诱导可逆性永生化前成牙本质细胞系及其建立方法

摘要

本发明公开了诱导可逆性永生化前成牙本质细胞系及其建立方法。本发明细胞系是其引入了致永生化基因，在该基因的两端具有LoxP序列，同时该细胞系还表达Cre酶与雌激素受体蛋白的融合蛋白。这种融合蛋白由于体积过大无法进入细胞核，因此在正常情况下这种蛋白无法将基因组内的LoxP位点间的敲除。而当细胞接受一定浓度的4-OH-Tomaxifen刺激后，Cre两端的雌激素受体将脱落，Cre得以进入细胞核从而将去除基因组内的永生化基因编码序列，达到去永生化的目的。本发明为进一步研究成牙本质细胞生物学特性提供了理想的体外模型，同时也为牙本质再生修复和牙本质发育相关疾病机制研究提供理想的材料。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种哺乳动物细胞系，具体来说是涉及一种可利用药物诱导的永生化可逆性小鼠前成牙本质细胞系，及其建立方法。

技术背景：

牙齿，作为人类重要的消化器官主要由硬组织组成，其结构从外向内依次为牙釉质（牙冠部，牙根为牙骨质），牙本质以及牙髓，而牙本质则构成了超过牙齿2/3的硬组织，成为牙齿重要的硬组织结构，而另一方面作为联系牙髓软组织和牙釉质硬组织重要的连接组织其内部有大量规律排列的牙本质小管，成牙本质细胞的突起则生长于这些小管之中，起到了营养、传递感觉的作用。大部分患有牙本质发育不全症状的患者出现牙色偏黄、形状不规则以及牙髓腔闭塞等症状，这些都极大的影响了这些患者的正常食物营养摄取，降低了其生活质量。这些都说明了牙本质这个结构在牙齿中起着不可或缺的作用。

牙本质的只能由成牙本质细胞完成，成牙本质细胞则由神经嵴来源的间充质细胞在牙成釉细胞诱导下分化而成。成牙本质细胞在其终末分化过程中逐渐极化，形成成牙本质细胞突起，并分泌矿化组织将成牙本质细胞突起包绕保护，最终形成含有牙本质小管的牙本质结构。除了矿化能力以外，成牙本质细胞，作为牙髓牙本质复合体最外一层细胞是牙中最早接受外来刺激的可以将包括病原入侵等绝大多数刺激传递至人牙髓，从而使人产生相应的措施，因此，它又被认为是一层保护细胞。然而，在人牙齿发育和正常生理过程中扮演如此重要角色的细胞一旦分化完成将不能自我分裂而是一直位于牙齿的最外一层，伴随牙齿的一生，也就是说一旦这类细胞出现了病损，牙齿将不能再次产生同样的细胞来完成其功能。细胞量的稀缺为我们研究这种细胞的分化或者细胞应激反应带来了巨大的障碍，因此如何方便大量的获取这种细胞在成牙本质细胞研究乃至是牙相关研究方面就显得尤为重要。而解决这一问题的方法之一就是建立永生化稳定的成牙本质细胞系。

近十年来，很多牙发育学者致力于建立永生化的小鼠或者人来源的永生化细胞系，为牙发育研究或者牙相关疾病研究提供能模拟正常生理状况的研究模型。如1995 年MacDougall等在文献1：MacDougall M, hiemann F, Ta H, et al(1995) Temperature sensitive simian virus 40 large T antigen immortalization of murine odontoblast cell cultures: establishment of clonal odontoblast cell line. Connect Tissue Res 33,97-103.报道了一种使用SV40大T抗原转染小鼠牙乳头细胞而获得的成牙本质细胞样细胞系。1998年Sun ZL 等在文献2：Sun ZL, Fang DN, Wu XY, et al(1998) Expression of dentin sialoprotein and other molecular determinants by a new cell line from dental papillae, MDPC-23.Connect Tissue Res 37,251-261.报道了一种来自于小鼠牙乳头细胞的成牙本质细胞样细胞系，这种细胞系可以表达一些成牙本质细胞特征性的蛋白如牙本质涎磷蛋白，骨桥蛋白等。2006年Galler K等在文献3：Galler K，Schweikl H, Thonemann B, et al(2006) Human pulp-derived cells immortalized with Simian Virus 40 T-antigen 114,138-146.报道了一种人牙髓细胞来源的永生化细胞系。经过SV40T抗原的转染，细胞可持续传代。并同样表达多种成牙本质细胞的特征性蛋白。由于SV40T抗原本身是一种原癌基因，经其转染的细胞都具有潜在的成瘤性。越来越多的学者正不断寻找构建永生化细胞系的新方法。

近年来一些学者通过慢病毒的方式建立了可逆性永生化细胞的方法，2000年，Salmon P 等在文献4：Salmon P, Oberholzer J, Occhiodoro T, Morel P, Lou J, Trono D（2000）Reversible immortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer of specific genes.Mol Ther 2，727-731.中提出一种可逆性永生化细胞的模型：该利用慢病毒感染细胞的特性将永生化基因两端带有LoxP位点的慢病毒感染肝窦内皮细胞，从而建立永生化细胞系，然后再使用表达CreDNA重组酶的慢病毒感染永生化的细胞系，利用Cre能特异性识别LoxP位点并且将两LoxP位点间的DNA切除的特性将永生化细胞系基因组内表达永生化基因的DNA序列从基因组中去除，从而成功的使细胞系丧失永生化能力并且与原代培养的细胞保持相同的特性。2004年Kowolik CM等在文献5: Kowolik CM, Liang S, Yu Y, Yee JK (2004) Cre-mediated reversible immortalization of human renal proximal tubular epithelial cells Oncogene 23, 5950-5957.中利用该模型永生化了近端肾小管上皮细胞，并取得了成功。另一方面，在实验中我们发现由于慢病毒感染的特性不能达到百分之百，且多次的病毒感染易造成基因组的不稳定性，因此在去永生化过程中我们需要将去永生的细胞进行筛选，以获得Cre重组酶去除永生化基因的细胞，即去永生化细胞。但是有些细胞比如处于终末分化阶段的成牙本质细胞其原代培养的细胞生长极为缓慢而且容易衰老，简单的药物筛选会使去永生化的细胞失去使用价值，从而达不到通过该体系保存扩增原代细胞的目的。到目前为止，还没有理想的使永生化细胞去分化的方法。

本发明人在利用这种表达可逆性永生化基因的慢病毒的同时对去分化的方法进行了改进，本发明在Cre的两端引入了雌激素受体（ER），即ER^T2CreER^T2融合蛋白，制作一种药物诱导性的Cre构建体。这种构建体表达药物筛选标记，从而能筛选出稳定表达这种融合蛋白的细胞。而这种融合蛋白由于体积过大无法进入细胞核，因此在正常情况下这种蛋白无法将基因组内的LoxP位点间的敲除。而当细胞接受一定浓度的4-OH-Tomaxifen刺激后，Cre两端的雌激素受体将脱落，Cre得以进入细胞核从而将去除基因组内的永生化基因编码序列，达到去永生化的目的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种可利用药物诱导的永生化可逆性、能保持前成牙本质细胞性状及功能的细胞系，及其建立方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种融合蛋白，其包括至少一个蛋白A，所述蛋白A能够作用于细胞核内物质，包括核酸或蛋白，以及至少一个与蛋白A相结合的蛋白B，所述蛋白B无法进入细胞核，并且蛋白B可控脱落。所述可控脱落包括受药物调控脱落、受温度调控脱落或受光处理调控脱落。

其中，所述蛋白A可以是Cre酶，其能够特异性识别DNA序列中LoxP位点，并将两同向LoxP位点之间的DNA序列从原序列中除去。

其中，所述蛋白B可以是雌激素受体蛋白，该蛋白能够阻止所融合的蛋白进入细胞核，而当受到他莫西分处理后可以从所融合蛋白两端脱落。

上述融合蛋白的蛋白A在正常情况下由于与蛋白B相结合，因而不能进入细胞核，无法作用于细胞核内物质（例如基因组或者蛋白），而当受到相应条件处理时，蛋白B从蛋白A上脱落，从而蛋白A可以正常进入细胞核，作用于相应位点。

进而本发明提供编码上述融合蛋白的基因，以及含有相关基因的表达载体。

进一步本发明提供一种细胞系，其能表达上述的融合蛋白。该细胞系，含有上述基因或表达载体。

本发明的诱导可逆性永生化细胞系，其引入了致永生化基因，在该基因的两端具有LoxP序列，同时该细胞系还表达上述的融合蛋白。优选所述融合蛋白为Cre酶与雌激素受体蛋白的融合蛋白，并且在Cre酶的两端各结合一雌激素受体蛋白。

本发明还提供一种构建上述细胞系的方法，其是将上述表达Cre酶与雌激素受体蛋白的融合蛋白的表达载体导入永生化细胞系中，得到可逆性永生化细胞系，所述永生化细胞系引入了致永生化基因，在该基因的两端具有LoxP序列。

在本发明实施例中，本发明以前牙本质细胞（小鼠）为出发细胞，将慢病毒载体pLOX-tTagiresTK导入所述细胞，得到永生化细胞，进一步将质粒pCAGER^T2CreER^T2-neo导入到所述永生化细胞系中，得到诱导可逆性永生化前牙本质细胞。

具体地，本发明细胞系的构建可包括以下步骤：

i)使细胞永生化的慢病毒载体，由瑞典Trono教授（文献4：Salmon P, Oberholzer J, Occhiodoro T, Morel P, Lou J, Trono D（2000）Reversible immortalization of human primary cells by lentivector-mediated transfer of specific genes.Mol Ther 2，727-731.）提供的慢病毒载体：pLOX-tTagiresTK (Addgene)包含有SV40大T抗原和TK的编码序列，而慢病毒感染细胞后，整合入基因组的片段两端将带有LoxP位点，由该载体包装的慢病毒在感染目标细胞后，细胞将稳定表达SV40大T抗原和胸腺嘧啶核苷激酶元件，前者使细胞获得永生化能力， TK元件则可以作为负向筛选的标志，即被病毒感染的细胞在接受甘昔洛韦刺激后将死亡。与此同时，整个慢病毒整合入细胞基因组的所有片段两端将带有LoxP位点可以在Cre重组酶作用下从基因组中消除。 

ii)使由i)所述病毒永生化的细胞可在药物控制下去永生化的载体：表达ER^T2CreER^T2 和新霉素抗性的真核表达载体，将该质粒转染感染i)述慢病毒的细胞中，采用G418抗生素正向筛选出的细胞克隆将可能稳定表达ER^T2CreER^T2蛋白，而表达该片段的细胞在接受4-OH-Tamoxifen药物处理后ER^T2CreER^T2将变成Cre重组酶进入细胞核从而识别基因组内LoxP位点将位点之间的永生化基因从基因组中去除，最终使细胞失去永生化能力进入正常原代培养细胞的细胞周期。而此时再次使用甘昔洛韦药物处理细胞，将杀死没有完全失去SV40T抗原永生化基因的细胞，剩余下来去永生化的细胞。

其中i)所述的使细胞永生化的慢病毒载体，可以单独使用建立永生化细胞系，而配合ii)所述的载体，可以建立在药物诱导下去永生化的细胞系。

本发明提供的可诱导的永生化可逆性小鼠前成牙本质细胞系，是通过以下步骤建立获得：脱颈处死健康怀孕胚胎18.5天母鼠，获取其胚胎，并在体式显微镜下分离获得胚胎鼠下颌第一磨牙牙胚中牙乳头细胞；从中筛选出间充质来源的前成牙本质细胞；依次经过SV40T抗原和胸腺嘧啶核苷激酶编码基因病毒感染和ER^T2CreER^T2基因转染，筛选出具有药物诱导下可逆性永生化小鼠前成牙本质细胞株：mDPC6T。

对mDPC6T细胞增殖和生化特性的鉴定：

细胞形态观察：倒置相差显微镜下观察发现，mDPC6T在培养基中呈现单层生长，多角形，细胞为单核，每个细胞中含有1～3个核仁；在长期培养过程中极难观察到多核细胞；细胞的形态特征可以保持到100世代，并能够继续延续。

本发明所建立的mDPC6T细胞比原代培养的正常小鼠前成牙本质细胞增殖速度显著提高，并且表达前成牙本质细胞的表面标志，可以在体外诱导矿化形成肉眼可见的矿化结节；在裸鼠中不致瘤；生长活跃，100世代的细胞仍未出现老化标志，是一种永生化的小鼠前成牙本质细胞系；而当加入4-羟基他莫昔芬和甘昔洛韦药物之后，细胞生长几乎停止，胞体呈现向一端伸长的极性的成熟成牙本质细胞形态，与原代培养的前成牙本质细胞性状几乎完全按相同。鉴于以上特性，mDPC6T为进一步研究成牙本质细胞生物学特性提供了理想的体外模型，同时也为牙本质再生修复和牙本质发育相关疾病机制研究提供理想的材料。另一方面，这种药物诱导的永生化可逆性的细胞系建立方法为扩增保存一些较难获取或生长缓慢的细胞研究提供了新的思路。

附图说明：

图1为在200倍倒置相差显微镜下观察到的mDPC6T细胞；其中（A）为原代培养的小鼠前成牙本质细胞；（B）为永生化50世代的mDPC6T细胞；（C）为永生化100世代的mDPC6T细胞；（D）为细胞加入4-羟基他莫昔芬和甘昔洛韦处理后细胞的形态； 

图2为mDPC6T体外矿化诱导照片；其中（A）大体观察体外诱导14天后矿化结节；（B）为茜素红染色200倍镜下显示细胞诱导14天后矿化结节；。

图3为蛋白免疫印迹分析显示mDPC6T中成牙本质细胞标志基因Dmp1，Dspp，Nestin,以及SV40Tag的蛋白质表达，以原代培养的成牙本质细胞作为阳性对照，b-actin作为内参照。

具体实施方法：

pCAGER^T2CreER^T2-neo构建体

将pCAGER^T2CreER^T2(Addgene)采用NotI和EcoRI限制性内切酶双酶切，获取长度为2951bp大小的ER^T2CreER^T2全长编码序列，并将pCAG2LMKSOimO(Addgene)用NotI和EcoRI酶切获得带有新霉素抗性（neoR）片段的以CAG作为启动子的真核表达骨架，最后将ER^T2CreER^T2全长编码序列插入该缺口中，获得pCAGER^T2CreER^T2-neo。

可逆性小鼠成牙本质细胞系

根据提供者的说明书，本发明分离培养Swiss小鼠胚胎期18.5天下颌第一磨牙的牙胚成牙本质细胞，并将pLOX-tTagiresTK包装的慢病毒感染该细胞，克隆筛选获得同时表达SV40大T抗原和胸腺嘧啶核苷激酶的细胞株mDPC6T，该细胞可以在常规培养模式条件下快速增值，传代超过100代而不出现衰老现象，而且成牙本质细胞标志性基因能稳定的表达于不同代数的细胞里，细胞具有可矿化诱导性质，因此是具有永生化特性的成牙本质细胞。另一方面该细胞永生化基因SV40大T抗原编码序列两端含有LoxP位点，在Cre重组酶作用下可以从基因组中脱离，而丧失永生化的能力。因此该细胞的永生化性能具有可逆性。

药物诱导性可逆性小鼠成牙本质细胞系

在可逆性小鼠成牙本质细胞系mDPC6T的基础上，本发明采用FuGene HD（德国Roche公司）转染pCAGER^T2CreER^T2-neo（SEQ ID NO:1），将细胞置于含有200ug/ml G418（美国Merck公司）的筛选培养基培养下，选择存活克隆，并验证ER^T2CreER^T2全长编码序列整合入细胞基因组内，将该株细胞命名为mDPC6T-EC。在常规细胞培养条件下向培养基内加入含有10uM 4-OH-Tomaxifen 的培养基 2ml/孔，作用4天后，更换含有20ug/ml GCV的培养基2ml/孔，杀死具有SV40大T抗原的细胞，所剩余的细胞即为去永生化的细胞，其生长特性以及成牙本质细胞标志基因的表达于原代细胞类似。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1 一种可逆性小鼠成牙本质细胞系的建立

首先从胚胎18.5天Swiss小鼠胚胎中获得原代培养的前成牙本质细胞。从湖北省实验动物研究中心获得怀孕18.5天Swiss母鼠，带回细胞实验室，脱颈处死，立即从孕鼠子宫内分离出胚胎18.5天小鼠胚胎；以下操作均在无菌操作台上进行。用含有青霉素-链霉素双抗的PBS（美国Invitrogen 公司）冲洗干净胚胎表面的血块，粗略分离出胚胎下颌，并转移至新鲜的PBS缓冲液中，于体式显微镜下寻找并分离出下颌第一磨牙牙胚，机械分离牙胚表面的上皮组织，获得牙乳头组织，并用无菌显微系结镊将牙乳头组织捏碎至大小0.1～0.5mm³大小的碎组织块，浸泡于新鲜的含有青霉素-链霉素双抗的PBS缓冲液中。向6-well细胞培养板（日本IWAKI公司）中每孔滴加大约600uL的含有20%澳洲胎牛血清（美国Thermo Fisher Scientific公司）的高糖DMEM培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司），使培养基均匀铺平整个培养板，按照每孔9个组织块的密度将牙乳头组织贴在培养板上，于37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养过夜。次日在倒置相差显微镜下可以看到贴壁组织块周围有细胞“爬出”，并向每孔添加1mL含有20%胎牛血清的培养基。

然后从培养细胞中分离间充质来源的细胞，即前成牙本质细胞。在上述培养条件下，每两天更换一次培养基。大约1周后，细胞生长密度较大，绝大多数细胞为间充质来源细胞，胞体较大，性状为圆形或多角形。而有少数细胞为上皮来源细胞，胞体小，呈铺路石状，而且由于上皮细胞在该培养基中生长缓慢，数量极少。通过差速消化的方法获得间充质来源的细胞，具体方式如下：吸取培养板中的培养基，并用细胞培养用PBS缓冲液冲洗细胞两次，向每孔细胞中轻轻滴加1mL浓度为0.25%胰酶（美国Invitrogen 公司），室温消化2分钟左右，在倒置相差显微镜下可以发现胞体较大的细胞，即间充质来源细胞周围逐渐脱离培养板，而上皮来源细胞则无任何被消化的现象。吸去胰酶，向每孔中加入2mL含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，吹打消化下来的间充质来源细胞，镜下可以发现吹打后上皮来源的细胞仍保留在原培养板上。将吹打下来的细胞按照1：2的比例传代至新的培养板上，即获得原代培养的牙乳头细胞即成牙本质细胞。

随后向细胞导入SV40大T抗原。分两部分：1 慢病毒pLOX-tTagiresTK的包装；2 慢病毒感染细胞及筛选。

1 慢病毒pLOX-Ttag-iresTK的包装

具体方法如下：

1）共转染293FT（美国Invitrogen公司）细胞前24小时，将细胞按照1X10⁶的量接种于六孔板中一孔，体积为1.5mL；

2）在一个消毒的Eprendorf管中用170uL无血清高糖DMEM培养基溶解2ug pLOX-Ttag-iresTK (Addgene:12246)1.6ug psPAX2(Addgene: 12260)和0.6ug pMD2.G（Addgene：12259）质粒，混匀；

3）向2）配置的混合液中加入8.5uL FuGene HD（德国Roche公司），轻柔的用微量移液器吹打混匀，室温静置15分钟；

4）将3）中混匀的试剂，均匀的滴加入1）所准备的293FT细胞培养基中，轻轻晃匀，于37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养过夜；

5）转染24小时后，更换4）述培养过夜的细胞培养基，于37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养；

6）转染48小时，72小时收集5）培养细胞的细胞培养液，并更换新鲜培养基；

7）6）所收集的细胞培养液即为含有慢病毒的液体，将收集的慢病毒液通过孔径为0.4um的滤器，除去其中死细胞成分，所获得的液体即可作为pLOX-tTagiresTK慢病毒使用。

2 慢病毒感染细胞及筛选

具体方法如下：

1）用无核酸酶超纯水（美国Invitrogen公司）配置浓度为8ug/uL的Polybrene （美国Sigma公司），0.22um孔径的滤器（(美国Merck Millipore 公司）抽滤除菌；

2）胰酶消化上述培养的第一代成牙本质细胞，成细胞悬液，计数，将浓度调整为1X10⁵/mL，取0.5mL细胞悬液，与上述制作的慢病毒液体0.5mL混合均匀，并向里加入1uL浓度为8ug/uL的Polybrene（美国Sigma公司），全部加入到6孔板的一个孔中，于37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养过夜；

3）慢病毒感染12小时后，将2）培养的细胞更换新鲜的含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基；

4）由于表达SV40大T抗原的细胞生长速度很快，而原代培养的成牙本质细胞生长速度极为缓慢并且很难体外培养很难超过5代，因此随着继续培养传代，成功感染上SV40大T抗原慢病毒的细胞将占所有细胞的绝大多数；将感染后的细胞持续培养，当细胞张至80%密度时，按照1：3~1:5的比例传代，并于37℃，5% CO₂恒温细胞培养箱中培养；

5）传代5代后，将细胞消化计数，将浓度调整为1X10³/mL，吸取7mL接种于直径10cm的细胞培养皿中，于37℃，5 %CO₂恒温细胞培养箱中培养，每3天更换一次培养基，直至镜下出现明显的细胞克隆；

6）将5）中获得的细胞克隆采用克隆环消化从培养皿中消化传代扩增，每个克隆扩增出的细胞均在早代冻存：细胞消化后，移入15mL离心管，300g离心5分钟，弃上清，加入含有50%胎牛血清10%二甲亚砜的高糖DMEM培养基，将浓度调整为10⁷以上，分装入1.5mL细胞冻存管中，将冻存管放入细胞冻存程序降温盒中（美国Nalgene公司）,然后转移至-80℃冰箱过夜，次日将冻存细胞转移至液氮冻存；

7）用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基配置含有GCV（美国Sigma公司）浓度为10uM的筛选培养基；

8）将同一克隆按照等浓度分别接种于24孔板的两孔中，待细胞长至80%密度，一孔换成含有GCV的培养基，而另一孔则是新鲜的10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，前者作为实验组，后者作为对照组，将细胞于37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养；

9）3日后，在镜下观察8）培养的细胞，如果加入GCV培养基的细胞有大量死亡而对照组没有异常变化，那么就证明该克隆的细胞基因组已经稳定的整合入含有编码SV40大T抗原以及TK的编码片段，将该克隆保留为后续鉴定筛选；

经过以上过程，共获得12个稳定的克隆细胞株，分别被命名为mDPC1T～mDPC12T，其中mDPC6T表达成牙本质细胞标志基因最为显著，至今已传代超过100代，并没有出现任何衰老特征。细胞生物学认为，细胞传代超过100代被认为是具有永生化水平，我们所建立的mDPC6T已经是永生化的细胞。

实施例2 一种可诱导可逆性小鼠成牙本质细胞系的建立

1）pCAGER^T2CreER^T2-neo质粒构建

将pCAGER^T2CreER^T2(Addgene:13777)采用Not I（美国NEB公司）和EcoR I（美国NEB公司）限制性内切酶双酶切，获取长度为2951bp大小的ER^T2CreER^T2全长编码序列，并将pCAG2LMKOSimO(Addgene:20866)用Not I和EcoR I酶切获得带有新霉素抗性（neoR）片段的以CAG作为启动子的真核表达骨架，最后将ER^T2CreER^T2全长编码序列插入该缺口中，获得pCAGER^T2CreER^T2-neo (SEQ ID NO:1)，而不插入编码序列的质粒骨架直接采用平端连接作为空白对照质粒：pCAG-neo。

2）构建药物性诱导的可逆性小鼠成牙本质细胞系

将早代的mDPC6T细胞系传代至6孔细胞培养板中，待细胞铺满细胞培养皿50%左右时，进行基因转染，具体方法如下：

（1）至少准备两孔细胞；

（2）在两个无菌1.5mLEppendorf管内，用200uL的OptiMEM减血清培养基（美国Invitrogen 公司）分别溶解2ug的pCAGER^T2CreER^T2-neo质粒或者pCAG-neo质粒，前者作为实验组，后者作为空白对照组；

（3）向两管中分别加入8uL FuGene HP（德国Roche公司），轻轻吹打混匀，室温静置15分钟；

（4）将两管转染混合物分别均匀滴加入两个孔板细胞中，轻轻摇匀，于37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养；

（5）转染后两天，实验组和空白对照组细胞培养基均换成含200ug/ml G418的10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37℃，5% CO₂恒温细胞培养箱中连续培养10天，并通过更换新的G418培养基弃去死亡细胞；

之后进行细胞克隆和增殖工作。细胞经过上述筛选实验后，空白对照组的细胞几乎全部死亡，而实验组确有10%的细胞存活，并有少量呈现小克隆生长，借助显微镜观察，标记克隆。克隆环消化，每个克隆单独传代扩增，细胞按照1：3比例传代扩增，每个克隆按照应用实例一所述方法冻存。

提取每个克隆细胞的基因组DNA，采用PCR验证ER^T2CreER^T2全长编码序列是否整合入基因组DNA内，具体方法如下：

（1）将每个克隆的细胞分别传代入6孔板的一个孔内培养；

（2）待细胞生长至90%密度时用0.25%胰酶将每孔细胞消化，离心收集每孔细胞，向每管细胞沉淀中加入200uL 溶有2mg/mL蛋白酶K（美国Invitrogen公司）的TE缓冲液（pH=8.0，中国天根公司），在60℃中孵育1小时；

（3）1小时后，向（2）管中加入200uL的酚，氯仿，异戊醇溶液（25：24：1，pH=8.0），用力震荡15秒，4℃ 15000g离心10分钟；

（4）抽取上清，保存，取1uL作为PCR模板，采用Cre特异性引物（正向：5’-ATGTCCAATTTACTGACC-3’；负向：5’-CTAATCGCCATCTTCCAG-3’；产物大小：1032bp；由美国Invitrogen公司合成）按照如下反应条件进行PCR验证，选择有阳性条带的克隆作为ER^T2CreER^T2全长编码序列整合入基因组的细胞系，而这些细胞系即为可药物诱导性可逆性小鼠成牙本质细胞系。

PCR反应体系在冰上按如下成分混匀：

10×PCR缓冲液（日本TAKARA公司）       5uL

MgCl2（25mmol/L,日本TAKARA公司）      2uL

dNTP(各10mmol/L)                       1uL

正向引物（10umol/L）                   1uL

负向引物（10umol/L）                   1uL

无核酸酶水（美国GIBICO公司）          37uL

上清                                   1uL

Taq DNA polymerase（日本TAKARA公司）  1uL

混匀后，在PCR仪上如下程序扩增：94℃/3min→[94℃/30sec→58℃/30sec→72℃/1min]×33个循环→72℃/10min。引物交美国Invitrogen公司测序，将产物序列与Genebank中Cre重组酶序列BLAST比对验证。

经过上述实验筛选验证，获得三个稳定的克隆细胞株，命名为mDPC6TEC， mDPC7TEC，mDPC8TEC。以下以mDPC6TEC为例进行相关实验的描述。

实施例3 一种可诱导可逆性小鼠成牙本质细胞系的特性鉴定

1）  细胞增殖速度分析

将第3代的原代培养前成牙本质细胞和待鉴定的mDPC6T（每孔细胞数1*10⁵）传代至6孔板，每种细胞做3组副孔。使用EdU细胞增殖检测试剂盒（中国锐博公司）检测细胞增殖能力。具体方法如下：

（1）传代24小时后使用含1%FBS的DMEM培养基培养24小时，EdU1:1000培养基培养4小时。

（2）4%多聚甲醛固定 15分钟。

（3）0.2%甘氨酸室温孵育 10分钟。

（4）PBS 冲洗2次，每次5分钟

（5）使用含0.5% triton-100的PBS透化10分钟

（6）PBS冲洗 一次5分钟。

（7）使用Apoolo 染色液 每孔1ml，避光室温孵育30分钟。

（8）含0.5% triton-100的PBS 3次 每次5’

（9）Hochest 1:100避光孵育 10分钟。

（10）PBS 冲洗十分钟。

（11）EdU在550nm激发光下显示红色荧光。 Hochest在紫外光激发下显示蓝色荧光。

（12）随机选取5个视野每孔进行计数。EdU染色阳性细胞数占总细胞数的比例反映细胞增殖能力。

实验结果显示：mDPC6T细胞增殖能力显著高于原代培养的细胞。

）  细胞衰老检测

将第6代的原代培养前成牙本质细胞和第50代的mDPC6T分别传代至六孔板（细胞数1*10⁵）24小时后使用细胞衰老检测试剂盒（中国碧云天公司）鉴定细胞衰老指标。具体方法如下：

（1）吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，每孔加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。

（2）吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。

吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工作。工作液配制方法：β-半乳糖苷酶染色液A：10μl ，β-半乳糖苷酶染色液B：10μl，β-半乳糖苷酶染色液C：930μl， X-Gal溶液：50μl。

（3） 37℃孵育过夜，用保鲜膜封住6孔板防止蒸发。

   （4） 倒置显微镜下观察。

衰老细胞胞浆会被染为蓝色，每孔随机选取5个视野，计数后进行统计学分析。

实验结果显示：6代的原代培养前成牙本质细胞已有部分细胞发生衰老，而第50代的mDPC6T细胞未见衰老阳性的指标。

）  细胞矿化能力研究。

将第6代的原代培养前成牙本质细胞和第6代mDPC6T分别传代至六孔板（细胞数2*10⁵），48小时后加入矿化诱导培养基。其成分为：含有10%胎牛血清， 10 nmol/L地塞米松（美国Sigma公司），50ug/ml维生素C（美国Sigma公司）， 10 nmol/Lβ甘油磷酸钠（美国Sigma公司），100u/ml青霉素,100u/ml链霉素（美国Invitrogen公司）的DMEM培养基。

加入诱导液当天记为0天。每72小时换一次矿化诱导。分别在0，1,5,7,11,14天提取细胞蛋白和RNA。在0,7,14天固定细胞做茜素红染色。具体方法为：

（1)蛋白质提取：

①吸去细胞培养基，使用预冷的PBS冲洗细胞。

②加入蛋白裂解液M-PERTM（美国Thermo Fisher Scientific公司），400ul/孔。冰上孵育5分钟。

③使用细胞刮刮下贴壁的细胞形成细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管。

④涡旋振荡器上振荡15秒，冰上孵育十分钟。重复3次。

⑤4℃，13000rpf离心15分钟

⑥吸取上清，-80℃保存。

（2）RNA提取

①吸去细胞培养基，使用DEPC处理后的PBS冲洗细胞。

②加入TriZol（美国Invitrogen公司），1ml/孔。室温孵育5分钟。

③吹打细胞形成细胞悬液，转移至1.5ml离心管。

④加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置10分钟。

⑤4℃，13000rpf离心15分钟

⑥小心吸出上层的水相液体大致300ul，转移至新的EP管。

⑦在管中再加入0.5ml异丙醇。小心的摇匀，室温放置10分钟。

⑧4℃，13000rpf离心10分钟.

⑨弃上清，加入75%乙醇漂洗, 4℃，7500rpf离心5分钟。

⑩室温干燥10分钟，加入20ulDEPC水溶解沉淀。测浓度。

（3）矿化结节染色。

①将0.5g茜素红粉剂（美国Sigma公司）溶于100ml Trish-HCl中，配置为0.5%茜素红染色液。调PH至7.2，避光4℃保存备用。

②吸去细胞培养基，使用PBS冲洗细胞。

③95%乙醇固定10分钟。

④PBS冲洗5分钟，重复三次。

⑤加入茜素红染色液每孔1ml，37℃孵育1小时。

⑥使用ddH₂O洗去底色。

⑦倒置显微镜下照相，进行结节计数。

实验结果显示，同原代培养的前成牙本质细胞相似，在矿化诱导培养基培养14天后，mDPC6T也可产生正常的矿化结节。

）成牙本质细胞标志基因表达验证

(1)将3）所获得的蛋白质进行蛋白印记实验。

主要步骤为：

①20ul蛋白提取物加入蛋白上样缓冲液5ul，95℃变性5分钟。

②10%SDS PAGE胶上每孔上样20ul。

③60V电压下电泳30分钟后，100v1电泳1小时。

④使用PVDF膜（德国Roche公司）转印，75V电压下转印2.5小时。

⑤丽春红染色确认转印成功。

⑥将PVDF膜用封闭液室温下封闭1小时；

⑦在封闭液中加入一抗：NESTIN（美国eBioscience公司）、DMP1（美国Biovision公司）、DSP（美国Santa Cruz 公司）、β-actin（美国Santa Cruz 公司），4℃孵育过夜；

⑧一抗孵育结束后用TBST漂洗，10分钟×5次；

⑨加入HRP标记的IgG二抗（美国Santa Cruz 公司）（用TBST稀释到适当浓度），置于摇床中室温孵育1.5小时，孵育结束后用TBST漂洗，10分钟×5次；

⑩ECL化学发光显色、显影、定影：在暗室中将PVDF膜放入新鲜配制的ECL试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）中发光，胶片（美国柯达公司）显影，定影，照相。

     

(2)将3）所获得的RNA进行Realtime RT-PCR实验。

(A)使用反转录试剂盒（日本Takara公司）将RNA反转录为cDNA。

反应体系如下：

试剂            体积（μl）RNase Free H2O75×RT Buffer4dNTP Mixture2RNase inhibitor1OligdT1Total RNA5Total Volume20

反转录（RT）温度循环如下：

54℃， 20分钟；99℃，5分钟；4℃，5分钟，终止反应。

 

(B)DMP1、DSPP、ALP及GAPDH引物序列（美国Invitrogen公司）见下表

 (C)Realtime RT-PCR反应（日本Takara公司）。体系如下表：

反应液的配制在冰上进行。

反应条件如下：

95℃预变性30秒；

95℃变性5秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环；

72℃延伸5分钟。

实验结果显示：mDPC6T细胞可表达成牙本质细胞特征性基因如Dmp1,Dsp,Nestin,这些标志基因随着矿化诱导，表达逐渐增强。

实施例 4 可诱导可逆性小鼠成牙本质细胞系安全性分析

1）  细胞致瘤性分析

 将ACC细胞和待鉴定的mDPC6T传代至T175培养瓶中，待细胞长满后，消化离心。

使用DMEM培养基重悬细胞，达到密度1*10⁷ 个/ml. 从湖北省实验动物研究中心获得裸鼠，将细胞悬液注射入裸鼠皮下；左侧注射ACC细胞，右侧注射待鉴定的mDPC6T细胞。每个位置注射200ul，缓慢注射，在皮下形成一个皮丘。14天后查看肿块形成情况。脱颈法处死裸鼠，取下肿块，拍照，HE染色。

实验结果显示：ACC细胞注射区形成明显的肿块，切片显示为肿瘤细胞，而没DPC6T细胞注射区未见到肿块，切片未见到肿瘤细胞。结果说明mDPC6T无成瘤性或低成瘤性。

）  染色体核型分析

（1）细胞试验前达到50%融合度，实验前一天细胞换液。

（2）秋水仙素（美国Sigma公司）处理细胞，37℃孵育2小时。

（3）将培养细胞用0.25%胰酶消化吹打混匀，分装到离心管中，1500rpm水平离心10分钟，弃上清。

（4）向沉淀中加入37℃温浴的0.075MKCL 5ml，轻轻混匀，5分钟后，立即加入卡诺固定液2ml，混匀。

（5）水平离心机1500rpm离心10min，弃上清。

（6）向沉淀中加入37℃温浴的卡诺固定液7ml，轻轻混匀。

（7）水平离心机1500rpm离心10min，（如果发现细胞中有发黄物质可以再次用固定液洗涤方法同（6）弃上清，留0.5ml-1ml液体，重悬沉淀。

（8）吸取细胞悬液滴片（玻片事先放入4℃冰箱冰冻），置75℃烤箱中3小时干片。

（9）取2.5%的胰酶储存液，用PH7.4的磷酸缓冲液稀释成0.025%的工作液，置于37℃水浴中温浴。

（10）取染色体片置于胰酶中消化55秒-2min.

（11）取染色体片，去掉胰酶，放入配置好的磷酸缓冲液中冲洗两次。

（12）甩掉液体，然后放入Gimsa（美国Sigma公司）染液中染色2-3min。

（13）        双蒸水冲洗2分钟，吹干。

（14）显微镜观察并作图。

染色体核型分析结果显示，mDPC6T细胞为40条染色体。未发现染色体数目畸变。

实施例 5 小鼠成牙本质细胞系去永生化实验

该实例介绍通过药物刺激使可诱导可逆性小鼠成牙本质细胞系仅在胞质中表达的ER^T2CreER^T2进入细胞核，识别永生化基因SV40大T抗原编码序列两端的LoxP位点，将永生化基因从基因组中移除，从而使细胞失去永生化能力。在药物筛选下获得完全没有永生化基因的细胞。具体操作如下：

1）将培养至50代的mDPC6TEC细胞，消化传代至六孔板中，待细胞张至密度为30%~50%，加入含有10uM 4-OH-Tomaxifen和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养4天，两天更换一次含有4-OH-Tomaxifen的培养基；

2）为1）中培养的细胞更换成含有10uM GCV和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5%CO₂恒温细胞培养箱中培养3天，死亡的细胞大多数为仍表达SV40大T抗原具有永生化性质的细胞，而剩余的基本为不具有永生化能力的细胞；

3）鉴定细胞去永生化：

该步分为两部分，分别从DNA和蛋白质角度验证2）存活下来的细胞不表达SV40大T抗原，具体步骤如下：

（1）PCR验证细胞基因组内不含有SV40大T抗原编码序列：

①按照实例2中所述方法提取存活细胞及mDPC6TEC细胞基因组DNA，前者DNA作为实验组，后者为阳性对照；

②采用SV40大T抗原特异性引物（正向：5’-AGCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAGTAAG-3’；负向：5’-GACTTTGGAGGCTTCTGGATGCAACTGAG-3’；产物大小：751bp；由美国Invitrogen公司合成）进行PCR，水作为阴性对照；

③产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可见实验组和阴性对照组均未见目的条带，而阳性对照组在800bp附近出现唯一的明显条带

通过以上实验及结果，我们得知经过4-OH-Tomaxifen和GCV依次处理的mDPC6TEC细胞已经丧失编码SV40大T抗原的DNA序列。

（2）蛋白印迹实验

①按照实例3中提取存活细胞及mDPC6TEC细胞总蛋白，前者DNA作为实验组，后者为阳性对照。

②按照实例3中方法，采用SV40大T抗原单克隆抗体（美国Biovision公司）进行蛋白印迹实验（一抗浓度：1:800，二抗浓度为1：2000）；使用ACTIN为内参抗体。

③蛋白印迹实验结果显示实验组未见目的条带，而阳性对照组在95KD附近出现唯一的明显条带。以上结果证实：经过4-OH-Tomaxifen和GCV依次处理的mDPC6TEC细胞已经不再表达SV40大T抗原。

以mDPC7TEC和mDPC8TEC细胞进行相关实验，也取得了上述类似的结果。

序列表

 

<110>  武汉大学

<120>  诱导可逆性永生化前成牙本质细胞系及其建立方法

<130> 

<160>  9    

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  9385

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg       60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg      120

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ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt     5520

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gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg     6540

gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt     6600

tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg     6660

cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc     6720

ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag     6780

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