包含步骤：

（a）制备包含DNA的临床样品；以及

（b）检测所述临床样品DNA中的至少一个如下基因的CpG岛的、或者 所述至少一个基因启动子CpG岛的甲基化：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)

在本发明中，步骤（b）可以通过检测所述基因内含子区域内的CpG岛的 甲基化来实施。这里，所述SDC2基因的内含子区域可位于距离转录起始位点 +681到+1800核苷酸（nt）之间，并可包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。另 外，所述SORCS3基因的内含子区域可位于距离转录起始位点+851到+2000 核苷酸（nt）之间，并可包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

此外，所述CpG岛可位于所述基因的启动子区域。这里，所述SIM1基 因的启动子区域可位于距离转录起始位点-1500到-501核苷酸（nt）之间，并 可包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

在本发明中，步骤（b）可以通过选自由PCR、甲基化特异性PCR、实时 甲基化特异性PCR、利用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR试验、定量PCR、 基于DNA芯片的试验、焦磷酸测序以及亚硫酸盐测序组成的组中的方法来实 施。另外，所述临床样品可选自由来自疑似癌症患者或待诊断对象的组织、细 胞、血液、血浆、粪便以及尿液组成的组，但不限于此。

在本发明的一个实施方式中，用于检测基因的甲基化的方法包含：（a） 制备包含DNA的临床样品；（b）从所述临床样品中分离DNA；（c）利用能 够扩增包含SDC2,SIM1和SORCS3基因中任何一个或多个的启动子或内含子 的CpG岛片段的引物来扩增所述分离的DNA；以及（d）基于所述DNA在步 骤（c）中是否被扩增，确定所述内含子是否被甲基化。

在本发明的另一个实施方式中，样品中结肠直肠组织细胞增殖异常（发育 异常）可利用试剂盒通过检测如下基因的甲基化状态来诊断：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

因此，另一方面，本发明致力于一种用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，所述 试剂盒包含：用于扩增包含至少一个如下基因的CpG岛的、或所述至少一个 基因的启动子CpG岛的片段的PCR引物对；以及

用于对通过所述引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

本发明中，所述PCR引物对可选自由SEQ ID NO:12和13引物对、SEQ ID NO:14和15引物对以及SEQ ID NO:16和17引物对所组成的组。

本发明中，所述测序引物可选自由SEQ ID NO:22到24的引物组成的组。

本发明的另一个实施方式中，样品中结肠直肠组织细胞的细胞增殖异常 （发育异常）可利用核酸芯片通过检测如下基因的甲基化状态来诊断。

因此，另一方面，本发明致力于一种用于诊断结肠直肠癌的核酸芯片，所 述芯片上固定有探针，所述探针能够与包含至少一个如下基因的CpG岛的、 或所述至少一个基因的启动子CpG岛的片段在严格的条件下杂交：

(i)SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2);

(ii)SIMI(NM_05068,单意同源物1)(果蝇);以及

(iii)SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的含VPS10域的受体3)。

在本发明中，所述CpG岛可位于所述基因的内含子区域。这里，所述SDC2 基因的内含子区域可位于距离转录起始位点+681到+1800核苷酸（nt）之间， 并可包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。另外，所述SORCS3基因的内含子区 域可位于距离转录起始位点+851到+2000核苷酸（nt）之间，并可包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。而且，所述CpG可位于所述基因的启动子区域。这里， 所述SIM1基因的启动子区域可位于距离转录起始位点-1500到-501核苷酸（nt） 之间，并可包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

本发明中，所述探针可选自由SEQ ID NO:33到44所示的碱基序列组成 的组，其中特定的例子如下：

SDC2

1)5'-tgggtcgggc ccgcgaggga acggc-3'(SEQ ID NO:33)

2)5'-ggggggagcc tgggtcgggc ccgcgaggga acggctccac-3'(SEQ ID NO:34)

3)5'-tcgccctcgg cgggtcttgc tgcgtggtct gggaaggacg gaggggaaag-3'(SEQ ID NO: 35)

4)5'-ggggtccctt cctccgcaca ccatcccccc cgcgccagct ttcctgtttg actgcatgca agttctgggg agatgggggc cagatttaag agacccgcga-3'(SEQ ID NO:36)

SIM1

1)5'-gatgggcgcc cccgaaacct ctgcc-3'(SEQ ID NO:37)

2)5'-gccccgcgcc cgcccagcag ccccgcagct ccgcggtggt-3'(SEQ ID NO:38)

3)5'-gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga-3'(SEQ ID NO:39)

4)5'-gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga acagttaaga

gatgggcgcc cccgaaacct ctgccgcttg tggggactga-3'(SEQ ID NO:40)

SORCS3

1)5'-cgagaggtgg cgtcgttgag cccgg-3'(SEQ ID NO:41)

2)5'-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3'(SEQ ID NO:42)

3)5'-cgagaggtgg cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3'(SEQ ID NO: 43)

4)5'-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac tgggcgcccg actgagcatc gcgcctgcct ggcagctgca gcggcccgca gcgcgtgccc ggaggggctc-3'(SEQ ID NO:44)

使用本发明的诊断试剂盒或核酸芯片使得确定样品中结肠直肠组织细胞 的异常生长（发育异常进程）成为可能。所述方法包括确定分离自样品中的至 少一种核酸的甲基化状态，其中所述至少一种核酸的甲基化状态与分离自无异 常生长（发育异常进程）的结肠直肠细胞的样品中的核酸分子的甲基化状态进 行比较。

在本发明的另一个实施方式中，转化的结肠直肠癌细胞可利用所述试剂盒 或核酸芯片通过检查所述标志物基因的甲基化来检测。

在本发明的又一个实施方式中，结肠直肠癌可利用所述试剂盒或核酸芯片 通过检查所述标志物基因的甲基化来诊断。

在本发明的再一个实施方式中，所述发展成结肠直肠癌的可能性可利用所 述试剂盒或核酸芯片通过检查表现出正常表型的样品中的标志物基因的甲基 化来诊断。用于本发明的样品可以是固体或液体组织、细胞、粪便、尿液、血 清或血浆。

本文所用的主要术语定义如下。

如本文所用，术语“细胞转化”指细胞特征从一种形式到另一种形式的改 变，例如从正常变成异常，非肿瘤性的变成肿瘤性的，未分化的变成分化的， 干细胞变成非干细胞。另外，所述转化可通过细胞形态、表型、生化特征以及 类似特征的来识别。

如本文所用，术语癌症的“早期检测”指在转移之前发现癌症的可能性， 优选是在观察到组织或细胞中的形态改变之前。另外，术语细胞转化的“早期 诊断”指在细胞被形态学认定为转化之前的早期所述细胞发生转化的高度可能 性。

如本文所用，术语“高度甲基化”指CpG岛的甲基化。

如本文所用，术语“样品”或“临床样品”指其最广泛的含义，并包括获 自个体、体液、细胞系、组织培养物的任何生物样品，这取决于所要实施的试 验类型。从哺乳动物中获取组织切片和体液的方法为本领域所公知。结肠直肠 组织的切片（biospy）是优选来源。

结肠直肠癌生物标志物—癌细胞中与正常细胞中比较的应用

本发明中，“正常”细胞指未表现出任何异常形态学或细胞学变化的细胞。 “肿瘤”细胞是癌细胞。“非肿瘤”细胞是病变组织的一部分，但并不认为是 肿瘤部分的那些细胞。

一方面，本发明是基于对结肠直肠癌与SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚 糖2),SIM1(NM_05068,单意同源物1)(果蝇)以及SORCS3(NM_014978,分拣蛋 白相关的含VPS10域的受体3)基因的高度甲基化之间的关系的发现。

在本发明的另一个实施方式中，利用本发明的试剂盒或核酸芯片通过确定 来自对象的至少一种核酸的甲基化阶段，可早期诊断结肠直肠组织细胞的细胞 增殖异常。这里，所述至少一种核酸的甲基化阶段可与分离自不含结肠直肠组 织细胞增殖异常的对象的至少一种核酸的甲基化状态进行比较。所述核酸优选 是包含CpG例如CpG岛的核酸。

在本发明的另一个实施方式中，结肠直肠组织细胞增殖异常可利用本发明 的试剂盒或核酸探针，通过确定来自对象的至少一种核酸的甲基化来诊断。这 里，所述核酸可以是选自SDC2(NM_002998,多配体蛋白聚糖2)基因,SIM1 (NM_05068,单意同源物1)(果蝇)基因,SORCS3(NM_014978,分拣蛋白相关的 含VPS10域的受体3)基因，以及上述基因的组合，中的至少一种。在该实施 方式中，所述至少一种核酸的甲基化可与分离自不具有结肠直肠组织细胞增殖 异常倾向的对象的至少一种核酸的甲基化状态进行比较。

如本文所使用，“倾向”指容易发生细胞增殖异常的特性。具有细胞增殖 异常倾向的对象还没有细胞增殖异常，但该对象发生细胞增殖异常的可能性较 高。

另一方面，本发明提供了一种诊断结肠直肠组织细胞增殖异常的方法，所 述方法包括：将包含核酸的样品与能够确定所述样品的甲基化状态的试剂相接 触，并确定所述至少一种核酸的至少一个区域的甲基化。这里，所述至少一种 核酸的至少一个区域的甲基化不同于无异常生长细胞的对象中存在的相同核 酸区域的甲基化阶段。

本发明的方法包含确定分离自对象的至少一种核酸的至少一个区域的甲 基化的步骤。

本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸，核苷酸或多核苷 酸，或它们的片段，或者基因组或合成来源的单链或双联DNA或RNA，基因 组或合成来源的正义链或反义链DNA或RNA，肽核酸（PNA），或任何天然 或合成来源的类DNA或类RNA材料。对本领域技术人员而言显而易见的是， 当所述核酸是RNA时，脱氧核糖核苷酸A，G，C和T分别被核糖核苷酸A， G，C和U替代。

任何核酸均可用于本发明，只要其中差别化甲基化的CpG岛的存在可被 检测到。所述CpG岛是核酸序列中富含CpG的区域。

甲基化

本发明中，任何核酸样品，纯化或非纯化形式的，均可使用，只要其包含 或疑似包含含有靶位点的核酸序列（例如包含CpG的核酸）。一种能够被差 别化甲基化的核酸区域是CpG岛，即一种相对于其他核酸区域来说CpG二核 苷酸的密度较高的核酸序列。所述CpG二核苷酸在脊椎动物DNA中的出现机 率仅为由G*C碱基对的比例预测得到的机率的大约20%。在某些区域中，CpG 二核苷酸的密度达到预测值；相对于所述基因组的其他区域，密度增加了十倍。 与主体DNA（bulk DNA）中40%的平均G*C含量相比，CpG岛的平均G*C 含量约为60%。所述CpG岛采取典型地约1-2千个碱基长度的DNA延伸 （stretches）形式。人类基因组中约有45,000个CpG岛。

许多基因中，所述CpG岛始于启动子的紧上游，并向下游延伸至转录区 域。启动子处的CpG岛的甲基化通常抑制了所述基因的表达。所述CpG岛也 可位于所述基因的编码区域的5'区域以及3'区域附近。因此，CpG岛可见诸于 核酸序列的多个区域，包括：在处于包含启动子区域的调控区域内的编码序列 的上游，在编码区域中（例如外显子），在处于例如增强子区域内的编码区域 的下游，，以及在内含子中。

典型地，所述包含CpG的核酸是DNA。然而，本发明的方法可采用，例 如包含DNA的样品，或者含mRNA的DNA和RNA样品，其中DNA或者 RNA可为单链或双链，或者所述样品可包括DNA-RNA杂交体。

还可使用核酸混合物。待检测的特异性核酸序列可以是较大分子的片段， 或者可以最初以不连续的分子存在，由此所述特异性序列构成了完整的核酸。 待研究的序列最初不必以纯的形式存在；所述核酸可以是复杂混合物的较小片 段，例如包含在整个人类DNA中。包含在用来检测甲基化CpG岛的样品中的 核酸可通过不同的技术提取，例如由Sambrook等人描述的方法(Molecular  Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。

分离自对象的核酸从所述对象的生物样品中获得。如果希望检测结肠直肠 癌或结肠直肠癌的进展阶段，可通过刮取或切片方式从结肠直肠组织中分离所 述核酸。这种样品可通过本领域技术人员已知的多种医疗程序获取。

在本发明的一方面中，获自对象的样品中的核酸的甲基化状态与没有结肠 直肠组织细胞增殖异常的对象中的相同核酸区域相比较，发生了高度甲基化。 如本文所使用的高度甲基化是指在一种或多种核酸中甲基化等位基因的存在。 当检查相同的核酸时，来自没有结肠直肠组织细胞增殖异常的对象的核酸中不 含可检测到的甲基化等位基因。

单个基因和基因组合

可以理解，本发明的实践可以分别将每个基因作为诊断或预后标志物，也 可以将几个标志物基因组合成基因组合显示的形式，以便可以检测数个标志物 基因而获得甲基化基因的总览图或列表，从而增加可靠性和效率。另外，本发 明中鉴定的任何基因都可单独使用，或者作为一组基因，与本文所引用的任何 其他基因以任意的组合使用。或者，可根据基因的重要性排位和加权，并结合 发生甲基化的基因的数量，指定癌症发展的可能性水平。这种算法处于本发明 保护范围之内。

检测甲基化的方法

甲基化特异性PCR

当基因组DNA经亚硫酸盐处理时，如果被甲基化，5'-CpG'-3区域的胞嘧 啶保持完整，但如果未被甲基化，胞嘧啶就转变成尿嘧啶。据此，基于亚硫酸 盐处理后转变的碱基序列，构建与具有5'-CpG-3'碱基序列的区域对应的PCR 引物组。这里，所构建的引物组有两种引物组：对应于甲基化碱基序列的引物 组，以及对应于非甲基化碱基序列的引物组。当基因组DNA经亚硫酸盐转变， 然后使用上述两种引物组通过PCR扩增时，如果所述基因组DNA被甲基化， 则使用对应于甲基化碱基序列的引物的PCR混合物中可以检测到所述PCR产 物，但如果所述基因组DNA未被甲基化，则使用对应于非甲基化碱基序列的 引物的PCR混合物中可以检测到所述基因组DNA。该甲基化可通过琼脂糖凝 胶电泳定量分析。

实时甲基化特异性PCR

实时甲基化特异性PCR是一种由甲基化特异性PCR方法改良得到的实时 检测方法，包括用亚硫酸盐处理基因组DNA，设计对应于所述甲基化碱基序 列的PCR引物，以及使用该引物进行实时PCR。检测基因组DNA甲基化的 方法包括两种：一种是使用与扩增的碱基序列互补的Tanman探针来检测的方 法；以及另一种是使用Sybergreen检测的方法。因此，所述实时甲基化特异性 PCR允许对甲基化的DNA进行选择性定量分析。这里，使用体外甲基化的 DNA样品绘制标准曲线，并且还扩增了碱基序列中不含5'-CpG-3'序列的基因， 作为阴性对照组的标准用于定量分析所述甲基化程度。

焦磷酸测序

所述焦磷酸测序法是一种由亚硫酸盐测序法改良而来的定量实时测序方 法。与亚硫酸盐测序法类似，基因组DNA经亚硫酸盐处理转化，接着构建与 不含5'-CpG-3'碱基序列的区域对应的PCR引物。具体地，所述基因组DNA 经亚硫酸盐处理，使用所述PCR引物扩增，然后使用测序引物进行实时碱基 序列分析。通过分析5'-CpG-3'区域中的胞嘧啶和胸腺嘧啶含量，来表示甲基 化的程度以作为甲基化指数。

使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR，定量PCR，以及DNA芯片试 验

当仅特异性结合甲基化DNA的蛋白与DNA混合时，所述蛋白仅特异性 结合所述甲基化DNA。因此，使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR或者 使用DNA芯片试验都允许仅选择性地分离甲基化DNA。将基因组DNA与甲 基化特异性结合蛋白混合，然后仅有甲基化DNA被选择性分离出来。所述分 离的DNA利用与所述启动子区域对应的PCR引物进行扩增，接着通过琼脂糖 凝胶电泳检测所述DNA的甲基化。

另外，DNA甲基化还能通过定量PCR方法检测，通过甲基化DNA特异 性结合蛋白分离出来的甲基化DNA能被荧光探针标记，并能与包含互补探针 的DNA芯片杂交，从而测量所述DNA的甲基化。这里，所述甲基化DNA特 异性结合蛋白可以是，但不限于McrBt。

差别化甲基化检测—甲基化敏感的限制性内切酶

差别化甲基化的检测可通过将核酸样品与仅切割非甲基化CpG位点的甲 基化敏感的限制性内切酶相接触而进行。

在一个单独的反应中，将所述样品进一步与所述甲基化敏感的限制性内切 酶的同切酶（isoschizomer）相接触，所述同切酶对甲基化和非甲基化CpG位 点都切割，从而切割甲基化核酸。

将特异性引物添加至所述核酸样品，并通过任意常规方法扩增所述核酸。 经甲基化敏感的限制性内切酶处理的样品中存在扩增产物，但经甲基化敏感的 限制性内切酶的同切酶处理的样品中不存在扩增产物，这表明被试的核酸区域 发生了甲基化。然而，经甲基化敏感的限制性内切酶处理的样品中不存在扩增 产物，与此同时经甲基化敏感的限制性内切酶的同切酶处理的样品中也不存在 扩增产物，这表明被试的核酸区域未发生甲基化。

如本文所使用，术语“甲基化敏感的限制性内切酶”指一种限制性内切酶 （例如SmaI），所述酶包括CG作为其识别位点的一部分，并且当C被甲基 化时，与C不被甲基化的情况相比，所述酶具有活性。所述甲基化敏感的限 制性内切酶的非限制性例子包括MspI,HpaII,BssHII,BstUI以及NotI。这类酶 可以单独或组合使用。其他甲基化敏感的限制性内切酶的例子包括，但不限于 SacII及EagI。

所述甲基化敏感的限制性内切酶的同切酶是一种与所述甲基化敏感的限 制性内切酶识别相同识别位点，但对甲基化和非甲基化CG都切割的限制性内 切酶。所述甲基化敏感的限制性内切酶的同切酶的例子包括MspI。

本发明的引物设计成与待扩增位点的每个链“实质性”互补，并如上所讨 论包括适当的G或C核苷酸。这意味着所述引物在聚合反应条件下必须与其 各自链实质性互补以便杂交。本发明的引物用于所述扩增过程，这是一种酶链 式反应（例如PCR），其中通过若干反应步骤使靶位点呈指数级增加。典型 地，一条引物与所述位点的负（-）链同源（反义引物），另一条引物与正（+） 链同源（正义引物）。当所述引物退火以使核酸变性后，所述核酸链通过酶例 如DNA聚合酶I（Klenow）和反应物例如核苷酸进行延伸，结果，新合成了 包含所述靶位点序列的正链和负链。当所述新合成的靶位点用作模板并经过变 性、引物退火以及延伸的重复循环时，所述靶位点序列发生了指数级的合成。 所得到的反应产物是不连续的核酸双链，该核酸双链的末端对应于所使用的特 异性引物的末端。

所述扩增反应为本领域所通用的PCR。然而，也可使用替代性方法，例 如实时PCR或利用等温酶的线性扩增。另外，也可使用多重扩增反应。

差别化甲基化检测--亚硫酸盐测序法

另一种用于检测包含甲基化CpG的核酸的方法包括步骤：将包含核酸的 样品与修饰非甲基化胞嘧啶的试剂相接触；使用CpG特异性寡核苷酸引物扩 增样品中包含CpG的核酸，其中所述寡核苷酸引物可区分经修饰的甲基化核 酸和非甲基化核酸，并可检测到甲基化核酸。所述扩增步骤是可选的且可取的， 但并不必需。所述方法依靠所述PCR反应以区分经修饰（例如化学修饰）的 甲基化DNA和非甲基化DNA。这种方法在编号为No.5,786,146，涉及用于检 测甲基化核酸的亚硫酸盐测序的美国专利中有描述。

试剂盒

本发明提供了一种用于检测对象中细胞增殖异常的试剂盒。本发明的所述 试剂盒包括分区以在其中容纳样品的载体工具，一个或多个容器，所述容器包 含容纳用于扩增5'-CpG-3'碱基序列的PCR引物的第二容器，和容纳用于对扩 增PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物的第三容器。

载体工具适于容纳一个或多个容器，例如瓶子、试管及类似物，每个所述 容器包含所述方法中用到的一个单独的成分。基于本文提供的对该创造性方法 的描述，本领域技术人员很容易确定所述容器中配备的必要试剂。

基质

在所述靶核酸区域扩增后，所述核酸扩增产物能与附着在固相支持体（基 质）上的已知基因探针杂交，从而检测所述核酸序列的存在。

如这里所使用，术语“基质”，当涉及物质、结构、表面或材料时，是指 包含非生物的、合成的、无生命的、平坦或圆形表面的合成物，所述合成物迄 今为止尚不知道包含特异性结合、杂交或催化识别位点，或多个不同的识别位 点或者超出构成所述表面、结构或材料的不同分子种类的数量的数个不同的识 别位点。所述基质的例子包括，但不限于半导体、合成（有机）金属、合成半 导体、绝缘体和掺杂剂；金属、合金、单质、化合物和矿物质；合成、切割、 蚀刻、印刷、打印、机器加工及微制造的载片、装置、结构和表面；工业聚合 物、塑料、薄膜硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；以及木头、纸、硬纸板、棉、 羊毛、布、纺织和非纺织纤维、材料和纤维织物；以及两性表面。

本领域知晓一些能附着核酸序列的膜类型。这些膜的特殊但非限制性例子 包括硝酸纤维素膜或其他用于检测基因表达的膜，例如聚氯乙烯、重氮化纸以 及其他市场上可买到的膜，例如GENESCREEN^TM、ZETAPROBE^TM (Biorad) 以及NYTRAN^TM。还包括珠、玻璃、晶片以及金属基质。用于将核酸附着在 这些物体上的方法是本领域周知的。或者，可以在液相中进行筛选。

杂交条件

在核酸杂交反应中，用于实现特定严格水平的条件根据被杂交核酸的性质 而有所不同。例如，在选择杂交条件时可考虑核酸杂交区域的长度、互补程度、 核苷酸序列组成（例如，GC/AT含量）以及核酸类型（例如RNA/DNA）。另 外的考虑因素是所述核酸之一是否固定，例如固定在滤纸上。

以下是渐趋严格的条件的例子：2X SSC/0.1%SDS，室温（杂交条件）； 0.2X SSC/0.1%SDS，室温（低严格条件）；0.2X SSC/0.1%SDS，42℃（中 等严格条件）；以及0.1X SSC，68℃（高严格条件）。可以仅用这些条件中 的一种，例如高严格条件，进行清洗，或可每种条件均使用，例如，按上述顺 序各清洗10-15分钟，重复所列步骤中的任意或全部。然而，如上所述，优化 条件根据所涉及的特定杂交条件而有所不同，并可以凭经验确定。通常，高严 格条件用于目的探针的杂交。

标记

所述目的探针可以被可检测地标记，例如用放射性同位素、荧光化合物、 生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物或酶可检测地标记。这些探针 的适当标记为本领域周知，并能通过任意常规的方法实施。

实施例

下文中将参照实施例对本发明做更详细的描述。对本领域普通技术人员而 言，显而易见的是，这些实施例仅起说明的目的，不能理解成对本发明保护范 围的限制。

实施例1：结肠直肠癌特异性甲基化基因的发现

为了筛选在结肠直肠癌中特异性甲基化的生物标志物，将来自2个正常人 的基因组DNA和来自12名结肠直肠癌患者的癌组织和相邻正常组织的基因 组DNA各500ng进行超声处理(Vibra Cell,SONICS)，由此构建约200-300bp 的基因组DNA片段。

为了从所述基因组DNA中仅获取甲基化DNA，使用已知能结合甲基化 DNA的甲基结合域（MBD）(Fraga et al.,NucleicAcidRes.,31:1765,2003)。具 体地，将2μg 6×His标记的MBD2bt与500ng大肠杆菌JM110（No.2638， 生物资源中心，韩国生物科学和生物技术研究院（Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience&Biotechnology））的基因组DNA预先 温育，然后结合到Ni-NTA磁珠(Qiagen，美国)上。将经超声处理的分离自正 常人和结肠直肠癌患者的基因组DNA各500ng，在结合缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5),50mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,3mM MgCl₂,0.1% Triton-X100,5%甘油,25mg/ml BSA)存在的条件下与所述磁珠于4℃反应20 分钟。接着，用500μL包含700mM NaCl的结合缓冲液清洗所述磁珠三遍， 然后用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)分离与MBD2bt结合的甲基 化DNA。

接下来，用基因组DNA扩增试剂盒(Sigma，美国，Cat.No.WGA2)扩增 与MBD2bt结合的甲基化DNA，并用BioPrime全基因组标记系统I(BioPrime  Total Genomic Labeling system I，Invitrogen公司，美国)对4μg经扩增的DNA 进行Cy4标记。为了间接比较正常人和结肠直肠癌患者之间的甲基化程度， 构建参考DNA。这里，所述参考DNA这样构建，使相同数量的来自12个结 肠直肠癌患者的基因组DNA彼此混合，用基因组DNA扩增试剂盒(Sigma， 美国，Cat.No.WGA2)扩增所述基因组DNA混合物，并用BioPrime全基因组 标记系统I(Invitrogen公司，美国)对4μg所述经扩增的基因组DNA进行Cy3 标记。将参考DNA与正常人和结肠直肠癌患者的DNA分别混合，然后与244K 人CpG微阵列（Agilent，美国）杂交（附图1）。杂交后，将所述DNA混合 物经一系列清洗过程，然后用Agilent扫描仪扫描。利用特征抽取程序v.9.5.3.1 （Feature Extraction program，Agilent），通过计算正常人和结肠直肠癌患者 样品间的信号强度的相对差异，计算来自所述微阵列图像的信号值。

为了筛选具有可靠杂交信号的探针，使用GeneSpring 7.3程序（Agilent， 美国），通过交叉基因误差模型筛选了总共26个阵列之中的至少21个阵列中 的64,325个Cy3信号值超过112.8的探针。为了从上述探针中筛选在结肠直 肠癌中高度甲基化的探针，实施两种分析方法。在第一种分析方法中，将正常 人的结肠直肠组织和与结肠直肠癌组织相邻的看似正常的组织作为同一组，为 了筛选与结肠直肠癌组织相比表现出差别化甲基化的探针，实施方差分析 （ANOVA test），从而筛选出4,498个探针(p<0.05)。从这些探针中，进一 步筛选出1,560个在结肠直肠癌组织中高度甲基化的探针，并从这些探针中选 定4个生物标志物候选基因(CHST11,IRX5,KCNA1,SDC2和SORCS3)，这4 个候选基因在约400bp距离的范围内存在的两个或多个相邻探针中表现出高 甲基化（附图2）。在第二种分析方法中，为了发现适于早期诊断的生物标志 物，所述结肠直肠癌组织和相邻与该结肠直肠癌组织的看似正常组织作为同一 组，实施方差分析（ANOVA test），从而筛选出3,242个与正常人结肠直肠组 织相比表现出差别化甲基化的探针(p<0.01)。从这3,242个探针中，筛选出705 个在结肠直肠癌组织和相邻于结肠直肠癌组织的看似正常组织中表现出高度 甲基化的探针。从这些筛选出的探针中，选定6个生物标志物候选基因(CHST11, IRX1,IRX5,KCNA1,SIM1和SORCS3)，这6个候选基因在约400bp距离范围 内存在的两个或多个相邻探针中表现出高甲基化（附图2）。

在使用上述两种分析方法选定的生物标志物候选基因中，有4个确定为共 同的基因，因此，总共得到7个生物标志物候选基因（表1）。另外，利用 MethPrimer(http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html)分析与在CpG 微阵列中表现出高度甲基化的7个基因中的每个探针对应的核苷酸序列，从而 确定所述探针中的CpG岛。

[表1]用于结肠直肠癌诊断的甲基化生物标志物候选基因列表

^a，距离转录起始位点(+1)的碱基对(bp)

实施例2：检测癌细胞系中生物标志物基因的甲基化

为了进一步证实实施例1中选定的生物标志物候选基因的甲基化状态，对 每个基因的启动子和内含子区域进行焦磷酸测序。

为了用亚硫酸盐将非甲基化的胞嘧啶修饰成尿嘧啶，从结肠直肠癌细胞系 Caco-2(KCLB No.30037.1)和HCT116(KCLB No.10247)中分离总基因组 DNA，并采用EZ DNA甲基化-金标试剂盒（Zymo Research，美国）用亚硫酸 盐处理200ng所述基因组DNA。当所述DNA用亚硫酸盐处理时，非甲基化的 胞嘧啶修饰成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。将亚硫酸盐处理后的DNA 在20μl无菌蒸馏水中洗提，并进行焦硫酸测序。

使用PSQ试验设计程序（Biotage，美国）对所述7个基因设计PCR引物 以及用于焦磷酸测序的测序引物。用于检测各基因甲基化的PCR引物和测序引 物如下表2和3所示。

[表2]PCR引物

^a Y=C或T;R=A或G

^b与转录起始位点(+1)的距离（核苷酸）：用于甲基化测量的基因组DNA 中的CpG区域的位置

[表3]用于甲基化标志物基因的测序引物序列

  基因   序列(5'-->3')   序列编号   CHST11   TAGGAGAATGGTGTGAAT   18   IRX1   TCCCTCTTCTCCCTA   19   IRX5   ATTTTAATGGATTAAATTAG   20   KCNA1   TTTTTTGGGGGAGGA   21   SDC2   GGGATGATTTGGAAATT   22   SIM1   CATCTCTTAACTATTCTCATACCT   23   SORCS3   TTTTTTTGGATAAGGATG   24

通过PCR扩增20ng经亚硫酸盐处理的基因组DNA。在所述PCR扩增中， 使用PCR反应液（20ng经亚硫酸盐处理的基因组DNA，5μl 10×PCR缓冲液 （Enzynomics，韩国），5单位Taq聚合酶（Enzynomics，韩国），4μl 2.5mM dNTP(Solgent，韩国)以及2μl（10pmole/μl）PCR引物），并在如下条件下 进行PCR反应：95℃预变性5分钟，然后进行95℃变性40秒、60℃退火 45秒和72℃延伸40秒的循环45个，接着在72℃进行最终延伸5分钟。所 述PCR产物的扩增通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳来证实。

所扩增PCR产物以PyroGold试剂（Biotage，美国）处理，然后用PSQ96MA 系统（Biotage，美国）进行焦磷酸测序。测序后，通过计算甲基化指数来测量 所述DNA的甲基化程度。所述甲基化指数通过确定结合到每个CpG岛的胞嘧 啶的平均比率来计算。

如上所述，结肠直肠癌细胞系中的所述生物标志物候选基因的甲基化程度 利用焦磷酸测序法来检测。结果可参见附图3A，在至少一种所述细胞系中， 所述7个标志物基因全部高度甲基化。所述7个标志物基因在结肠直肠癌细胞 系中表现出高度甲基化，表明这些基因适于用作结肠直肠癌诊断的生物标志 物。为了证实这些基因是否适于作为生物标志物，利用组织样品另外进行了如 下测试。

实施例3：检测正常人结肠直肠组织中生物标志物候选基因的甲基化

所述7个生物标志物候选基因为了能用作结肠直肠癌诊断的生物标志物， 这些基因应该在正常人而非患者的结肠直肠组织中表现出低甲基化水平，而应 该在结肠直肠癌组织中表现出高度甲基化水平。

为了证实这些基因是否满足这些要求，利用QIAamp DNA小型试剂盒 （QIAGEN，美国）从两个正常人的结肠直肠组织（Biochain）中分离基因组 DNA，并用EZ DNA甲基化-金标试剂盒（Zymo Research，美国）用亚硫酸盐 处理200ng所述分离的基因组DNA。将处理后的DNA以20μl无菌蒸馏水洗 提，并进行焦硫酸测序。

通过PCR扩增20ng所述经亚硫酸盐处理后的基因组DNA。在所述PCR 扩增中，使用PCR反应液（20ng经亚硫酸盐处理的基因组DNA，5μl 10×PCR 缓冲液（Enzynomics，韩国），5单位Taq聚合酶（Enzynomics，韩国），4 μl 2.5mM dNTP(Solgent，韩国)以及2μl（10pmole/μl）PCR引物），并在 如下条件下进行PCR反应：95℃预变性5分钟，然后进行95℃变性40秒、 60℃退火45秒和72℃延伸40秒的循环45个，接着进行72℃最终延伸5 分钟。所述PCR产物的扩增通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳来证实。

所扩增的PCR产物用PyroGold试剂（Biotage，美国）处理，然后用 PSQ96MA系统（Biotage，美国）进行焦磷酸测序。测序后，通过计算所述DNA 的甲基化指数来测量所述DNA的甲基化程度。所述甲基化指数通过确定结合 到每个CpG岛区域的胞嘧啶的平均比率来计算。表2中的PCR引物和表3中 的测序引物以与实施例2中相同的方式使用。

结果可参见附图3B，7个基因中的IRX1,IRX5,KCNA1和CHST11基因表 现出比正常组织中的甲基化水平高40%，表明这些基因不能作为生物标志物使 用。因此，这些基因从生物标志物候选基因中排除。另一方面，SIM1,SDC2 和SORCS3基因在正常组织中表现出相对较低的甲基化水平。因此，为了证实 SIM1,SDC2和SORCS3基因是否适合作为生物标志物，使用结肠直肠癌患者的 组织进行了如下测试。

实施例4：检测结肠癌患者组织中生物标志物基因的甲基化

为了证实在正常人结肠直肠组织中表现出低水平甲基化的SIM1,SDC2和 SORCS3基因是否适合作为结肠直肠癌诊断的生物标志物，从12名结肠直肠癌 患者（延世（Yonsei）大学生物芯片研究中心，经韩国卫生福利部（Ministry of  Health and Welfare）授权）中分离的结肠直肠癌组织和与结肠直肠癌组织相邻 的看似正常的组织中分离基因组DNA。

用EZ DNA甲基化-金标试剂盒（Zymo Research，美国）用亚硫酸盐处理 200ng所述分离的各个基因组DNA。将处理后的各DNA在20μl无菌蒸馏水 中洗提，并进行焦硫酸测序。

通过PCR扩增20ng所述经亚硫酸盐处理后的基因组DNA。在所述PCR 扩增中，使用PCR反应液（20ng用亚硫酸盐处理的基因组DNA，5μl 10×PCR 缓冲液（Enzynomics，韩国），5单位Taq聚合酶（Enzynomics，韩国），4 μl 2.5mM dNTP (Solgent，韩国)以及2μl（10pmole/μl）PCR引物），并在 如下条件下进行PCR反应：95℃预变性5分钟，然后进行95℃变性40秒、 60℃退火45秒和72℃延伸40秒的循环45个，接着进行72℃最终延伸5 分钟。所述PCR产物的扩增通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳来证实。

所扩增的PCR产物用PyroGold试剂（Biotage，美国）处理，然后用 PSQ96MA系统（Biotage，美国）进行焦磷酸测序。测序后，通过计算所述DNA 的甲基化指数来测量所述DNA的甲基化程度。所述甲基化指数通过确定结合 到每个CpG岛区域的胞嘧啶的平均比率来计算。表2中的PCR引物和表3中 的测序引物以与实施例2中相同的方式使用。

对所述3个基因的甲基化程度进行测量。结果可参见附图4，SDC2和SIM1 基因在所有12个病人（100%）的结肠直肠癌组织中均显示出比看似正常的组 织中更高的甲基化水平。另外，SORCS3基因在12个患者中的10个（83.3%） 的结肠直肠癌组织中显示出高度甲基化。因此，经发现，所有上述3个基因均 非常适合作为结肠直肠癌诊断的甲基化生物标志物。下表4表示了上述3个生 物标志物基因在结肠直肠癌组织中和与结肠直肠癌组织相邻的看似正常的组 织中的甲基化水平的平均值。为了证实所述基因的甲基化水平在结肠直肠癌组 织和看似正常的组织之间是否具有统计学上的显著性差异，进行卡方 （Chi-Square）检验。结果可见，所有3个基因均显示出统计学上的显著性水 平(p<0.01)（参见表4）。

[表4]3个生物标志物甲基化的定量分析结果

^a通过卡方检验获得的P值

实施例5：对3个生物标志物诊断结肠直肠癌能力的评估

对于在实施例4中证实适合作为结肠直肠癌标志物的SIM1,SDC2和 SORCS3基因，使用MedCalc程序（MEDCALC，比利时）进行受试者操作特 性（ROC）分析，以评估所述基因诊断结肠直肠癌的能力。

结果可参见附图5，所述基因对结肠直肠癌的灵敏性和特异性分别为： SDC2基因100%和100%，SIM1基因83.3%和100%，SORCS3基因83.3%和 100%。这表明所述基因都具有非常优异的诊断结肠直肠癌的能力。

另外，对于上述3个生物标志物中最具诊断结肠直肠癌能力的SDC2基因， 还评估了它在粪便样品中诊断结肠直肠癌的能力。

具体地，使用巢式甲基化特异性PCR(MSP)技术，基因组DNA分离自4 个正常人和10名结肠直肠癌患者（延世大学生物芯片研究中心，经韩国卫生 福利部授权）的粪便样品。用EZ DNA甲基化-金标试剂盒（Zymo Research， 美国）用亚硫酸盐处理4μg所述分离的各基因组DNA。将处理后的各DNA 在20μl无菌蒸馏水中洗提，并进行巢式MSP测试。在所述巢式MSP测试中 所用的引物序列如下表5中所示。

[表5]在巢式MSP测试中SDC2基因所用的引物序列

通过PCR扩增1μg经亚硫酸盐处理的基因组DNA。在所述PCR扩增中， 使用PCR反应液（20μg经亚硫酸盐处理的基因组DNA，5μl 10×PCR缓冲 液（Enzynomics，韩国），5单位Taq聚合酶（Enzynomics，韩国），4μl 2.5 mM dNTP (Solgent，韩国)以及2μl（10pmole/μl）PCR引物），并在如下条 件下进行PCR反应：95℃预变性5分钟，然后进行95℃变性40秒、60℃ 退火45秒和72℃延伸40秒的循环30个，接着进行72℃最终延伸5分钟。 取1/2的所述PCR产物，以与上述相同的方式进行PCR扩增45个循环。所述 PCR产物的扩增通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳来证实。

结果可参见附图6，观察到SDC2基因在4个正常人的组织中未被甲基化， 但在10名结肠直肠癌患者中的6人（60%）中甲基化。这表明，SDC2基因适 于在粪便中诊断结肠直肠癌。

工业实用性

如上所述，用于检测甲基化的所述创造性方法和用于诊断结肠直肠癌的所 述创造性组合物、试剂盒以及核酸芯片的应用，使得在转化早期诊断结肠直肠 癌成为可能，从而能够在早期诊断结肠直肠癌。另外，所述创造性方法使结肠 直肠癌能以与传统方法相比更准确而快速的方式有效地诊断。

尽管参照了特定特征对本发明进行详细描述，但对本领域技术人员显而易 见的是，这些描述只针对优选实施方式，并未限制本发明的保护范围。因此， 本发明的实质性保护范围将由所附的权利要求书和其等同方式确定。