浸麻类芽孢杆菌菌株在溶解土壤或富营养化水体中磷源的应用

摘要

本发明公开了一种浸麻类芽孢杆菌菌株在溶解土壤或富营养化水体中磷源的应用。所述的浸麻类芽孢杆菌菌株为浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)ZJU0902，保藏号为CCTCC NO：M 209158；所述的磷源为无机磷源和有机磷源中的至少一种。本发明将浸麻类芽孢杆菌ZJU0902用于土壤中无机、有机磷源的溶解，具有解磷稳定、高效、广谱的特点；以该菌株发酵液与肥料基质混合制得的微生物肥料，施入土壤后能迅速形成优势菌群，肥效好，能使土壤中有效磷含量显著提高，促进植物的健康生长；将该菌株用于富营养化水体中无机、有机磷源的溶解，能促使水生植物吸收水体中多余的磷元素，从而防治水体富营养化。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种浸麻类芽孢杆菌菌株在溶 解土壤或富营养化水体中磷源的应用。

背景技术

植物生长需要一些必需的营养元素，磷是其中一种能影响植物健康生 长的主要元素。磷不仅是植物体内许多重要化合物的组分，而且还以多种 途径参与植物体内的重要代谢。但土壤中90％的磷都以难溶状态存在，这 可能是由于自然土壤中的磷在酸性条件下易与Fe³⁺、Al³⁺等离子络合，形 成FePO₄和AlPO₄等难溶磷酸盐；在碱性条件下又与Ca²⁺离子络合，形成 Ca₃(PO₄)₂或CaHPO₄等惰性磷酸盐，这些磷都不能被植物直接吸收，从而 阻碍植物的健康生长，并使得产量得不到最大化。

水体富营养化是指氮、磷等植物营养物质含量过多引起的水质污染现 象，结果导致水生生态系统丧失自我维持、自我调节的能力，导致环境污 染的进一步加剧。据统计，我国富营养化和超富营养化湖泊分别达湖泊总 量的66％和22％(胡绵好等.2010)。提高水生植物对氮、磷等无机元素 的吸收能力来防治水体富营养化，是当前环保领域的一个重要研究课题。

土壤中存在着一些微生物能够将难溶性的磷酸盐转化为可利用形态， 这些微生物称为解磷微生物(phosphate-solubilizing microorganisms， PSM)。解磷微生物能依靠自身的代谢产物或与其它生物协同溶解土壤中 的难溶无机磷或有机磷，从而在磷素转化中起着重要作用。因此解磷微生 物的研究一直受到科学家的重视，期望以接种剂的途径提高土壤难溶性磷 的有效性和磷肥的利用效率。由于不同种类的解磷菌或菌株之间的解磷能 力和接种效果差异悬殊，所以高效解磷菌株的筛选显得尤为重要。虽然真 菌的解磷能力大于细菌，但在微生物肥料生产中解磷细菌所占比例远高于 真菌。目前微生物肥料生产中解磷稳定、高效、广谱的菌株还比较少，这 为优良菌株的选育工作提出了迫切任务(Fan BQ，2002)。

浸麻类芽孢杆菌已从很多植物的根际被分离到(Guemori-Athmani et  al.2000；von der Weid et al.2000)。研究表明，浸麻类芽孢杆属细菌耐热、 稳定、自然适应力强，目前不仅是植物生长的促生菌(Artursson et al.2006； Algam et al.2010)，还是植物抵抗多种病害的生防菌(Timmusk et al.2009； Li et al.2007，2010，2011a，b)。真正地，浸麻类芽孢杆菌已被发现卷入了 植物促生(Timmusk et al.1999)和病菌抑制(Bae et al.2000；Timmusk 2003； Li et al.2011a，b)，但目前还没有关于浸麻类芽孢杆菌作为磷溶解细菌的 报道。因此，研究浸麻类芽孢杆菌的磷溶解能力对于明确该细菌植物促生 和防病机制具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种浸麻类芽孢杆菌菌株在溶解土壤或富营养化水体 中磷源的应用，该浸麻类芽孢杆菌菌株能够稳定、高效、广谱地溶解土壤 或富营养化水体中的无机或有机磷源。

一种浸麻类芽孢杆菌菌株在溶解土壤或富营养化水体中磷源的应用， 所述的浸麻类芽孢杆菌菌株为浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans) ZJU0902，保藏号为CCTCC NO：M 209158；所述的磷源为无机磷源和有 机磷源中的至少一种。

所述的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902已保藏，保藏于位于武汉市珞珈山武 汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月 19日，保藏编号为CCTCC NO：M 209158。公开号为CN101712942A的发 明专利申请中公开了该菌株，并详细公开了其筛选、培养方法、形态及生 物学特征等，该菌株为浙江省杭州市一块青枯病严重发生的黄瓜地里黄瓜 根际周围表层土壤中分离得到的，经鉴定为浸麻类芽孢杆菌，对植物青枯 病具有一定的防治效果。

所述的土壤可以为Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄、FePO₄或AlPO₄等难溶性磷 酸盐含量较高，而需磷植物长势较弱的土壤。

所述的需磷植物可以为十字花科作物、豆科作物、番茄、茄子或甜菜 等对磷极为敏感的植物，或者也可以为玉米、芝麻等中等需磷植物。

所述的富营养化水体可以为富含磷元素的富营养化水体。

所述的无机磷源可以为Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄、FePO₄和AlPO₄中的一 种或多种混合物。

优选地，所述的无机磷源为Ca₃(PO₄)₂或CaHPO₄。

所述的有机磷源可以为植酸。

所述的应用可以通过如下步骤：将经活化的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902 接种到LB液体培养基中，于28-30℃培养12-24h，制得种子液；将种子 液加入土壤或富营养化水体中，混合均匀；

其中，以每千克土壤或每升富营养化水体计，所述种子液的加入量为 5-10mL。

为了方便分析菌株的解磷能力，可以设计实验室解磷试验研究菌株对 磷源化合物的溶解。

所述的实验室解磷试验可以通过如下步骤：将浸麻类芽孢杆菌 ZJU0902接种到添加有磷源的NBRIP液体培养基中，于28℃摇床培养1-7 d；

其中，以体积1L计，所述的NBRIP液体培养基包括以下组分：葡萄 糖10g，六水氯化镁5g，七水硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g， 余量为水，pH 7.0；所述磷源的添加量以每升NBRIP液体培养基计为 0.001-0.04mol。

所述的NBRIP液体培养基是微生物解磷研究中常用的培养基，该培 养基检测磷含量比较灵敏。

所述的摇床培养时间优选为4-6d；更优选为5d，解磷效果最好。

本发明还提供了一种能溶解土壤磷源的微生物肥料，所述的微生物肥 料含有以下成分：菌体浓度大于10⁸个/g的浸麻类芽孢杆菌菌株、质量浓 度为4-6％的全氮、质量浓度为35-40％的有机质和质量浓度为1-2％的全 磷；

其中，所述的浸麻类芽孢杆菌菌株为浸麻类芽孢杆菌ZJU0902，保藏 号为CCTCC NO：M 209158；

所述的全氮中含有质量浓度为90％-100％的有机氮。

所述的微生物肥料可以施于种植十字花科作物、豆科作物、番茄、茄 子、甜菜、玉米或芝麻的土壤中。

本发明还提供了上述微生物肥料的制备方法，包括：将浸麻类芽孢杆 菌ZJU0902接种到LB加富培养基中，于28-30℃培养24-48h，得到发酵 液；将发酵液按重量比4-6％的比例添加到基料中，混匀，于20-28℃发酵 3-5d，制得微生物肥料；

其中，所述的LB加富培养基由LB液体培养基中添加硝铵、硫铵和 黄豆粉制得；

所述的基料为畜禽粪便、作物秸秆、无机氮肥和豆渣中的一种或多种 混合物。

优选地，所述的微生物肥料也可由浸麻类芽孢杆菌ZJU0902发酵液和 有机高氮肥混合制成。所述有机高氮肥的制备可参照公开号CN1215022C 的发明专利中的相关记载。

本发明中，所述的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902是从植物根际土壤中分离 得到的，其能适应复杂的土壤环境；同时，实验室解磷试验及植物试验结 果表明，该菌株对多种无机或有机磷源具有溶解能力，由此可知，该菌株 能用于土壤中磷源的溶解。另一方面，根据实验室解磷试验，浸麻类芽孢 杆菌ZJU0902在NBRIP液体培养基中对磷源溶解效果良好，表明该浸麻 类芽孢杆菌ZJU0902能用于溶解液体环境中的磷元素，如富营养化水体中 磷源的溶解。

本发明以土壤中分离得到的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902用于土壤中无 机、有机磷源的溶解，具有解磷稳定、高效、广谱的特点，而且有利于植 物吸收生长必需的磷元素，促进植物的长势；以该菌株发酵液与肥料基质 混合制得的微生物肥料，施入土壤后能迅速形成优势菌群，肥效好，能使 土壤中有效磷含量显著提高，促进植物的健康生长。该菌株用于富营养化 水体中无机、有机磷源的溶解，能促使水生植物吸收水体中多余的磷元素， 从而防治水体富营养化。

附图说明

图1为实施例1中用50mg/l磷酸标准溶液建立的标准磷曲线；

图2为实施例3中浸麻类芽孢杆菌ZJU0902对不同磷源溶解圈直径的 大小；

图3为实施例5中接种时间对浸麻类芽孢杆菌ZJU0902磷溶解能力的 影响；其中，abcd表示不同处理间的显著性差异；

图4为实施例5中接种时间对浸麻类芽孢杆菌ZJU0902菌体生长的影 响；其中，abcdef表示不同处理间的显著性差异。

具体实施方式

以下实施例中，所用浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans) ZJU0902(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 209158，保藏时间为2009年7月19日)的筛选、培养方法、形态及生物 学特征等均已在公开号为CN101712942A的发明专利申请中公开，具体 为：

该菌株是从浙江省杭州市一块青枯病严重发生的黄瓜地里黄瓜根际 周围表层土壤中分离筛选得到，经Biolog、脂肪酸以及16S rDNA鉴定为 浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)。生物学特性如下：细胞呈杆状， 革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动。在膨大包囊内有椭圆形芽孢，在营养 琼脂上无可溶性色素。兼性厌氧。在培养基上的菌落薄，呈形状扩展，菌 量多而黏，表面无光泽。生长物会黏连到培养基上。生长最适温度28-30℃， 生长温度范围15-50℃。生长最适pH为7.0，生长pH范围为5.6-8.5。

实施例1建立标准磷曲线

将KH₂PO₄在105℃下烘干4h，精确称取0.2195g KH₂PO₄溶于水中 并移到1000ml的容量瓶中，加入400ml水和5ml浓硫酸，定容到1000ml， 得到50mg/l磷酸标准溶液。用50mg/l磷酸标准溶液作为磷源，配成系列 浓度的标准溶液，建立一条关于OD₄₅₀值与溶液中磷含量的标准曲线，通 过标准曲线可以由实验中所测的OD₄₅₀值得到相应的磷含量。

其中，磷含量的测定采用磷钼黄光度法，具体为：

(1)称取2.4g NaOH，加水并不断搅拌，定容到100ml配成6N NaOH 溶液；

称取0.25g 2，4-二硝基酚固体，加入12.5ml无水乙醇，然后定容到 100ml，配成2，4-二硝基酚指示剂；

称取0.5g(NH₄)₆MoO₂₄·H₂O溶于200ml蒸馏水中，称取0.625g NH₄Vo₃于150ml沸水里，等冷却后加入125ml浓硝酸，降到室温；慢慢 地将钼酸铵溶液倒入偏钒酸铵溶液中，不断搅拌，最后定容到500ml，配 成偏钒酸铵与钼酸铵混合液。

(2)将系列浓度的磷酸标准溶液离心后移取10ml上清液到25ml 容量瓶中，滴入1滴2，4-二硝基酚指示剂，然后逐滴加入6N NaOH使溶 液刚好出现黄色，加入偏钒酸铵与钼酸铵混合液5ml，定容到25ml，在 室温下放置15min，测OD₄₅₀值。

实施例2制备种子液

用三区划线法将保藏的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902在NA琼脂平板上划 线，置于28℃下培养24h；将浸麻类芽孢杆菌ZJU0902单菌落接到LB 液体培养基中，于28℃，160r/min的摇床中振荡培养12h，制成种子液， 种子液中菌体浓度为10⁸CFU/ml。

实施例3固体培养基中磷溶解能力的测定

在NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，六水氯化镁5g，七水硫酸镁0.25 g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000ml，pH7.0)中分别加入5g/ l无机磷Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄、FePO₄和AlPO₄以及5ml/l有机磷植酸作为 磷源，再加入琼脂(20g/l)配制成固体培养基。高压灭菌后倒板，用灭过 菌的牙签沾取实施例2中纯化培养的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902到平板上， 30℃无光培养。4周以后检测透明磷溶解圈的直径大小。重复4次。

结果显示，浸麻类芽孢杆菌ZJU0902能溶解Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄和植 酸中的磷元素，且对植酸的磷溶解量最大。在固体培养基中，浸麻类芽孢 杆菌ZJU0902并不能溶解FePO₄、AlPO₄中的磷元素(图2)。

实施例4液体培养基中磷溶解能力的测定

在50ml锥形瓶中倒入20ml NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，六水 氯化镁5g，七水硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000 ml，pH7.0)，分别加入5g/l无机磷Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄、FePO₄和AlPO₄以及5ml/l有机磷植酸作为磷源。接种实施例2中的浸麻类芽孢杆菌 ZJU0902种子液使菌初始浓度为10⁷CFU/ml，在28℃、130r/min摇床上 培养3d，收集菌悬液后10000r/min离心10min，采用实施例1中的磷钼 黄光度法测定上清液的OD₄₅₀值，根据实施例1中的标准磷曲线将OD₄₅₀值转换成磷含量。

结果显示，浸麻类芽孢杆菌ZJU0902能溶解不同的无机磷和有机磷， 且对Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄、植酸的磷溶解能力很强。虽与各自的对照(不 接种菌株，其它相同)相比，磷溶解量都显著增加，但浸麻类芽孢杆菌 ZJU0902对Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄的磷溶解量增加3-12倍，对FePO₄的磷溶 解量增加1倍以上，而对AlPO₄、植酸的磷溶解量增加的最少。这说明细 菌对不同磷源的磷溶解能力是不同的，浸麻类芽孢杆菌ZJU0902最适合溶 解Ca₃(PO₄)₂、CaHPO₄(见表1)。

表1浸麻类芽孢杆菌ZJU0902对不同磷源的磷溶解能力

注：ab表示不同处理间的显著性差异。

实施例5接种时间对浸麻类芽孢杆菌ZJU0902磷溶解能力的影响

在50ml锥形瓶中倒入20ml NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，六水 氯化镁5g，七水硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000 ml，pH7.0)，加入5g/l Ca₃(PO₄)₂作为磷源。接种实施例2中的浸麻类芽 孢杆菌ZJU0902种子液使菌初始浓度为10⁷CFU/ml，在28℃、130r/min 摇床上培养1d，2d，3d，4d，5d，6d，7d，分别收集菌悬液后10000 r/min离心10min，采用实施例1中的磷钼黄光度法测定上清液的OD₄₅₀ 值，根据实施例1中的标准磷曲线将OD₄₅₀值转换成磷含量。用平板计数 法测定相应时间的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902细胞数量。

结果如图3和图4所示，接种2d以后溶液中的磷含量达21.8μg/ml， 与接种1d没有显著性差异；接种2-3d这段时间内，溶液中的磷含量增 加速率最大，接种3d以后溶液中的磷含量达54.9μg/ml，是接种2d磷 含量的2.5倍。接种3-5d这段时间内磷含量缓慢增加，接种5d以后溶液 中的磷含量达到最大值58.6μg/ml。接种5-7d，磷含量略有下降，但没有 显著性差异。因此接种5d浸麻类芽孢杆菌ZJU0902对磷酸钙的溶解达到 最大值，5d是最佳接种时间。这与Son et al.(2006)的磷含量随接种时间 增加而下降的报道不一致，可能是由于磷溶解细菌种类不同造成的。

另外，菌体生长结果表明，接种2d以后溶液中的菌体数量达到最大 值，比最初增加了2.4log10 CFU/ml，这很好地解释了接种后2-3d这段时 间内磷含量增加速率最大的现象。

随着接种时间的增加，菌体数量开始减少，到接种第7d细胞数量达 7.66 log10 CFU/ml。

实施例6解磷细菌浸麻类芽孢杆菌ZJU0902降解磷源Ca₃(P0₄)₂的植物 试验

配制NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，六水氯化镁5g，七水硫酸镁0.25 g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000ml，pH 7.0)，加入5g/l Ca₃(PO₄)₂作为磷源。吸取10ml培养液到铺有3层灭菌滤纸的培养皿中。将黄瓜种子 在实施例2制备的浸麻类芽孢杆菌ZJU0902菌悬液或无菌蒸馏水中浸泡4 h，转移到培养皿中，16小时21℃/8小时19℃人工培养箱中黑暗催芽3天， 测定发芽率。种子发芽后每天补充5ml培养液，以保证种子幼苗有足够水 分并能使其根从中吸收磷元素。10天后收获黄瓜苗测量根、茎鲜重。每个 处理5个重复，每个重复80粒种子。

结果显示，用浸麻类芽孢杆菌ZJU0902菌悬液处理过的黄瓜种子发芽 率达87％，用蒸馏水处理过的黄瓜种子发芽率达85％，这说明浸麻类芽孢 杆菌ZJU0902不会影响黄瓜种子的正常发芽，而黄瓜种子本身的发芽率就 很高。另外，从黄瓜苗的根、茎鲜重可以看到，用浸麻类芽孢杆菌ZJU0902 菌悬液处理过的黄瓜种苗长势好于对照。这说明浸麻类芽孢杆菌ZJU0902 将培养液中的Ca₃(PO₄)₂降解成有效磷，促进黄瓜苗对磷元素的吸收。

表2浸麻类芽孢杆菌ZJU0902降解Ca₃(PO₄)₂对植物发芽和幼苗生长的影响

注：ab表示不同处理间的显著性差异。

实施例7解磷细菌浸麻类芽孢杆菌ZJU0902微生物有机肥的生产

(1)浸麻类芽孢杆菌ZJU0902发酵液的制备：将实施例2中的种子 液按接种量5-10％(v/v)，转速130-160r/min，培养温度28-30℃，培养时 间24-48h，在发酵培养基(LB培养基加硝铵、硫铵、黄豆粉等，pH 6.8-7.2) 中发酵培养，获得高密度发酵液(含菌量＞10¹⁰个/ml)。

(2)有机载体的制备：按中国专利“利用农业固体废弃物制成的方 法及其肥料产品”，专利号：ZL200410014773.1公开的方法生产有机高氮 肥，以此作为肥料的有机载体。

(3)微生物肥料的制备：将发酵液按重量比5％的比例添加到有机载 体中，充分混合后在自然条件下放置3-5d，使散失水分至含水量小于30％， 即获得解磷微生物有机肥料。

经测定，最终产品中细菌数量达到10⁸个/g以上，全氮含量达到4％， 其中有机氮含量达到90％以上，有机质含量达到35％，全磷含量为1-2％。 产品指标达到国家微生物有机肥料的标准。

十字花科作物、豆科作物、番茄、茄子或甜菜等是对磷极为敏感的作 物。其中油菜、番茄常作为缺磷指示作物用于判断田块是否有充足的有效 磷。

在杭州、金华等地选取磷总含量高而有效磷含量低的田块，施于本实 施例的微生物有机肥料施，种植玉米、黄瓜植物，并设置对照。观察整个 发育过程，缺磷玉米植株瘦小，茎叶大多呈明显的紫红色，花丝抽出迟， 雌穗畸形，穗小，结实率低，推迟成熟。黄瓜缺磷整株矮小发僵，暗绿， 老叶出现红褐色焦枯，所结黄瓜颜色黄而小。而施有本实施例的微生物有 机肥料施区块上种植的玉米和黄瓜植株长势好，茎叶茂盛，发育正常，所 结玉米和黄瓜产量明显增加。