一种克服美洲黑杨×中国山杨杂交障碍的方法

摘要

本发明公开了一种克服美洲黑杨×中国山杨杂交障碍的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1)按照包括如下步骤的方法处理母本柱头：A)用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头；B)用所述母本的花粉水提液涂抹经步骤A)处理的所述母本的雌花柱头；2)将雌蕊柱头经过步骤1)所述方法处理的所述母本与作为父本的杨树杂交，得到杂交种；所述母本为杨属黑杨派杨树；所述父本为杨属白杨派或山杨亚派杨树；所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液体。本发明所提供的方法可以有效地克服杨属黑杨派与白杨派杨树间杂交的不亲和性，实验证明，通过该方法获得杂交种子的结实率高，饱满度好，种子发芽率可达78.2％，为杨树远缘杂交获得优良杂种无性系提供了一种新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种克服美洲黑杨×中国山杨杂交障碍的方法。

背景技术

杨属树种根据形态特征、地理分布和杂交亲合力分为5派即：白杨派(Leuce或Poplus)、黑杨派(Aigeiros)、青杨派(Tacamahaca)、大叶杨派(Leucoides)、胡杨派(Turanga)，白杨派又分为白杨亚派、山杨亚派，但种内变异丰富，种间天然和人工杂种较多，使得杨树不同派间或种间的亲缘关系不同，亲缘关系较近的杨树之间容易杂交，而亲缘关系较远的杨树存在杂交障碍。Willing R.R和Pryor L.D.(1976年)研究了多种杨树的种间杂交后，认为青、黑、大叶杨三派之间可配性高，容易杂交，而白杨派与其它四派可配性差，很难杂交，胡杨派亦然。

但由于白杨派、黑杨派两派间许多经济性状优缺点互补，因此有必要通过杂交等手段，把两派间的优良性状集于一体，获得黑白杨优良杂种无性系。国内外不少育种学家对黑白杨之间杂交进行研究，国外研究的主要有Knox等(1972年)所做的美洲黑杨×欧洲山杨杂交，几乎没有得到种子。Guris和Stelttler(1976年)做了28个组合的杨树杂交试验，发现美洲山杨与黑杨、青杨杂交严重不亲合，授粉12h后，仅有少数花粉萌发。他们还发现美洲黑杨的花粉管不能进入美洲山杨的柱头，而是在其表面扭曲生长。Ronald(1982年)用5种白杨作母本，做了58个组合的杨树派间杂交试验，发现用原种白杨作母本的大多数组合，花粉发芽率低，而用杂种白杨作母本的组合，花粉发芽率相对较高，所得杂种在形态上介于两亲本之间，能扦插生根。Rougier(1992年)研究美洲黑杨×银白杨，发现花粉管长到花柱底部就出现沉积现象。国内这方面的工作主要有，徐纬英(1988)用母本花粉的糖蛋白处理柱头技术做了银白杨×欧洲黑杨、毛白杨×欧美杨等组合的杂交，但是幼胚仍然败育。张金风等(1999年)进行了21个杂交组合白杨与黑杨派间杂交试验，结果表明，白杨派与其它派杂交没有获得苗木。张金风等(2000年)利用黑杨与青杨的杂种作为中介亲本，成功地得到了杨树派间杂种。

目前，急需一种有效地克服杨树派间、杨树派内种间杂交不亲和性的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种克服美洲黑杨×中国山杨杂交障碍的方法。

本发明所提供的方法包括如下步骤：

1)按照包括如下步骤的方法处理母本柱头：A)用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头；B)用所述母本的花粉水提液涂抹经步骤A)处理的所述母本的雌蕊柱头；

2)将雌蕊柱头经过步骤1)所述方法处理的所述母本与作为父本的杨树杂交，得到杂交种；

所述母本为杨属黑杨派杨树；

所述父本为杨属白杨派或山杨亚派杨树；

所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液体(提取液)。

所述花粉水提液制备过程中，所述提取在20-25℃进行。

可按照如下方法用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头：将雌花序竖直伸入盛有液态正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm，用正己烷的挥发气熏雌蕊柱头5～10min。

所述花粉水提液按照包括如下步骤的方法制备：将所述母本的花粉用水提取50-70min后收集不含花粉粒的液体，该液体即为花粉水提液。

所述提取中所述母本的花粉与水的配比为每克所述母本的花粉与20-30ml蒸馏水混合。

所述方法中，所述母本具体可为美洲黑杨(Populus deltoides)；所述步骤A)是在所述母本的雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头。

所述方法中，所述父本具体可为中国山杨(Populus davidiana)。

所述方法具体可为：所述提取的时间为60min、所述母本的花粉与水的配比为每克所述母本的花粉与25ml蒸馏水混合，所述用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头的时间为8min。

所述方法还可具体为：所述提取的时间为70min、所述母本的花粉与水的配比为每克所述母本的花粉与30ml蒸馏水混合，所述用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头的时间为10min。

所述方法还可具体为：所述提取的时间为50min、所述母本的花粉与水的配比为每克所述母本的花粉与20ml蒸馏水混合，所述用正己烷的挥发气熏所述母本的雌蕊柱头的时间为5min。

本发明所提供的方法可以有效地克服杨属黑杨派与白杨派杨树间杂交的不亲和性，尤其是有效地克服了美洲黑杨(Populus deltoides)和中国山杨(Populusdavidiana)的杂交障碍，实验证明，通过该方法获得杂交种子的结实率高，饱满度好，种子发芽率可达78.2％，为杨树远缘杂交获得优良杂种无性系提供了一种新的途径。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、美洲黑杨×中国山杨的杂交实验

1、实验材料

本实施例所用的母本和父本分别为：

母本：美洲黑杨辽宁杨(Populus×Liaoningnsis Z.Wang et H.D.Chen cv.nov)(陈鸿雕，潘成良，刘志成，等.新杂交种辽宁杨、辽河杨、盖杨的选育，林业科技通讯，1995(11)：16-18，公众可从辽宁省杨树研究所获得)，为杨属(Populus)黑杨派杨树；

父本：中国山杨(Populus davidiana)(邢亚娟.中国山杨与美洲山杨杂交种新品系选育研究[D]，东北林业大学，2005，公众可从辽宁省杨树研究所获得)，为杨属(Populus)白杨派山杨亚派杨树。

2、实验方法与操作步骤

本实验共设计5种杂交的处理方法，分别如下：处理1是对照，常规授粉；处理2是母本花粉水提液点涂母本雌蕊柱头后正常授粉；处理3是正己烷有机溶剂熏母本雌蕊柱头后正常授粉；处理4是用正己烷有机溶剂熏母本雌蕊柱头后再用母本花粉水提液点涂柱头，然后正常授粉；处理5是用正己烷有机溶剂点涂母本雌蕊柱头后正常授粉。每个处理2根花枝共9个花序，分3次重复。观测每个处理所获得的种子数、种子饱满度、千粒重及发芽率等。

操作方法如下：

1)花枝的采集与花粉的收集

2月份采集美洲黑杨辽宁杨和中国山杨的雄花枝入温室，切枝水培，室温控制在15-25℃，相对湿度为50-70％。散粉前套袋隔离，分别收集花粉，收集的花粉放入消毒的培养皿里(培养皿上贴上标签，注明品种、日期等)，然后将培养皿放入干燥器中干燥24小时，密封后放入0-4℃冰箱中的干燥器内备用。在收集花粉时将美洲黑杨辽宁杨雌花枝入温室，切枝水培，室温控制在25℃左右，相对湿度为50-70％。美洲黑杨辽宁杨花芽膨大后即套袋隔离，水培至雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时进行杂交试验。

2)杂交

处理1：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，按常规方法进行正常授粉，即用毛笔粘少量收集的父本中国山杨花粉轻轻抖动，将花粉洒在母本的雌蕊柱头上，授粉时毛笔不能触及柱头，授粉量不宜过多，用放大镜观察授粉后的柱头上均匀密布花粉即可(授粉时间最好在上午10时前后)。授粉次数在三日内连续进行，一天一次。

处理2：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，用毛笔尖蘸取美洲黑杨辽宁杨花粉水提液，轻轻地点涂于雌蕊柱头，点涂均匀，放置0.5-1.0小时后待水取液干后，然后按处理1的方法进行授粉。

处理3：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，将美洲黑杨辽宁杨雌花序伸入盛有正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，试管内液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm。用正己烷挥发的气体熏雌花柱头8min后按处理1的方法进行正常授粉，期间用手握住试管下部以促进挥发。

处理4：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，将美洲黑杨辽宁杨雌花序竖直伸入盛有液态正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，试管内液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm，用正己烷的挥发气熏雌蕊柱头8min后，再用毛笔尖蘸取美洲黑杨辽宁杨花粉水提液，轻轻地点涂于雌蕊柱头，点涂均匀，放置0.5-1.0小时后待花粉水提液干后，按照处理1的方法进行授粉。

处理5：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，用毛笔尖蘸取正己烷轻轻点涂在雌蕊柱头上，放置0.5-1.0小时后待正己烷液干后，按照处理1的方法进行授粉。

上述美洲黑杨辽宁杨花粉水提液的制备方法如下：

20-25℃条件下，按1g母本美洲黑杨辽宁杨花粉与25ml蒸馏水的比例混合并进行充分搅拌，静置30min，再充分搅拌静置，反复2次，然后以定性滤纸过滤，所得浅黄色滤液即为花粉水提液，经检测，该花粉水提液中不含花粉粒。

3)杂交后的培养

授粉后继续水培，室内温度控制在15-25℃、湿度控制在50-70％，每两天换1次水，直至蒴果变黄或有裂嘴果粒时，用有透明窗的羊皮纸袋将果穗套上，待蒴果开始飞絮后，收集种子在温室内进行播种育苗，播种容器采用72孔或128孔规格的穴盘，播种土壤用高温灭菌的腐质土，1穴1粒种子，不用覆土，保持土壤湿润，待小苗长出3片真叶后移到室外，每天浇水2-3次，保持土壤湿润，待幼苗长出5-8片真叶后移入大田。

4)杂交后代的表型观测

当杂种苗平均株高为50cm时，用形态学标记的方法对杂种苗的特征进行观测，主要观测叶形以及叶边缘、叶基部、叶柄及芽的特征等。

3、试验结果

美洲黑杨与中国山杨杂交，经不同方法处理后，所获得的杂交种子数、种子饱满度、千粒重及发芽率观测结果见下表。

表1.不同处理获得的杂交种子调查表

  种子数(粒)  饱满度 千粒重(g)  发芽率(％) 处理1  53  --  0.184  0 处理2  98  不饱满  0.264  5.0 处理3  156  不饱满  0.256  6.4 处理4  252  饱满  0.385  78.2 处理5  81  不饱满  0.279  10.0

由上表得知，美洲黑杨与中国山杨杂交各处理均获得了种子，但所获得的种子数及品质差别达显著水平，处理4所获得的种子数及品质比其他几个处理都要好。

对处理4得到的杂种苗进行特征观测的结果为：杂种苗中，150株苗木叶为卵圆形，基部截形，边缘锯齿较大而浅，但不具半透明边，叶背白色，叶柄圆柱形，芽被绒毛，呈父本特征，另47株苗木叶为菱状卵形，先端长渐尖，基部楔形，边缘具圆锯齿，并有半透明狭边，两面皆为绿色，叶柄长而侧扁，芽有粘质，呈母本特征，观测结果表明杂交得到的种子均为美洲黑杨辽宁杨与中国山杨的杂交种，从而说明处理4是克服美洲黑杨与中国山杨间杂交障碍的最佳方法。

实施例2、美洲黑杨×中国山杨的杂交实验

1、实验材料

本实施例所用的母本和父本分别为：

母本：美洲黑杨辽宁杨(Populus×Liaoningnsis Z.Wang et H.D.Chen cv.nov)(陈鸿雕，潘成良，刘志成，等.新杂交种辽宁杨、辽河杨、盖杨的选育，林业科技通讯，1995(11)：16-18，公众可从辽宁省杨树研究所获得)，为杨属(Populus)黑杨派杨树；

父本：中国山杨(Populus davidiana)(邢亚娟.中国山杨与美洲山杨杂交种新品系选育研究[D]，东北林业大学，2005，公众可从辽宁省杨树研究所获得)，为杨属(Populus)白杨派山杨亚派杨树。

2、实验方法与操作步骤

本实验共设计5种杂交的处理方法，分别如下：处理1是对照，常规授粉；处理2是母本花粉水提液点涂母本雌蕊柱头后正常授粉；处理3是正己烷有机溶剂熏母本雌蕊柱头后正常授粉；处理4是用正己烷有机溶剂熏母本雌蕊柱头后再用母本花粉水提液点涂柱头，然后正常授粉；处理5是用正己烷有机溶剂点涂母本雌蕊柱头后正常授粉。每个处理2根花枝共9个花序，分3次重复。观测每个处理所获得的种子数、种子饱满度、千粒重及发芽率等。

操作方法如下：

1)花枝的采集与花粉的收集

2月份采集美洲黑杨辽宁杨和中国山杨的雄花枝入温室，切枝水培，室温控制在15-25℃，相对湿度为50-70％。散粉前套袋隔离，分别收集花粉，收集的花粉放入消毒的培养皿里(培养皿上贴上标签，注明品种、日期等)，然后将培养皿放入干燥器中干燥24小时，密封后放入0-4℃冰箱中的干燥器内备用。在收集花粉时将美洲黑杨辽宁杨雌花枝入温室，切枝水培，室温控制在25℃左右，相对湿度为50-70％。美洲黑杨辽宁杨花芽膨大后即套袋隔离，水培至雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时进行杂交试验。

2)杂交

处理1：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，按常规方法进行正常授粉，即用毛笔粘少量收集的父本中国山杨花粉轻轻抖动，将花粉洒在母本的雌蕊柱头上，授粉时毛笔不能触及柱头，授粉量不宜过多，用放大镜观察授粉后的柱头上均匀密布花粉即可(授粉时间最好在上午10时前后)。授粉次数在三日内连续进行，一天一次。

处理2：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，用毛笔尖蘸取美洲黑杨辽宁杨花粉水提液，轻轻地点涂于雌蕊柱头，点涂均匀，放置0.5-1.0小时后待水取液干后，然后按处理1的方法进行授粉。

处理3：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，将美洲黑杨辽宁杨雌花序伸入盛有正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，试管内液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm。用正己烷挥发的气体熏雌花柱头10min后按处理1的方法进行正常授粉，期间用手握住试管下部以促进挥发。

处理4：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，将美洲黑杨辽宁杨雌花序竖直伸入盛有液态正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，试管内液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm，用正己烷的挥发气熏雌蕊柱头10min后，再用毛笔尖蘸取美洲黑杨辽宁杨花粉水提液，轻轻地点涂于雌蕊柱头，点涂均匀，放置0.5-1.0小时后待花粉水提液干后，按照处理1的方法进行授粉。

处理5：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，用毛笔尖蘸取正己烷轻轻点涂在雌蕊柱头上，放置0.5-1.0小时后待正己烷液干后，按照处理1的方法进行授粉。

上述美洲黑杨辽宁杨花粉水提液的制备方法如下：

20-25℃条件下，按1g母本美洲黑杨辽宁杨花粉与30ml蒸馏水的比例混合并进行充分搅拌，静置35min，再充分搅拌静置，反复2次，然后以定性滤纸过滤，所得浅黄色滤液即为花粉水提液，经检测，该花粉水提液中不含花粉粒。

3)杂交后的培养

授粉后继续水培，室内温度控制在15-25℃、湿度控制在50-70％，每两天换1次水，直至蒴果变黄或有裂嘴果粒时，用有透明窗的羊皮纸袋将果穗套上，待蒴果开始飞絮后，收集种子在温室内进行播种育苗，播种容器采用72孔或128孔规格的穴盘，播种土壤用高温灭菌的腐质土，1穴1粒种子，不用覆土，保持土壤湿润，待小苗长出3片真叶后移到室外，每天浇水2-3次，保持土壤湿润，待幼苗长出5-8片真叶后移入大田。

4)杂交后代的表型观测

当杂种苗平均株高为50cm时，用形态学标记的方法对杂种苗的特征进行观测，主要观测叶形以及叶边缘、叶基部、叶柄及芽的特征等。

3、试验结果

美洲黑杨与中国山杨杂交，经不同方法处理后，所获得的杂交种子数、种子饱满度、千粒重及发芽率观测结果见下表。

表2.不同处理获得的杂交种子调查表

  种子数(粒)  饱满度 千粒重(g)  发芽率(％) 处理1  35  --  0.184  0 处理2  60  不饱满  0.224  5.0 处理3  75  不饱满  0.236  6.6 处理4  110  不饱满  0.285  20.0 处理5  66  不饱满  0.219  7.5

由上表得知，美洲黑杨与中国山杨杂交各处理均获得了种子，但所获得的种子数及品质差别达显著水平，处理4所获得的种子数及品质比其他几个处理都要好。

对处理4得到的杂种苗进行特征观测的结果为：杂种苗中，18株苗木叶为卵圆形，基部截形，边缘锯齿较大而浅，但不具半透明边，叶背白色，叶柄圆柱形，芽被绒毛，呈父本特征，另4株苗木叶为菱状卵形，先端长渐尖，基部楔形，边缘具圆锯齿，并有半透明狭边，两面皆为绿色，叶柄长而侧扁，芽有粘质，呈母本特征，观测结果表明杂交得到的种子均为美洲黑杨辽宁杨与中国山杨的杂交种，从而说明处理4是本试验中克服美洲黑杨与中国山杨间杂交障碍的最佳方法。

实施例3、美洲黑杨×中国山杨的杂交实验

1、实验材料

本实施例所用的母本和父本分别为：

母本：美洲黑杨辽宁杨(Populus×Liaoningnsis Z.Wang et H.D.Chen cv.nov)(陈鸿雕，潘成良，刘志成，等.新杂交种辽宁杨、辽河杨、盖杨的选育，林业科技通讯，1995(11)：16-18，公众可从辽宁省杨树研究所获得)，为杨属(Populus)黑杨派杨树；

父本：中国山杨(Populus davidiana)(邢亚娟.中国山杨与美洲山杨杂交种新品系选育研究[D]，东北林业大学，2005，公众可从辽宁省杨树研究所获得)，为杨属(Populus)白杨派山杨亚派杨树。

2、实验方法与操作步骤

本实验共设计5种杂交的处理方法，分别如下：处理1是对照，常规授粉；处理2是母本花粉水提液点涂母本雌蕊柱头后正常授粉；处理3是正己烷有机溶剂熏母本雌蕊柱头后正常授粉；处理4是用正己烷有机溶剂熏母本雌蕊柱头后再用母本花粉水提液点涂柱头，然后正常授粉；处理5是用正己烷有机溶剂点涂母本雌蕊柱头后正常授粉。每个处理2根花枝共9个花序，分3次重复。观测每个处理所获得的种子数、种子饱满度、千粒重及发芽率等。

操作方法如下：

1)花枝的采集与花粉的收集

2月份采集美洲黑杨辽宁杨和中国山杨的雄花枝入温室，切枝水培，室温控制在15-25℃，相对湿度为50-70％。散粉前套袋隔离，分别收集花粉，收集的花粉放入消毒的培养皿里(培养皿上贴上标签，注明品种、日期等)，然后将培养皿放入干燥器中干燥24小时，密封后放入0-4℃冰箱中的干燥器内备用。在收集花粉时将美洲黑杨辽宁杨雌花枝入温室，切枝水培，室温控制在25℃左右，相对湿度为50-70％。美洲黑杨辽宁杨花芽膨大后即套袋隔离，水培至雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时进行杂交试验。

2)杂交

处理1：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，按常规方法进行正常授粉，即用毛笔粘少量收集的父本中国山杨花粉轻轻抖动，将花粉洒在母本的雌蕊柱头上，授粉时毛笔不能触及柱头，授粉量不宜过多，用放大镜观察授粉后的柱头上均匀密布花粉即可(授粉时间最好在上午10时前后)。授粉次数在三日内连续进行，一天一次。

处理2：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，用毛笔尖蘸取美洲黑杨辽宁杨花粉水提液，轻轻地点涂于雌蕊柱头，点涂均匀，放置0.5-1.0小时后待水取液干后，然后按处理1的方法进行授粉。

处理3：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，将美洲黑杨辽宁杨雌花序伸入盛有正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，试管内液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm。用正己烷挥发的气体熏雌花柱头5min后按处理1的方法进行正常授粉，期间用手握住试管下部以促进挥发。

处理4：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，将美洲黑杨辽宁杨雌花序竖直伸入盛有液态正己烷的内径(mm)×长度(mm)为20mm×180mm的试管中，试管内液态正己烷的高度为30-40mm，雌花序的顶端距正己烷液面的垂直距离是90-110mm，用正己烷的挥发气熏雌蕊柱头5min后，再用毛笔尖蘸取美洲黑杨辽宁杨花粉水提液，轻轻地点涂于雌蕊柱头，点涂均匀，放置0.5-1.0小时后待花粉水提液干后，按照处理1的方法进行授粉。

处理5：当母本美洲黑杨辽宁杨的雌花开放，雌蕊柱头发亮具有分泌汁液时，用毛笔尖蘸取正己烷轻轻点涂在雌蕊柱头上，放置0.5-1.0小时后待正己烷液干后，按照处理1的方法进行授粉。

上述美洲黑杨辽宁杨花粉水提液的制备方法如下：

20-25℃条件下，按1g母本美洲黑杨辽宁杨花粉与20ml蒸馏水的比例混合并进行充分搅拌，静置25min，再充分搅拌静置，反复2次，然后以定性滤纸过滤，所得浅黄色滤液即为花粉水提液，经检测，该花粉水提液中不含花粉粒。

3)杂交后的培养

授粉后继续水培，室内温度控制在15-25℃、湿度控制在50-70％，每两天换1次水，直至蒴果变黄或有裂嘴果粒时，用有透明窗的羊皮纸袋将果穗套上，待蒴果开始飞絮后，收集种子在温室内进行播种育苗，播种容器采用72孔或128孔规格的穴盘，播种土壤用高温灭菌的腐质土，1穴1粒种子，不用覆土，保持土壤湿润，待小苗长出3片真叶后移到室外，每天浇水2-3次，保持土壤湿润，待幼苗长出5-8片真叶后移入大田。

4)杂交后代的表型观测

当杂种苗平均株高为50cm时，用形态学标记的方法对杂种苗的特征进行观测，主要观测叶形以及叶边缘、叶基部、叶柄及芽的特征等。

3、试验结果

美洲黑杨与中国山杨杂交，经不同方法处理后，所获得的杂交种子数、种子饱满度、千粒重及发芽率观测结果见下表。

表3.不同处理获得的杂交种子调查表

  种子数(粒)  饱满度 千粒重(g)  发芽率(％) 处理1  38  --  0.184  0 处理2  50  不饱满  0.220  4.0

 处理3  65  不饱满  0.225  6.2 处理4  100  不饱满  0.265  15.0 处理5  60  不饱满  0.229  5.0

由上表得知，美洲黑杨与中国山杨杂交各处理均获得了种子，但所获得的种子数及品质差别达显著水平，处理4所获得的种子数及品质比其他几个处理都要好。

对处理4得到的杂种苗进行特征观测的结果为：杂种苗中，12株苗木叶为卵圆形，基部截形，边缘锯齿较大而浅，但不具半透明边，叶背白色，叶柄圆柱形，芽被绒毛，呈父本特征，另3株苗木叶为菱状卵形，先端长渐尖，基部楔形，边缘具圆锯齿，并有半透明狭边，两面皆为绿色，叶柄长而侧扁，芽有粘质，呈母本特征，观测结果表明杂交得到的种子均为美洲黑杨辽宁杨与中国山杨的杂交种，从而说明处理4是本试验中克服美洲黑杨与中国山杨间杂交障碍的最佳方法。