胰岛素受体α-链以及胰岛素样生长因子受体α-链的C末端区域的结构

摘要

本发明总体上涉及胰岛素受体(IR)以及胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的胰岛素结合位点的结构研究。更具体地说，本发明涉及包括IRα-链的C末端区域以及IGF-1R的相应区域的IR外结构域的低亲和性胰岛素结合位点的晶体结构，并且涉及使用该晶体以及相关结构信息来筛选并且设计与IR和/或IGF-1R相互作用或对其功能进行调节的化合物的方法。

说明书

发明领域

本发明总体上涉及胰岛素受体(IR)以及胰岛素样生长因子1受体(IGF- 1R)的胰岛素结合位点的结构研究。更具体地说，本发明涉及包括IR α-链的C 末端区域以及IGF-1R的相应的区域的IR外结构域的低亲和性胰岛素结合位点的 晶体结构，并且涉及使用该晶体以及相关结构信息来筛选并且设计与IR和/或 IGF-1R相互作用或对其功能进行调节的化合物的方法。

发明背景

胰岛素受体(IR)以及它的同源物1型胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R) 是酪氨酸激酶受体家族的紧密相关的成员并且是由若干结构域构成的大的跨膜糖 蛋白二聚体。

胰岛素受体(IR)的重要作用在于通过肌肉和脂肪摄入和代谢葡萄糖。小鼠 敲除研究也已经显示IR在脂肪形成、新生血管形成、肝葡萄糖合成的调节以及 葡萄糖诱导的胰腺胰岛素分泌中是重要的(Kitamura et al，2003)。IR信号在脑 中也是重要的，涉及调节食物摄入、外周脂肪沉积以及生殖内分泌轴并且涉及学 习和记忆(Wada et al.，2005)。异常的IR信号牵涉多种疾病，包括I型和II型 糖尿病、痴呆以及癌。

IR作为两种剪接变异体同种型IR-A和IR-B而存在，这两个同种型对应地 缺乏或包含由外显子11编码的12个氨基酸。较长的变异体，IR-B，是负责发出 代谢应答信号的同种型。相对地，IR-A主要地发出促有丝分裂应答的信号，在 一些癌中是优先表达的同种型(Denley et al.，2003)，并且能够以高亲和性结合 胰岛素样生长因子2(IGF-II)(Denley et al.，2004)。

IR的序列与IGF-1R的序列是高度同源的，表明这两种受体的三维结构极可 能是接近类似的。成熟的人IR和IGF-1R分子各自是包括两个α-链和两个β-链 的同型二聚体，这些α-和β-链是通过在弗林蛋白酶切割位点处在残基720-723 (IR-A，以成熟的N末端残基编号为1来编号)或707-710(IGF-1R)处进行翻 译后切割而产生的。IR和IGF-1R的结构性组织已经被广泛地评论(Adams et al.， 2000；De Meyts and Whittaker，2002；Ward et al.，2003；Lawrence et al.，2007；Ward  and Lawrence，2009)。这些受体的序列关系以及结构域组织示于图1中。

每个IR或IGF-1R单体的细胞外部分包含(顺序地从N-末端至C-末端)一 个富含亮氨酸的重复单位结构域(L1)、一个富含半胱氨酸的区域(CR)以及 一个第二富含亮氨酸的重复单位结构域(L2)，紧接着是三个III型纤连蛋白结 构域(FnIII-1、FnIII-2以及FnIII-3)。该FnIII-2结构域包含约120个残基的一 个大的插入结构域(ID)(α-β切割位点位于其中)。在细胞内，每个单体包含 由两个调节区域侧翼的一个酪氨酸激酶催化结构域，这两个调节区域包含用于信 号分子的磷酸酪氨酸结合位点。每个α-链通过残基Cys647与Cys860(Sparrow  et al.，1997)(在IR的情况下)和/或Cys633-Cys849(在IGF-1R的情况下)之 间的一个二硫键连接到它的配偶体β-链上。IR和IGF-1R两者的α链是在两个位 置上通过二硫键来交联的。第一个是在交联到相对的单体中它的对应物上的 FnIII-1结构域中的Cys524(IR)或Cys514(IGF-1R)处，并且第二个涉及交联到 相对的单体中它们的对应物上的每个FnIII-2结构域的插入区域中残基Cys682、 Cys683以及Cys685(IR)或Cys669、Cys670以及Cys672(IGF-1R)中的一项或多 项(Sparrow et al.，1997)。

IR以及IGF-1R的结构域展示高的(47％-67％)氨基酸序列一致性，表明三 维结构的高度保守性。IGF-1R(L1-CR-L2)的第一个三个结构域的晶体结构已 经被确定(Garrett et al.，1998)并且显示这些L结构域由一个单链的右手β-螺旋 (β链的一种螺旋安排)组成，而富含半胱氨酸的区域包括八个相关的二硫键模 块。IR(L1-CR-L2)的第一个三个结构域的晶体结构也已经被确定(WO 07/147213，Lou et al.，2006)并且与预测的一样是紧密地类似于它的IGF-1R对应 物。IR和IGF-1R的紧密的结构相似性的其他证据来自下面各项：(i)电子显微镜 分析(Tulloch et al.，1999)，(ii)杂交受体(一个IR单体二硫键键连到一个IGF- 1R单体上的异二聚体)自然存在于并且被通常发现于表达这两种受体的组织中 的事实(Bailyes et al.，1997)，以及(iii)可以构建来自一个受体的多肽的全结构 域或较小片段被来自其他受体的相应结构域或序列替换的受体嵌合体的事实(回 顾见于Adams et al.，2000)。

用于胰岛素结合的目前模型提出在基态下该IR同型二聚体包含每个单体上 的两个完全相同的配对的结合位点(称为位点1和位点2)(De Meyts and  Whittaker，2002；1994；De Meyts，1994；De Meyts，2004；Kiselyov et al.， 2009)。胰岛素结合到一个α-亚基上的一个低亲和性位点(位点1)上紧接着是 该结合的胰岛素与该第二IR α-亚基的一个不同区域(位点2)之间的一个第二 结合事件。这两个α-亚基之间的这种配体介导的桥接产生了高亲和态，该高亲 和态导致了信号转导。相对地，没有被栓系在其C末端上的可溶性IR外结构域 不能产生这种高亲和性受体-配体复合物。该可溶性IR外结构域能够同时在其两 个位点1上结合两个分子的胰岛素，但仅具有低亲和性(Adams et al.，2000)。 IGF-I或IGF-II结合到IGF-1R上的模型与刚刚对于胰岛素结合到IR上所说明的 是相同的并且涉及IGF-I(或IGF-II)结合到一个初始低亲和性位点(位点1) 上并且随后交联到相对的单体的一个第二位点(位点2)上从而形成该高亲和性 位点(如对于IR所说明的)。然而，在这两个系统中描述这些事件的动力学参 数的数值有一些不同(Surinya et al.，2008；Kiselyov et al.，2009)。

虽然在结构上是类似的，IGF-1R和IR发挥不同的生理功能。IGF-1R被表 达于除了肝之外几乎所有正常的成人组织中，它本身是IGF-I生产的主要位点 (Buttel et al.，1999)。在IGF-I或IGF-II结合到IGF-1R上之后(包括Src以及 Ras)紧接着激活了多种信号通路，以及多种下游通路，例如MAP激酶级联以 及P13K/AKT轴(Chow et al.，1998)。IR主要涉及代谢功能，而IGF-1R介导生 长和分化。于此一致的是，IGF-I的切除(即在IGF-I敲除小鼠中)导致胚胎生 长缺陷、出生后生长受损、以及不育。此外，IGF-1R敲除小鼠仅具有45％正常 大小并且在出生时死于呼吸衰竭(Liu et al.，1993)。然而，胰岛素和IGF-I两者 可以诱导促有丝分裂作用和代谢作用两者。

使用电镜技术已经进行了IR以及胰岛素与IR的相互作用的多种非结晶学3- D结构分析(Luo et al.，1999；Ottensmeyer et al.，2000，2001；Yip and Ottensmeyer， 2001)。然而，由于得到的低分辨率信息(＞20埃)，这些研究的结论已经被质 疑(De Meyts and Whittaker，2002)。

以前已经提出了IR的外结构域的晶体结构(WO 07/147213，McKern et al.， 2006；Lou et al.，2006)，并且已经阐明了一些潜在的配体/IR相互作用，特别地 是IR L1的表面上的低亲和性位点的部分。然而，该IR L1结构域表面上的模糊 的电子密度的一个区域不能被分辨(WO 07/147213，McKern et al.，2006)。因 此，在本领域中对于更加完全地分辨IR以及IGF-1R两者的结构从而阐明所有潜 在的配体/受体相互作用存在一种需求。这个信息可能提供针对对于IR以及IGF- 1R激动剂/拮抗剂开发所必需的IR以及IGF-1R两者的作用机制的更加完整的理 解。

发明概述

本发明诸位发明人已经确定了人IR的低亲和性胰岛素结合位点的晶体结 构。具体地是，已经确定了包括胰岛素受体α-链的C-末端区域的人IR外结构域 的低亲和性胰岛素结合位点的晶体结构。这个结构允许第一次看到了完整的低亲 和性胰岛素受体结合位点区域，该区域控制胰岛素初始结合以及随后的导致信号 转导的高亲和性胰岛素-IR复合物的形成。该结构第一次显示其中该胰岛素受体 α-链的C-末端区域与该受体的第一富含亮氨酸的重复单位(L1)结构域相结合从 而形成该完整的低亲和性胰岛素结合位点的方式。该结构还第一次提供了直接深 入了解所谓的位点1胰岛素模拟肽结合到该胰岛素受体的低亲和性结合位点上的 方式并且还为设计与IR的低亲和性胰岛素结合位点相互作用的胰岛素模拟肽提 供了一个基础。通过类比，所提出的结构信息还指示了涉及胰岛素生长因子 (IGF)结合的紧密相关的IGF-1R中的相应区域。

在开发有效且安全的疗法中鉴别仅对于IR或IGF-1R之一具有高度特异性的 分子结构是重要的。例如，作为胰岛素激动剂开发的分子应当具有很小的或没有 IGF-I活性从而避免IGF-I的促有丝分裂活性以及促进肿瘤生长的可能性。因 此，确定IR和IGF-1R的哪个区域具有足够的差别来提供针对它们对应的配体或 针对治疗分子(例如化学实体或生物试剂)的选择性是重要的并且具有显著进 展。类似地，可以认为能够鉴别出模拟胰岛素和/或IGF-I的活性结合区域并且赋 予选择性的激动剂或拮抗剂活性的分子结构的能力还将协助并且推进新药的开 发。

为了辅助设计IR和/或IGF-1R的激动剂/拮抗剂，本发明诸位发明人已经使 用包含该胰岛素受体α-链的C端区域(附件I)的人IR外结构域的结构来将该 胰岛素受体α-链的C端区域的一个模型放到IGF-1R外结构域(附件II)的3D 结构中。本发明的诸位发明人还已经使用这些模型来将该IGF-1R α-链的C端区 域的一个模型放到IR外结构域以及IGF-1R外结构域(对应地，附件III和IV) 的3D结构中。本发明的诸位发明人使用所有这些结构来将一个胰岛素模拟肽 (S519C16)的一个模型放到IR以及IGF-1R(对应地附件V和VI)的结合位点 中。具有附件II至VI中坐标的这些模型是相对于附件I中发现的原子坐标来定 向的，并且可以用于与附件I的原子坐标相结合来设计结合到IR的胰岛素结合 位点上的一种化合物和/或结合到IGF-1R的IGF结合位点上的一种化合物。

就通过结合来自附件I至附件VI的坐标子集来定义结构而言，可以通过多 种方法(例如从各集合组装全结构域的组合，从其中来自一个结构的坐标和对应 的氨基酸序列被转置到另一个之上的各集合组装全结构域的组合，使用其他集合 的相应坐标来将一个晶体的较少分辨的区域精细化)来实现这类组合。

因此，本发明提供了一种鉴别、设计或筛选一种化合物的方法，该化合物能 够潜在地与胰岛素受体(IR)和/或胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)相互作 用，该方法包括基于该化合物与一种结构的相互作用对一种化合物进行基于结构 的鉴别、设计或筛选，该结构是由附件I至VI中一项或多项的原子坐标、或它 们至少表示IR的α-链的C末端区域、IGF-1R的α-链的C-末端区域、或IR和/或 IGF-1R的α-链的C-末端区域的一种模拟物的一项或多项的原子坐标的一个子集 定义的。

在一个实施方案中，该方法包括鉴别、设计或筛选一种化合物，该化合物与 下面各项的三维结构相互作用：(i)IR的低亲和性胰岛素结合位点，该结构是由 附件I、III以及V的一项或多项中所示的原子坐标定义的，和/或(ii)IGF-1R的 低亲和性胰岛素样生长因子(IGF)结合位点，该结构是由附件II、IV以及VI 的一项或多项中所示的原子坐标定义的，其中该化合物与该结构的相互作用在能 量上是有利的。

在另一个实施方案中，该方法进一步包括合成或得到一种鉴别的或设计的候 选化合物并且确定该候选化合物与IR和/或IGF-1R相互作用的能力。

在一个进一步的实施方案中，这些原子坐标定义了针对胰岛素的IR的低亲 和性结合位点，和/或针对IGF的IGF-1R的低亲和性结合位点的一个或多个区 域，包括IR的α-链C末端区域，IGF-1R的α-链C末端区域，或IR和/或IGF- 1R的α-链C末端区域的一种模拟物。

在一个特别优选的实施方案中，IR的α-链的C末端区域包括IR α-链(SEQ  ID NO：13)的氨基酸693至710。

在另一个优选的实施方案中，定义了IR的低亲和性胰岛素结合位点的这些 原子坐标进一步包括IR外结构域的富含亮氨酸的重复单位1(L1)的结构域和/ 或富含半胱氨酸(CR)的结构域。

在又另一个优选实施方案中，这些原子坐标定义了该L1结构域的中心β-折 叠的分子表面的多个部分以及该第二富含亮氨酸的重复单位(LRR)的分子表面 的多个部分，该第二富含亮氨酸的重复包含Phe39和/或该L1结构域的第四LRR 横档(rung)中的环。

在又另一个优选实施方案中，这些原子坐标定义了IR的CR结构域的模块 6。

在另一个实施方案中，这些原子坐标进一步定义了选自IR氨基酸残基1- 156、157-310、594以及794的一个或多个氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，选自IR氨基酸残基1-156的该一个或多个氨基 酸包括选自Arg14、Asn15、Gln34、Leu36、Leu37、Phe39、Pro43、Phe46、 Leu62、Phe64、Leu87、Phe88、Phe89、Asn90、Phe96、Glu97、Arg118、 Glu120以及His144的至少一个氨基酸。

在另一个实施方案中，选自IR氨基酸残基157-310的该一个或多个氨基酸 包括选自192-310、227-303以及259-284的至少一个氨基酸序列。

以前已经报道了IGF-1R的外结构域的第一个三个结构域的晶体结构(WO 99/028347)。随后报道了IR的外结构域的第一个三个结构域的晶体结构(WO 07/147213)，使得第一次能够在紧密关联的IGF-1R以及IR中直接比较控制配 体的特异性的区域。然而，不能阐明完整的低亲和性胰岛素结合位点的结构(即 包括该受体α-链的C端区域在内)。如业内人士所应当清楚的，在此在IR外结 构域完整的胰岛素结合位点的结构、形状以及取向上提出的发现可以被转置到 IGF-1R外结构域的IGF结合位点的结构、形状以及取向上。

本发明能够鉴别IR外结构域的胰岛素结合位点的之前未识别的区域。通过 类比，本发明还鉴别出IGF-1R中的等效区域，前体条件是这两个受体中结构域 的结构组织是有效地相同的。本发明已经鉴别出涉及胰岛素结合并且涉及介导随 后的导致了信号转导的高亲和性胰岛素-IR复合物的形成的IR的关键区域。再一 次，对于业内人士而言应当清楚的是这些发现可以被转置到IGF-1R上。

因此在鉴别和/或设计结合到IGF-1R的低亲和性IGF结合位点上的化合物 中，本发明也是有用的。

在一个实施方案中，定义了IGF的IGF-1R的低亲和性结合位点的一个或多 个区域的原子坐标包括IGF-1R的α-链的C端区域。在一个优选的实施方案中， IGF-1R的α-链的C末端区域包括IGF-1R α-链(SEQ ID NO：15)的氨基酸681 至697。

在另一个实施方案中，定义了IGF-1R的低亲和性IGF结合位点的这些原子 坐标进一步包括IGF-1R外结构域的L1结构域和/或CR结构域。

在一个优选的实施方案中，这些原子坐标定义了该L1结构域的中心β-折 叠，和/或包含Ser35的第二LRR的部分、和/或该L1结构域的第四LRR横档中 的环。

在另一个优选实施方案中，这些原子坐标定义了IGF-1R的CR结构域的模 块6。

在一个实施方案中，IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的模拟物是 S519C16(SEQ ID NO：18)。

在进一步的实施方案中，在IR或IGF-1R的低亲和性结合位点的形成中该化 合物替代IR的α-链的C-末端区域和/或IGF-1R的α-链的C-末端区域。这类化合 物可以作为这些受体的激动剂或拮抗剂之一起作用。在这个实施方案的一个替代 方案中，在该化合物的存在下，胰岛素和/或IGF-1R结合IR和/或IGF-1R的低 亲和性结合位点。在这个实施方案的另一个替代方案中，在该化合物的存在下， 胰岛素和/或IGF-1R不结合IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点，或已经减少 结合到其上。

在另一个实施方案中，作为基于结构的评估的一个结果，用于与IR和/或 IGF-1R相互作用的候选化合物被化学修饰。

在一个进一步的实施方案中，该化学修饰被设计为下面两项之一：

i)降低该候选化合物结合到IR上的可能性，同时保持结合到IGF-1R上； 或

ii)降低该候选化合物结合到IGF-1R上的可能性，同时保持结合到IR上。

候选化合物或使用本发明的一种方法鉴别或设计的化合物可以是任何适合的 化合物，包括自然发生的化合物、重新设计的化合物、文库产生的化合物(化学 地或重组地产生的)、模拟物等，并且包括有机化合物、新化学实体、抗体、除 了基于抗体的分子(非免疫球蛋白)之外的结合蛋白，包括例如蛋白支架，例如 脂质运载蛋白、设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPins，Stumpp et al.，2007)以 及蛋白A结构域(回顾见于Binz et al，2005)、avimer(Silverman et al.， 2005)、以及其他新的生物实体，例如核酸适体(回顾见于Ulrich，2006)。

对于改善IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点的已知配体的特性而言，本 发明也是有用的。例如，可以针对IR外结构域的胰岛素结合位点或由附件I的 原子坐标定义的IR外结构域的胰岛素结合位点的一个区域、或它们的一部分的 3D结构来筛选现有IR或IGF-1R低亲和性结合位点配体(任选地利用附件II至 VI中给出的使用原子坐标来进一步细化对能量上与IR相互作用的可能性的筛选 和/或评估)，以及由能量上与IR的胰岛素结合位点相互作用的可能性构成的一 种评估。

因此，本发明还提供了一种重新设计一种化合物的方法，该化合物已知结合 到IR和/或IGF-1R上，该方法包括基于该化合物与一种结构的相互作用对该化 合物进行基于结构的评估，该结构是由附件I至VI中一项或多项的原子坐标、 或它们的至少表示IR的α-链的C末端区域、IGF-1R的α-链的C-末端区域、或 IR和/或IGF-1R的α-链的C-末端区域的一种模拟物的一项或多项的原子坐标的 一个子集定义的，并且根据该评估结果对该化合物进行重新设计或化学修饰。

在一个实施方案中，已知结合到IR和/或IGF-1R上的化合物被重新设计或 化学修饰以便(i)改进结合到IR上的亲和性，和/或(ii)降低结合到IGF-1R上的 亲和性。

在另一个实施方案中，已知结合到IR和/或IGF-1R上的化合物被重新设计 或化学修饰以便(i)改进结合到IGF-1R上的亲和性，和/或(ii)降低结合到IR上 的亲和性。

当针对结合到IR或IGF-1R的胰岛素结合位点上的选择性筛选潜在的配体或 化合物时，重要的是注意这些区域的IR和IGF-1R的外结构域的低亲和性结合位 点之间3D结构中的差异。在此鉴别并且说明这类区域。具体地，重要的是注意 这些区域的在胰岛素结合到受体中被鉴定为是潜在重要的差异。

因此，在一个进一步实施方案中，该化合物被重新设计或修饰从而由于IR 的α-链的C末端区域以及IGF-1R的α-链的C末端区域处或附近的IR与IGF-1R 之间的结构差别降低了对IR或IGF-1R亲和性。

本发明还提供了一种计算机系统，该系统用于鉴别可以潜在地与IR和/或 IGF-1R相互作用的一种或多种化合物，该系统包含表示下面各项结构的数据：(i) IR的低亲和性胰岛素结合位点，该结构是由附件I、III以及V的一项或多项中 所示的原子坐标定义的；(ii)IGF-1R的低亲和性IGF结合位点，该结构是由附件 II、IV以及VI的一项或多项中所示的原子坐标定义的；和/或(iii)IR的α-链的C 端区域、IGF-1R的α-链C端区域、或IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的一种 模拟物，该结构是由附件I至VI的一项或多项中所示的原子坐标的一个子集定 义的。

在另一个方面，本发明提供了一种计算机可读取介质，该介质将表示一个模 型和/或如附件I至VI的一项或多项中所示原子坐标，或它们的至少表示下面各 项的一项或多项的原子坐标的一个子集的数据记录在其上：

i)IR的α-链的C-末端区域；

ii)IGF-1R的α-链的C-末端区域；和/或

iii)当(i)至(iii)中任何一项与IR和/或IGF-1R结合时，IR和/或IGF- 1R的α-链的C-末端区域的一个模拟物。

还提供了附件I至VI的一项或多项中所示的坐标的一个集合，或它们的至 少表示下面各项的一项或多项的原子坐标的一个子集：

i)IR的α-链的C-末端区域；

ii)IGF-1R的α-链的C-末端区域；和/或

iii)当i)至iii)中任何一项与IR和/或IGF-1R结合时，IR和/或IGF-1R 的α-链的C-末端区域的一个模拟物。

可以使用IR和/或IGF-1R α-链的C端区域的三维结构来开发对于药物设计 和/或计算机上筛选与IR和/或IGF-1R相互作用和/或对其进行调节的候选药物有 用的模型。其他物理化学特征也可以用于开发模型，例如结合、静电等。

总体上，术语“计算机上”是指在计算机存储器中(即在硅或其他类似芯片 上)生成。另外说明“计算机上”是指“虚拟的”。当在此使用时，术语“计算机上” 是意指基于使用计算机模型而不是体外或体内实验的筛选方法。

因此，本发明还提供了一种鉴别化合物的计算机辅助方法，该化合物潜在地 与IR和/或IGF-1R相互作用，该方法包括将具有下面各项的结构拟合到一种候 选化合物的结构中：(i)IR的低亲和性胰岛素结合位点，该结构是由附件I、III 以及V的一项或多项中所示的原子坐标定义的；(ii)IGF-1R的低亲和性IGF结合 位点，该结构是由附件II、IV以及VI的一项或多项中所示的原子坐标定义的； 和/或(iii)IR的α-链的C端区域、IGF-1R的α-链C端区域、或IR和/或IGF-1R 的α-链的C端区域的一种模拟物，该结构是由附件I至VI的一项或多项中所示 的原子坐标的一个子集定义的。

本发明还提供了一种计算机辅助方法，该方法使用包括一个处理器的一种编 程的计算机用于鉴别能够与IR和/或IGF-1R相互作用的化合物，该方法包括如 下步骤：使用多种计算机方法产生一种结构的一组原子坐标，该结构具有与下面 各项的原子坐标能量上有利的相互作用：(i)IR的低亲和性胰岛素结合位点，该 结构是由附件I、III以及V的一项或多项中所示的原子坐标定义的；(ii)IGF-1R 的低亲和性IGF结合位点，该结构是由附件II、IV以及VI的一项或多项中所示 的原子坐标定义的；和/或(iii)IR的α-链的C端区域、IGF-1R的α-链的C端区 域、或IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的一种模拟物，该结构是由附件I至 VI的一项或多项中所示的原子坐标的一个子集定义的，这些坐标被输入计算机 中由此产生一个标准数据集；(b)使用该处理器将该标准数据集与化学结构的一 个计算机数据库进行比较；(c)使用多种计算机方法从该数据库中选择与该标准 数据集的一个区域互补或类似的化学结构；并且任选地，(d)将选定的与该标准 数据集的一个区域互补或类似的化学结构输出到一个输出设备上。

本发明进一步提供了一种计算机辅助方法，该方法使用包括一个处理器的一 种编程的计算机用于鉴别IR和/或IGF-1R的潜在模拟物，该方法包括如下步 骤：(a)从下面各项的一组原子坐标中产生一个标准数据集：(i)IR的低亲和性胰 岛素结合位点，该结构是由附件I、III以及V的一项或多项中所示的原子坐标定 义的；(ii)IGF-1R的低亲和性IGF结合位点，该结构是由附件II、IV以及VI的 一项或多项中所示的原子坐标定义的；和/或(iii)IR的α-链的C端区域、IGF-1R 的α-链的C端区域、或IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的一种模拟物，该结 构是由附件I至VI的一项或多项中所示的原子坐标的一个子集定义的，这些坐 标被输入计算机中；(b)(i)使用该处理器将该标准数据集与储存在一个计算机数 据存储系统中的化学结构的一个计算机数据库进行比较；并且使用多种计算机方 法从该数据库中选择具有结构上类似于该标准数据集的一个区域的化学结构；或 (ii)使用多种计算机方法构建具有结构上类似于该标准数据集的一个区域的化学 结构的模型，并且任选地，(C)将下面各项输出到一个输出设备上：(i)从步骤 (b)(i)中选定的化学结构，这些结构具有类似于该标准数据集的一个区域；或(ii) 从步骤(b)(ii)构建的模型。

本发明进一步提供了一种用于对化合物与IR和/或IGF-1R相互作用的能力 进行评估的方法，该方法包括如下步骤：(a)使用多个原子坐标使用多种计算手 段来进行该化合物与IR外结构域上胰岛素的低亲和性结合位点，和/或IGF-1R 外结构域上IGF的低亲和性结合位点的计算机模型的结合表面之间的一个拟合操 作，其中这些原子坐标与附件I至VI的一项或多项的原子坐标或它们的至少表 示IR的α-链的C末端区域、IGF-1R的α-链的的C-末端区域、或IR和/或IGF- 1R的α-链的C-末端区域的一个模拟物的一项或多项的原子坐标的一个子集之间 的均方根差是不大于1.5并且(b)对拟合操作的结果进行分析从而对该化合 物与该结合表面模型之间的结合进行定量。

本发明还提供了一种使用分子置换法来得到关于具有未知结构的分子或分子 复合物的结构信息的方法，包括以下步骤：(i)产生结晶分子或分子复合物的X 射线衍射图案；并且(ii)将附件I至VI的一项或多项的原子坐标，或它们的至少 表示IR的α-链的C末端区域、IGF-1R的α-链的C-末端区域、或IR和/或IGF- 1R的α-链的C-末端区域的一个模拟物的一项或多项的原子坐标的一个子集应用 到该X射线衍射图案上从而产生结构未知的分子或分子复合物的至少一个区域 的一个三维电子密度图。

本发明提供了一种化合物，该化合物结合到使用本发明的方法设计、重新 设计或修饰的IR和/或IGF-1R外结构域上。优选地这类化合物具有小于10^-5M 的对于IR和/或IGF-1R的亲和性(K_d)。在一个特别优选的实施方案中，该化 合物结合到IR的低亲和性结合位点上和/或IGF-1R的低亲和性结合位点上。

本发明还提供了它的一种分离的肽或模拟物，该分离的肽或模拟物结合IR 的L1结构域和/或IGF-1R的L1结构域，该肽包括：(i)如SEQ ID NO：13或 SEQ ID NO：15中提供的一种氨基酸序列；(ii)一种氨基酸序列，该氨基酸序列 与SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：15是至少50％一致，更优选地至少80％一 致，更优选地至少90％一致，更优选地至少95％一致；或(iii)i)或ii)的一个片 段，该片段结合IR的L1结构域和/或IGF-1R的L1结构域，其中该肽具有一种 螺旋结构。

进一步提供了对分离的肽或它的模拟物进行编码的一种分离的多核苷酸，连 同包含所述多核苷酸的一种载体以及包含所述载体的一种宿主细胞。

本发明还提供了一种组合物，该组合物包括本发明的一种化合物、本发明的 一种肽或模拟物、和/或本发明的一种多核苷酸、以及任选地一种可接受的载体 或稀释剂，更优选地一种药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明进一步提供了用于预防或治疗与异常IR和/或IGF-1R作用和/或信号 相关的疾病的一种方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用本发明的一种化 合物、本发明的一种肽或模拟物、和/或本发明的一种多核苷酸。

本发明还提供了本发明的一种化合物、本发明的一种肽或模拟物、和/或本 发明的一种多核苷酸用于制造治疗受试者体内与异常IR和/或IGF-1R作用和/或 信号相关疾病的药物的用途。

与异常IR和/或IGF-1R作用和/或信号相关的疾病的实例包括但不限于肥胖 症、I型和II型糖尿病、心血管疾患、骨质疏松症、痴呆以及癌。

在制造药物中本发明的实施方案还旨在包括多个制造步骤，例如将该化合物 (例如一种肽)结合到一种药物组合物中。

贯穿本说明书，当适当时将优选的方面以及实施方案单独地或结合地使用到 已作必要的修正的其他方面和实施方案中(无论是否如此清楚地说明)。

现在参考下面实例将进一步说明本发明，这些实例仅是说明性的并且不是限 制性的。

附图简要说明

一些图形包含彩色的说明或实体。当要求时这些图形的彩色版本可以从专利 权人或者从适当的专利局得到。如果从专利局得到的话可能会收费。

图1：显示了人胰岛素受体(IR，外显子11-同种型)和人IGF1受体 (IGF-1R)的外结构域的序列比对。这些序列之间保守的残基通过垂直条带来 指示并且潜在的N-连接的糖基化位点通过阴影来指示。二硫键来通过该对比上 的方括号来指示。序列来源是：IR(Ullrich et al.，1985)，人1型IGF受体 (Ullrich et al.，1986)。

图2.下面各项滴定的ITC曲线：(a)IR典型αCT肽相对于IR485，(b) IGF-1R典型αCT肽相对于IR485，以及(c)IR典型αCT.714A肽相对于IR485。

图3.下面各项滴定的ITC曲线：(a)ZFP-胰岛素相对于用10倍摩尔比的 IR典型αCT肽预先复合的IR485，(b)ZFP-胰岛素相对于用10倍摩尔比的IGF- 1R典型αCT肽预先复合的IR485，(c)IGF-1R相对于用10倍摩尔比的IR典型 αCT肽预先复合的IR485，以及(d)IGF-1R相对于用10倍摩尔比的IGF-1R典型 αCT肽预先复合的IR485。

图4.下面各项滴定的ITC曲线：(a)S519C16相对于IR485，(b) S519C16相对于用10倍摩尔比的IR典型αCT肽预先复合的IR485，(c)S519N20 相对于IR485，以及(d)S519相对于IR485。

图5.从下面各项的样品中得到的动态光散射体积分布曲线：(a)IR485 在6mg/ml下，(b)IR485在0.5mg/ml下，(c)IR485在6mg/ml下加上3-倍摩尔 比的一种IR αCT肽，(d)IR485在6mg/ml下加上3-倍摩尔比的一种IR典型αCT 肽以及2-倍摩尔比的一种ZFP-胰岛素。

图6.包括IR的α-链的C-末端区域的IR外结构域的晶体结构。(a)与IR 残基693-710的最终模型重叠的负B-因子增强的(F_o-F_c)单子密度；(b)IR残基 693-710(黄色为主链，绿色为碳，非粗体标号)与L1-β2的表面(粉红色为主 链，蓝绿色为碳，粗体标号)之间相互作用的详细情况；(c)IR和IGF-1R的α-链 与该S519C16肽的C-末端区域的序列比对(Menting et al.，2009)。阴影区域显示 这三个序列之间的保守部分，并且加框的区域显示被预测在构象中是螺旋的区段 (Menting et al.，2009)。

图7.结合到从IR外结构域(包括残基693-710在内)的晶体结构产生的 IGF-1R(附件II)的L1结构域上的IR α-链的C-末端区域的模型结构。对应的 L1结构域的主链被显示为一个橙色螺旋，与相应的结合肽相互作用的L1结构域 内这些残基的侧链是用绿色碳原子、红色氧原子以及蓝色氮原子来显示的，并且 该结合肽螺旋的主链被显示为一个蓝色螺旋。选定的与该L1结构域相互作用的 肽残基是用蓝绿色碳原子、红色氧原子以及蓝色氮原子来显示的。剩余的肽残 基，这些残基具有更多限制的或没有与该L1结构域相互作用，是仅通过它们的 α-碳原子(显示为包埋在该肽螺旋中的球体)来表示的，其中为了清楚的目的将 这些残基中其他原子省略掉。为了清楚的目的，将位于IR α-链的C-末端区域中 的残基加下划线。

图8.结合到IR(附件III)的L1结构域上的IGF-1R α-链的C-末端区域 的模型结构。颜色和形式如上面对于图7所述。

图9.结合到IGF-1R(附件IV)的L1结构域上的IGF-1R α-链的C-末端 区域的模型结构。颜色和形式如上面对于图7所述。

图10.结合到IR(附件V)的L1结构域上的S519C16肽的模型结构。颜 色和形式如上面对于图7所述。

图11.结合到IGF-1R(附件VI)的L1结构域上的S519C16肽的模型结 构。颜色和形式如上面对于图7所述。

图12.对于包含下面相应突变的N-端生物素酰化的αCT肽698-719相对 于胰岛素迷你受体IR485滴定得到的样品等温滴定量热曲线：(A)野生型、(B) T704Y、(C)R702W、(D)R702Y、(E)T704W以及(F)R702Y/T704W。

序列表的说明

SEQ ID NO：1-成熟的人胰岛素受体外结构域的氨基酸序列(同种型A)。

SEQ ID NO：2-成熟的人胰岛素受体外结构域的氨基酸序列(同种型B)。

SEQ ID NO：3-小鼠胰岛素受体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4-猕猴胰岛素受体的氨基酸序列(预测的)。

SEQ ID NO：5-牛胰岛素受体的氨基酸序列(预测的)。

SEQ ID NO：6-成熟的人胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R)外结构域的氨基酸 序列。

SEQ ID NO：7-小鼠胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8-猕猴胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R)的氨基酸序列(预测 的)。

SEQ ID NO：9-牛胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R)的氨基酸序列(预测 的)。

SEQ ID NO：10-IR485的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11-人IR的典型α-链C端肽(αCT)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12-人IR的典型α-链C端肽(‘αCT’)的F714A突变体的氨基酸序 列。

SEQ ID NO：13-人IR的α-链的C端区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14-人IGF-1R的典型α-链C端肽(αCT)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15-人IGF-1R的α-链的C端区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16-S519肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17-S519N20肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18-S519C16肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19-FYXWF基序。

发明详细说明

除非另外定义，在此使用的所有的技术的和科学的术语具有与本领域(例 如，在分子生物学、生物化学、结构生物学、以及计算生物学中)中一个普通技 术人员所通常理解的相同的含义。对于分子以及生物化学方法(总体上参见， Sambrook et al.，2001，以及Ausubel et al.，1999，它们通过引用结合在此)以及 化学方法而言，使用标准技术。

贯穿本说明书，词语“包括”、或变体例如“包括了”或“包括着”应当理解为意 指包括一个所述的元素、整数或步骤、或多个元素、整数或步骤的组，但不排除 任何其他一个元素、整数或步骤、或多个元素、整数或步骤的组。

IR外结构域晶体以及晶体结构

基于IRΔβ构建体(参见实例)本发明提供了包括IR α-链的一个C端区域的 一种晶体。

如在此使用的，术语“晶体”是指一种结构(例如，一种三维的(3D)固体 聚集体)，其中这些平面以确定的角度相交，并且其中存在构成的化学种类的一 种有规则的结构(例如内部结构)。术语“晶体”具体地是指一种固体实体晶形， 例如一种实验性制备的晶体。

根据本发明的晶体可以使用任何IR外结构域(即，包含该细胞外结构域并 且缺少跨膜结构域以及细胞内酪氨酸激酶结构域的IR多肽)来制备。典型地， 该细胞外结构域包括人IR的残基1至917(成熟的受体编号)或它的等价物连 同这些残基的任何翻译后修饰(例如N-连接或O-连接的糖基化作用)一起。

在一个优选的实施方案中，该IR多肽是人IR(SEQ ID NOs：1以及2)。然 而，该IR多肽还可以从其他物种得到，例如其他哺乳动物、脊椎动物或无脊椎 动物物种。在SEQ ID NOs：3至5中给出来自其他物种的IR多肽的实例。

可以用野生型IR多肽外结构域序列或它们的变异体(包括等位基因变异体 以及自然发生的突变以及基因工程的变异体)来构建晶体。典型地，这些变异体 与相应的野生型IR外结构域多肽具有至少95％或98％序列一致性。

任选地，IR外结构域的晶体可以包括一种或多种分子，这些分子结合到该 外结构域上，或者另外地浸入该晶体中或者与IR外结构域共结晶。这类分子包 括配体或小分子，它们是旨在调节IR与它的生物靶之间相互作用的候选药物试 剂。IR外结构域的晶体还可以是与该IGF受体家族的其他受体(例如IGF-1R) 的一种分子复合物。该复合物还可以包括额外的分子，例如针对这些受体的配 体。

下面说明IR外结构域晶体的生产。

在一个优选的实施方案中，包括IR α-链的C-末端片段的本发明的IR外结构 域晶体具有在附件I中提出的原子坐标。如在此使用的，术语“原子坐标”或“一 组坐标”是指参考一个轴线系统定义一个或多个原子的位置的一组数值。本领域 普通技术人员应当清楚的是原子坐标可以被改变，而不显著地影响从中得到的模 型的准确度。因此，虽然本发明提供了一种优选的原子结构的一种非常精确的定 义，应当理解的是小的变更是可以想见的，并且本权利要求书旨在包括这类变 更。

应当理解的是，除非另外明确说明，在此对于附件I中所示的原子坐标或原 子坐标的子集的任何引用应当包括当叠合在通过附件I中所示的原子坐标说明的 相应的主链原子之上时，具有主链原子的均方根差不大于1.5的原子坐标，优 选地不大于1而且，除非另外清楚地说明，对于附件II至VI中所示的原子 坐标或原子坐标的子集的任何引用应当包括当叠合在通过附件II至VI中所示的 原子坐标说明的相应的主链原子之上时，具有主链原子的均方根差原子不大于 2.5的原子坐标。

下面定义术语两个数据集之间的“均方根差(RMSD)”所要表达的意思。对 于第一个数据集中的每个元素，计算出它与第二数据集中相应项的偏差。方差是 该偏差的平方，并且均方差是所有这些方差的平均值。

均方根差是该均方差的平方根。

优选的变异体是其中对于除了氢之外所有主链原子而言，与附件I中给出的 这些坐标相比较，x、y以及z坐标的RMSD小于1.5的那些(优选地小于1 、0.7或小于0.3)。本领域普通技术人员容易理解的是这些原子坐标的 3D刚体旋转和/或平移不改变所关心的分子的结构。

在一个高度优选的实施方案中，该晶体具有如附件I中所示的原子坐标。

本发明还提供了包括IR α-链的C末端区域或IR α-链的一个区域的IR外结 构域多肽的低亲和性胰岛素结合位点的一种晶体结构。

对于氨基酸4至655、693至710(“IR α-链的C-末端区域”)，以及人IR-A (成熟的受体编号；SEQ ID NO：1)的755至909而言，实验得到的原子坐标示 于附件I中。然而，本领域普通技术人员应当清楚的是通过X射线晶体法确定的 一组原子坐标并非没有标准差。因此，对于包含当叠合(使用主链原子)在附件 I中列出的原子坐标上时具有蛋白主链原子的均方根差小于0.75的IR α-链的 C-末端区域的IR外结构域多肽而言，任何一组结构坐标应当被认为是完全相同 的。

本发明还包括与附件I中列出的原子坐标基本上一致的IR α-链的C-末端区 域的原子坐标。

与一组给定的原子坐标“基本上一致”的结构是其中在每个结构域中在二级结 构元件中对于主链原子而言该结构的至少约50％具有RMSD小于约1.5的一种 结构，并且更优选地，对于每个结构域中二级结构元件中的主链原子而言小于约 1.3并且在不断优选中，对于每个结构域中二级结构元件中主链原子而言， 小于约1.0小于约0.7小于约0.5并且最优选地，小于约0.3

在一个更优选的实施方案中，与一组给定的原子坐标基本上一致的结构是这 样一种结构，其中至少约75％的这种结构具有列举的RMSD值，并且更优选 地，至少约90％的这种结构具有列举的RMSD值，并且最优选地，约100％的这 类结构具有列举的RMSD值。

在一个甚至更优选的实施方案中，上面定义的“基本上一致”可以被延伸以 便包括氨基酸侧链的原子。如在此使用的，短语“普通氨基酸侧链”是指多种氨基 酸侧链，这些氨基酸侧链对于与一组给定的原子坐标基本上一致的结构与实际上 由这类原子坐标表示的结构两者而言是共同的。

本发明还提供了包括该IR外结构域α-链跨膜残基693至710的C末端区域 (SEQ ID NO：13)在附件I和II中列出的原子坐标的一个优选的子集。

如在此使用的，术语“IR外结构域”是指缺少IR的跨膜结构域以及细胞内酪 氨酸激酶结构域的IR的细胞外结构域，典型地包括人IR的残基1至917(成熟 的IR-A受体编号)，或它们的等价物，连同这些残基的任何翻译后修饰(例如 N-连接或O-连接的糖基化作用)一起。

如在此使用的，术语IR的“低亲和性结合位点”是指涉及形成对于胰岛素的 IR的低亲和性结合位点(也称为“位点1”)的IR的区域，包括IR α-链的C-末端 区域，以及额外地IR的L1结构域以及IR的CR结构域之一或两者。胰岛素结 合到IR的低亲和性结合位点上诱导形成IR的高亲和性胰岛素结合位点以及随后 的信号转导。

如在此使用的，术语IR α-链的“C末端区域”是指如在SEQ ID NO：13中给出 的人IR α-链的同种型A(IR-A)的氨基酸693-710，其中根据人IR(SEQ ID  NO：1)的成熟的同种型A进行编码。然而，本领域普通技术人员应当理解的是 来自成熟的人IR(SEQ ID NO：2)的同种型B的IR α-链的相应区域(氨基酸 693-710)可以可替代地用于本发明中。

如在此使用的，术语“典型的α-链C末端肽”或“αCT”，在IR中是指前面在 文献中所述的(如对于胰岛素结合是重要的(Kurose et al.，1994；Kristensen et al， 2002)，并且包括如SEQ ID NO：11中给出的氨基酸704-719(成熟的IR-A受体 编号)的IR的C末端α-链的一个区域。

如在此使用的，术语“富含亮氨酸的重复单位结构域1”或“L1结构域”是指在 IR中一个富含亮氨酸的结构域，该结构域包含成熟的人IR的氨基酸1-156 (SEQ ID NO：1)。IR的L1结构域包括一个中心β折叠，该β折叠包括选自成 熟的人IR(SEQ ID NO：1)的10-15、32-37、60-65、88-97、116-121以及142- 147的氨基酸。

如在此使用的，术语“富含亮氨酸的重复单位结构域2”或“L2结构域”是指在 IR中一个富含亮氨酸的结构域，该结构域包含成熟的人IR的氨基酸310-469 (SEQ ID NO：1)。

如在此使用的，术语“该L1结构域的第四富含亮氨酸的重复单位(LRR)横 档中的环”或其变化是指在IR中一个富含亮氨酸的结构域，该结构域包含成熟的 人IR(SEQ ID NO：1)的氨基酸85-91。

如在此使用的，术语“富含半胱氨酸的结构域”或“CR结构域”是指在IR中一 个富含半胱氨酸的结构域，该结构域包含成熟的人IR(SEQ ID NO：1)的氨基 酸157-309。该CR结构域包含多种不同分子。如在此使用的，术语“CR结构域 的模块6”是指IR中成熟的人IR(SEQ ID NO：1)的氨基酸256-286。

IGF-1R外结构域结构

由于IR与IGF-1R之间高度的序列同源性和结构相似性，当IGF-1R α-链的 C端区域与IGF-1R相结合从而形成该低亲和性IGF结合位点时，本发明还为 IGF-1R α-链的C端区域提供了一个模型。本发明提供了包括该IGF-1R外结构域 α-链跨膜残基681至697的C末端区域(SEQ ID NO：15)在附件III和IV中列 出的原子坐标的一个优选的子集。

如在此使用的，术语“IGF-1R外结构域”是指缺少IGF-1R的跨膜结构域以及 细胞内酪氨酸激酶结构域的IGF-1R的细胞外结构域，典型地包括人IGF-1R的 残基1至905(成熟的受体编号)，或它们的等价物，连同这些残基的任何翻译 后修饰(例如N-连接或O-连接的糖基化作用)一起。

如在此使用的，术语IGF-1R的“低亲和性结合位点”是指涉及形成IGF的 IGF-1R的低亲和性结合位点(也称为“位点1”)的IGF-1R的区域，包括IGF- 1Rα-链的C-末端区域，以及额外地IGF-1R的L1结构域以及IGF-1R的CR结构 域之一或两者。IGF结合到IGF-1R的低亲和性结合位点上诱导形成IGF-1R的高 亲和性IGF结合位点以及随后的信号转导。

如在此使用的，术语IGF-1R α-链的“C末端区域”是指如在SEQ ID NO：15 中给出的人IGF-1R α-链的氨基酸681-697，其中根据成熟的人IGF-1R(SEQ ID  NO：6)进行编码。

如在此使用的，术语“典型的α-链C末端肽”或“αCT“，在IGF-1R中是指相 应于前面在文献中所述的(如对于胰岛素结合是重要的(Kurose et al.，1994； Kristensen et al，2002)，并且包括如SEQ ID NO：14中给出IGF-1R的氨基酸 691-706(成熟的IGF-1R编号)的IR的C末端α-链的IGF-1R的一个区域。

如在此使用的，术语“富含亮氨酸的重复单位结构域1”或“L1结构域”是指在 IGF-1R中一个富含亮氨酸的结构域，该结构域包含成熟的人IGF-1R的氨基酸1- 149(SEQ ID NO：6)。

如在此使用的，术语“富含亮氨酸的重复单位结构域2”或“L2结构域”是指在 IGF-1R中一个富含亮氨酸的结构域，该结构域包含成熟的人IGF-1R的氨基酸 300-459(SEQ ID NO：6)。

如在此使用的，术语“包含Ser35的第二LRR的部分”是指在IGF-1R中成熟 的人IGF-1R(SEQ ID NO：6)的氨基酸35-41。

如在此使用的，术语“富含半胱氨酸的结构域”或“CR结构域”是指在IGF-1R 中一个富含半胱氨酸的结构域，该结构域包含成熟的人IGF-1R(SEQ ID NO： 6)的氨基酸150-299。该CR结构域包含多种不同分子。如在此使用的，术语 “CR结构域的模块6”是指成熟的人IGF-1R(SEQ ID NO：6)的氨基酸249-275。

本发明的原子坐标的处理

应当理解的是多肽的一组原子坐标是在三维空间中定义一种形状的一组相关 联的点。因此，有可能的是完全不同组的坐标可以定义类似的或完全相同的形 状。而且，在单独坐标上的轻微改变将对全部形状具有较小的影响。

由于对原子坐标的数学处理，可以产生坐标变更。例如，可以通过结晶学排 列这些原子坐标、将这些原子坐标分成部分、整体地加上或减去这些结果坐标的 集合、倒转这些原子坐标，或它们的任何组合来处理附件I中提出的原子坐标。

作为替代方案，由于组成该晶体的组分的任何一项中氨基酸突变、添加、取 代、和/或缺失，或其他变化，晶体结构变更也可能说明原子坐标的改变。

使用不同的计算分析来确定是否一个分子复合物或它的一部分与上述IR的 细胞外结构域的结构的全部或部分是足够类似的。能够以目前应用软件进行这类 分析，例如Sequoia程序(Bruns et al.，1999)。

这种分子相似性程序允许不同结构、相同结构的不同构象、以及相同结构的 不同部分之间进行比较。

这些比较典型地包括计算所需要的最佳平移以及旋转这样使得在指定配对的 等效分子上该拟合的均方根差在绝对值上是最小的。这个数量是以埃的形式给出 的。

因此，包括本发明的低亲和性结合位点的IR和/或IGF-1R外结构域的原子 坐标包括通过整体平移和/或旋转与附件I至VI中列出的原子坐标相关联的原子 坐标。因此，上面列出的RMSD值是假定至少该结构的主链原子被最佳地叠合 (这可能需要平移和/或旋转)从而实现所要求的最佳拟合，从该最佳拟合来计 算该RMSD值。

可以通过适当的建模计算机程序例如MODELLER(Sali&Blundell， 1993)，使用例如从下面数据中得到的信息对IR和/或IGF-1R外结构域多肽或 它的与一个指定组的原子坐标基本上一致的区域的三维结构进行建模：(1)人IR 和/或IGF-1外结构域多肽的氨基酸序列；(2)通过指定组的具有一种三维构型的 原子坐标表示的蛋白的相关的一个或多个部分的氨基酸序列；以及(3)该指定的 三维构型的原子坐标。还可以通过一种方法(例如下面详细说明的分子置换法) 来计算与一个指定组的原子坐标基本上一致的IR和/或IGF-1R外结构域多肽的 三维结构。

典型地将原子坐标加载到一个机器可读取的介质上用于随后的计算操作。因 此，模型和/或原子坐标被有利地存储在机器可读取的介质上(例如磁性或光学 介质，以及随机存取或只读存储器，包括磁带、磁盘、硬盘、CD-ROM以及 DVD、闪存卡或芯片、服务器以及互联网)。该机器典型地是计算机。

这些原子坐标可以用于计算机中以便产生可以通过计算机显示的和/或以一 种电子文件形式表示的IR和/或IGF-1R外结构域晶体的三维结构的一种表示， 例如一个图像。

从其中得到的这些原子坐标以及模型还可以用于多种目的，例如药物发现、 生物试剂(结合蛋白)选择以及其他蛋白晶体的X射线晶体学分析。

分子置换/结合

包括α-链的C末端区域的(例如附件I至IV中提出的那些)IR和/或IGF- 1R的结构坐标还可以用于确定包含IR和/或IGF-1R的α-链的至少C末端区域的 分子复合物的三维结构。具体地说，可以得到关于另一种结晶分子复合物的结构 信息。这可以通过多种公知技术(包括分子置换)中任何一项来实现。

总体而言分子置换的方法是本领域普通技术人员已知的(总体上在Brunger， 1997；Navaza&Saludjian，1997；Tong&Rossmann，1997；Bentley，1997；Lattman， 1985；Rossmann，1972；McCoy，2007中说明)。

总体上，X射线衍射数据是从结晶的目标结构的晶体中收集的。该X射线 衍射数据被转换以便计算帕特森函数。将结晶的目标结构的帕特森函数与从一种 已知结构(在此称为搜寻结构)计算的帕特森函数进行比较。在该目标结构帕特 森函数上这种搜寻结构的帕特森函数被旋转从而确定该晶体中该搜寻结构的正确 的取向。然后计算平移函数来确定搜寻结构相对于晶体轴线的位置。一旦该搜寻 结构已经被正确地定位在晶胞中，可以计算这些实验数据的初始相。对于计算可 以从中观察到结构差异的电子密度图，以及对于细化该结构，这些相是必需的。 优选地，该搜寻分子的这些结构特征(例如，氨基酸序列、保守的二硫键、以及 β链或β折叠)在与该结晶的目标结构相关联的。

进而，使该电子密度图经历任何公知的建模以及多种结构精修技术从而提供 该未知的(即靶)结晶的分子复合物的最终的、准确结构(例如，参见Jones et  al.，1991；Brünger et al.，1998)。

通过除了分子置换之外的多种方法得到这些相的准确值是一个耗时的过程， 该过程涉及近似值和精修值的迭代循环并且显著地妨碍了晶体结构的解析。然 而，当已经解析出包含至少一个同源部分的蛋白的晶体结构时，来自已知结构的 相为该未知结构的相提供了一个令人满意的起始估计。

与试图从头确定这类信息相比较，通过使用分子置换法，可以使用包括在此 提供的(以及在附件I至IV中提出的)α-链的C末端区域的IR和/或IGF-1R的 结构坐标的全部或一部分来更快速并且有效地确定结构未知的已知结晶的分子复 合物的结构。在确定IR和/或IGF-1R的突变体或同源物的结构中，这种方法是 特别有用的。

可以通过这种方法解析与IR和/或IGF-1R的细胞外结构域的任何部分充分 同源的任何结晶的分子复合物的任何部分的结构。

对于解析与多种分子(例如，化学实体)共同复合的IR和/或IGF-1R的晶 体结构而言，这类结构坐标也是特别有用的。例如，这种方法能够确定这些化学 实体之间相互作用，以及候选的IR和/或IGF-1R激动剂或拮抗剂的相互作用的 最佳位点。

可以使用公知的X射线衍射技术来研究上述的所有这些复合物，并且可以 使用计算机软件，例如X-PLOR(耶鲁大学，由Molecular Simulations公司分 销；参见Brünger，1996)将其针对1.5-3.5分辨率X射线数据细化到R值为约 0.25或更小。然后可以使用这个信息来优化已知的IR和/或IGF-1R激动剂/拮抗 剂(例如抗-IR和/或抗-IF-1R抗体)，并且更重要地，来设计新的或改进的IR 和/或IGF-1R激动剂/拮抗剂。

用于化合物鉴别、设计或筛选的目标位点

本发明提供的(附件I至IV)IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点的三维 结构可以用于鉴定IR和/或IGF-1R的低亲和性胰岛素结合位点中潜在的目标结 合位点(即用来鉴定涉及胰岛素和/或IGF的结合以及随后的信号转导的并且对 其是重要的IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点的这些区域)以及用于鉴别或 设计与IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点相互作用的化合物的方法中(例如 IR和/或IGF-1R的潜在调节剂)。

本发明提供的(附件I至IV)IR和/或IGF-1R的三维结构可以用来鉴定对 于结合到IR和/或IGF-1R α-链的C端区域上是重要的IR和/或IGF-1R的L1结 构域中潜在的目标结合位点(即用于鉴别涉及IR和/或IGF-1R α-链的C端区域 的结合并且对其是重要的IR和/或IGF-1R的L1结构域的那些区域)以及用于以 类似于IR和/或IGF-1R α-链的C端区域的方式(例如IR和/或IGF-1R的潜在的 调节剂)鉴别或设计与IR和/或IGF-1R的L1结构域相互作用的化合物的方法 中。

IR的低亲和性结合位点是涉及胰岛素对接到受体上的IR外结构域的一个区 域。优选的低亲和性靶结合位点包括该α-链的C端区域以及来自IR外结构域的 L1结构域和/或CR结构域的一个或多个区域。就L1结构域而言，该靶结合位点 优选地包括L1的中心β-折叠的分子表面的多个部分以及包含如上所述的Phe39 或L1的第四LRR横档中的环，或优选地两者的第二富含亮氨酸的重复单位 (LRR)的分子表面的部分。就CR结构域而言，该靶结合位点优选地包括如上 所述的CR结构域的模块6。

作为替代方案，在IR中该低亲和性靶结合位点可以包括选自氨基酸693-710 (包括IR α-链的C末端区域)的一个或多个氨基酸加上下面氨基酸序列的一项 或多项：(i)氨基酸1-156；(ii)氨基酸157-310，以及(iii)氨基酸594以及794。

就氨基酸1-156而言，该靶结合位点优选地包括选自Arg14、Asn15、 Gln34、Leu36、Leu37、Phe39、Pro43、Phe46、Leu62、Phe64、Leu87、 Phe88、Phe89、Asn90、Phe96、Glu97、Arg118、Glu120或His144的至少一个 氨基酸。

就氨基酸157-310而言，该靶结合位点优选地包括选自氨基酸序列192-310 的至少一个氨基酸，更优选地选自序列227-303的至少一个氨基酸、又更优选地 选自序列259-284的至少一个氨基酸。

就氨基酸594以及794而言，该靶结合位点优选地包括选自Asn594或 Arg794的至少一个氨基酸。

在一个优选的实施方案中，范德华和/或疏水性相互作用占化合物与IR的低 亲和性胰岛素结合位点之间结合能的主要部分。

本发明提供的IR α-链的C端区域的三维结构还可以用来鉴别或更清楚地阐 明IGF-1R外结构域上的潜在的靶结合位点(即用来鉴别涉及IGF的结合以及信 号转导并且对其是重要的IGF-1R外结构域的那些区域、或至少更准确地阐明涉 及IGF的结合以及信号转导并且对其是重要的IGF-1R外结构域的那些区域)以 及用于鉴别或涉及与IGF-1R外结构域的潜在的靶结合位点相互作用的化合物的 方法中(例如IGF-1R的潜在的调节剂)。

优选的靶结合位点是控制特异性的那些，即涉及IGF的初始低亲和性结合 IGF-1R外结构域的那些区域(即，IGF初始结合到IGF-1R上)。

IGF-1R的低亲和性结合位点是涉及IGF-I结合到受体上的IGF-1R外结构域 的一个区域。优选的低亲和性靶结合位点包括IGF-1R α-链的C端区域以及来自 IGF-1R外结构域的L1结构域和/或CR结构域的一个或多个区域。就L1结构域 而言，该靶结合位点优选地包括如上定义的L1结构域的一个中心β-折叠、和/或 包含Ser35的该第二LRR的部分、和/或L1结构域的第四LRR横档中的环，或 优选地所有这些。就CR结构域而言，该靶结合位点优选地包括如上所述的CR 结构域的模块6。

作为替代方案，该低亲和性IGF结合位点可以包括选自氨基酸681-697(包 括IGF-1Rα-链的C末端区域)的一个或多个氨基酸加上选自下面氨基酸序列的 一个或多个氨基酸：(i)氨基酸1-149；以及(ii)氨基酸150-298。

就氨基酸1-149而言，该靶结合位点优选地包括选自氨基酸序列1-62，优选 地1-19，并且更优选地氨基酸序列23-49的至少一个氨基酸。就氨基酸150-298 而言，该靶结合位点优选地包括选自氨基酸序列185-298的至少一个氨基酸，更 优选地选自序列220-294的至少一个氨基酸、又更优选地选自序列252-273的至 少一个氨基酸。该靶结合位点优选地包括选自Arg10、His30、Leu32、Leu33、 Leu56、Phe58、Arg59、Phe82、Tyr83、Asn84、Tyr85、Va188、Phe90、Arg112 以及Asn136的至少一个氨基酸。

在一个优选的实施方案中，范德华和/或疏水性相互作用占化合物与IGF-1R 的低亲和性结合位点之间结合能的主要部分。

在IR和IGF-1R两者的情况下，特别是对于生物大分子(例如蛋白或适体) 而言另外优选的结合位点是在空间附近的多个位点上缺乏糖基化或缺乏来自共价 连接到该多肽上的聚糖的空间位阻的那些。

结合IR和/或IGF-1R的化学实体的设计、选择、拟合以及评估

使用多种已知的建模技术，可以使用本发明的晶体结构来生成IR和/或IGF- 1R的低亲和性结合位点的一个模型，或IR或IGF-1R的α-链的C端区域的至少 一部分。

如在此使用的，术语“建模”包括基于原子结构信息以及相互作用模型对分子 结构和/或功能进行定量的和定性的分析。术语“建模”包括常规的基于数字的分 子动力学以及能量最低化模型、交互式计算机图形模型、改良的分子力学模型、 距离几何学以及其他基于结构的限制模型。

分子建模技术可以被应用到IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点，或IR或 IGF-1R的α-链的C端区域的至少一部分、或它们的一个区域的原子坐标上从而 导出3D模型的范围并且从而研究这些结合位点的结构(例如单克隆抗体、非免 疫球蛋白结合蛋白以及抑制肽的结合位点)。

这些技术还可以被用于筛选或设计小的以及大的化学实体，这些化学实体能 够结合IR并且调节IR与细胞外分子目标(例如胰岛素或IGF受体家族的成员， 例如调节IR的异二聚能力的那些)相互作用的的能力。这种筛选可以使用一种 实体3D筛选系统或一个计算筛选系统。

这类建模方法将设计或选择多种化学实体，这些化学实体具有与IR和/或 IGF-1R的低亲和性结合位点，或与IR和/或IGF-1R的L1结构域的这些区域 (这些区域与IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域相互作用)的立体化学互补 性。就“立体化学互补性”而言，我们是指该化合物或它的一部分与该受体产生充 分数量的能量有利的接触从而在结合到受体方面具有自由能的净减少。

这样的立体化学互补性是如通过附件I中提出的坐标列举的与沿着受体的沟 排列的内部位点表面残基分子配合的一个分子的特征，任选地也使用附件II至 VI中提出的坐标。就“配合”而言，是指例如经由氢键或通过非共价的范德华以 及库伦相互作用(与表面或氨基)(这促进该位点内分子的去溶剂化作用)，经 由这样一种方式(即在将分子保留在结合位点是能量上有利的)，这些鉴定的部 分与表面残基相互作用。

优选的是立体化学互补性是这样的即该化合物具有受体位点的K_d小于10^-4M，更优选地小于10^-5M，并且更优选地10^-6M。在一个最优选地实施方案中， 该K_d值是小于10^-8M并且更优选地是小于10^-9M。

与特征为附件I至IV在和提出的位于原子坐标上的氨基酸的受体位点的形 状和静电性质或化学性质互补的化学实体将可能结合到该受体上，并且当该结合 是足够强时，显著地抑制了IR和/或IGF-1R外结构域与生物靶分子例如胰岛素 或IGF的相互作用。

应当理解的是化学实体与受体位点之间的互补性延伸到该受体位点的所有残 基之上从而抑制与IR和/或IGF-1R外结构域自然地相互作用的分子或复合物的 结合是不需要的。

可以使用多种方法来鉴别具有与IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点，或 与IR和/或IGF-1R的L1结构域的这些区域(这些区域与IR和/或IGF-1R的α- 链的C端区域相互作用)立体化学互补性的化学实体。例如，该过程可以基于 从机器可读取的存储介质中产生的附件I至IV中的坐标通过在计算机屏幕上对 包含IR的α-链的C端区域，或IGF-1R中等效区域的整个低亲和性胰岛素结合 位点的目检来启动。作为替代方案，然后可以将选定的片段或化学实体定位在多 个取向上，或以类似于如上定义的IR或IGF-1R的α-链的C端区域的方式对接 在IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点之内，或IR和/或IGF-1R的L1结构域 之内。可以使用类似方法来鉴定能够以类似于IR和/或IGF-1R的α-链的C端区 域与IR和/或IGF-1R的L1结构域相互作用的化学实体或化合物。

可以使用本领域中公知的并且可以得到的建模软件(Guida，1994)。这些包 括Discovery Studio(Accelrys软件公司，圣地亚哥)、SYBYL(Tripos  Associates公司，密苏里州圣路易斯，1992)、Maestro(LLC，波特 兰)、MOE(Chemical Computing Group公司，蒙特利尔，加拿大)。这个建模 步骤可以紧接着用标准分子力学力场例如AMBER(Weiner et al.，1984)、OPLS (Jorgensen and Tirado-Rives，1988)以及CHARMM(Brooks et al.，1983)进行 能量最低化。此外，存在多种更专业的计算机程序来辅助选择本发明的的结合部 分的过程。

专业计算机程序还可以辅助选择片段或化学实体的过程。这些包括，尤其 是：

1.GRID(Goodford，1985)。GRID可以从意大利Molecular Discovery公司 得到。

2.AUTODOCK(Goodsell&Olsen，1990)。AUTODOCK可以从加利福尼 亚州拉霍亚市Scripps研究院得到。

3.DOCK(Kuntz et al.，1982)。DOCK可以从加利福尼亚州旧金山市加利福 尼亚大学得到。

4.GLIDE(Friesner et al，2004)。GLIDE可以从波特兰LLC公 司得到。

5.GOLD(Cole et al，2005)。GOLD可以从英国剑桥市剑桥晶体学数据中 心得到。

一旦已经选定适当的化学实体或片段，可以将它们组装成一个单个的化合 物。在一个实施方案中，可以通过对与IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点的 结构坐标或IR或IGF-1R的α-链的C端区域与之结合的L1的结构域相关联的在 计算机屏幕上显示的三维图像上这些片段彼此之间的关系进行目检来进行组装。 这紧接着是使用软件例如Discovery Studio、Maestro、MOE或Sybyl进行手工建 模。作为替代方案，可以使用标准的化学几何形状将这些片段连接到额外原子 上。

用于化学实体的上述评估方法能够以类似于化合物的方式来执行。

帮助本领域技术人员连接单个的化学实体或片段的有用的程序包括：

1.CAVEAT(Bartlett et al.，1989)。CAVEAT可以从加利福尼亚州伯克利市加利 福尼亚大学得到。

2.GANDI(Day and Caflisch，2008)。GANDI可以从苏黎士大学得到。

还可以根据本发明使用其他分子建模技术，参见例如Cohen et al.(1990)以 及Navia&Murcko(1992)。

根据本发明有两种优选的方法来设计分子，它们与IR和/或IGF-1R的低亲 和性结合位点的立体化学，或IR或IGF-1R的α-链的C端区域与之结合的L1结 构域互补。该第一方法是在计算机上主要地但不排他地使用几何标准来评估具体 分子与位点的拟合度将来自一个三维结构数据库的分子直接对接到靶结合位点 上。在这种方法中，当一个本体(活性位点)包含形成第二本体(互补的分子) 的结合位点的“口袋”或“沟”时，通过仅考虑两个刚体的几何学(硬球)相互作用 来降低自由度的内部度数的数值(以及在分子构象空间内相应的局部最小值)。

可以通过使用受体的多重构象(Totrov and Abagyan，2008)将受体、IR或 IGFR的柔性结合到该计算机上筛选中。能够以计算方式通过使用分子动力学模 拟或类似方法从附件I至VI中列出的坐标产生该受体的多重构象。

这种方法由Kuntz等人(1982)以及Ewing等人(2001)说明，其内容通过 引用结合在此，它的配体设计算法是在由加利福尼亚大学董事会承销的一个商用 软件包，DOCK版本4.0中执行的，并且在由该分销商提供的一个文件中被进一 步说明，该文件标题为“Overview of the DOCK program suite”，其内容通过引用 结合在此。根据Kuntz算法，IR或IGF-1R的α-链的C端区域拟合在其中的空腔 的形状被定义为一系列不同半径的重叠的球体。然后针对接近如此定义的形状的 分子搜索晶体学数据的一个或多个现存数据库，例如剑桥结构数据库系统(英国 剑桥市剑桥晶体学数据中心)、由结构生物信息学研究合作组织维护的蛋白数据 库(美国新泽西州罗格斯大学)、LeadQuest(密苏里州圣路易斯市Tripos  Associates公司)、Available Chemicals Directory(Symyx Technologies公司)、 以及NCI数据库(美国国立癌症研究所)。

然后可以对基于几何参数鉴别的分子进行修改以满足与化学互补性相关联 的标准，例如氢键、离子相互作用以及范德华相互作用。可以使用不同的评分函 数来从数据库中分类和选择最佳的分子。参见例如Bohm&Stahl(1999)。由 Tripos Associates公司(密苏里州圣路易斯市)销售的软件包FlexX是可以用于 这种直接对接方法的另一种程序(参见Rarey et al.，1996)。

该第二优选方法包括对该位点内或周围样品位置处对应的化学基团(“探 针”)与该活性位点的相互作用进行一个评估，这导致了能量值的一个阵列，可 以在选定的能级下从该阵列产生三维轮廓表面。这种配体设计的化学探针法例如 由Goodford，(1985)来说明，其内容通过引用结合在此，并且在数种商业软件 包，例如GRID(意大利Molecular Discovery公司的产品)中被执行。

根据这种方法，最初通过用不同的化学探针(例如水、一个甲基基团、一 个胺氮、一个羧基氧、或一个羟基)探查活性位点来鉴定位点互补分子的化学先 决条件。因此确定了该活性位点与每个探针之间相互作用的有利的位点，并且可 以从得到的这类位点的三维图案产生一个假定的互补分子。这可以通过搜索三维 数据库以鉴别出结合希望的药效团模式的分子的程序亦或通过使用有利位点和探 针作为输入来进行重新设计的程序来实现。用于确定以及设计药效团的适当的程 序包括CATALYST (Accelrys Software公司)，以及CERIUS2，DISCO(Abbott  Laboratories，Abbott Park，IL；由Tripos Associates公司分销的)。

可以使用一种程序(例如CATALYST(Accelrys Software公司)以及 Sybyl/3DB Unity(密苏里州圣路易斯市Tripos Associates公司))使用该药效团 在计算机上筛选化合物库/三维数据库。

这些化学结构的数据库可以从多种来源(包括剑桥晶体学数据中心(英国 剑桥市)、Molecular Design公司(加利福尼亚州圣莱安德罗市)、Tripos  Associates公司(密苏里州圣路易斯市)、Chemical Abstracts Service(俄亥俄州哥 伦布市)、Available Chemical Directory (Symyx Technologies公司)、Derwent  World Drug Index(WDI)、BioByteMasterFile、国立癌症研究所数据库 (NCI)、Medchem Database(BioByte Cortp.)、以及Maybridge目录)得到。

重新设计程序包括LUDI(加利福尼亚州圣地亚哥市Accelrys Software公 司)、Leapfrog(Tripos Associates公司)、以及LigBuilder(中国北京大学)。

一旦通过上述方法已经设计或选定了一种实体或化合物，可以通过计算评 估来测试以及优化该实体或化合物可以结合到IR和/或IGF-1R上的效率。例 如，已经被设计或选定来作为一种IR结合化合物起作用的化合物，当它结合到 该天然IR上时，它还必须优选地横过未重叠被结合位点占据的一个体积。一种 有效的IR结合化合物必须优选地证明它的结合态与游离态之间在能量方面有相 对小的差异(即结合的一种小的变形能)。因此，应当优选地用结合的形变能量 不大于约10kcal/摩尔，优选地不大于7kcal/摩尔来设计最有效的IR和/或IGF- 1R结合化合物。IR和/或IGF-1R结合化合物能够以多于一种构象与IR和/或 IGF-1R相互作用，这些构象在总结合能方面是类似的。在这些情况下，取得结 合的变形能是游离化合物的能量与当该化合物结合到该蛋白上时观察到的这些构 象的平均能量之间的差值。

被设计或选定为结合到IR和/或IGF-1R上的化合物可以被进一步计算机优 化这样使得它的结合表明它应当优选地缺乏与靶蛋白的排斥性静电相互作用。

这类非互补性(例如静电的)相互作用包括排斥性电荷-电荷、偶极子-偶极 子、以及电荷-偶极子相互作用。具体地说，当该化合物结合到IR和/或IGF-1R 上时该化合物与该蛋白之间所有静电相互作用的总和优选地为结合焓做出中性或 有利的贡献。

一旦已经如上所述最佳地选择或设计了一种IR和/或IGF-1R-结合化合物， 然后可以在它的原子或侧基中的一些上进行取代以改善或改变它的结合特性。总 体上，最初的取代是保守的，即替换基团应当具有与初始基团大致相同的尺寸、 形状、疏水性以及电荷。当然应当理解的是应当避免本领域已知的改变构象的组 分。然后可以通过上面详细说明的相同的计算机方法针对与IR的拟合效率对这 类取代的化合物进行分析。

在本领域中可以得到专用计算机软件来评估化合物变形能以及静电相互作 用。针对这类应用设计的程序的实例包括：Gaussian 03，(Frisch，Gaussian公 司匹兹堡，宾夕法尼亚州)；GAMESS(Gordon等人，爱荷华州立大学)； Jaguar(LLC公司，波特兰市)；AMBER，版本9.0(Case等人，加 利福尼亚大学旧金山分校)；CHARMM(Accelrys Software公司，圣地亚哥 市，加利福尼亚州)；以及GROMACS版本4.0(van der Spoel等人)。

这些筛选/设计方法能够以硬件或软件，或两者的一种组合的形式实现。然 而，优选地，这些方法以计算机程序的方式实现，这些计算机程序在可编程的计 算机上执行，每个计算机包括一个处理器、一个数据存储系统(包括可变以及固 定存储器和/或存储元件)、至少一个输入设备、以及至少一个输出设备。使用 程序码来输入数据从而运行上述函数并且产生输出信息。该输出信息以已知方式 应用到一个或多个输出设备上。该计算机可以是例如一台常规设计的个人计算 机、微型计算机、或工作站。

每个程序优选地以高级程序的或面向对象编程的语言来实现以便于计算机 系统进行交流。然而，这些程序能够以汇编或机器语言来实现(如果希望的 化)。在任何情况下，该语言可以是编译的或解释的语言。

每个这样的计算机程序都被优选地存储在可被通常或专用目的可编程计算 机读取的一个存储介质或设备上(例如ROM或磁盘)，从而当该存储介质或设 备被该计算机读取以运行在此所述的步骤时，配置并且操作该计算机。该系统还 可以被认为以计算机可读取的存储介质的形式来执行，该存储介质配备有一个计 算机程序，其中这样配置的存储介质引起计算机以科学的并且预定方式操作从而 执行在此所述的函数。

化合物

本发明的化合物包括使用本发明的一种筛选方法设计或识别的那些以及能 够识别并且结合到如上定义的IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点上的那些两 者。本发明还包括以类似于IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的方式结合到IR 和/或IGF-1R的L1结构域上的化合物，即，模拟IR和/或IGF-1的α-链的C端 区域的化合物。

可以使用基于使用相应于IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点的3D结构 的原子坐标的一种筛选方法生产能够识别并且结合到IR和/或IGF-1R的低亲和 性位点上的化合物，或者可替代地，可以通过针对指示结合到IR和/或IGF-1R 的低亲和性结合位点上的能力的特异性靶分子的筛选来鉴别。

能够识别并且以类似于IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的方式结合到IR 和/或IGF-1R的L1结构域上化合物(例如模拟IR和/或IGF-1R的α-链的C端区 域的化合物)可以使用基于在分离状态下或当它与IR和/或IGF-1R相结合时使 用相应于IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的3D结构的原子坐标一种筛选方 法来生产，或可替代地可以通过针对指示结合到IR和/或IGF-1R的低亲和性结 合位点上的能力的一种特异性靶分子筛选来鉴定。

候选化合物和/或使用本发明的方法鉴别的或设计的化合物可以是任何适当 的化合物(合成的或自然发生的，优选地是合成的)。在一个实施方案中，通过 本发明的方法选择的或设计的合成化合物优选地具有分子量等于或小于约 5000、4000、3000、2000、1000或500道尔顿。本发明的一种化合物优选地是 在生理条件下可溶的。

这些化合物可以包括多种化学种类(虽然典型地它们是有机分子)，优选 地是具有分子量大于50且小于约2,500道尔顿，优选地小于1500，更优选地小 于1000，并且还更优选地小于500的有机小分子。这类化合物可以包括与蛋白 结构性相互作用所必需的多种官能团，典型地是氢键，并且典型地包括至少一个 胺、羰基、羟基或羧基，优选地是这些功能性化学基团的至少两种。该化合物可 以包括用上述官能团中一项或多项取代的环碳或杂环结构和/或芳香族的或杂芳 族结构。这些化合物还可以包括多种生物分子，包括肽类、糖类、脂肪酸类、类 固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物类、结构类似物类、或它们的组合。

这些化合物可以包括例如：(1)肽类，例如可溶性肽类，包括Ig-尾部的融合 肽类以及随机肽文库的成员(参见例如Lam et al.，1991；Houghten et al.，1991)以 及由D-和/或L-构型氨基酸组成的组合化学衍生的分子库；(2)磷酸肽类(例 如，随机的以及部分降解的，直接的磷酸肽库的成员，参见例如Songyang et al.， 1993)；(3)抗体类(例如，多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合的、以 及单链抗体连同抗体的Fab、(Fab)_2′、Fab表达文库、以及表位结合片段)；(4) 非免疫球蛋白结合蛋白，例如但不限于avimer、DARPin以及脂质运载蛋白；(5) 基于核酸的适体；以及(6)有机的以及无机的小分子。

可以从广泛多样的来源(包括合成的或天然化合物的文库)得到配体。合 成化合物文库可以从例如Maybridge Chemical公司(英国康沃尔郡廷塔杰尔 市)，AMRI(匈牙利布达佩斯)以及ChemDiv(加利福尼亚州圣地亚哥市)， Specs(荷兰代尔夫特市)商购。

包括细菌、真菌、植物或动物提取物是天然化合物文库可以从例如Pan  Laboratories(华盛顿州博瑟尔市)，TimTec(特拉华州纽瓦克市)得到。此 外，对于广泛多样的有机化合物和生物分子的随机或定向合成而言，有多种方法 可供使用，包括随机寡核苷酸的表达。

可替代地，能够以细菌、真菌、植物以及动物提取物的形式容易地生成天 然化合物的文库。可以容易地得到合成分子文库的方法(参见，例如，DeWitt et  al.，1993；Erb et al.，1994；Zuckermann et al.，1994；Cho et al.，1993；Carell et al.， 1994a；Carell et al.，1994b；以及Gallop et al.，1994)。此外，天然或合成的化合 物文库以及化合物可以通过常规的化学的、物理的以及生物化学手段(参见，例 如，Blondelle and Houghton，1996)来容易地改变，并且可以用于生产组合文 库。在另一种方法中，前面鉴定的药理学试剂可以经受定向或随机化学，例如酰 基化、烷基化、酯化、酰胺化，并且可以针对IR和/或IGF-1R-调节活性筛选类 似物。

生产组合文库的多种方法是本领域已知的，包括涉及生物文库、空间可寻 址平行固相或溶液相文库、需要去卷积的合成文库方法、“一珠粒一化合物”文库 方法、以及使用亲和层析选择合成文库方法的那些。生物文库法限于多肽或肽文 库，而其他四种方法可用于多肽、肽、非肽寡聚物、或化合物的小分子文库 (Lam，1997)。

这些化合物还包括可以从由基于碎片的药物设计产生的前导物合成的那 些，其中这类化学片段的结合是通过将这类筛选片段浸泡或共结晶成为由本发明 提供的晶体并且然后使这些经受一个X射线束并且得到衍射数据来评估的。本 领域普通技术人员易于使用差异傅里叶技术来确定IR外结构域和/或IGF-1R外 结构域结构中这些片段结合的位置，并且然后这类片段可以通过合成化学组装成 具有增加的受体亲和性的更大的化合物。

分离的肽或其模拟物

使用本发明的方法鉴定的或设计的化合物可以是一种肽或它的一种模拟 物。而且，一方面，本发明提供了一种分离的肽或它的模拟物，该分离的肽或模 拟物结合IR的L1结构域和/或IGF-1R的L1结构域，该肽包括：

i)如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中提供的一种氨基酸序列；

ii)一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO： 15是至少50％一致的；或

iii)i)或ii)的一种片段，该片段结合IR的L1结构域和/或IGF-1R的L1 结构域，

其中该肽具有一种螺旋结构。

本发明的分离的肽或模拟物可以是构象限制的分子或可替代地不是构象限 制的分子，像例如非限制性肽序列。术语“构象限制的分子”是指构象限制的肽以 及构象限制的肽类似物以及衍生物。

术语“类似物”是指具有与天然发生的α-氨基酸化学类似结构的分子。实例 包括包含偕二氨基烷基基团或烷基丙二酰基基团的分子。

术语“衍生物”包括α-氨基酸，其中在天然发生的α-氨基酸中发现的一个或 多个侧基已经被修饰。因此，例如，这些氨基酸可以被多种非编码的或修饰的氨 基酸替换，例如对应的D-氨基酸或N-甲基-氨基酸。其他修饰包括用化学上类似 基团取代羟基、巯基、氨基以及羧基官能团。

就肽以及它们的模拟物而言，能够以取代或加成引入的其他非天然氨基酸 或化学氨基酸类似物/衍生物的其他实例，包括但不限于：2，4-二氨基丁酸、α-氨 基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙 酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、 磺基丙胺酸、叔-丁基甘氨酸、叔-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β- 丙胺酸、氟-氨基酸类、设计的氨基酸类例如β-甲基氨基酸类、Cα-甲基氨基酸 类、Nα-甲基氨基酸类、以及泛指的氨基酸类似物。

该模拟物可以是一种模拟肽。“模拟肽”是模拟肽的生物活性的一种分子，但 在化学性质上不是较长的肽。就严格定义而言，模拟肽是不再包含任何肽键 (即，氨基酸之间的酰胺键)的一种分子。然而，术语肽模拟物有时用于说明在 本质上不再是完全的肽的分子，例如似肽、半肽以及类胨。无论是否完全或部分 地非肽，用于本发明的方法中的和/或本发明的模拟肽提供了反应化学部分的一 种空间安排，这些化学部分紧密地类似于该模拟肽所基于的肽中活性基团的三维 结构安排。这种类似的活性位点几何形状的结果是，该模拟肽对类似于该肽的生 物活性的生物系统具有影响。

使用给定肽的模拟物而不是该肽本身有时具有多个优点，因为这些肽通常 展示两个不令人希望的特性：(1)较差的生物利用率；以及(2)短的作用持续时 间。肽模拟物围绕这两个主要障碍提供了一个清楚的路径，因为所关注的分子是 小到足以具有口服活性以及具有长的作用持续时间两者。还存在与肽模拟物相关 联的显著的成本节省以及病人顺应性的改善，因为与肠胃外施用肽相比较，它们 可以被口服施用。而且，这些肽模拟物总体上是比肽更廉价生产的。

可以使用容易得到的技术来开发基于IR和/或IGR-1R的α-链的C端区域的 适当的模拟肽。因此，例如，可以用允许该模拟肽采用与初始肽类似结构(并且 因此生物活性)的非肽键来替换肽键。还可以通过用类似结构的其他化学基团替 换氨基酸的化学基团进行进一步修饰。通过参考如附件I至IV中提供的这些残 基的三维结构辅助开发从IR和/或IGF-1R α-链的C端区域的肽衍生的模拟肽。 可以使用这种结构信息使用多种程序(例如Sybyl/3DB Unity(密苏里州圣路易 斯市Tripos Associates公司))来搜索多个三维结构数据库来鉴定具有类似结构 的分子。

本领域普通技术人员应当理解的是模拟肽的设计可能要求使用本发明的方 法稍微地结构改变或调整设计的或鉴定的化学结构。总体上，使用本发明的方法 鉴定的或设计的化合物可以化学地合成并且然后使用在此所述的任何方法针对调 节IR和/或IGF-1R活性的能力进行测试。本发明的方法是特别有用的，因为它 们可以被用来显著地降低必须针对它们的调节IR和/或IGF-1R活性的能力进行 筛选的潜在模拟物的数量。

本发明的肽或模拟肽可以被用于针对候选化合物的筛选测定中，这化合物 结合到IR和/或IGF-1R的多个区域上并且有可能干扰胰岛素结合到IR上和/或信 号转导和/或IGF结合到IGF-1R上和/或信号转导。模拟靶结合位点的肽或模拟 肽作为用于鉴定潜在有用的IR和/或IGF-1R的配体的特异性靶分子是特别有用 的。

对于鉴定结合到受体上的化合物而言，标准的固相ELISA测定形式是特别 有用的。根据这个实施方案，该肽或模拟肽固定在一个固体基质上，像例如聚合 物针的一个阵列或一种玻璃载体。方便地，该固定的肽或模拟肽是包含谷胱甘肽 S转移酶(GST；例如一种CAP-ERK融合物)的一种融合的多肽，其中该GST 部分有助于该蛋白固定到固相载体上。然后可以使用这种测定形式来针对结合到 该固定的肽或模拟肽和/或干扰IR和/或IGF-1R的天然结合的配偶体结合到固定 的肽或模拟肽上的候选化合物进行筛选。

如在此使用的，“片段”是本发明的肽的一部分，它保持该“全长”肽的定义的 活性，即结合到IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点上或结合到IR和/或IGF- 1R的L1结构域上的能力。这些片段可以是任何尺寸，只要它们保持定义的活性 即可。优选地，该片段保持该全长多肽的至少50％，更优选地至少75％的活 性。

肽的％一致性是通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程 序)、使用空隙建立罚分＝5，以及空隙延伸罚分＝0.3来确定的。该查询序列的 长度是至少10个氨基酸，并且该GAP分析在至少10个氨基酸的区域内比对了 这两个序列。更优选地，该GAP分析在它们整个长度上比对了两个序列。

对于一个定义的多肽/酶而言，应当理解的是高于以上所提供的那些的％一 致性的数值将包括在优选的实施方案中。因此，当适当时，就最小％一致性数值 而言，优选的是该肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与有关指定的SEQ ID NO具有至少50％、更优选地至少55％、更优选地至少60％、更优选地至少 65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地 至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优 选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、 更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少 99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更 优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少 99.8％、以及甚至更优选地至少99.9％一致性。

使用本发明的方法鉴别或设计的、和/或本发明的这些肽的氨基酸序列突变 体可以通过将适当的核苷酸改变引入本发明的一个核酸中、或通过体外合成希望 的肽来制备。此类突变体包括例如该氨基酸序列中的残基的缺失、插入或置换。 可以进行缺失、插入和置换的组合来达到最终的构建体，条件是这种最终的肽产 物具有令人希望的特性。

在设计氨基酸序列突变体中，该突变位点的定位以及该突变的本性将取决 于有待修饰的一种或多种特征。可以逐个地或系列地修饰用来突变的位点，例如 通过(1)首先用保守的氨基酸选择进行置换，并接着用更多基团的选择进行置 换，这取决于所达到的结果，(2)删除该目标残基，或(3)邻近该定位的位点将 其他残基插入。

取代突变体在该肽中将至少一个氨基酸去除，并且在其位置上插入一种不 同的残基。感兴趣的位点是以下位点，其中从不同菌株或物种获得的具体的残基 是一致的。这些位点，特别是落在至少3个其他相同的保守位点的序列中的那些 位点，优选地按照一种相对保守的方式被取代。这类保守取代示于标题为“示例 性取代”下的表1中。

表1.示例性的取代

  初始残基  示例性取代   Ala(A)  val；leu；ile；gly   Arg(R)  lys   Asn(N)  gln；his   Asp(D)  glu   Cys(C)  ser   Gln(Q)  asn；his   Glu(E)  asp   Gly(G)  pro，ala   His(H)  asn；gln   Ile(I)  leu；val；ala   Leu(L)  ile；val；met；ala；phe   Lys(K)  arg   Met(M)  leu；phe   Phe(F)  leu；val；ala   Pro(P)  gly   Ser(S)  thr   Thr(T)  ser   Trp(W)  tyr   Tyr(Y)  trp；phe   Val(V)  ile；leu；met；phe，ala

在一个优选的实施方案中，当与在此定义的肽比较时，突变体/变异体肽具 有一个或两个或三个或四个保守氨基酸改变。保氨基酸改变的详细情况提供于表 1中。

还包括在本发明范围内的是多种肽，这些肽在合成过程中或之后被差异性 地修饰，例如通过生物素化作用，苄基化作用，糖基化作用，乙酰化作用，磷酸 化作用，酰胺化作用，通过已知的保护/阻断基团，蛋白酶剪切、连接到一种抗 体分子或其他细胞配体上等等的衍生作用。这些修饰可以用于增加该肽的稳定性 和/或生物活性。

形成IR片段693-710的残基可以被分成三类：类型A：侧链被完全埋入与 L1的界面中的那些(即，F701以及F705)；类型B：侧链位于与L1的界面周 围的那些(即K694、E697、E698、S700、R702、T704、Y708以及L709)；以 及类型C：侧链显示没有与L1相互作用的那些(即L693、E695、L696、 S699、K703、E706、D707以及H710)。就使用693-710肽本身作为在它结合到 L1结构域上期间可以与IR α-链肽的C端区域竞争模拟物的支架而言，在第一种 情况中设计可以集中在取代属于类型B中的这些残基上，条件是位于类型A中 的这两个残基被相对最佳地填在界面中并且已经具有少量自由度。通过用天然发 生的氨基酸亦或非天然氨基酸取代一个或多个类型B残基可以实现更高亲和性 结合。例如，用具有减少的旋转异构的自由度(即减少的熵)的残基取代一个或 多个带电荷的残基K694、E697、E698以及R702可以导致更高的亲和性结合或 化合物的理化特性改变。例如这类修饰可以包括用天然发生的氨基酸Phe、Tyr 或Trp进行取代。作为一个进一步实例，在K694以及R702的情况下，可能的 是通过保留末端阳离子特性的更大体积的非天然氨基酸取代这些残基，例如通过 碱性苯基丙酸衍生物App(L-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸)和/或Gpp(L-2-氨基- 3-(4-胍基苯基)丙酸)(Svenson et al.，2009)进行取代。设计的进一步的策略可 以涉及取代以便改善该螺旋结构的整体稳定性(例如，U形螺旋-参见Danial et  al.，2008)。这类取代在类型C残基中将可能被完成。用于提高亲和性或理化特 性的一个又进一步的实施方案可以涉及平截该螺旋区段和/或附接同样设计的一 个N-或C-端基团从而提高亲和性。可以基于如上针对IR肽列出的天然IGF-1R 肽681-697应用类似的设计原则来产生修饰的肽。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的一个肽或它的模拟物不包括下面 US 7,173,005中说明的任何一项：

a)X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁，X₂，X₄以及X₅是芳香族氨基酸，并且X₃是 任何一种极性氨基酸；

b)X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃，其中X₆以及X₇是芳香族氨基酸，X₈、 X₉、X₁₁以及X₁₂是任何一种氨基酸，并且X₁₀以及X₁₃是疏水性氨基酸；

c)X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁，其中X₁₄，以及X₁₇是疏水性氨基酸， X₁₅、X₁₆、X₁₈以及X₁₉是任何一种氨基酸，并且X₂₀以及X₂₁，是芳香族氨基 酸；

d)X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁，其中X₂₂、X₂₅、X₂₈、X₂₉、X₃₀、X₃₃、X₃₄、X₃₅、X₃₆、X₃₇、X₃₈、X₄₀、 以及X₄₁是任何一种氨基酸，X₃₅以及X₃₇可以是用于结合到IR上的任何一种氨 基酸，而X₃₅优选地是一种疏水性氨基酸并且X₃₇优选地是用于结合到IGF-1R上 的甘氨酸并且具有激动剂或拮抗剂活性。X₂₃以及X₂₆是疏水性氨基酸。这个序 列进一步包括至少两个半胱氨酸残基，优选地在X₂₅以及X₄₀处，X₃₁以及X₃₂是 小氨基酸；

e)X₄₂X₄₃X₄₄S₄₅X₄₆X₄₇X₄₈X₄₉X₅₀X₅₁X₅₂X₅₃X₅₄X₅₅X₅₆X₅₇X₅₈X₅₉X₆₀X₆₁，其中X₄₂、X₄₃、X₄₄、X₄₅、X₅₃、X₅₅、X₅₆、X₅₈、X₆₀以及X₆₁可以是任 何一种氨基酸、X₄₃、X₄₆、X₄₉、X₅₀、X₅₄是疏水性氨基酸，X₄₇以及X₅₉优选地 是半胱氨酸，X₄₈是一种极性氨基酸，并且X₅₁、X₅₂以及X₅₇是小氨基酸；

f)X₆₂X₆₃X₆₄X₆₅X₆₆X₆₇X₆₈X₆₉X₇₀X₇₁X₇₂X₇₃X₇₄X₇₅X₇₆X₇₇X₇₈X₇₉X₈₀X₈₁，其中X₆₂、X₆₅、X₆₈、X₆₉、X₇₁、X₇₃、X₇₆、X₇₇、X₇₈、X₈₀、以及X₈₁可 以是任何一种氨基酸；X₆₃、X₇₀、X₇₄是疏水性氨基酸；X₆₄是一种极性氨基酸， X₆₇以及X₇₅是芳香族氨基酸并且X₇₂以及X₇₉优选地是能够形成一个环的半胱氨 酸；

g)H X₈₂X₈₃X₈₄X₈₅X₈₆X₈₇X₈₈X₈₉X₉₀X₉₁X₉₂，其中X₈₂是脯氨酸或丙 氨酸，X₈₃是一个小氨基酸，X₈₄是选自亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸，X₈₅是一种极 性氨基酸、X₈₆、X₈₈、X₈₉以及X₉₀是任何一种氨基酸，并且X₈₇、X₉₁以及X₉₂是 一种脂肪族氨基酸；

h)X₁₀₄X₁₀₅X₁₀₆X₁₀₇X₁₀₈X₁₀₉X₁₁₀X₁₁₁X₁₁₂X₁₁₃X₁₁₄，其中X₁₀₆至X₁₁₁的氨基酸中至少一项，并且优选地两项，是被三个氨基酸分开的色氨酸，并且其 中X₁₀₄、X₁₀₅以及X₁₀₆的至少一项以及X₁₁₂、X₁₁₃以及X₁₁₄的至少一项是半胱氨 酸；

i)一种氨基酸序列，该序列包括序列JBA5： DYKDLCQSWGVRIGWLAGLCPKK或JBA5减去标记以及末端赖氨 酸：LCQSWGVRIGWLAGLCP(式9)；以及

j)W X₁₂₃G Y X₁₂₄W X₁₂₅X₁₂₆其中X₁₂₃是选自脯氨酸、甘氨酸、丝氨 酸、精氨酸、丙氨酸或亮氨酸，更更优选地是脯氨酸；X₁₂₄是任何一种氨基酸， 但优选地是一种带电荷的或芳香族氨基酸；X₁₂₅是一种疏水性氨基酸优选地是亮 氨酸或苯丙氨酸，并且最优选地是亮氨酸。X₁₂₆是任何一种氨基酸，但优选地是 一种小氨基酸。

在一个进一步优选的实施方案中，与它是上面a)至j)中任何一项的情况相 比较(例如以SEQ ID No：16至18形式提供的肽)，本发明的一种肽或它的模 拟物在结构上是更类似于IR的α-链的天然C端区域和/或IGF-1R的α-链的C末 端区域。

这些α螺旋的合成的非肽模拟物的设计是一个已确立的技术(参见例如 Davis et al.，2006)。具体地说，模拟i、i+4、i+7基序(例如在IR以及IGF-1R 的α-链的C端螺旋区域内鉴别出的那些以及与对应的L1结构域相互作用的那些 (即，IR残基Phe701、Phe705、Tyr708以及IGF-1R残基Tyr688、Phe 692、 Phe 695)的方法是已知的。例如，可以通过联三苯、寡聚苯基、查耳酮或1，4- 苯并二氮杂卓-2，5-二酮支架(Davis et al.，2006)或者通过苯甲酰脲支架(US 2008153802)来模拟这些基序。在多种疾病背景例如HIV1感染(六元螺旋束的 组件的分裂(Ernst et al.，2001))以及癌(HDM2-p53复合物的组件的分裂 (Yin et al.，2005)；Bcl-2家族异二聚作用的抑制剂(Degterev et al.，2001)) 中这些α-螺旋的非肽模拟物已经作为疗法被研究。

就使用本发明的方法重新设计化合物而言，在一个实施方案中，该化合物 被重新设计以便在结构上更类似于IR的α-链的天然C端区域和/或IGF-1R的α- 链的C端区域。可能以这种方式被重新设计的肽的实例包括但不限于由等人(2003)和/或US 7,173,005(参见上面)说明的那些。

化合物与IR和/或IGF-1R的相互作用

一种化合物可以通过直接地亦或间接地结合到该区域上与IR和/或IGF-1R 的低亲和性结合位点相互作用。直接结合的化合物结合到指定的区域上。间接地 结合的化合物结合到紧密接近于或邻近于IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点 的一个区域上，其结果是它以拮抗方式亦或以激动方式干扰IR结合到胰岛素上 或IGF-1R结合IGF的能力。这类干扰可以是空间的、静电的、或变构的。优选 地，一种化合物通过直接地结合到该指定区域上而与IR和/或IGF-1R的低亲和 性结合位点相互作用。在结合到特异性靶分子上的化合物的情况下，这类化合物 直接地结合到特异性靶分子上。

可替代地，一种化合物能够以类似于IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域的 方式通过直接地亦或间接地结合到该区域上与IR和/或IGF-1R的L1结构域相互 作用。直接结合的化合物结合到指定的区域上。间接结合的化合物以类似于IR 和/或IGF-1R的α-链的C端区域的方式结合到紧密接近于或邻近于IR和/或IGF- 1R的L1结构域的一个区域上，其结果是它以拮抗的方式亦或以激动的方式干扰 IR结合到胰岛素上或IGF-1R结合IGF的能力。这类干扰可以是空间的、静电 的、或变构的。优选地，一种化合物以类似于IR和/或IGF-1R的α-链的C端区 域的方式通过直接地结合到指定区域上与IR和/或IGF-1R的L1结构域相互作 用。在结合到特异性靶分子上的化合物的情况下，这类化合物直接地结合到特异 性靶分子上。

结合可以是通过共价或非共价相互作用，亦或两者。非共价相互作用的实 例包括静电相互作用、范德华相互作用、疏水性相互作用以及亲水性相互作用。

当本发明的化合物与IR和/或IGF-1R相互作用时，对供应地它优选地“调 节”IR或IGF-1R。就“调节”而言，我们是指该化合物将IR或IGF-1R的活性改变 了至少10％。适当地，一种化合物通过增加或减少经由IR或IGF-1R的信号转 导而对应地调节IR或IGF-1R。短语“降低信号转导”旨在包括经由IR或IGF-1R 的信号转导的部分或全部抑制。候选化合物增加或降低经由IR或IGF-1R的信号 转导的能力可以通过在此所述的IR或IGF-1R基于细胞测定法中任何一项来评 估。

这些化合物可以作为胰岛素结合到IR上的拮抗剂或激动剂或者作为IGF结 合到IGF-1R上的拮抗剂或激动剂来起作用。

本发明的化合物优选地具有足以提供预期目的的适当结合的IR或IGF-1R 的亲和性。适当地，这类化合物以及结合到IR或IGF-1R的特异性靶分子上的化 合物具有从10^-5至10^-15M的亲和性(K_d)。为了作为一种治疗方法来使用，该 化合物适当地具有从10^-7至10^-15M、优选地从10^-8至10^-12M并且更优选地从10 ^-10至10^-12M的亲和性(K_d)。当在用于鉴别其他配体的比较测定法中一种化合 物将被用作试剂时，该化合物适当地具有从10^-5至10^-12M的亲和性(K_d)。

如业内人士应当清楚的，在此提出的晶体结构能够第一次直接比较控制胰 岛素或IGF结合在紧密相关的IR以及IGF-1R中的区域。这些结构能够鉴别对应 地对于胰岛素或IGF的初始结合以及在随后的导致信号转导的高亲和性胰岛素- IR或IGF-IGF-1R复合物的形成中是关键性的IR以及IGF-1R的α-链的C端区 域。

在一个优选的实施方案中，一种化合物具有对于IR和/或IR的一种特异性 靶分子的高亲和性，但对于IGF-1R则没有，即一种化合物选择性地结合到IR上 或针对IR比针对IGF-1R具有增强的选择性。在这个方面，一种化合物适当地具 有对于IR和/或IR的一种特异性靶分子的亲和性(K_d)为不大于10^-5M、优选 地不大于10^-7M，以及对于IGF-1R的亲和性为至少10^-5M、优选地至少10^-3M。这类化合物是希望的，因为例如当倾向与IGF-1R相互作用并且因此例如促 进不希望的细胞增殖时，IR激动剂被减少。

在一个优选的实施方案中，对于一种化合物而言(IR或IR的特异性靶分 子)/IGF-1R结合亲和性比率是至少10并且优选地是至少100。

在另一个优选的实施方案中，一种化合物具有对于IGF-1R和/或IGF-1R的 一种特异性靶分子的高特异性，但对于IR则没有，即一种化合物选择性地结合 到IGF-1R上并且对于IGF-1R比IR具有增强的选择性。在这个方面，一种化合 物适当地具有对于IGF-1R和/或IGF-1R的一种特异性靶分子的亲和性(K_d)为 不大于10^-5M、优选地不大于10^-7M，以及对于IR的亲和性为至少10^-5M、优 选地至少10^-3 M。这类化合物是希望的，因为例如当倾向与IR相互作用并且因 此例如促进不希望的葡萄糖摄取以及代谢时，IGF-1R激动剂被减少。

在一个优选的实施方案中，对于一种化合物而言(IGF-1R或IGF-1R的特异 性靶分子)/(IR)结合亲和性比率是至少10并且优选地是至少100。

筛选测定法以及结合确认

通过如上所述使该化合物与IR和/或IGF-1R共结晶并且进行结构确定，可 以使本发明的化合物经历结合到IR和/或IGF-1R上的进一步确认。

根据本发明的方法设计的或选择的化合物优选地通过用于确定它们与IR和/ 或IGF-1R相互作用并且调节其活性的能力的IR和/或IGF-1R功能的多个体外以 及体内测定法来评估。例如，可以针对它们结合到IR和/或IGF-1R上的能力和/ 或针对它们调节(例如破坏)IR和/或IGF-1R信号转导的能力来测试化合物。

可以通过本领域普遍已知的方法来筛选溶液中的文库以便确定配体是否竞 争性结合在共同结合位点上。这类方法可以包括筛选溶液中(例如，Houghten， 1992)，或珠粒(Lam，1991)、芯片(Fodor，1993)、细菌或孢子(U.S. 5,223,409)、质粒(Cull et al.，1992)上、或噬菌体(Scott&Smith，1990；Devlin， 1990；Cwirla et al.，1990；Felici，1991；U.S.5,223,409)上的文库。

当该筛选测定是一种结合测定时，当一个标记可以直接地或间接地提供可 检出信号时，可以将IR或IGF-1R连接到该标记上。不同标记包括放射性同位 素、荧光分子、化学发光分子、酶、特异性结合分子、颗粒、例如磁性颗粒， 等。特异性结合分子包括多个对，例如生物素和链亲和素，地高辛和抗地高辛， 等。对于特异性结合部件而言，根据已知步骤互补性部件可以正常地标记有提供 用于检测的一个分子。

多种其他试剂可以被包括在该筛选测定中。这些包括多种试剂，例如盐 类、中性蛋白类，例如白蛋白、洗涤剂类等，它们用于促进最佳的蛋白-蛋白结 合和/或降低非特异性或背景相互作用。可以使用提高该测定效率的试剂，例如 蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。这些组分以产生该必要结合的任 何顺序加入。在任何温度下进行孵化，该温度有利于最佳活性，典型地是在4℃ 至40℃之间。

也可以通过表面等离振子共振(BIAcore)(回顾见于Morton&Myszka， 1998)将这些化合物直接结合到IR或IGF-1R上。在此通过使用胺或硫醇-二硫 化物转换偶联(Nice&Catimel，1999)的直接化学偶联亦或通过将受体外结构域 作为一个Fc融合蛋白捕获在一个适当地衍生的传感器表面上(Morten&Myszka， 1998)将受体固定在CM5或其他传感器芯片上。潜在的结合分子(称为分析 物)以适当的流速以及一定范围的浓度经过传感器表面之上。经典的分析方法将 针对广范围的分析物浓度来收集响应。一定范围的浓度提供了关于反应的足够的 信息，并且通过使用一种拟合算法例如CLAMP(参见Morton&Myszka， 1998)，可以确定速率常数(Morton&Myszka，1998；Nice&Catimel，1999)。 正常地，在每个分析物结合循环的结束时，该配体表面被再生。表面再生确保了 在每个循环的开始时对于分析物而言可以进入相同数量的配体结合位点。

针对最佳活性选择孵化持续时间，但也可以优化以有利于快速高通量筛 选。正常地，0.1至1小时之间将是足够的。总体上，多个测定混合物与不同测 定试剂浓度平行地运行从而得到对这些浓度的差别响应。典型地，这些浓度之一 用作负对照，例如在零浓度下或检出限之下。

作为针对替换胰岛素的有机小分子的异源筛选的基础，体外竞争性受体结 合测定的基本形式可以是如下：通过时间分辨荧光测定(TRFD)法对IR和/或 IGF-1R的低亲和性结合位点的占有情况进行定量(如Denley et al.，2004所 述)。对应地使用R-IR-A、R-IR-B以及P6孔作为IR-A、IR-B以及IGF-1R的来 源。在4℃下用溶解液(20mM HEPES，150mM NaCl，1.5mM MgCl₂，10％ (v/v)甘油，1％(v/v)曲通X-100，1mM EGTA pH 7.5)将细胞溶解持续1小 时。在3500rpm下将溶解产物离心10分钟，并且然后每孔100μl加入中之前用 抗胰岛素受体抗体83-7或抗-IGF-1R抗体24-31包被的白Greiner Lumitrac 600板 中。两种捕获抗体都不会干扰受体由胰岛素、IGF-I或IGF-II结合。在4℃下将 每孔大致100,000荧光计数的铕标记的胰岛素或铕标记的IGF-I连同不同数量的 未标记的竞争物一起孵化16小时。用20mM Tris，150mMNaCl，0.05％ (v/v)吐温20(TBST)洗涤这些孔并且加入DELFIA强化溶液(100μl/孔)。 使用340nm激发滤光片和612nm发射滤光片连同一台BMG Lab Technologies  Polarstar^TM荧光光度计或一台Wallac Victor II(EG&G Wallac公司)一起来测量 时间分辨荧光。

可以用于评估化合物结合到IR并且位于其上以及它们的生物活性的其他适 当测定的样品是本领域公知的。例如，可以在PCT国际公开号WO 03/027246中 找到适当的测定法。适当的测定法的实例包括下面各项：

(i)受体自身磷酸化(如Denley et al.，2004所述)。将R-IR-A，R-IR-B 细胞或P6细胞以2.5x10⁴细胞/孔铺于Falcon 96孔平底板中并且在37℃，5％ CO₂下生长过夜。在37℃，5％CO₂下在用具有1％BSA的100μl DMEM中胰岛 素、IGF-I亦或IGF-II之一处理10分钟之前在无血清培养基中将细胞洗涤4小 时。将包含2mM Na₃VO₄以及1mg/ml NaF的溶解缓冲液加入这些孔中并且来 自溶解产物的这些受体被捕获在预先包被有抗体83-7或24-31并且用1x TBST/0.5％BSA封闭的96孔板上。在4℃下过夜孵化之后，用1xTBST洗涤这 些板。用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PY20(130ng/孔，室温，2小时)检测磷 酸化的受体。加入DELFIA增强溶液(100μl/孔)并且如上所述进行时间分辨荧 光检测。

(ii)使用2-脱氧-[U-14C]葡萄糖的葡萄糖摄入(如Olefsky，1978所述)。 在24孔板中用添加有1％(w/v)RIA-级BSA以及2mM丙酮酸钠的Krebs- Ringer重碳酸盐缓冲液(25mM Hepes，pH 7.4含有130mM NaCl，5mM KCl， KH₂PO₄，1.3 mM MgSO₄.7H₂O，25mM NaHCO₃以及115mM CaCl₂)将分化后 8至12天的脂肪细胞洗涤两次。在加入胰岛素之前在37℃下将脂肪细胞平衡90 分钟或在加入激动剂或拮抗剂之前平衡30分钟。在37℃下在0.7至70nM的浓 度范围上加入胰岛素(Actrapid，Novogen)持续30分钟。将激动剂或拮抗剂(0 至500μM)加入脂肪细胞中持续90分钟紧接着在拮抗剂的实例中加入胰岛素。 通过闪烁计数法在激动剂刺激作用的最终10分钟上测量每孔50μM 2-脱氧葡萄 糖和0.5μCi 2-脱氧-[U-¹⁴C]葡萄糖(NEN，PerkinElmer Life Sciences)的摄入。

(iii)使用质膜苔(如Robinson&James(1992)以及Marsh et al.(1995)所 述)的葡萄糖转运蛋白GLUT4移位。

(iv)使用质膜苔的GLUT4移位(如Marsh et al.，1995所述)。使3T3-L1 成纤维细胞生长在6孔板中的玻璃盖玻片上并且分化成脂肪细胞。在分化后8至 12天，在包含0.5％FBS的DMEM中使脂肪细胞血清饥饿18小时。在Krebs- Ringer重碳酸盐缓冲液，pH 7.4中将细胞洗涤两次并且在加入胰岛素(100nM) 之前在37℃下平衡90分钟，或在加入化合物(100μM)之前平衡30分钟。在 处理之后，将脂肪细胞在PBS中0.5mg/ml聚-L-赖氨酸中洗涤，在冰上在1∶3 (v/v)膜缓冲液(30mM Hepes，pH 7.2包含70mM KCl，5mM MgCl₂，3mM EGTA以及新鲜加入的1mM DTT以及2mM PMSF)中通过三次洗涤进行低渗 休克。然后使用探头式超声发生器(Microson)(设置在0下)在冰上在1∶1 (v/v)膜缓冲液中对洗涤的细胞进行超声处理，从而产生仍然附连到该盖玻片 上的质膜的一个苔。在22℃下在膜缓冲液中2％(w/v)多聚甲醛中将这些片段 固定20分钟并且通过PBS中100mM甘氨酸进行固定猝灭。然后在22℃下在膜 缓冲液中1％(w/v)Blotto中将这些质膜片段封闭持续60分钟，并且用内部的 兔亲和纯化的抗GLUT4多克隆抗体(克隆R10，抗包含GLUT4的C端19个氨 基酸的一种肽而产生的)以及Alexa 488山羊抗兔二抗(Molecular Probes；1∶ 200)进行免疫标记。使用FluoroSave试剂(Calbiochem)将盖玻片固定在载玻 片上，并且使用一台OptiScan共聚焦激光扫描免疫荧光显微镜(Optiscan，VIC.， 澳大利亚)来成像。使用ImageJ(NIH)成像软件来分析数据。在针对各自条件 的每个实验中检测了至少六个视野，并且维持实验期间内的共聚焦显微镜增益设 置以便将实验之间的差异性降至最低。

可以使用一种脂肪细胞测定法来确定胰岛素激动剂活性。胰岛素增加了³H 葡萄糖进入脂肪细胞的摄入以及它变成脂类的转化。通过将脂相分配到闪烁混合 物中，确定³H进入脂相的结合，这将可溶于水的³H产物排除在外。在次于最大 胰岛素剂量下确定这些化合物对³H葡萄糖结合的影响，并且这些结果随着相对 于总胰岛素反应的增加而出现。该方法是从Moody et al.，(1974)改编的。将小鼠 附睾的脂肪垫切下，切碎到消化缓冲液(Krebs-Ringer 25mM HEPES，4％ HSA，11mM葡萄糖，0.4mg/ml 1型胶原酶，pH 7.4)中，并且在36.5℃下消 化持续高达1.5小时。在过滤、洗涤(Krebs-Ringer HEPES，1％HSA)以及重悬 于测定缓冲液(Krebs-Ringer HEPES，1％HSA)中之后，将游离的脂肪细胞移入 包含测试溶液以及大致ED₂₀胰岛素的96孔Pico plate中。

通过加入³H葡萄糖(像例如Amersham TRK 239)(终浓度为0.45mM葡 萄糖)来启动该测定。在36.5℃下在400rpm下在一个Labshaker孵化塔中将该 测定孵化2小时，然后通过加入Permablend/甲苯闪烁剂(或等效物)来终止， 并且在静置至少1小时之前将这些板密封并且在一台Packard Top Counter或等效 物中进行检测。在每个板上运行全胰岛素标准曲线(8个剂量)作为对照。

由于化合物对(大致的)ED₂₀胰岛素反应的影响，数据是图形表示的，其 中这些数据针对全胰岛素反应进行归一化。该测定也可以在基础或最大胰岛素浓 度下运行。

为了测试化合物的体内活性，可以如下在Wistar大鼠上进行静脉血葡萄糖 测试。雄性Mol:Wistar大鼠，重约300g，被分成两组。从尾静脉取10μl的血样 用于测定血糖浓度。然后在t＝30分钟时将这些大鼠麻醉(例如，用Hypnorm/ 多美康)并且在t＝-20分钟以及在t＝0分钟时再次进行血糖测量。在t＝0取样 之后，在相应于1ml/kg注射体积的浓度下将等渗水缓冲液中运载体或测试物质 注入大鼠的尾静脉中。在10、20、30、40、60、80、120以及180分钟时对血糖 进行测量。以20分钟间隔重复施用麻醉剂。

用于确定结合分子对IGF-1R活性的影响额外的测定法如下：

(i)通过诱导凋亡HT29细胞上细胞活力测定：在用丁酸钠诱导之后使用结肠直 肠细胞系HT29细胞(ATCC：HTB 38)测量化合物抑制避免凋亡的IGF-介导的 援救的能力。将HT29细胞以12,000细胞/ml铺于白色Fluoronunc 96孔板 (Nunc)上并且在37℃，5％CO₂下孵化48小时。将培养基吸出并且将100μl/ 孔的无血清DMEM/F12加入血清饥饿的细胞中持续2小时。在存在和缺少抑制 性化合物下将IGF(100μl/孔0.05-50nM稀释物)一式三份加入DMEM/F12 (Gibco)中0.1％BSA溶液(Sigma)中。将终浓度5mM丁酸盐(Sigma)加 入各孔中。在37℃，5％CO₂下将这些板孵化另外48小时。将这些板恢复到室 温并且显色(按照CTG测定(Promega)的每个说明书)。在Polarstar酶标仪上 测量发光信号并且使用表格曲线来评估数据从而得到特定的ED50。

(ii)细胞迁移测定在改进的96-孔Boyden室(Neuroprobe，贝塞斯达市，马里 兰州)中进行迁移测定。放置一个8μM聚碳酸酯滤器(在4℃下该滤器预先浸 于10mM乙酸中25μg/ml胶原中过夜)从而将该室分成一个上&下区室。一式 四份地将不同浓度的在具有0.5％BSA(Sigma)的RPMI(Gibco)中稀释的 IGF-I类似物(25μl 0-100nM)(用于测试它们的迁移诱导能力)置于下区室 中。用预先用11μl 2μM钙黄绿素(Molecular Probes)孵化30分钟/37℃的50 μl/孔2x10⁵SW480(ATCC：CCL 228)接种上区室的这些孔。在37℃，5％CO₂下细胞迁移8小时。通过擦拭过滤器去除未迁移的细胞。然后在Polarstar中针对 485nm激发波长以及520nm发射波长处的荧光对过滤进行分析。使用图表曲线 对数据进行评估从而得到特定的ED50值。

(iii)抗-IGF-1R抗体的小鼠异种移植研究：在56周龄雌性无胸腺BALBc裸小鼠 上(nunu等位基因纯合的)进行体内研究。将小鼠维持在位于正压限制格栅中 的高压灭菌的微隔离器笼子中(Thoren Caging Systems公司，黑泽尔顿市，宾夕 法尼亚州，美国)。为了建立异种移植，将100μl PBS中3x10⁶或5x10⁶个细 胞皮下注射到小鼠的左腹股沟乳房线中。通过式(长度x宽度²)/2(Clarke et  al.，2000)来计算肿瘤体积(TV)，其中长度是最长轴线并且宽度是在与长度成 直角下测量值。

通过用已建立的带有放射性标记的¹¹¹In-或¹²⁵I-抗-IGFR抗体(3μg，10 μCi)通过尾静脉异种移植静脉注射(总体积＝0.1ml)40只BALBc裸小鼠来确 定潜在的结合分子的初始生物学分布。在注射放射性偶联物之后指定时间点(t ＝4小时，第1、2、3、5以及7天)通过安氟醚麻醉井多组小鼠(n＝35)处 死。然后通过心脏穿刺使小鼠放血，并且立即切除肿瘤以及器官(肝、脾脏、 肾、肌肉、皮肤、骨骼(股骨)、肺、心脏、胃、脑、小肠、尾以及结肠)。在 一台双γ闪烁计数器(Packard Instruments)重对所有样品进行计数。在每个时 间点对从注射物质制备的三重标准品进行计数，其中组织和肿瘤样品使得这些计 算能够针对同位素的物理衰变而被修正。针对每个时间点的候选分子而言，组织 分布数据被计算为平均值±标准差％注射的剂量/克组织(％ID g^-1)。

如下确定了候选化合物的药物代谢动力学：从带有异种移植的小鼠体内得 到的血清(在如上所述输注放射性标记结合分子的之后)被一式两份地等分并且 在一台γ闪烁计数器中(Packard Instruments、墨尔本、澳大利亚)计数。在每 个时间点对从注射的物质制备的三重标准品进行计数，其中血清样品使得这些计 算能够针对同位素物理衰变而被修正。血清的结果被表示为％注射剂量/升(％ ID l-1)。使用一个曲线拟合程序(WinNonlin，Pharsight公司，芒廷维尤市，加 利福尼亚州，美国)进行血清数据的药物代谢动力学计算。对于¹²⁵I-以及¹¹¹In- 标记分子而言，使用一个二室模型来计算AUC的血清药物动力学参数参数(外 推到无限时间的血清浓度曲线下的面积)、CL(总血清清除率)、T12_α以及 T12_β(处置的初期和末期的半衰期)。

(iv)体内治疗研究：将100μl培养基中肿瘤细胞(3x10⁶)皮下接种到48周龄 雌性裸小鼠的两侧(n＝5组^-1)。肿瘤细胞接种后第7天(平均值±标准差肿瘤 体积＝60x15mm³)开始候选分子治疗，并且由2周内六次腹腔内注射适当数 量的候选分子或载体对照组成。如前面所述以mm³确定中肿瘤体积。对于每个 治疗组而言，数据被标示为平均肿瘤体积。通过t检验针对统计显著性(P＜ 0.05)测试对照与测试组之间肿瘤尺寸的差异。

化合物的用途

可以使用通过上述本发明的方法设计或选择的化合物/化学实体来调节细胞 中IR和/或IGF-1R的活性，例如激活或抑制IR和/或IGF-1R活性。这类化合物 可以与如在此定义的IR和/或IGF-1R的低亲和性结合位点相互作用或模拟如在 此定义的IR和/或IGF-1R的α-链的C端区域。它们还可以用于调节IR和/或 IGF-1R的同源二聚作用。

可以通过化学实体直接结合到IR和/或IGF-1R的同源二聚表面上，和/或通 过IR和/或IGF-1R细胞外结构域中其他地方变构相互作用实现IR和/或IGF-1R 的同源二聚作用的调节。

条件是异常IR和/或IGF-1R活性牵涉一定范围的疾病，上述化合物还可以 用于治疗、改善、或预防特征为IR和/或IGF-1R信号异常的障碍。这类障碍的 实例包括：多种恶性病症，包括脑、头颈、前列腺、卵巢、乳房、宫颈、肺、胰 以及结肠的肿瘤；以及黑色素瘤、横纹肌肉瘤、间皮瘤、皮肤的鳞状细胞癌以及 恶性胶质瘤。

设计为相互作用或鉴定为与IR和/或IGF-1R的细胞外结构域相互作用，并 且特别是与这些靶结合位点相互作用的化合物是针对IR上胰岛素活动和/或IGF- 1R上IGF活动的有用的激动剂或拮抗剂。这些化合物用作测定试剂用于通过例 如竞争测定来鉴别其他有用的配体，用作研究工具用于进一步分析IR和/或IGF- 1R并且在药用组合物中用作潜在的疗法。

本发明提供的化合物还用作前导化合物用于鉴别其他更有效的或更具选择 性的化合物。本发明的模拟化合物还潜在地用作胰岛素活动的抑制剂并且用在设 计针对鉴别能够结合到IR上胰岛素的低亲和性结合位点上的化合物的测定试剂 盒中。本发明的模拟化合物还潜在地用作IGF活动的抑制剂并且用在设计针对鉴 别能够结合到IGF-1R上IGF的低亲和性结合位点上的化合物的测定试剂盒中。 具体地说，可以想见的是本发明的化合物可以证明在选择/设计对于IR或IGF- 1R具有特异性的配体中是特别有用的。

在一个实施方案中，这些化合物中的一个或多个能够作为用于鉴别结合到 IR或IGF-1R上的其他配体的(例如小的，有机分子)试剂盒中的组分来提供。 这类试剂盒也可以包括IR或IGF-1R，或它们的功能性片段。该试剂盒的化合物 和受体组分可以是标记的(例如，被放射性同位素、荧光分子、化学发光分子、 酶或其他标记)，或可以是未标记的并且可以提供标记试剂。这些试剂盒还可以 包括外周的试剂，例如缓冲剂、稳定剂、等。还可以提供使用说明书。

本发明提供的IR和IGF-1R的激动剂以及拮抗剂，并且特别地是拮抗剂作 为疗法是潜在有用的。例如，这些化合物作为癌的(包括但不限于乳腺、前列 腺、结肠直肠、以及卵巢癌)疗法是潜在有用的。每年有超过40,000人死于乳 腺癌，因为目前是疗法，例如外科手术、化疗、放疗、以及免疫疗法显示有限的 成效。最近的报告显示以前鉴定的IGF-1R拮抗剂可以抑制引起糖尿病性视网膜 病的视网膜新生血管形成(Smith et al.，1999)。对于开发神经障碍的疗法(包 括中风以及糖尿病性神经病变)，IGF-1R拮抗剂化合物(即已经使用本发明的 方法修饰的现有的IGF-1R化合物)是有用的。几个不同组的报告涉及IGF-1R 降低全脑缺血，并且支持了IGF-I用于治疗糖尿病性神经病变的用途(回顾参见 Auer et al.，1998；Apfel，1999)。针对IGF-1R的多种疗法目前正作为抗癌试剂接 收临床试验(Hewish et al，2009)。

本发明的IGF-1R激动剂肽可以用于增强细胞存活和/或阻断细胞中的凋亡。

给药

本发明的化合物，即本发明的配体或通过本发明的筛选方法鉴定的或可鉴 定的IR和/或IGF-1R的调节剂可以优选地与不同组分结合从而生产本发明的组 合物。优选地，这些组合物与一种药学上可接受的载体或稀释剂组合从而生成一 种要用组合物(它可以用于人或动物应用)。

该配方将取决于该化合物的性质以及施用途径但是典型地它们可以按配方 制造用于局部、肠胃外、肌内、口服、静脉内、腹膜内、鼻内吸入、肺吸入、真 皮内或关节内给药。该化合物能够以可注射形式来使用。因此可以将它与任何 载体混合，该载体是药学上可接受的用于一种可注射的配制品，优选地用于在有 待治疗部位的直接注射，虽然它可以全身性给药。

该药学上可接受的载体或稀释剂可以是例如无菌等渗盐水溶液，或其他等 渗溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)。本发明的化合物可以与任何适当的一种或多种 粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、溶解剂混合。还优选的是以一种口服活性形 式按配方制造该化合物。

总体上，本发明的化合物治疗有效的每日口服或静脉给药的剂量(包括本 发明的化合物以及它们的盐)可能是范围从0.01至50mg/kg有待治疗的受试者 体重，优选地是0.1至20mg/kg。本发明的化合物以及它们的盐还能够通过静脉 输注以可能范围从0.001-10mg/kg/hr的一个剂量来给药。

适当时，这些化合物的片剂或胶囊可以单独地或一次两项或多项地给药。 还可能的是以持续释放的配制品的形式施用这些化合物。

典型地，医师将确定对于个体患者而言可能是最适合的实际剂量，并且它 可以随着年龄、体重、以及对具体病人的反应而改变。上述剂量是平均情况的示 例。当然可能存在其中应当使用更高或更低的剂量范围的个别情况，并且这些在 本发明的范围内。

对于一些应用而言，这些组合物优选地以包含赋形剂(例如淀粉或乳糖) 的片剂的形式、或以单独地或与赋形剂混合的胶囊或胚珠形式、或者以包含调味 料或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式口服施用。

还可以将组合物(以及单独的化合物)胃肠外(例如静脉地、肌内地或皮 下地)注射。在这种情况下，这些组合物将包括一种适当的载体或稀释剂。

对于肠胃外给药，这些组合物最好以一种无菌水性溶液的形式进行使用， 该水性溶液可以含有其他物质，例如足够的盐类或单糖类，从而使该溶液与血液 等渗。

对于口腔或舌下给药，这些组合为能够以按照常规方式进行配制的片剂或 锭剂的形式进行给药。

对于口服、肠胃外、颊、以及舌下向受试者(例如病人)给药，本发明的 化合物以及它们的药学上可接受的盐以及溶剂化物的日剂量水平典型地可以是从 10至500mg(以单剂或分份剂量的形式)。因此，并且通过举例，片剂或胶囊 可以包含从5至100mg的活性化合物用于单一的或同时两项或多项地给药(适 当是)。如上指示，医师将确定对于个体患者而言可能是最适合的实际剂量，并 且它可以随着年龄、体重、以及对具体病人的反应而改变。

所说明的给药途径以及剂量仅旨在作为指导因为资深开业医师根据例如年 龄、体重以及病人的情况将能够容易地确定最佳给药途径以及用于任何一个特定 病人的剂量。

实例

实例1：  配体结合到人胰岛素受体(IR)的第一三个结构域上的热力学研究：

该IRα链C-末端肽(αCT)与该位点1胰岛素模拟物肽之间的关系

1.1介绍

为了研究配体结合到IR细胞外结构域的该第一三个结构域上，使用等温滴 定量热法(ITC)。ITC允许直接测定该IR细胞外结构域经典的αCT肽(残基 704-719；SEQ ID NO：11)与IR485(由IR的第一三个N-末端结构域组成的一 种构建体；SEQ ID NO：10)之间的相互作用，以及人IGF-1R的模拟肽与IR485 之间的相互作用。同时检测了该胰岛素模拟肽S519(et al.，2003)的N- 以及C-末端片段结合到IR485上，以及S519本身结合到IR485上的热力学。 S519(SLEEEWAQVECEVYGRGCPSGSLDESFYDWFERQLG；SEQ ID NO：16) 是从两个共价连接的肽(S371，所谓的“位点1”肽，以及S446，所谓的“位点2” 肽，(Pillutla et al.，2002))的亲和性优化得到的一个36残基肽。.S519以K_d＝ 2.0x10^-11结合人IR(et al.，2003)。总之，这些结果揭示了该IR αCT 肽与该位点1模拟肽之间的一个显著的关系，并且表明了该模拟肽与胰岛素本身 之间一个以前未发现的结构相似性(Ward and Lawrence，2009)。最后，检测了 携带F714A突变(残基704-719，TFEDYLHNVVAVPRPS；SEQ ID NO：12)的IR αCT肽与IR485的结合。

1.2用于热力学实验的材料和方法

试剂

人IR的IR485构建体被表达于Lec8突变体CHO细胞中并且通过如前面所 述的(Lou et al.，2006)凝胶过滤层析法来纯化。IR485的构成为成熟的人胰岛素 受体的第一485个残基，紧接着是16-残基序列SDDDDKEQKLISEEDLN(SEQ  ID NO：10)，该16残基序列包括一个丝氨酸序列，紧接着是一个肠激酶切割位 点以及一个c-myc表位标签。为了在此所述的ITC研究不将该c-myc标签去除。 使用Ultrafree离心浓缩机(Millipore，美国)将IR485浓缩到在Tris-缓冲盐水 (TBSA；24.8mM Tris-HCl(pH 8.0)，137mM NaCl，2.7mM KCl以及0.02％叠 氮化纳)中30mg/ml。通过对抗0.1％(v/v)乙酸的广泛透析紧接着进行冷冻干 燥以无锌形式(称为ZFP胰岛素)制备了猪胰岛素(Sigma-Aldrich，美国)。 从Novozymes GroPep(澳大利亚)公司得到人IGF-I为“受体级”材料。

从Genscript公司(美国)以＞98％水平的纯度得到该IR典型αCT肽(残 基704-719，TFEDYLHNVVFVPRPS；SEQ ID NO：11)、IGF-1R典型αCT肽(残 基691-706，VFENFLHNSIFVPRPE；SEQ ID NO：14)以及IR αCT的F714A突变 体(表示为IR  CT.714A；SEQ ID NO：12)。从AusPep(澳大利亚)公司以＞ 90％水平的纯度得到该S519N20肽(SLEEEWAQVECEVYGRGCPS；SEQ ID NO： 17)以及该S519C16肽(GSLDESFYDWFERQLG；SEQ ID NO：18)。从 Activotec(英国)公司以＞85％纯度得到该S519肽 (SLEEEWAQVECEVYGRGCPSGSLDESFYDWFERQLG；SEQ ID NO：16)。通 过以约4mg/ml浓度溶于10mM HCl中并且然后用TBSA稀释来制备这些肽。 通过在室温下在黑暗中将对应的肽(以用氨溶液调节到pH 8.5的50mM重碳酸 铵中1mg/ml制备的)肽S519N20以及S519(它们包含两个半胱氨酸残基)氧 化2小时并且然后在使用前冷冻干燥。如通过用Ellman试剂(5，5′-二硫代双-2-硝 基苯甲酸酯)分析所确定的，完成氧化。使用一台NanoDrop 1000分光光度计 (Thermo Scientific，美国)通过280nm处吸光度测量值确定总蛋白浓度。 等温滴定量热法

使用一台带有保持在25℃下的热量计池的VP-ITC等温滴定热量计 (MicroCal公司，美国)进行ITC实验。在注入或放入池中之前将所有的样品 脱气，并且在开始注射之前对该仪器进行温度平衡。在所有实验中，置于池中的 样品体积是1.4ml并且以7μl体积在14秒内在3分钟的间隔下注入滴定剂，其 中注射的总数量是40。在滴定持续时间内以310rpm的速度搅拌样品内含物。首 先将所有的滴定液(即ZFP-胰岛素，IGF-I，IR αCT肽，IGF-1R αCT肽，IR αCT.714A肽，S519，S519N20，以及S519C20)独自地注入TBSA的溶液中从 而确定稀释热，然后当适当时从感兴趣的数据中将它减去。使用整合在Origin 7 软件(OriginLab，美国)中的仪器软件来分析数据，并且在所有情况下，使用仪 器手册中描述的方法以单位点相互作用的形式拟合。显示可定量相互作用的所有 测量做三遍(在一些情况下在不同浓度下)并且对得到的ITC-衍生的热力学参 数进行平均。

动态光散射(DLS)

使用一台Zetasizer NanoZS(Malvern Instruments公司，英格兰)进行DLS 测量。在TBSA中制备IR485以及IR485与不同浓度的IR αCT和/或ZFP-胰岛素 相结合的样品并且在4℃下平衡过夜。使用一台台式离心机在13,000下将样品 旋转从而将任何宏观微粒旋下并且然后移入保持在20℃下的45μl玻璃比色杯 中。使用仪器的Dispersion Technology Software版本5.0.2来分析数据从而产生 针对溶液中出现的散射粒子的一个体积分布。所提出的这些结果是几组实验的代 表。

1.3来自热力学实验的结果

IR485、激素以及αCT肽的配对相互作用

ITC实验研究了选定的IR485、ZFP-胰岛素、IGF-I、IR αCT肽、IGF-1R αCT肽以及IR αCT.714A肽的组合之间的配对相互作用。这些分析物的结果示于 表2中。确定(i)IR αCT与IR485，(ii)IGF-1R αCT与IR 485，以及(iii)IR αCT.714A与IR485之间相互作用的平均解离常数(K_d)对应地为3.9±1.1μM、 17.6±2.1μM以及6.5±1.7μM。这些测量的代表性ITC图示于图2中。在所有 情况下估计(i)ZFP-胰岛素与IR αCT肽，(ii)IGF-I与IGF-1R αCT肽，(iii)ZFP- 胰岛素与IR485以及(iv)IGF-I与IR485之间相互作用的解离常数(K_d)为小于1 mM。

表2-IR485、激素以及αCT肽配对相互作用的ITC分析

^aK_d值是三个实验的平均值，其中每组实验数据被作为滴定液与样品之间的一个 单位点相互作用来建模(参见材料与方法部分)。所述误差是该平均值的标准 差。与数据中噪音偶联的Wiseman参数c的相对低的值排除了ΔH⁰(并且因此- TΔS⁰)的精确确定。^b范围是当样品或滴定液浓度横跨这三个测量改变时，针对 这些而引证的。

激素与预先与IR485复合的αCT肽的相互作用

ITC实验研究了ZFP-胰岛素和IGF-I与IR485的相互作用，该IR485与10 倍摩尔比率的IR αCT亦或IGF-1R αCT肽预先复合。条件是这些αCT肽显示针 对IR485的微摩尔亲和性(参见上述)，计算出在用于这组实验中的IR485和 αCT肽的浓度下，在注射激素之前该ITC池中≥90％的IR485分子与αCT肽复 合。这些ITC研究的结果示于表3中，其中代表性的ITC曲线示于图3中。在 10倍摩尔比的IR αCT肽的存在下ZFP-胰岛素相对于IR485的解离常数是17±4 nM并且在10倍摩尔比率的IGF-1R αCT肽存在下，是5.7±11nM。相对地， 在10倍过量的IR αCT肽存在下，IGF-I相对于IR485的解离常数是490±75 nM，并且在10倍过量的IGF-1R αCT肽存在下，是22±3nM，对于注射之前未 用肽完全饱和的IR485而言不需要修正。图3中提出的热力学参数表明在所有四 种情况下，激素结合到αCT肽预先复合的IR485上是焓驱动的。

表3-ZFP-胰岛素和IGF-IR对于用10倍摩尔比的IR亦或IGF-1R αCT肽^a预先混 合的IR485的等温滴定

^aK_d，ΔH⁰以及-TΔS⁰值是三个实验的平均值，其中每组实验数据被作为滴 定液与样品之间的一个单位点相互作用来建模(参见材料与方法部分)。所述误 差是该平均值的标准差。^b范围是当样品或滴定液浓度横跨这三个测量改变时， 针对这些而引证的。

胰岛素模拟肽与IR485的相互作用

ITC实验研究了胰岛素模拟肽S519(SEQ ID NO：16)、S519N20(一种位 点2肽，相应于S519的20个N-端残基；SEQ ID NO：17)以及S519C16(一种 位点1肽，相应于S519的16个C-端残基；SEQ ID NO：18)与IR485的相互作 用。这些ITC研究的结果示于表4中，其中代表性的ITC曲线示于图4中。发现 S519以解离常数为11±3nM结合IR485，而S519C16以更高一些的亲和性(K_d＝2.6±0.7nM)结合IR485。S519和S519C16结合到IR485上显示是焓驱动 的。当IR485是在10倍摩尔比的IR αCT肽存在下时，S519C16的解离常数增加 到16±6nM。估计S519N20与IR485相互作用的解离常数是小于1mM，其中 排除了在所使用的反应物的浓度下K_d的精确确定。

表4-胰岛素模拟肽S519，S519N20以及S519C16对于IR485^a的等温滴定

^aK_d、ΔH⁰以及-TΔS⁰值是三个实验的平均值，其中每组实验数据被作为滴定液与 样品之间的一个单位点相互作用来建模(参见材料与方法部分)。所述误差是该 平均值的标准差。^b范围是当样品或滴定液浓度横跨这三个测量改变时，针对这 些而引证的。^cS519N20与IR485的相互作用的亲和力太弱以至不能允许ΔH⁰亦 或-TΔS⁰的有意义的计算。

在IR αCT肽的存在下IR485的多重态

在6mg/ml下(IR485主要处于二聚体状态的浓度(Lou et al.，2006)) IR485的DLS-确定的体积分布显示一个单一的宽峰，中心位于9.7nm粒径(图 5a)。该峰的半宽度是3.1nm并且球形颗粒的假设导致计算的散射颗粒分子量 为136kDa，这非常类似于通过尺寸排阻色谱法估计的约140kDa的分子量。仪 器限制预先排除了在IR485被认为是主要处于单体形式的浓度下(即，是＜ 0.025mg/ml下，(Lou et al.，2006))IR485的DLS测量。然而，在0.5mg/ml 下，IR485的DLS-确定的体积分布显示位于粒径8.2nm处的一个单一的宽峰 (图5b)。该峰的半宽度是2.2nm，并且该散射来自球形散射颗粒的单一种类 的假设导致计算的分子量为91kDa，这与溶液主要地处于单体形式相一致。使 用这对观察作为参考值，然后可以观察到的是(i)将三倍摩尔比率的IR αCT肽加 入IR485的mg/ml溶液中导致一种DLS-确定的体积分布，该分布具有一个单 峰，中心位于8.6nm(图5c)，以及(ii)将三倍摩尔比率的IR αCT肽与2倍摩 尔比率的ZFP-胰岛素一起加入IR485的6mg/ml溶液中导致一种体积分布，该分 布具有一个单峰，中心位于8.2nm(图5d)。这后面两个峰的半宽度是2.4nm 并且这些散射颗粒的计算的分子量(再一次假设单一种类的球形散射体)对应地 是102kDa以及92kDa。这些数据表明将(i)IR αCT肽亦或(ii)IR αCT肽加上 ZFP-胰岛素加入IR485的6mg/ml溶液中导致它的流体动力学直径改变，这与结 构经历从在溶液中处于主要的二聚体形式至在溶液中主要处于单体形式的转变相 一致。

实例2：解析IR的α-链的C端区域的晶体结构

2.1介绍：模糊电子密度

如前面所述的(WO 07/147213)，链状模糊电子密度的区域出现在IR的 L1-β2面附近。然而，虽然有多种不同的处理以及精细化方案，就任何肽序列而 言该密度是不能解释的。上面实例1中说明的数据表明S519C16肽(SEQ ID NO： 18)与以前文献(Kurose et al.，1994)中所述‘典型’αCT肽区域(残基704-719； SEQ ID NO：11)之间一个出人意料并且以前未料到的序列关系。重新考察WO 07/147213中得到的X射线数据并且然后进一步在头脑中复检IR的L1-β2面附近 的该模糊密度可能被归因于IR α-链的‘典型’αCT肽区域的可能性。

2.2蛋白生产，结晶以及从IR外结构域晶体中收集数据

如以前所述(WO 07/147213)进行IR外结构域蛋白的生产，随后的结晶 以及数据收集。

2.3衍射数据处理以及晶体学精修

所使用的衍射图像是用于人胰岛素受体外结构域同源二聚体天然结构确定 中的那些(“天然2”数据集，参见WO 07/147213的表3。使用XDS(2008年9 月10日版本；Kabsch，1993)对衍射图像进行重新处理(包括最大分辨率为3.8 的映像)。从XDS的衍射数据处理统计示于表5中。与以前用D*trek (Pfiugrath，1999)程序进行的分析相比较，在长晶胞尺寸方面观察到约1差 别。

使用PHENIX v1.3b(Adams et al.，2002)使与Fab 83-7和Fab 83-14(蛋白 数据库登录号2DTG，其中在内部改进中较小的在前面)复合的受体外结构域单 体对于该XDS处理的衍射数据集经受单独的结构域刚体晶体学精修。为了这个 目的定义了总计十四个刚体结构域(i)链E和残基4-191，(ii)链E和残基192- 311，(iii)链E和残基312-464，(iv)链E和残基465-594，(v)链E和残基595- 817，(vi)链E和残基818-909，(vii)链A和残基1-112，(viii)链B和残基1- 109，(ix)链A和残基113-220，(x)链B和残基110-219，(xi)链C和残基1- 109，(xii)链C和残基110-207，(xiii)链D和残基1-106，(xiv)链D和残基107- 214}。使用PHENIX中默认方案，然后进行刚体精修，紧接着进行原子坐标精 修，并且最终进行TLS(平移，振动以及螺旋转动移置)精修。然后使用多种结 构因子计算σ_A-加权的2F_o-F_c差异电子图，通过使用等于由Wilson曲线图 (Brünger et al.，2009)定义的值的负数的一个B值将这些因子的振 幅人为地放大。然后使用O v12.0(Jones，2004)对该图进行目检。在这个阶 段，以前关注的位于IR的L1-β2面上的电子密度的区段(WO 07/147213)具有 出人意料地清楚的螺旋形构象，其中侧链电子密度的显著改变表明该序列安排是 可能的(参见下面)。然后使用O进行IR区段693-710的所有随后模型构建， 其中用PHENIX中晶体学精修来重复模型构建。最后晶体学精修统计示于表5 中。

2.4将结构分配到IR α-链的C端区域上

在上面详细说明的精修方案之后，将序列分配到IR α-链的C端区域上是 可能的并且基于以下发现：(i)区段Glu698至Tyr708是预测具有形成螺旋倾向 的插入结构域的唯一区域(Ward and Lawrence，2009)，(ii)检查侧链位置i，i+ 4以及i+7上的密度表明它们可能来自三个大的残基(最可能地是芳香族的)， 表明在所有可能性中这些可以用来定义序列号，并且表明分辨的螺旋然后可以跨 越残基i-8至i+9，(iii)通过差异电子密度的螺旋“树”平均螺旋中多肽链的方向是 容易清楚的(Jones，2004)，并且(iv)该序列唯一可能分配到i，i+4，i+7全芳 香族的基序上(ii)以上用于使这些残基对应地与Phe701，Phe705以及Tyr708结 合。

图5-来自用XDS处理的IR外结构域晶体IR IRΔβ数据的数据处理以及晶体学精 修统计

*括号中的值是用于最高解析度外形的。从一个单一晶体收集数据。

观察到的密度的螺旋区域跨越IR残基693至710(SEQ ID NO：13；图 6)。该多肽的方向与在紧邻该外结构域二重轴线附近(McKern et al.，2006)具有 内部单体二硫键形成的三联体Cys682/Cys683/Cys685(Sparrow et al.，1997)相一 致。随后胰岛素受体残基693-710(SEQ ID NO：13)建模成为不同电子密度进一 步支持了序列寄存器分配的正确性(由于形状以及填装在L1与螺旋片段之间界 面上的静电互补性)。

Phe701和Phe705的侧链彼此邻近埋入由L1残基Phe64，Phe88，Phe96， Tyr91以及Arg118的侧链形成的一个疏水口袋中(图6b)。Tyr708的侧链被大致 平行于表面填充并且与L1残基Leu62，Gln34以及Phe64相互作用。残基对 Glu698以及Arg702的侧链位于紧邻的近端并且对应地并列在L1残基对Arg118 以及Asp120的侧链上，这四个侧链形成一个对称的电荷补偿的簇。L1的螺旋与 中心β折叠的表面之间最终相互作用来自Leu709的侧链与L1残基Leu37和Phe64 的侧链之间的相互作用。残基对Lys703和Asp707的螺旋侧链的相对表面上是彼 此邻近的并且也可能是电荷补偿的。(IR+Fab 83-7+Fab 83-14)结构的进一步 的晶体学精修(现在包括IR残基693-710)导致自由R-因子降低0.5％。胰岛素 受体残基693-710与晶体学精修之后计算的受体的L1结构域之间界面的形状互补 性(Lawrence and Colman，1993)是高的(0.72)。总之，这些结果为序列分配到 螺旋密度区段的正确性给出了极大的支持。

在此提供的结构(附件I)第一次使得能够看到完整的低亲和性胰岛素受 体结合位点，该位点包括受体α-链(SEQ ID NO：13)的极其重要的C端区域。 包括该螺旋区段的IR+Fab 83-7+Fab 83-14的原子坐标现在包括在附件I中并且 在图6中进行说明。IR α-链建模的螺旋区段(残基693-710，在此称为‘IR的α- 链的C-端区域’；LKELEESSFRKTFEDYLH；SEQ ID NO：13)出人意料地包括 前面文献中(Kurose et al.，1994；图6c)所述的IR的“典型”αCT肽的残基N端 (残基704-719；TFEDYLHNVVFVPRPS；SEQ ID NO：11)。这个区段的初始 断裂来自针对分离受体区段的胰蛋白酶消化，这些受体区段实验地交联到结合的 胰岛素上。在Lys703上的胰蛋白酶切割导致交联到胰岛素上的区段704-719的 分离。以前没有考虑紧靠N端704的残基涉及形成低亲和性胰岛素结合位点以 及使α-链C-端附连到该受体的第一三个结构域上两者的情况。

实例3：分子建模

3.1介绍

另一方面，IGF-1R与IR的L1结构域之间，并且另一方面，IGF-1R与IR 的α-链的C端区域之间存在高度序列一致性(图1以及图6c)。因此，使用 MODELLER程序(Sali and Blundell，1993)对应地构建IR与S519C16和IGF-1R α-链残基681-697复合的模型，其中使用正文中提供的IR外结构域的晶体学结 构作为模板。使用IGF-1R的第一三个结构域的晶体结构(Garrett et al.， 1998)，在此提出的IR外结构域的结构以及已知的IR与IGF-1R之间的序列关 系(Adams et al.，2000)对应地构建IGF-1R与IGF-1Rα-链残基681-697(SEQ  ID NO：15)，S519C16(SEQ ID NO：18)以及IR α-链残基693-710(SEQ ID NO： 13)复合的外结构域的模型。

3.2用于建模的材料和方法

制备每个模型25个实例并且选择具有最低DOPE得分的结构(Eramian et  al.，2006)用于进一步的分子动力学(MD)模拟。对应地从由MODELLER制备 的全长模型中切割与不同肽复合的IR和IGF-1R的L1-结构域、残基Pro4- Gln189以及残基Glu1-Gln189(用于MD计算)。使用GROMACS v4.0程序组 (van der Spoel et al.，2005)与OPLS-aa力场(Jorgensen and Tirado-Rives，1988) 一起进行MD模拟。将这些蛋白在一组水中溶剂化并且通过用钠离子替换水分子 来中和系统的总电荷。使用LINCS算法来限制键长(Hess et al.，1977)。使用与 0.1ps的偶联时间一起使用的速度重标(Bussi et al.，2007)将蛋白和溶剂(包括 离子)单独地偶联到300K的一个热浴上。使用10步(20fs)的邻近列表升级 频率用10的单一的非键连的截取值执行全部模拟。用的格栅宽度以及 四级样条内插法使用粒子筛Ewald方法来处理长程静电作用。所有模拟由用于去 除紧密接触的一个初始最小化组成，紧接着是用于使水分子与固体的蛋白平衡的 100ps的位置限制的MD。用于所有这些模拟的时间步骤是2fs。运行每个系统 的MD模拟持续总长度为2.0ns。

3.3分子模型

使用MODELLER产生下面模型并且如上所述进行MD模拟：

i.结合到IGF-1R的L1结构域上的IR α-链(SEQ ID NO：13)的C端区域 (附件II；图7)，

ii.结合到IR的L1结构域上的IGF-1R α-链(SEQ ID NO：15)的C端区域 (附件III；图8)，

iii.结合到IGF-1R的L1结构域上的IGF-1R α-链(SEQ ID NO：15)的C端区 域(附件IV；图9)，

iv.结合到IR的L1结构域上的S519C16模拟肽(SEQ ID NO：18)(附件V； 图10)，以及

v.结合到IGF-1R的L1结构域上的S519C16模拟肽(SEQ ID NO：18)(附件 VI；图11)。

上述模型示意地提供于图7至11中，其中对应地坐标在附件II至VI中。 这些模型定义了IR和IGF-1R上的能够结合这些受体的α-链的C端区域的一个共 同的结合表面。观察到下面的相互作用：

(i)IGF-1R/IRα-链残基693-710(图7)：这个相互作用特征为数个极性的 和离子的相互作用-对应地，受体的Y83与配体的S700和T704的羟基侧链形成 氢键，并且配体的E698和R702与受体的R112和E114形成盐桥。配体上的疏 水性残基在受体上包裹成部分地由L32、L33、L56、F58、F82、Y83、Y85、 V88和F90形成的一个疏水性口袋。

(ii)IR/IGF-1Rα-链残基681-69(图8)：IR与IGF-1R α链(残基681- 697)之间的复合物由对应地IR的R118与E120、该肽的E685与Y688之间电 荷的相互作用组成-这些相互作用的后者可以由水分子来介导。在接触该肽的IR 上存在大量的疏水性残基，部分地由L36、L37、L62、F64、F88、F89、Y91、 V94以及F96形成。

(iii)α-链残基681-697(图9)：这种相互作用的特征是受体 的R112与该肽的E685之间一个盐桥。另外地，Y688的侧链上的羟基基团与水 分子(未显示)形成氢键，该水分子本身与该受体的E114形成氢键。疏水性残 基Y688、F192、F195和L196包裹到部分地由L32、L56、F58、F82、Y83、 Y85、V88以及F90的侧链形成的受体的表面上的疏水性口袋中。

(iv)IR/S519C16(图10)：遍及IR(L1结构域)与S519C16肽之间复合 物的全部MD模拟，观察到几个氢键相互作用-IR的R119与该肽的D4之间， IR的E120与该肽的Y8之间，以及该肽的Q14与IR的两个残基R14和Q34之 间。受体与肽之间的相互作用涉及几个残基的芳香族侧链-该肽的F7和F11结 合由残基L62、F64、F88、F89、Y91和F96形成侧翼的IR的表面上的一个口 袋。另外地，该肽的L15包裹在L37和F64的疏水性侧链上。

(v)IGF-1R/S519C16(图11)：对应地，该肽的D4和Y8与受体的R112和 E114形成氢键。该肽的F7和F1的芳香族侧链结合由L56、F58、F82、Y83、 V88和F90形成的受体上的疏水性口袋。可以想象该肽的W10接触L32和F82 的疏水性侧链，这增加了它的亲和性。

现在可以使用在此提出的模型来改进由和合作者(et al.， 2003)开发的该胰岛素模拟肽。等温滴定量热法实验(参见上面实例1)表明一 种原型位点1模拟肽S519C16与IR C-末端肽704-719竞争结合到由该胰岛素受体 的第一三个结构域组成的构建体上。涉及该胰岛素受体α-的C端区域与该L1结 构域之间相互作用两个主要残基(即Phe701和Phe705)在S519C16中是保守的 (图3)。就涉及该α-链的C端与L1之间相互作用的剩余的残基而言，在 S519C16中Tyr708被一个天冬酰胺残基替换，Glu698是保守的亦或被一个天冬氨 酸残基替换，Arg702被一个酪氨酸替换并且Leu709是保守的。这两个苯丙氨酸 残基形成基序FYXWF(SEQ ID NO：19)的一部分，该基序表征了该位点1模拟 肽(et al.，2003)。用MODELLER以及随后的MD进行的建模显示以类 似于对接同源肽的一种方式将S519C16肽对接到IR和IGF-1R的L1表面上是可 能的(参见图6-11)。

实例4：突变体αCT肽结合到一个胰岛素迷你受体(IR485)构建体上

4.1介绍

通过噬菌体展示技术已经发现了胰岛素模拟肽并且基于与胰岛素受体结合 的竞争分类为“位点”1、2或3(Pillutla et al.，2002)。该亲和性成熟的位点1肽 的特征为一个FYXWF基序(SEQ ID NO：19)(Pillutla et al.，2002)；选定的位 点1和2肽已经被共价地栓系从而产生具有对于胰岛素受体具体高达皮摩尔亲和 性的激动剂(et al，2003)。已经显示了该αCT区域与原型位点1模拟 肽之间的序列关系(参见图6c)，该原型位点1模拟肽将该αCT区域残基 Phe701和Phe705对应地与FYXWF基序中两个侧翼苯丙氨酸残基对齐来放置。 使用这种关系来解释该αCT肽和该原型位点1模拟肽与胰岛素迷你受体IR485 (仅由受体L1-CR-L2结构域构成的一种构建体)的竞争性结合。如果这种关系 是正确的，则αCT区段中Arg702和/或Thr704突变成为酪氨酸亦或色氨酸将导 致该区段对于该胰岛素迷你受体的显著的更高的亲和性。然后还可能将这些取代 直接地建模到在此报告的结构上。这些假设测试如下。

4.2用于热力学实验的材料和方法

从Genscript公司(美国)以胰岛素受体的＞75％纯度的跨膜残基698-719 得到生物素酰化的αCT肽。如前所述(Lou et al.，2006)产生并且纯化该胰岛素 迷你受体IR485构建体，省略了最终的离子交换层析步骤。使用一台带有保持在 25℃下的热量计池的VP-ITC等温滴定热量计(MicroCal公司，美国)进行等温 滴定量热(ITC)实验。该ITC池包含在Tris-缓冲盐水加上叠氮化物(TBSA； 约24.8mM Tris-HCl(pH 8.0)，137mM NaCl，2.7mM KCl，以及0.02％叠氮化 物)中约10μM浓度下制备的胰岛素迷你受体IR485，并且该注射器包含在TBSA 中约60μM浓度下制备的肽。在注入或放入池中之前将所有的样品脱气，并且 在开始注射之前对该仪器进行温度平衡。

在所有实验中，置于池中的胰岛素迷你受体IR485样品的体积是1.4ml并 且以7μl体积在14秒内在3分钟的间隔下注入滴定剂，其中注射的总数量是 40。在滴定持续时间内以约310rpm的速度搅拌样品内含物。首先将所有滴定剂 注入单独的TBsA的溶液中从而确定稀释热，然后在适当时从感兴趣的数据中将 其减去。每个实验进行三次，除了使用天然肽的情况之外(它进行两次)。使用 整合在Origin7软件(OriginLab，美国)中的仪器软件来分析数据，并且在所有 情况下，使用仪器手册中描述的方法以单位点相互作用的形式拟合。

4.3来自热力学实验的结果

样本单独的滴定曲线提供于图12中。下面表6提供了针对该胰岛素迷你 受体IR485滴定的一组突变体αCT肽的ITC衍生的解离常数以及热力学参数。 表6-针对包含下面对应突变的N端生物素酰化的IR肽698-719的IR485滴定的 衍生的热力学参数：野生型，T704Y、R702W、R702Y、T704W以及R702Y/ T704W。

^*αCT肽跨越残基698-719并且具有附连在N端上的一个生物素部分。

误差估计是该平均值的标准差。

可以看到进一步包括位置702和704上的芳香族残基导致亲和性高达100 倍增加，这支持了这个观点，即该位点1模拟肽与该天然αCT区段之间存在一 种结构关系。使用GROMACS v4.0程序组(van der Spoel et al.，2005)与OPLS- aa力场(Jorgensen et al.，1988)一起通过分子动力学模拟研究了这些单突变体和 双突变体αCT肽对接到该L1结构域的表面上并且揭示了突变体αCT残基 Trp702和Tyr704的芳香族侧链有可能与L1结构域的表面相互作用并且增强了 该相互作用的亲和性。在位置702处，该芳香族侧链被对接到由Phe96以及L1 侧链Lys121的烷基部分形成的一个口袋之中；一个变异体酪氨酸残基的羟基基 团可以另外地与该Lys121ε-氨基基团形成一个氢键。在位置704处，这些变异 体的芳香族侧链被对接到L1侧链Phe88和Phe89上。

本领域的普通技术人员应当理解，正如在特定的实施方案中所示可以对本 发明进行许多改变和/或修饰，而不偏离如广泛说明的本发明的精神或范围。因 此，这些实施方案将在所有的方面被认为是用作说明性的并且不是限制性的。

本说明书要求于2009年4月22日提交的US 61/214,472的优先权，其全部 内容通过引用结合在此。

在此讨论和/或引用的所有出版物都以它们的全部内容结合在此。

已经包括在本说明书中的文件、法案、材料、设备、物品或类似物的任何 讨论仅用于提供本发明的背景的目的。当在本说明的各权利要求的优先权日之前 它存在时，它不应当被认为是承认这些材料的任何一项或全部形成现有技术基础 的一个部分，或是本发明相关领域中的常规一般性知识。

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附件I：带有附连的Fab 83-7(链A和B)以及Fab 83-14(链C和D)的 包含IR α-链(链F)的C端区域的IRΔβ单体(链E)的原子坐标

注释：本附件中的坐标说明了晶体晶胞的不对称单位。通过使用适当的 晶体学双重操作产生上述的二聚体形式的坐标，并且因此这些坐标暗含 地被包括在被附件中。

附件II：结合到IGF-1R外结构域上的IRα-链的C端区域模型的原子坐标

使用包含IR α链的C端区域的IR外结构域的结构坐标(附件I)来将该 IR α-链的C端区域的模型放入IGF的IGF-1R低亲和性结合位点之中。这 个模型是相对于附件I中发现的原子坐标来定向的并且可以用于与附件 I以及III至VI的原子坐标结合用来设计结合到IR和/或IGF-1R上的化 合物。

附件III：结合到IR外结构域上的IGF-1Rα-链的C端区域模型的原子坐标

使用附件I和II中的结构坐标来将IGF-1R α-链的C端区域建模到IR的低 亲和性结合位点中。这个模型是相对于附件I和II中发现的原子坐标来 定向的并且可以用于与附件I至II以及IV至VI的原子坐标结合用来设 计结合到IR和/或IGF-1R上的化合物。

附件IV：结合到IGF-1R外结构域上的IGF-1Rα-链的C端区域模型的原子坐标

使用附件I和III中的结构坐标来将IGF-1R α-链的C端区域的模型放到对 于IGF的IGF-1R低亲和性结合位点中。这个模型是相对于附件I和III 中发现的原子坐标来定向的并且可以用于与附件I至III以及V至VI的 原子坐标结合用来设计结合到IR和/或IGF-1R上的化合物。

附件V：结合到IR外结构域上的胰岛素模拟肽S519C16模型的原子坐标

使用附件I和III中的结构坐标来将胰岛素模拟肽S519C16建模到IR的低 亲和性胰岛素结合位点中。这个模型是相对于附件I和IV中发现的原子 坐标来定向的并且可以用于与附件I至IV以及VI的原子坐标结合用来 设计结合到IR和/或IGF-1R上的化合物。

附件VI：结合到IGF-1R外结构域上的胰岛素模拟肽S519C16的模型的原子坐标

使用附件II、IV和V中的结构坐标来将胰岛素模拟肽S519C16建模到 IGF-1R的低亲和性IGF结合位点中。这个模型是相对于附件II和IV中 发现的原子坐标来定向的并且可以用于与附件I至V的原子坐标结合用 来设计结合到IR和/或IGF-1R上的化合物。