家族3纤维素结合域在真核生物中作为重组蛋白质表达和纯化的亲和标签的应用

摘要

本发明属于重组蛋白表达纯化领域。本发明提供利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(1)构建所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；(2)构建步骤(1)中的所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体；(3)将步骤(2)中构建的所述重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；和(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白。本发明还提供利用CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签结合内蛋白子在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括构建目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体，从而将融合表达的重组蛋白无外额外氨基酸的切出及纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白质表达中进行蛋白质纯化的方法，特别是采用亲和标签进行快速纯化的方法。更具体的说，本发明涉及利用无定形纤维素及其他纤维素为层析材料进行蛋白质纯化的方法。本发明还涉及用于蛋白质纯化的亲和标签的构建。本发明还涉及采用纤维素结合域在真核细胞中与重组蛋白融合表达以及快速纯化融合重组蛋白的方法。更具体地，本发明还涉及在真核生物中利用家族3纤维素结合域CBM3和内蛋白子(intein)将融合表达的重组蛋白无外额外氨基酸的切出及纯化的方法。

背景技术

随着在制药和酶工业不断上升的重组蛋白质和酶的需求，快速而经济的重组蛋白质纯化方法在生物技术领域一直是一个挑战。通过标准的层析方法获得相对纯的蛋白质常要求几个连续的层析步骤。这使得采用这一方法需要消耗大量时间而且产率不高。这个复杂的过程常常会延迟实验室中对新蛋白质的研究。在大规模制备工业和药用重组蛋白质时，下游的纯化过程费用很高，可高达总成本的80％[1]。

在目前生物学研究中有许多重组蛋白质的纯化方法。通过各种亲和标记与树脂结合的亲和层析是最常用的蛋白纯化方法[2-4]。采用亲和层析纯化蛋白质的方法可以减少90％的费用，同时还可以减少纯化步骤，节约时间。引入亲和标记有时对目标蛋白质的生化特性还有促进作用。现有文献的报道表明亲和标记有下列优点：1)提高蛋白质产率[5，6]，2)避免被蛋白酶水解[7]；3)协助蛋白折叠[8，9]；4)保护重组蛋白的抗原性[10]；5)提高重组蛋白的可溶性。现在有许多亲和标记用于重组蛋白质的纯化。依据结合的树脂/层析柱的方式，它们可以分为几类：1)结合金属(例如，poly-His)；2)抗体(例如，FLAG，Protein A，HA，c-myc，T7-tag， GST等)：3)与树脂直接结合(例如，麦芽糖结合蛋白，几丁质结合域，纤维素结合域等)；4)其它的还有S-tag，streptag II等。

亲和层析纯化中采用的树脂通常非常昂贵，价格也从几美元一毫升到几百美元一毫升[11，12]。如果说对于高附加值的蛋白质比如药用蛋白质还可以忍受的话，对一些低售价的非药物蛋白质比如工业用酶来说，这个代价是难以接受的[13]。即使对于高附加值的蛋白，人们也在致力于降低成本。发展简单，低成本和对环境友好的大规模重组蛋白质纯化体系还是一个挑战[2，14]。

纤维素由于其具有下述优点，使其非常适合作为大规模亲和层析的树脂填料(matrix)：1).便宜，比如目前常用的微晶纤维素市场价约70元/kg；2).很好的物理特性，能够耐受高速离心、高柱压。3).惰性，不与蛋白质以及其他缓冲液中的常见物质反应；4).对于不带纤维素结合域(CBM)的蛋白质吸附能力很弱，吸附量非常低；5).有许多商业化的种类：棉花，布，滤膜，纤维素粉，纤维素纤维，纤维素小珠等；6).安全，在药物食品等领域作为填料、辅料已广泛使用[15]。

与纤维素对应的亲和标记是纤维素结合域(CBM)。CBM是一个很有吸引力的蛋白质纯化亲和标记，因为其具有下述优点：1).CBM对纤维素的高特异性结合能力，吸附速度很快；2).能够耐受纯化中的变性和酶水解[16，17]；3).非特异性吸附很低；4).通过CBM吸附的蛋白质能在非失活条件下解离下来；5).CBM还能促进蛋白质折叠和分泌[18，19]；6).提高重组蛋白表达量[20]；7).提高融合蛋白稳定性[21]。

采用CBM为亲和标记来纯化重组蛋白已经有了一些研究，详细的进展可以参考近期的综述[22，23]。使用的是一些结合能力/容量不高的商业化纤维素(Avicel，SigmaCell和无定形纤维素)[18，20，24-27]。不过大多数以CBM为基础的纯化系统是在大肠杆菌中构建的[28-30]，本发明人已在大肠杆菌中采用热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的家族3纤维素结合域(CBM3)构建了重组蛋白质的表达纯化体系[15，31]。

许多时候，纯化的蛋白质用于进一步的应用时，尤其是用于医药目的的应用时，亲和标记需要被除去。有许多方法可以除去亲和标记，它们中的大多数采用蛋白酶切开目标蛋白和亲和标记之间的位点来切除亲和 标记。这个方法，通常需要添加昂贵的蛋白酶，而且需要增加除去添加的蛋白酶的步骤[32]。内蛋白子(Intein)是一种“蛋白质内含子”[33]，能够将它们自己切出来同时将其两端的蛋白质片度连接起来[34，35]。在将C-或N-末端的氨基酸替换后，内蛋白子可以通过特定pH或巯基试剂诱导自我拼切，将目标蛋白从亲和标记和内蛋白子上切下来。这个方法避免了蛋白酶的昂贵费用，简化纯化过程[34-36]。

但是内蛋白子的缺点是在表达的过程中易发生自发的拼切导致最终表达产物中有许多在纯化前就丢失亲和标记而无法通过亲和柱纯化[15，31，37，38]。所以有效的控制内蛋白子的拼切在内蛋白子的应用中至关重要。在将融合蛋白结合到树脂上，洗去杂蛋白质前要尽量抑制内蛋白子的自发拼切，而在此之后又需要尽快使拼切发生，从而使目标蛋白切下来。目前的方法多为改变pH或添加巯基化合物。这些方法在大肠杆菌表达体系中，由于表达时间短(几小时)，表达中的自我拼切的损失还可以接受。而酵母中的表达，时间长(几十小时到几天)，如果不能控制内蛋白子的自发拼切，将极大影响下游纯化的得率。目前有许多内蛋白子抑制剂的研究和温度等条件型突变体也许可以解决这个问题。

在酵母中的利用CBM为亲和标记还很少见，也不成系统。酵母与大肠杆菌相比有很多优点：酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物对表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰等不足，因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。但是只有几例CBM在酵母体系的报道。Ahn研究组和Rotticci-Mulder研究组都采用采用来源于丝状真菌的属于家族I的CBM(CBM1)与酯酶融合表达，大大促进了酯酶的分泌，但他们没有采用CBM1作为纯化的亲和标记[19，39]。家族I的CBM与纤维素的结合通常被认为可逆的，与纤维素结合的解离很快，不适宜用于作为蛋白质纯化的亲和标记。源于细菌的CBM，包括家族2和3的CBM2，CBM3，被认为在普通的缓冲液环境下与纤维素的结合是不可逆的，可作为亲和标记用于重组蛋白的表达纯化[28]。在酵母中CBM2的应用已进行了初步的研究，Kilburn研究组对将粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的CBM2a在 毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)中表达后，重组的CBM2a以及融合蛋白对纤维素的结合特性进行了研究，认为没有糖基化的CBM2a适合作为重组蛋白表达的亲和标记。对于家族III的CBM3还没有在酵母中应用的系统研究。本发明以CBM3为亲和标记，以再生无定形纤维素为纯化树脂建立了一个快速高效，低成本的重组蛋白表达纯化系统，并通过对EGFP的表达纯化进行了验证

采用CBM与内蛋白子这两项技术结合的重组蛋白的体系，目前只有本发明人在大肠杆菌中构建的系统[31]，NEB公司在细菌中建立了一个几丁质结合域、内蛋白子与重组蛋白融合表达的体系，虽然方便简单，与本发明人建立的方法相似，但是几丁质珠价格昂贵，每15ml售价255元(NEB中国网页)。而纤维素中与几丁质珠蛋白质结合容量相似的RAC(3.6mg/ml)，15ml的成本可以低于1元人民币(按大批量制备计算)。说明纤维素的CBM-内蛋白子的体系比NEB的几丁质体系要便宜得多。

在许多时候，人们期望能够在真核生物(例如，酵母)中进行蛋白质表达，还有些蛋白质在细菌中难以表达，所有这些都希望能够在酵母中建立CBM-内蛋白子体系。但是酵母中的翻译后修饰问题对CBM纤维素亲和能力的影响，酵母表达过程中的内蛋白子的自发拼切问题都是酵母中CBM-内蛋白子系统实用化之前必须解决的问题。本发明将采用CBM3为亲和标签，酵母的内蛋白子Sce VMA(其核苷酸序列为SEQ ID NO：4)为基础，在酵母中构建了一个实用的重组蛋白纯化体系。

发明内容

本发明涉及重组蛋白质表达中进行蛋白质纯化的方法，特别是采用亲和标签进行快速纯化的方法。更具体的说，本发明涉及利用无定形纤维素及其他纤维素为层析材料进行蛋白质纯化的方法。本发明还涉及用于蛋白质纯化的亲和标签的构建。本发明还涉及采用纤维素结合域在真核细胞中与重组蛋白融合表达以及快速纯化融合重组蛋白的方法。更具体地，本发明还涉及在真核生物中利用家族3纤维素结合域CBM3和内蛋白子(intein)将融合表达的重组蛋白无额外氨基酸的切出及纯化的方法。

本发明提供下述：

1.利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)构建所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；

(2)构建步骤(1)中的所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体；

(3)将步骤(2)中构建的所述重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；

(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；和

(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白。

2.利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签结合内蛋白子在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)构建所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；

(2)构建步骤(1)中的所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体，并在编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列之间插入内蛋白子核苷酸序列，构建目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体；

(3)将步骤(2)中构建的所述目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；

(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；

(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白；和

(6)诱导步骤(5)中纯化的重组蛋白中的内蛋白子进行自我剪切，得到不含CBM3的目标蛋白。

3.根据第1或2项所述的方法，其中所述家族3纤维素结合域CBM3包括来源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，还包括来源于Clostridium phytofermentans、解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)、耐热梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium)的CBM3，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：28-30。

4.根据第1或2项所述的方法，其中所述真核生物包括酵母，例如酿酒酵母(Sachromyces cerevisiae)、毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)等。

5.根据第1或2项所述的方法，其中还包括构建在真核生物中不受翻译后修饰影响的CBM3突变体。

6.根据第5项所述的方法，所述CBM3突变体包括消除一个或多个N-糖基化位点的CBM3突变体。

7.根据第6项所述的方法，所述消除一个或多个N-糖基化位点的CBM3突变体包括下列突变中的一种、两种或三种：N14Q，N68Q，和N124Q。

8.根据第2项所述的方法，其中所述内蛋白子包括酵母的Sce-VMA、Pst VMA、Zbi VMA、Kex VMA和Sba VMA，其中Sce-VMA的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，Pst VMA、Zbi VMA、Kex VMA和Sba VMA的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：31-34。

9.根据第2项所述的方法，其中步骤(6)通过改变温度、加入半胱氨酸、DTT或β-巯基乙醇诱导内蛋白子的自我剪切。

10.根据第1或2项所述的方法，其中步骤(5)中所用的纤维素包括无定形纤维素、微晶纤维素、脱脂棉和滤纸。

本发明主要以酵母为例，详细阐述本发明的方法。但本领域技术人员应该明白，本发明所述的方法并不限于用于酵母，还可以适用于其它本领域常用的用于表达和纯化重组蛋白的真核生物体系，例如，但不限于，CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等哺乳动物细胞、蚕及果蝇等昆虫细胞等。

在本发明的第一方面中，在酵母中构建一个以纤维素结合域(cellulose binding module，CBM)为亲和标签表达重组蛋白，以纤维素为层析分离材料对重组蛋白进行分离纯化的方法。同时在酵母中建立了以CBM为亲和标签，通过内蛋白子除去亲和标签的重组蛋白表达纯化体系(图1)，其中所述纤维素结合域(CBM)为来源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3(其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，核苷酸序列为 SEQ ID NO：2)。所述方法主要包括：构建酵母密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)；在酵母中实现纤维素结合域CBM3与目标蛋白的融合表达；构建在酵母中不受翻译后修饰影响的CBM3突变体(表1)；并且在重组蛋白表达过程中和重组蛋白质从纤维素上洗脱前避免缓冲液含有巯基化合物来抑制内蛋白子自我剪切。本发明人在构建这个系统前，由于担心会发生表达过程中的自发剪切，所以计划构建温度敏感性的内蛋白子和添加剪切抑制物，但是在实际实验中发现，无需进行特别处理，只要在表达过程中和蛋白纯化过程中避免含有巯基化合物就可以得到不错的结果。原因是在表达过程中和剪切诱导之前由于细胞中及缓冲液中不含巯基化合物或浓度很低，所以剪切不发生或很弱，在加入半胱氨酸或DTT之后，巯基化合物浓度较高，剪切就比较快速的发生了。

因此，在本发明的具体实施方案中，提供利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签在酵母中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)构建所述酵母密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；

(2)构建步骤(1)中的所述酵母密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体；

(3)将步骤(2)中构建的所述重组构建体克隆到适于在所述酵母中表达的表达载体中；

(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述酵母中进行表达；和

(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白。

在本发明的另一个具体实施方案中，提供利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签结合内蛋白子在酵母中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)构建所述酵母密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；

(2)构建步骤(1)中的所述酵母密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体，并在编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列之间插入内蛋白子核苷酸序列，构建目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体；

(3)将步骤(2)中构建的所述目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建 体克隆到适于在所述酵母中表达的表达载体中；

(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述酵母中进行表达；

(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白；和

(6)诱导步骤(5)中纯化的重组蛋白中的内蛋白子进行自我剪切，得到不含CBM3的目标蛋白。

在上述方法中，所用的酵母包括但不限于本领域中常用的酵母种类，例如，酿酒酵母(Sachromyces cerevisiae)、毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。

在上述方法中，其中还包括构建在酵母中不受翻译后修饰影响的CBM3突变体，所述CBM3突变体包括消除一个或多个N-糖基化位点的CBM3突变体。更具体地，所述消除一个或多个N-糖基化位点的CBM3突变体包括下列突变中的一种、两种或三种：N14Q，N68Q，和N124Q。

在具体的实施方案中，本发明以EGFP为例，通过对EGFP与CBM3或与CBM3和内蛋白子重组融合蛋白的纯化展示已建立完整的重组蛋白质纯化方法。

纤维素结合域(CBM)已在大肠杆菌的表达系统中作为亲和标记得到了应用，源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3(氨基酸序列为SEQ ID NO：1)同样已经在大肠杆菌中重组蛋白的亲和层析中作为亲和标记进行了应用。这个蛋白对纤维素的结合能力是确定的。但是CBM3在酵母中表达，能否作为重组蛋白的亲和标签的应用还没有系统的研究。而内蛋白子虽然在大肠杆菌中广泛应用，但是来自酵母的内蛋白子在酵母中功能是否受影响，在酵母中与目标蛋白融合表达后，能否正常进行剪切及其应用也研究的不是很多。本发明在酵母中构建一个以CBM3为亲和标记，且不依赖昂贵的蛋白酶除去亲和标记蛋白表达纯化系统。

本领域技术人员应该理解，其他菌来源的家族3的纤维素结合域(CBM3)也可用于本发明，例如来源于Clostridium phytofermentans，解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，耐热梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium)等的CBM3，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：28-30所表 示。

以下是本发明的具体描述：

1)首先要对热纤维梭菌来源的CBM3进行酵母密码子优化。

热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)来源的CBM3密码子不是酵母中基因编码的最优密码子，直接采用原始CBM3基因可能会导致在酵母中表达效率低下，所以要对CBM3密码子进行酵母密码子优化。

方法：在计算机中采用TmPrime对CBM3密码子优化以后，通过设计寡聚核苷酸，PCR等方法合成所需的CBM3基因(即，酵母密码子优化后的核苷酸序列，SEQ ID NO：3)。

2)将酵母密码子优化后的CBM3与目标蛋白质基因融合起来，构建表达CBM3-目标蛋白质的重组融合蛋白的构建体

方法：可通过分子克隆领域的常规重叠PCR(overlapping PCR)、或利用限制酶切位点进行连接。

3)采用合适的表达质粒(例如，毕赤甲醇酵母的表达质粒pPICZaA等)来表达CBM3-目标蛋白质。

4)在重组表达CBM3-目标蛋白以后，重组蛋白与纤维素的结合能力通过测量吸附蛋白质的活性来确定。也就是测定不同浓度的CBM-目标蛋白与纤维素结合的量，然后依据langmuir方程计算出最大吸附(Amax)。具体细节方法可以参考本发明人在测定纤维素结合CBM能力方面的工作成果[40]。

5)在得到与纤维素高度亲和的CBM3-目标蛋白后，可在CBM3与目标蛋白之间插入内蛋白子基因。

所采用的内蛋白子为酵母的Sce-VMA(核苷酸序列为SEQ ID NO：4)。由于VMA在体内(In Vivo)的自发剪切很少，比较适合需要长时间进行表达的酵母表达体系。

本领域技术人员应该理解，适用于本发明方法的内蛋白子不限于酵母的Sce-VMA，其他真核内蛋白子也可适用于本发明的方法，例如，Pst VMA，Zbi VMA，Kex VMA，Sba VMA等酵母内蛋白子(其氨基酸序列分别参见SEQ ID NO：31-34)，采用巯基化合物诱导进行拼接都可适用于本发明的方法。

6)可以采用有很大的吸附容量(约5μmol/g)的再生无定形纤维素(RAC)为填料。但也可采用本领域常用的脱脂棉、微晶纤维素、滤纸等材料进行尝试，为在没有RAC时提供替代方法。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.酵母中构建的以CBM为亲和标记的重组蛋白表达纯化体系。

图2.纤维素结合域(CBM)与目标蛋白的融合方式。

图3.采用无定形纤维素(RAC)进行CBM-GFP的纯化。1.装RAC柱子；2.开始上样；3.上样基本结束；4.采用Tris-Cl缓冲液(100mM，pH 8.0)，洗去杂蛋白；5.一倍体积的乙二醇混匀；6.采用离心洗脱；7.纯化的CBM-GFP及洗脱后的柱子。

图4.CBM3中潜在的N-糖基化位点(下划线的氨基酸残基)。

图5.SDS-PAGE分析纯化的蛋白。M：标准蛋白分子量；1.CBMmt-EGFP；2.CBMw13m2-EGFP；3.CBMwt-EGFP；4.大肠杆菌表达的CBMwt-EGFP。

图6.对CBM3进行突变的过程。A：构建CBM3所有突变体的过程，B：构建突变的具体策略。

图7.不同浓度的半胱氨酸对EGFP-intein-CBM3(GIC)自我剪切的影响(A)以及不同温度对GIC自我剪切的影响(50mM半胱氨酸)。

图8.不同浓度的DTT对GIC自我剪切的影响(A)以及不同温度对GIC自我剪切的影响(50mM DTT)。

图9.SDS-PAGE检测通过GIC对EGFP的纯化。1.细胞裂解上清；2.GIC被RAC结合后上清；3.结合在RAC上没有剪切后的GIC；4剪切后仍结合在RAC上的Intiein-CBM；5.纯化的EGFP；6.标准分子量。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1

纤维素结合域与EGFP的融合表达和纯化。

EGFP是一种绿色荧光蛋白质，其常常用于分子标记和蛋白定位，是一种常见的蛋白，在本实施例中以此蛋白为例，通过在酵母中与纤维素结合域CBM3融合表达，进行纯化来展示CBM3在亲和层析中表达纯化的能力和优点

试剂和菌株：

本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。微晶纤维素Avicel PH105(20μm)购自FMC Co(Philadelphia，PA)。大肠杆菌Escherichia coli XL10 gold(购自Stratagene)作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100μg/mL氨苄青霉素(购自Bio.Basic.Inu)的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)KM71H(购自Invitrogen)用于表达重组蛋白质，YPD(yeast extract，peptone dextrose)培养基用于培养酵母。YPG(yeast extract，peptone，glycerol)用于表达重组蛋白的前培养，BYPM(Buffered yeast extract，peptone，methanol)培养基用于重组蛋白的表达。

表达重组蛋白的菌株通过电穿孔法将重组表达质粒转化到毕氏甲醇酵母(P.pastoris)KM71H中获得。实验中所用的所有引物均由上海生工合成。

再生无定形纤维素(RAC)的制备：

0.2g微晶纤维素(购自FMC Co(Philadelphia，PA))和0.6mL水在50mL离心管中充分混合制备成纤维素浆，再加入10mL冰冷的浓磷酸(＞85％，购自国药集团)。加入时速度要慢，同时剧烈混合。纤维素混合物会很快变透明。在冰上放置1小时，并不时搅动。然后分四次加入40mL冰冷的水。加入时要剧烈搅动，避免成块的纤维素出现。沉淀的纤维素在4℃，5000Xg条件下离心20min.弃去上清，将沉淀重悬于冰水之中，再次离心，并弃上清，重复4次，以除去磷酸.加入1mL 2M Na₂CO₃和40mL冰冷的水到纤维素中以中和残余的磷酸，离心除去上清后，再用 水清洗两遍。如果纤维素pH为5-7，那么无定形纤维素的制备完成。(如果纤维素pH不为5-7，则需要添加适量的酸或碱调整pH至5-7。)无定形纤维素的制备的定量采用phenol-H₂SO₄法，其他纤维素如Sigmacell、脱脂棉等也可以用于制备无定形纤维素。制备好的无定形纤维素添加0.2％(W/V)叠氮化钠(购自国药集团)后在4℃可保存一年以上。

表达载体的构建：

为了在酵母中表达CBM3(来源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum))的融合蛋白质，对CBM3的密码子进行了优化，优化后的编码核苷酸序列见SEQ ID NO：3。优化后的cbm3基因通过基因合成进行了人工合成，合成的cbm基因插入到克隆载体pUCm-T(购自上海生工)中。然后将egfp基因从pCG(pCG是一种质粒，见参考文献[41])通过PCR扩增出来，所用的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。采用DNA聚合酶为PrimerStar(购自大连宝生物)。

egfp基因PCR扩增反应混合物：

5X PrimerStar反应缓冲液    10μl

dNTP(10mM)                 5μl

正向引物(10μM)            1μl

反向引物(10μM)            1μl

pCG模板                    0.1μl

DNA聚合酶PrimerStar        0.5μl

H₂O                        32.4μl

总反应体积                 50μl

PCR循环条件为：

1.95℃    4min

2.95℃    30sec

3.55℃    15sen

4.72℃    1min

5.从2到4循环25次

6.72℃    7min

最后将扩增得到的egfp基因经琼脂糖凝胶纯化并在使用前于4℃保存。

将上述扩增产物采用SalI(NEB)和HinDIII(NEB)酶切以后插入到已克隆了cbm3的pUCm-T中，构建cbm3和egfp融合的基因。然后通过PCR将cbm3-egfp扩增出来，所用的引物序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。扩增的cbm3-egfp序列在被EcoRI和XbaI酶切后克隆到同样被EcoRI和XbaI的质粒pPICZ B(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，得到质粒pYCG。在pYCG中，CBM3-EGFP的氨基酸序列在N-端与α-因子的编码序列融合，在C-端与His-tag融合。CBM-EGFP融合蛋白可以在AOX启动子的控制下表达。pCG通过电穿孔转化于Pichia pastoris KM71H(购自Invitrogen)中。

纤维素酶结合域CBM3突变体的构建：

由于CBM3如果在酵母中分泌表达，其可能被糖基化。有3个潜在的糖基化位点(参见图4，下划线表示糖基化位点)。为了构建不同程度的消除N-糖基化位点的CBM3，构建了7种突变(参见表1)。

表1.CBM3突变体和野生型

这些突变是通过PCR引物引入，然后通过融合PCR进行的。

构建Asn14突变成Gln的突变体(N14Q)时，采用序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引物，以pYCG或其他位置已突变的CBM3为模板进行PCR扩增。由于SEQ ID NO：9是一条长引物，可以直接将第14位的Asn改变成Gln。采用的DNA聚合酶为PrimerStar(购自大连宝生物)。

N14Q突变基因PCR反应混合物：

5X PrimerStar反应缓冲液    10ul

dNTP(2.5mM)                4ul

正向引物                   0.2uM(终浓度)

反向引物                   0.2uM(终浓度)

模板                       1ng

PrimerStar(2.5U/ul)        0.5ul

H₂O                        添加至50ul

PCR循环条件为

1.95℃    4min

2.98℃    30sec

3.55℃    15sec

4.72℃    45sec

5.从2到4循环25次

6.72℃    7min

最后将扩增得到的基因产物经琼脂糖凝胶纯化并在使用前于4℃保存。

构建Asn68突变成Gln的突变体(N68Q)时，编码CBM3N端的DNA采用序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12的引物通过PCR扩增，编码CBM3C端的DNA通过PCR采用序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的引物扩增，然后，扩增的两条DNA通过融合PCR(Overlapping Extension PCR)后，以序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10的引物扩增出cbm3的全长。采用DNA聚合酶为PrimerStar(购自大连宝生物)。

CBM3 N68Q突变基因N端PCR反应混合物：

5X PrimerStar反应缓冲液    10ul

dNTP(2.5mM)                4ul

引物SEQ ID NO：7           0.2uM(终浓度)

引物SEQ ID NO：12          0.2uM(终浓度)

模板                       1ng

PrimerStar(2.5U/ul)        0.5ul

H₂O                        添加至50ul

CBM3 N68Q突变基因C端PCR反应混合物：

5X PrimerStar反应缓冲液    10ul

dNTP(2.5mM)                4ul

引物SEQ ID NO：10          0.2uM(终浓度)

引物SEQ ID NO：11          0.2uM(终浓度)

模板                       1ng

PrimerStar(2.5U/ul)        0.5ul

H₂O                        添加至50ul

上述N端和C端两个片段的PCR循环条件为：

1.95℃    4min

2.95℃    30sec

3.55℃    15sec

4.72℃    45sec

5.从2到4循环25次

6.72℃    7min

7.4℃     保存

在得到N端和C端小片段后，进行融合PCR反应的条件为：其中采用DNA聚合酶为PrimerStar(购自大连宝生物)，模板为为上述扩增的N端和C端片段。

CBM3 N68Q突变基因全长融合PCR反应体系：

5X PrimerStar反应缓冲液    10ul

dNTP(2.5mM)                4ul

引物SEQ ID NO：7           0.2uM(终浓度)

引物SEQ ID NO：10          0.2uM(终浓度)

模板(为上述扩增的N端和C端片段)    1ng

PrimerStar(2.5U/ul)        0.5ul

H₂O                        添加至50ul

融合PCR循环条件为：

1.95℃    4min

2.98℃    30sec

3.55℃    15sec

4.72℃    45sec

5.无引物条件下从2到4循环10次

6.添加最终10pM的引物

7.98℃    30sec

8.55℃    15sec

9.72℃    45sec

10.从7到9循环25次

11.72℃   7min

12.4℃    保存

构建Asn124突变成Gln的突变体时，编码CBM3 N端的DNA通过PCR采用序列为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：7的引物扩增，编码CBM3 C端的DNA通过PCR采用序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：10的引物扩增，然后，扩增的两条DNA通过融合PCR(Overlapping ExtensionPCR)后，以序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10的引物扩增出cbm3的全长。采用DNA聚合酶为PrimerStar(购自大连宝生物)，PCR循环条件同上。

对于一个以上的突变的突变体的构建，则采用上述方法进行组合，最终构建了7种突变体(参见表1)。

Cbm3-egfp基因的表达：

在cbm3及突变体与egfp的融合基因插入到pPICZαA后，得到的质粒在PmeI酶切以后，采用EasySelect.Pichia Expression Kit的方法通过电穿孔转化到P.pastoris KM71H中，转化后的细胞涂到含有100μg/ml博来霉素(Zeocin)(购自：Solarbio(索莱宝))的YPDS平板(含有1M山梨糖醇的酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖培养基)。得到阳性克隆以后在有1000μg/ml Zeocin的YPDS平板进行复筛。

复筛得到的菌株在500mL YPG(酵母提取物，蛋白胨，甘油)中在30℃进行前培养24小时后，离心回收菌体，转接到100mL BYPM(缓冲的酵母提取物，蛋白胨，甲醇)培养基中，诱导培养7天，每天补充0.5mL甲醇。7天之后，离心回收上清。上清将用于纯化。

重组蛋白的纯化：

在得到上清后，将通过两条路径进行纯化。既可以将RAC(再生无定形纤维素，Regenerated amorphous cellulose)直接加入到上清中进行吸附，也可以将上清添加到RAC的层析柱中，添加的比例为每克RAC对应约4μM目标蛋白质(上清中目标蛋白的量可以通过上清的SDS-PAGE或蛋白质活性来估计)。将目标蛋白质和RAC混合15分钟，将结合了蛋白质的RAC装到空层析柱中，然后用5倍柱体积的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)对装好的RAC柱子进行洗涤，除去杂蛋白。待缓冲液完全流出后，加入一倍柱体积的100％乙二醇(EG，购自上海生工)，混匀后将层析柱置于一个大离心管中(图3)，进行离心，回收纯化了的CBM-EGFP。重复洗脱步骤一次，将两次得到的蛋白合并。乙二醇洗脱的蛋白质可以在-20℃保存。使用时可以透析或超滤除去乙二醇。甘油同样也可以用于洗脱，但是甘油的粘度更大，除非乙二醇会抑制蛋白活性，否则不建议使用甘油。从表1可以看出对CBM-EGFP的得率在50％左右。

EGFP荧光的检查和蛋白质分析：

EGFP荧光通过SpectraMax M5多道微孔板酶标仪检测(multidetection microplate reader(California，USA))，激发波长为485nm，发射波长为528nm。

蛋白质量浓度的测定为Bradford method方法，标准蛋白采用牛血清白蛋白。12％SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳用于分析纯化结果。图5可以看到目标蛋白已被纯化至单一条带。而CBMwt-EGFP有拖尾是由于CBM被部分糖基化造成的，采用endoH(NEB)可以除去这些糖侧链。

在实际应用中，不除去CBM3一般不影响目的蛋白的构象、功能和活性。如果要除去CBM3的话，除了如下述实施案例2中采用内蛋白子进行剪切外，还可以采用在融合蛋白结合到纤维素上后，采用合适的蛋白酶(例如，凝血酶、凝血因子X a蛋白酶、rTEV蛋白酶、PreScission蛋白酶、肠激酶等)在CBM3和目的蛋白之间切断，将目的蛋白切下，与CBM3分离除去CBM3。

表2.CBM-EGFP的纯化的定量分析(100mL表达体积)

CBM及其突变体在RAC上的结合能力：

表3是三种酵母表达的CBM-EGFP对RAC结合能力与大肠杆菌表达的结合能力的比较。可以看出虽然有所差别，但所有的CBM都保持了很高的结合能力，也就是说CBM在酵母中表达后完全可以作为亲和标签使用，而且结合能力受糖基化影响不大。虽然各种突变体效果差别不大，但是CBMmt2(SEQ ID NO：22)不会被糖基化，而且与纤维素结合能力大，效果最优。

表3.各种CBM-EGFP蛋白在RAC上的吸附特点

A_max：最大吸附能力；K_a：吸附常数；CBMe：大肠杆菌表达的无突变CBM-EGFP；CBMwt：酵母中表达的野生型CBM-EGFP；CBMw13m2：酵母中表达的N68Q突变CBM-EGFP；CBMmt：酵母中表达的潜在N-糖基化位点消除的CBM-EGFP。

实施例2

纤维素结合域与酵母内蛋白子VMA及EGFP的融合表达和纯化，通过内蛋白子的自我剪切得到不含亲和标记的纯EGFP蛋白。

在本实施例中仍以EGFP为例，通过在酵母中与纤维素结合域CBM3和内蛋白子融合表达，进行纯化来展示内蛋白子在CBM3融合表达目标蛋白的亲和层析中的优点。

试剂和菌株：

本实施例中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。微晶纤维素Avicel PH105(20μm)购自FMC Co(Philadelphia，PA)。大肠杆菌Escherichia coli XL10 gold作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用于培养E.coli。毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)KM71H(购自Invitrogen)用于表达重组蛋白质。YPD(酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖)培养基用于培养酵母。YPG(酵母提取物，蛋白胨，甘油)由于表达重组蛋白的前培养，BYPM(缓冲的酵母提取物，蛋白胨，甲醇)培养基用重组蛋白的表达。

表达重组蛋白的菌株通过电穿孔法将重组表达质粒转化到P.pastoris KM71H中获得。所用的所有引物均由上海生工合成。

无定形纤维素的制备：

本实施例中所用的无定形纤维素同样按照实施例1中“无定形纤维素的制备”方法制备。

表达载体的构建：

首先构建含有编码EGFP-intein-CBM(GIC)的基因的质粒。pGIC以pTYB1(New England Biolabs，USA)为基础进行构建。EGFP和CBM3 DNA片段分别以序列为SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18的引物从质粒pYCG(见实施案例1)中扩增出来。采用的DNA聚合酶为PrimerStar(购自大连宝生物)。

EGFP或CBM3 DNA片段PCR扩增反应混合物：

5X PrimerStar反应缓冲液    10ul

dNTP(2.5mM)                4ul

正向引物                   0.2uM(终浓度)

反向引物                   0.2uM(终浓度)

模板                       1ng

PrimerStar(2.5U/ul)        0.5ul

H₂O                        添加至50ul

EGFP或CBM3 DNA片段的PCR循环条件为：

1.95℃    4min

2.98℃    30sec

3.55℃    15sec

4.72℃    1min

5.从2到4循环25次

6.72℃    7min

7.4℃     保存

EGFP片段在NdeI和XhoI酶切后插入到同样以NdeI/XhoI酶切的pTYB1中得到重组质粒pGI，然后CBM片段在AgeI/PstI酶切后插入到同 样被AgeI/PstI酶切的pGI中，得到pGIC质粒。然后整个egfp-intein-cbm3通过以序列为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的引物的PCR扩增后，插入到酵母表达质粒pPICZA(购自Invitrogen)中，构建得到pPICZA-GIC。这个质粒转入毕氏甲醇酵母(P.pastoris)KM71H后进行表达。

Egfp-intein-cbm3基因的表达：

质粒pPICZA-GIC在PmeI酶切以后，采用EasySelect.Pichia Expression Kit的方法通过电穿孔转化到P.pastoris KM71H中，转化后的细胞涂到含有100μg/ml Zeocin的YPDS平板(含有1M sorbitol的YPD培养基)。得到阳性克隆以后在有1000μg/ml Zeocin的YPDS平板进行复筛。复筛得到的菌株在500mLBMGY中在30℃进行前培养24h后，离心回收菌体，转接到100mL BMMY培养基中，诱导培养7天，每天补充0.5mL甲醇。7天之后，离心回收菌体。

EGFP荧光的检查和蛋白质分析：

EGFP荧光通过SpectraMax M5多道微孔板酶标仪检测(multidetection microplate reader(California，USA))，激发波长为485nm，发射波长为528nm。当采用DTT诱导时，由于DTT会抑制EGFP的荧光，所以采用Bradford method方法进行蛋白质量浓度的测定，确定剪切的效果。12％SDS聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳用于分析纯化结果。

重组蛋白的纯化：

在得到菌体以后可以悬浮到Tris-HCl缓冲液(pH8.0100mM)中，通过超声波破碎细胞。破碎后离心(5000X g 10分钟)后，回收上清。在得到上清后，将通过两条路径进行纯化。既可以将RAC直接加入到上清中进行吸附，也可以将上清添加到RAC的层析柱中，添加的比例为每g RAC对应约4μM目标蛋白质(上清中目标蛋白的量可以通过上清的SDS-PAGE或蛋白质活力来估计)。将目标蛋白质和RAC混合15分钟，将结合了蛋白质RAC装到空层析柱中，然后用5倍柱体积的50mM Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)对装好的RAC柱子进行洗涤，除去杂蛋白。待缓冲液完全流出后，将层析柱的下端堵住，加入一倍柱体积的拼切缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA，50mM DTT或半胱氨酸)，然后将上端也堵住，混匀后在室温保持12h，或4℃24h，进行拼切。拼切完成以后将上下端打开，按图3中离心，回收不带有CBM和intein的EGFP。如果样品体积较大时，可以不采用层析柱进行纯化，而直接在离心管中进行纯化，杂蛋白可以通过3次5倍RAC总体积的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤去除，然后添加巯基化合物进行自我剪切的催化，得到的纯蛋白通过离心，回收上清获得。图9是表达的融合蛋白及纯化了得蛋白SDS-PAGE分析结果。从图中可以看出EGFP被成功的纯化。

本实施例还测试温度对剪切的影响，由图7和图8可以看出，随着温度升高剪切速度加快，因此如果纯化的重组蛋白是比较耐热的，可以提高剪切的温度以缩短时间，而对于热稳定性差的蛋白，在4℃也是可以完成剪切的。

本实施例还以半胱氨酸为例测定了诱导物的浓度对EGFP-intein-CBM(GIC)自我剪切的影响，同样诱导物的浓度越高，GIC自我剪切速度越快，考虑到诱导物的成本，50mM的半胱氨酸比较合适(图7)。

本实施例还对DTT对GIC自我剪切的诱导做了调查，研究发现，DTT同样具有很好的GIC自我剪切诱导作用(图8)。另外β-巯基乙醇也可以催化内蛋白子的自我剪切。

所以，采用本发明的方法进行重组蛋白纯化时，如果蛋白质对热不稳定，可以在4℃进行，热稳定的蛋白可以在更高温度比如室温或37℃进行。另外如果蛋白对DTT敏感、不稳定则可以降低DTT浓度或采用半胱氨酸来诱导内蛋白子的自我剪切。

将100ml培养体系中的表达细胞，裂解后取上清，在RAC吸附及缓冲液洗涤后采用50mM半胱氨酸，在37℃，剪切，最终得到4.71mg荧光蛋白质。由于在酵母的细胞裂解液中干扰非常的大，荧光无法准确测量，所以无法测定其中的GIC含量，最终的EGFP的得率见表4。

表4.EGFP的纯化的定量分析(100mL表达体积)

从上述实施例可以看出，采用CBM3与内蛋白子Sce VMA结合的策略，利用纤维素为纯化材料可以快速有效的，进行目的蛋白(例如，EGFP、药物蛋白等)的纯化。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

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