免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体，是由转录shRNA的DNA序列、转录ssRNA的DNA序列与pTZU6+1载体组成的重组载体，其序列如seq.12所示。本发明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体，转染小鼠肝癌Hepa1-6细胞，24h后检测，通过Sem-qPCR和Western-blot检测发现能够下调Hepa1-6细胞中Pim-3的表达；转染Hepa1-6细胞，24h后检测，发现能够明显增加Hepa1-6细胞的凋亡；转染Hepa1-6细胞，能明显上调Hepa1-6细胞上清中I型干扰素(IFN-α和IFN-β)的分泌，由此可见，本发明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体有可能成为治疗肝癌的新的生物学手段，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体，及其构建方 法与应用，属于基因工程和生物治疗的技术领域。

背景技术

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，自20世纪90年代以来肝癌的年病死率已上升为城市 和农村恶性肿瘤病死率的第二和第一位。而对于肝癌的治疗，目前仍然以放射疗法、化学疗 法和手术治疗为主，其中外科治疗起了决定性的作用，特别是手术切除仍占主导地位.但由于 肝癌恶性程度高，极易发生早期播散和转移等原因，上述疗法都有一定的局限性。近年来随着 分子生物学、病毒学、免疫学等基础研究向肝癌领域的渗透，许多学者逐渐把基因治疗和生 物治疗引入到肝癌治疗中，RNAi技术就是研究的比较广泛的一种。近年来，科学家们采用生 物信息学等技术已经发现了与肝癌的发生以及发展密切相关的一些原癌基因，但并未见有关 Pim-3这样一种原癌基因的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的发明人寻找到了Pim-3这样一种原癌基因，该基因在人的 肝癌组织以及癌旁组织中的表达明显高于正常肝组织，Pim-3能通过磷酸化一些促凋亡蛋白 如Bad使其失活，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，因此采用RNAi技术去靶向沉默Pim-3，就会在 一定程度上延缓肝癌的发展进程，达到治疗肝癌的目的；而另一方面，在肿瘤的发生过程中， 肿瘤细胞可以通过许多机制，比如增加IL-10等抑制性细胞因子的产生来逃逸免疫系统的监 视，使机体免疫系统处在相对低下的状态，本发明就找到某些RNA序列，他们能够激活免疫 系统，进而引起自身免疫系统对于肝癌细胞的杀伤以及清除。故设计并构建能够表达靶向沉 默Pim-3基因的RNA和能够激活免疫系统的RNA这样一种双表达载体，就能达到对肝癌双管 齐下的治疗作用。

基于上述发现，针对肝癌靶基因Pim-3的特点，本发明提供了一种免疫刺激RNA和肝癌 靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体，及其在治疗肝癌过程中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体，是由转录shRNA的DNA 序列、转录ssRNA的DNA序列与pTZU6+1载体组成的重组载体，其序列如seq.12所示。

所述免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体是通过以下方法构建制得：

(1)针对Pim-3基因的序列，通过shRNA设计软件设计合成shRNA相对应的DNA序列， 并在序列的两端添加双酶切位点Sal I和Xbal I，得seq.1-8所示的序列；

(2)将步骤(1)制得的序列与pTZU6+1载体连接，构建pTZU-shRNA重组载体；分别表 示为pTZU-shRNA1、pTZU-shRNA2、pTZU-shRNA3、pTZU-shRNA4；

(3)通过Sem-qPCR和Real-Time PCR对步骤(2)中四对shRNA的沉默作用进行初步筛 选，筛选得到沉默作用较明显的载体，如图2所示；

(4)将步骤(3)中沉默作用较明显的pTZU-shRNA1载体进行EcoR I和Hind III双酶切， 得到U6+shRNA的表达框，其序列如seq.9所示；

(5)根据能够激活免疫系统的RNA病毒序列，设计编码具有潜在免疫刺激作用序列的 RNA的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点序列EcoR I和BamH I，得seq.10、11所 示的序列；

(6)将步骤(5)制得的序列与pSIREN载体连接，构建pSIREN-ssRNA重组载体；

(7)将步骤(6)中制得的重组载体进行EcoR I单酶切，得线性片段；

(8)将步骤(4)制得的U6+shRNA表达框和步骤(7)制得的线性片段平端化，连接， 并经过菌落PCR筛选同时表达shRNA和ssRNA的双表达载体，序列见seq.12。

本发明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体，转染小鼠肝癌 Hepa1-6细胞，24h后检测，通过Sem-qPCR和Western-blot检测发现能够下调Hepa1-6细胞 中Pim-3的表达；转染Hepa1-6细胞，24h后检测，发现能够明显增加Hepa1-6细胞的凋亡； 转染Hepa1-6细胞，能明显上调Hepa1-6细胞上清中I型干扰素(IFN-α和IFN-β)的分泌， 由此可见，本发明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的双表达载体有可能成为治 疗肝癌的新的生物学手段。

上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产品。

本发明利用构建的shRNA和ssRNA的双表达载体能够诱导细胞因子的分泌，相较于shRNA 的表达载体，双表达载体对Hepa1-6细胞具有更好的抑制作用，能够明显的抑制Hepa1-6细 胞的增殖，并且能够增强小鼠脾淋巴细胞对Hepa1-6细胞的杀伤，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为Sem-qPCR检测Pim-3基因在小鼠肝癌细胞Hepa1-6和H22以及正常的小鼠肝细胞 BNL.cl2中的表达示意图。

图2为对shRNA的沉默作用进行初步筛选的示意图，其中A为Sem-qPCR的检测结果，B 为Real-time PCR的检测结果。

图3为pSIREN-shRNA和双表达载体均能够明显的下调Hepa1-6细胞Pim-3基因的表达示 意图。

图4为pSIREN-shRNA和双表达载体均能够明显的下调Hepa1-6细胞Pim-3蛋白的表达示 意图。

图5为双表达载体能够明显上调Hepa1-6细胞上清中I型干扰素的分泌表达，其中A为 IFN-α的分泌水平，B为IFN-β的分泌水平。

图6为双表达载体能够更明显的增加Hepa1-6细胞的凋亡，其中Annexin V和PI双阳性 的细胞即处于晚期凋亡，如图所示：用pSIREN-shRNA和双表达载体转染Hepa1-6细胞后，发 生凋亡的细胞比例明显增加。

图7为双表达载体能够更明显的抑制Hepa1-6细胞的增殖。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本 发明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

实施例

1，一种双表达载体构建：

(1)针对Pim-3基因的序列，设计针对Pim-3基因的特异性沉默RNA及相对应的DNA序 列，并且在序列的两端添加双酶切位点序列Sal I和Xbal I， 退火形成双链结构，序列见seq. 1-8；

(2)将pTZU6+1载体进行Sal I和Xbal I的双酶切，并回收载体骨架；

(3)将步骤(1)制得的序列与步骤(2)制得的pTZU6+1载体连接构建成pTZU-shRNA； 分别表示为pTZU-shRNA1、pTZU-shRNA2、pTZU-shRNA3、pTZU-shRNA4。

(4)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000(购自invitrogen)将步骤(3)中构建的 pTZU-shRNA转染到小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6，并检测Pim-3基因的表达水平，结果表明 pTZU-shRNA1具有更明显的沉默能力(如图2所示)。将pTZU-shRNA1进行EcoR I和Hind III 双酶切，并回收U6+shRNA的表达框，其序列见seq.9；

(5)根据能够激活免疫系统的RNA病毒序列，设计编码具有潜在免疫刺激作用序列的RNA 的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点序列EcoR I和BamH I，退火形成双链结构ssRNA， 序列见seq.10、11；

(6)将pSIREN载体进行EcoR I和BamH I双酶切，并回收载体骨架；

(7)将步骤(5)制得的ssRNA序列和步骤(6)制得的pSIREN载体链接，构建成 pSIREN-ssRNA；

(8)将步骤(7)中制得的重组载体进行EcoR I单酶切，得线性片段；

(9)将步骤(4)制得的pTZU-shRNA1表达框和步骤(8)制得的线性pSIREN-ssRNA平 端化，连接。筛选得到同时表达shRNA和ssRNA的双表达载体，序列见seq.12。

(10)用阳离子脂质体lipofectamine2000(购自invitrogen)将双表达载体转染到小 鼠的肝癌细胞系Hepa1-6，并检测细胞因子I型干扰素的基因水平和蛋白水平，如图1和图5 所示，结果表明其能够激活免疫系统，具有刺激作用。

2双表达载体的应用

①沉默作用：pSIREN-shRNA和双表达载体转染小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6 24h后，提取 RNA和细胞的总蛋白，分别检测Pim-3的基因水平和蛋白水平，发现两者均有很好的沉默作 用(如图3和图4所示)。

②免疫刺激作用：双表达载体转染小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6 24h后，在基因水平和蛋 白水平检测I型干扰素的表达，发现双表达载体能明显上调Hepa1-6上清中IFN-α和IFN- β的表达，如图1和图5所示。由此综合前面两个结果，认为该载体的构建是成功的。

③体外治疗：利用pTZU-shRNA1和双表达载体转染小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6 24h后， 能够增加Hepa1-6细胞的凋亡(如图6所示)，且利用双表达载体转染小鼠的肝癌细胞系 Hepa1-6细胞24h后能更明显的抑制Hepa1-6细胞的增殖(如图7所示)；此外，双表达载体 转染后能更明显的增强小鼠脾淋巴细胞对Hepa1-6细胞的杀伤。