粘质沙雷氏菌D-乳酸脱氢酶基因,克隆、表达重组菌株及重组酶的研究

摘要

本发明涉及粘质沙雷氏菌D-乳酸脱氢酶基因，克隆、表达重组菌株及重组酶的研究。具体地，本发明提供了一种新的D-乳酸脱氢酶(简称为“D-LDH蛋白”)，编码D-LDH蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种D-LDH蛋白的方法。本发明还公开了编码这种D-LDH蛋白的多核苷酸的用途。D-LDH蛋白具有催化丙酮酸形成D-乳酸的功能，可用于高效地生产价格比L-乳酸昂贵8-10倍的D-乳酸，因而具有巨大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的来自于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)多肽及其编码基因。本发明还涉及含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主细胞(重组菌株)，及其在催化丙酮酸生成D-乳酸中的用途。

背景技术

乳酸广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸依其旋光性不同可分为D-乳酸、L-乳酸、D，L-乳酸三种。

D-乳酸及其衍生物，广泛应用于食品、医药、饲料和化工等领域，特别是在医药领域，D-乳酸的聚合物可以被用作药物缓释剂型的材料。这是因为，D-乳酸的聚合物不能被人体消化吸收，但能被寄生于人体的微生物分解，从而起到缓释药物的作用。另外，D-乳酸可以用作手性药物的前体物，利用光学纯的D-乳酸的手性特征，用于开发手性药物，大大提高药物的治疗效果和用药的安全性。此外，D-乳酸可以作为农药的前体物，由此而合成的农药易分解、无残留，是一种环保型农药。因此，目前对D-乳酸的需求日益增加，其价格是L-乳酸的8-10倍，具有很大的市场潜力。

在动物或微生物体中，乳酸脱氢酶(简称“LDH”)是以NADH为辅酶，将丙酮酸经过生化反应生成乳酸，因此乳酸脱氢酶是乳酸菌发酵的关键酶。自然界中存在L和D两种依赖NADH的乳酸脱氢酶，分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸。

近年来，手性物质以其特殊的光学结构和广泛的应用受到越来越多的重视，已慢慢发展成为科学研究的一个新领域。乳酸是自然界最小的手性分子，全世界近80％的厂家采用直接发酵法生产光学纯度乳酸，主要是L-乳酸。D-乳酸作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、化工等方面的应用十分广泛。与L-乳酸繁荣的研究景象相比，D-乳酸的开发略显单薄。目前世界乳酸的总生产能力为25万吨/年，总产量为13万吨/年，并以每年6％～8％递增。目前D-乳酸生产能力约1.6万吨，而世界上D-乳酸的需求约2.6万吨，因此，目前对D-乳酸的需求日益增加。

不同的手性物质其制备方法大致相同，主要分为化学拆分法和微生物发酵法。化学拆分法需要消耗石油、煤炭等逐渐匮乏、日益昂贵的化石资源，而且对生态环境的破坏及其严重；相比之下，微生物发酵法以可再生资源为原料，成本低廉，绿色环保，是一种高效的生物加工模式。

然而，目前人们对于D-乳酸生产了解甚少，缺乏多样的和高效的D-乳酸脱氢酶，因此，本领域迫切需要开发新的D-乳酸脱氢酶，以便用于用于D-乳酸的发酵生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的粘质沙雷氏菌D-乳酸脱氢酶(即D-LDH蛋白)以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离的D-乳酸脱氢酶(即D-LDH多肽)，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该D-乳酸脱氢酶选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化丙酮酸形成D-乳酸的功能的由(a)衍生的多肽。

在另一类优选例中，该D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者该酶是带有6His标签的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码本发明第一方面中所述D-乳酸脱氢酶的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

在另一类优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的D-乳酸脱氢酶。

在另一类优选例中，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：

(a)SEQ ID NO：1中1-990位的序列；

(b)SEQ ID NO：1中1-993位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体。还提供了被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞，即含有上述的载体或者在基因组中整合有本发明第二方面中所述的多核苷酸的序列的宿主细胞。在另一类优选例中，上述的宿主细胞是粘质沙雷氏菌。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述D-乳酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明上述所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出粘质沙雷氏菌D-LDH多肽。

在本发明的第五方面，提供了一种制备D-乳酸的方法，该方法包括步骤：

在本发明第一方面所述的D-乳酸脱氢酶或本发明第三方面中所述的宿主细胞存在下，催化丙酮酸和辅酶NADH反应，从而形成D-乳酸。

在另一类优选例中，在所述反应中，反应体系中的pH为7.0-8.0，丙酮酸浓度为5-40mM，和/或辅酶NADH浓度为0.3-0.7mM。

在另一类优选例中，所述的反应体系中，基本上不存在二价的铜离子或二价铁离子。

在另一类优选例中，反应温度为20-65℃，更佳地为20-40℃。

在本发明的第六方面，提供了与上述的D-LDH多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第七方面，提供了模拟、促进、拮抗D-LDH多肽活性的化合物，以及抑制D-LDH多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是D-LDH多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第八方面，提供了检测样品中是否存在D-LDH蛋白的方法，它包括：将样品与D-LDH蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在D-LDH蛋白。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明的粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就某一大范围(如10-100)的上限可以与另一优选的较小范围(如20-80)的下限20进行组合，从而构成另一范围(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是本发明的D-LDH蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。

图2是本发明D-LDH蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3显示了利用简并引物LDHf(SEQ ID NO：3)和LDHr(SEQ ID NO：4)扩增的D-乳酸脱氢酶基因的ORF片段(泳道1)，泳道M为标准DNA分子量，自上向下的条带分别为(kb)：17，9.3，5.4，4.1，3.1，2.7，1.6，1.1，0.5。

图4为D-乳酸脱氢酶基因重组表达质粒pET-ldh的构建过程。

图5显示了重组质粒pET-l dh双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳。泳道1为pET-ldh酶切后(阳性结果)；泳道2为pET-28a(+)酶切后(阴性结果)；泳道M为标准DNA分子量，自上向下的条带分别为(kb)：17，9.3，5.4，4.1，3.1，2.7，1.6，1.1，0.5。

图6显示了原始菌BL21(DE3)(泳道1)和E.coli BL21(DE3)/pET-ldh(泳道2)诱导表达后的全菌体SDS-PAGE电泳图。图中泳道M为标准蛋白分子量(自上而下的条带分别为97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3kDa)。

图7显示了在D-乳酸脱氢酶参与催化丙酮酸生成D-乳酸的反应中于1h、3h、17h取样，利用SB-Aq反向柱进行的HPLC检测。

图8显示了在D-乳酸脱氢酶参与催化丙酮酸生成D-乳酸的反应中于0h、25h取样，利用Chirobiotic R手性柱进行的HPLC检测。

图9为D-乳酸脱氢酶热稳定性的研究。

图10为D-乳酸脱氢酶酶反应温度的研究。

图11为D-乳酸脱氢酶pH稳定性研究。

图12为D-乳酸脱氢酶酶反应pH的研究。

图13为二价金属阳离子对D-乳酸脱氢酶稳定性的影响。

图14为丙酮酸浓度对D-乳酸脱氢酶活力的影响。

图15为双倒数作图法测定D-乳酸脱氢酶对丙酮酸的Km和Vmax。

图16为NADH浓度对D-乳酸脱氢酶活力的影响。

图17为双倒数作图法测定D-乳酸脱氢酶对辅酶NADH的Km和Vmax。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，筛选了大量微生物品种，意外地粘质沙雷氏菌筛选到一种新的D-乳酸脱氢酶。该D-乳酸脱氢酶可以有效地催化丙酮酸形成D-乳酸。然而，与现有的D-乳酸脱氢酶不同，本发明的D-乳酸脱氢酶对于大多数金属阳离子不敏感(但对于Cu²⁺和Fe²⁺而极其敏感)。再次基础上完成了本发明。

本发明的D-乳酸脱氢酶的主要酶学性质及酶反应动力学如下：

(1)D-乳酸脱氢酶的温度稳定性，在高于50℃的环境里极易失活。

(2)D-乳酸脱氢酶酶反应最适温度为60℃。

(3)D-乳酸脱氢酶的pH稳定性，在pH7.0左右最为稳定。

(4)D-乳酸脱氢酶酶反应最适pH为7.5

(5)二价金属阳离子对D-乳酸脱氢酶的稳定性影响，Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺对酶仅有很弱的抑制作用，Zn²⁺和Ba²⁺抑制作用最弱，Cu²⁺和Fe²⁺的抑制作用较强。

(6)D-乳酸脱氢酶对底物丙酮酸的动力学参数Km＝3.39mmol/L，Vmax＝6.87mmol/(mg·min)。

(7)D-乳酸脱氢酶对辅酶NADH的动力学参数Km＝1.43mmol/L，Vmax＝1.61mmol(mg·min)。

在本发明中，术语“D-LDH蛋白”、“D-LDH多肽”或“D-乳酸脱氢酶D-LDH”可互换使用，都指具有粘质沙雷氏菌D-乳酸脱氢酶D-LDH氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的D-乳酸脱氢酶D-LDH。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的D-LDH蛋白或多肽”是指D-LDH多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化D-LDH蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。D-LDH多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列(如6His)或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“D-LDH多肽”指具有粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白活性的SEQID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与D-LDH蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗D-LDH多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含D-LDH多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO：3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了D-LDH多肽的可溶性片段。通常，该片段具有D-LDH多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然D-LDH多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

  最初的残基  代表性的取代 优选的取代  Ala(A)  Val；Leu；Ile Val  Arg(R)  Lys；Gln；Asn Lys  Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg Gln  Asp(D)  Glu Glu  Cys(C)  Ser Ser  Gln(Q)  Asn Asn  Glu(E)  Asp Asp  Gly(G)  Pro；Ala Ala  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg Arg  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu  Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile  Lys(K)  Arg；Gln；Asn Arg  Met(M)  Leu；Phe；Ile Leu  Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu  Pro(P)  Ala Ala  Ser(S)  Thr Thr  Thr(T)  Ser Ser  Trp(W)  Tyr；Phe Tyr  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser Phe  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码D-LDH蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的D-LDH蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或D-LDH蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的D-LDH多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码D-LDH多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，D-LDH蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含D-LDH蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接用于催化生产D-乳酸。

另一方面，本发明还包括对D-LDH蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于D-LDH蛋白基因产物或片段。较佳地，指那些能与D-LDH蛋白基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白的分子，也包括那些并不影响粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的D-LDH蛋白基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的D-LDH蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerl ing等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白功能的抗体以及不影响粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用D-LDH蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与D-LDH蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白的抗体可用于检测，检测样本中的粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白。

一种检测检测样品中是否存在D-LDH蛋白的方法是利用D-LDH蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与D-LDH蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在D-LDH蛋白。

多克隆抗体的生产可用粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与D-LDH蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。该多肽是本发明人从粘质沙雷氏菌(S.marcescens)H3010的基因组DNA中克隆到的D-乳酸脱氢酶，其开放阅读框(ORF)993bp(SEQ IDNO：1和图1)，编码330个氨基酸(SEQ ID NO：2和图2)。经生物信息学分析表明，该分子中含有18个S原子，由12个β-折叠和13个α-螺旋组成，该酶分子量为约36kDa(理论值36466.8Da)，理论等电点pI为5.55。

本发明人还利用现有的pET28a(+)表达系统，成功的在E.coli BL21DE3中实现了对D-乳酸脱氢酶的高效表达，得到了大部分以可溶性形式存在的D-乳酸脱氢酶，构建的表达质粒pET-ldh的N末端有6个组氨酸(His6)融合标记，因此选择Ni柱亲和层析的方法进行分离纯化，最后得到高纯度的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)，酶活为322.9U/mg(测定条件为37℃，pH 7.0)。

测定酶的热稳定性发现，D-乳酸脱氢酶在高于50℃的环境里极易失活，而测反应最适温度为60℃(反应30s内)。该酶在pH7.0左右最为稳定，而反应最适pH为7.5。二价金属阳离子Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺对酶仅有很弱的抑制作用，Zn²⁺和Ba²⁺抑制作用最弱，然而Cu²⁺和Fe²⁺的抑制作用较强。动力学研究显示，底物丙酮酸浓度超过30mmol/L时对酶的抑制作用逐渐增强，而辅酶NADH浓度高于0.5mmol/L时对酶具有很强的抑制作用，当其浓度达到1.0mmol/L时酶的表观活力变为0。D-乳酸脱氢酶对底物丙酮酸的Km＝3.39mmol L^-1，对辅酶NADH的Km＝1.43mmol L^-1，D乳酸脱氢酶对辅酶NADH的亲和力大于对底物丙酮酸的亲和力。通过HPLC成功检测到异源表达的D-LDH催化底物丙酮酸(pyruvate)生成手性产物D-乳酸。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的D-乳酸脱氢酶可以价格低廉的丙酮酸作为底物，高效地生产价格比L-乳酸昂贵8-10倍的D-乳酸，因而具有巨大的应用前景。

(b)本发明的D-乳酸脱氢酶的活性可以用二价的铜离子或铁离子方便地进行调控。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1粘质沙雷氏菌基因组DNA的提取

按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Biodev，北京)抽提处于对数生长期的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)H3010(购自ATCC)的基因组DNA，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。

实施例2D-乳酸脱氢酶基因的克隆，表达质粒的构建及诱导表达

1.D-乳酸脱氢酶基因的克隆

合成以下引物LDHf和LDHr，引物序列为：

LDHf：5’-CCCATATGAAATTGGCGATATC-3’(SEQ ID NO：3)；

LDHr：5’-TCAGGCGTTCAGCTGGTTC-3’(SEQ ID NO：4)

以实施例1获得的粘质沙雷氏菌的基因组DNA为模板，扩增沙雷氏菌基因。

PCR扩增体系为：基因组DNA 2μl，引物LDHf和LDHr各2μl，dNTP1.6μl，10×Tag缓冲液2μl，TAKARA Tag聚合酶0.4μl，ddH₂O 10μl。

PCR反应程序为：97℃预变性5min，95℃变性30s，56.5℃退火1.5min，循环30次，72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，部分结果如图3所示。

将扩增条带切胶后用博大泰克公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于购自TaKaRa公司的pMD18-T载体，形成载体pMD-ldh，并转化常规的大肠杆菌JM83。通过在氨苄青霉素LB平板上进行筛选并结合酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在上海英骏生物技术公司进行序列测定。

计算机分析表明，克隆得到的D-乳酸脱氢酶基因ORF如SEQ ID NO：1所示，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO：2所示)。此蛋白质被命名为D-LDH蛋白，其编码基因命名为D-LDH蛋白基因。

D-LDH cDNA为1757bp(图1和SEQ ID NO：1)，含有完整的开放性读框990bp，编码含330氨基酸残基的多肽(图2和SEQ ID NO：2)。该蛋白含有18个S原子，由12个β-折叠和13个α-螺旋组成，该酶分子量为约36kDa(理论值36466.8Da)，理论等电点pI为5.55。与大多数已知的D-乳酸脱氢酶同源性较低。

综上所述，D-LDH蛋白为一未见报道的新型D-乳酸脱氢酶。

实施例3D-乳酸脱氢酶表达系统的构建

培养重组菌JM83/pMD-ldh，碱法抽提质粒，用限制性内切酶BamHI、NdeI双酶切，经胶回收试剂盒回收的1.0kb大小的外源片段再与经限制性内切酶BamHI、NdeI双酶切胶回收的pET-28a(+)载体在T4DNA Ligase的作用下连接，可得到质粒pET-ldh，构建程序如图4所示。

对构建好的pET-ldh进行XbaI酶切(重组质粒上有两个XbaI酶切位点)验证，应得到1.1kb和5.2kb大小两个片段，而以载体pET-28a(+)为对照时应只出现5.4kb的线性化片段，如图5所示。为正确构建了pET-ldh表达质粒。

实施例4D-LDH蛋白的重组表达

1.宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备

用牙签挑取少许宿主菌BL21(DE3)保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于30ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，按1％接种量将BL21(DE3)培养液接种于30ml培养基中，37℃摇床培养1～2h至OD₆₀₀≈0.4，收菌，4℃恒温，6000rpm离心10min，将菌体沉淀置于冰水浴中，用5ml的10mmol/L CaCl₂(冰冻)混匀洗涤一次，4℃恒温，6000rpm离心10min，沉淀用1ml的75mmol/L CaCl₂(冰冻)混匀悬浮，4℃放置8h再进行转化。

2、pET-ldh转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)

从4℃冰箱取出放置8h以上的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，手心融化，取出100μL至新的eppendorf管中，迅速置于冰水浴中，加入10μL构建好的质粒pET-ldh，轻轻混匀，冰水浴中放置30min，42℃水浴脉冲2min，快速转移至冰水浴中放置1～2min，加入900μL LB培养基，37℃摇床复苏培养1～1.5h，吸取100μL转化液涂布于卡那青霉素终浓度为50μg/μL的LB固体培养基上，37℃倒置培养12～16h，挑选出单菌落划线扩增。进一步抽质粒酶切鉴定，将含有质粒pET-ldh的E.coli BL21(DE3)测序，测序结果显示开放阅读框(ORF)序列正确。这表明，得到了含有表达质粒pET-ldh的表达菌株。

3、D-乳酸脱氢酶的诱导表达

将重组大肠杆菌BL21/pET-ldh接种于添加适当抗生素的LB液体培养基中(LB培养基组成为：酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH7.0)，37℃摇床培养过夜；再以1％的接种量转接到装有30mL LB培养基的250mL摇瓶中，以野生菌BL21(DE3)为阴性对照，分别培养至OD₆₀₀≈0.6时，加入0.8mmol/L诱导剂IPTG于37℃摇床培养，在诱导4.5h时取样，离心收集菌体，进行全菌SDS-PAGE电泳。

结果如图6所示，表明基因工程菌表达出了D-乳酸脱氢酶，图中泳道M为标准蛋白分子量(自上而下的条带分别为97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3kDa)。在29.0kDa和44.3kDa间表达出了一条明显的蛋白条带，分子量大小与预测值相符。这表明，酶已成功表达。

实施例5D-乳酸脱氢酶的分离纯化

1.可溶性D-乳酸脱氢酶粗酶液的获得

将含有重组表达质粒pET-ldh的大肠杆菌BL21(DE3)以1％的接种量接入卡那青霉素(Kan)终浓度为50μg/mL的30mL LB培养基当中，37℃摇床培养过夜(约12～16h)，再以1％的接种量接入卡那青霉素(Kan)终浓度为50μg/mL的150mL LB培养基当中，37℃摇床培养至OD₆₀₀≈0.6时加入0.8mmol/L诱导剂IPTG，再于20℃摇床培养4h(此优化后的诱导条件可以保证表达的重组蛋白大部分以可溶性形式存在)，收集菌体，以8000rpm离心5min，去上清。再用磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤菌体两次，最后用咪唑终浓度为20mmol/L的30mL磷酸缓冲液(pH 7.0)悬浮菌体(粗酶液中含一定浓度的咪唑有助于亲和层析时减少非特异性结合的蛋白与柱结合)，以功率200w，超声3s，间隔3s，超100次的条件破碎菌体至菌悬液通透，此时再于4℃下以15000rpm高速离心15min，保留上清即为目的蛋白D-乳酸脱氢酶粗酶液。

2.可溶性D-乳酸脱氢酶粗酶液的亲和层析

根据所构建的重组表达质粒pET-ldh所带6个组氨酸(6×His)融合标记的特性，选择Ni柱做为层析柱，柱与Chromatography Data Acpuisition Unit CT-22检测器相接。为了得到效好的分离纯化效果，对该目的蛋白的Ni柱亲和层析做了一定条件的优化，最终选择Banding缓冲液含50mmol/L咪唑，Elution缓冲液含300mmol/L咪唑。以此优化后的亲和层析条件收集洗脱下来的较纯的重组D-乳酸脱氢酶酶液。

3.超滤浓缩D-乳酸脱氢酶纯酶液

经亲和层析纯化后的纯酶液中含有一定量的咪唑，NaCl盐，所以需要利用超滤的方法将这些小分子盐除去，以免对酶的稳定性造成影响，同时一些小于滤膜孔径的小分子杂蛋白也被滤出，使酶得到进一步纯化，最后可得浓缩后的D-乳酸脱氢酶。

实施例6D-乳酸脱氢酶的功能性反应鉴定

1、重组D-乳酸脱氢酶对底物的催化反应验证

经过上述的各步纯化得到较高纯度的D-乳酸脱氢酶，于磷酸缓冲液(pH 7.0)中加入终浓度为2.75mg/mL的底物丙酮酸(Pyruvate)和终浓度为17.74mg/mL的辅酶NADH，再加入200μL的纯酶液(约0.17mg)至总反应体系3.1mL，于37℃进行底物催化反应，分别在反应1h、3h、17h时取样，利用SB-Aq反向柱进行HPLC检测。

结果如图7所示，在1h、3h、17h产物乳酸的峰面积依次是659.4、1211.5、19160逐步增大，而反应物丙酮酸的峰面积是明显减小的。由此可知，随着反应的进行，反应产物乳酸不断生成，其与反应底物丙酮酸的比值逐步变大，特别在反应17h后，乳酸产量明显增大很多。由此充分说明从S.marcescens H3010中发现的D-乳酸脱氢酶基因所表达的该D-乳酸脱氢酶确实有将丙酮酸催化生成乳酸的功能。

2、手性产物D-乳酸生成的检验

在验证了该D-乳酸脱氢酶能够将丙酮酸转化生成乳酸后，需要进一步证实的是所产乳酸为D型乳酸而非L型乳酸。于上一反应中0h(未加酶)和25h(加酶反应)取样，利用Chirobiotic R手性柱进行检测。

结果如图8所示。由图中第I幅图可知D-乳酸出峰时间为3.7min，在0h和25h产物D-乳酸的峰面积依次是3765.2、21977.3明显增大。因为使用该柱检测时，丙酮酸在D-乳酸的出峰处均有干扰，更换流动相或变换双流动相配比，以及改变流速均无法很好的在此柱上将丙酮酸，D-乳酸三种物质的吸收峰分开，所以在0h未反应时此处便有检测峰，而通过反应后25h的检测结果可以看出，在D-乳酸出峰处物质的量大大增加，而由此前经SB-Aq柱检测得出的结论可知该处增长的是产物乳酸。与消旋乳酸标品比较，可以确定反应所生成的乳酸为D型而非L型，因其在L-乳酸出峰时间未检测到任何物质的存在。

实施例7D-乳酸脱氢酶酶学性质的研究

1、酶的热稳定性

将用磷酸缓冲液(pH 7.0)稀释的纯酶液分为等量的几管，分别放置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃水浴锅中，每隔10min分钟从各个温度下的水浴锅中取相等量的酶液出来，于37℃，pH 7.0磷酸缓冲液中测定酶活力，最后一个样取到40min，以0min时所测酶活力为100％。

结果如图9所示。D-LDH在≥50℃的温度中，第10min时便几乎完全失活(因60℃和70℃的结果与50℃同，所以未列出)，在40℃中保存10min，酶活仅剩50％，40min时酶活所剩已不足10％。在30℃下保存40min，酶活约丧失一半。在20℃下保存40min酶活基本没有损失，残余酶活在90％以上。因而该D-乳酸脱氢酶的热稳定性不是很好，需要在20℃以下保存，否则容易失活。

2、温度对D-乳酸脱氢酶反应的影响

将一定量的D-乳酸脱氢酶液加入预热于不同温度的混合有底物丙酮酸和辅酶NADH的磷酸缓冲液(pH7.0)中，混均，测定30s内的酶活力，以所测酶活力最高时温度所对应的酶活力为100％。

结果如图10所示。在20℃-60℃范围内，乳酸脱氢酶活性随温度的升高而提高，其最适反应温度为60℃，当反应温度超过60℃时，反应速度比60℃时稍有降低，但由之前的D-乳酸脱氢酶热稳定性实验结果可知，随着温度的提高，温度诱导的酶失活速率也在提高，所以在≥60℃高温下反应，30s之后乳酸脱氢酶急速失活。所以，温度既能改变酶反应本身的速度，也能导致酶蛋白变性失效，因此这种“最适温度”与反应时间密切相关，在此设定的时间为30s之内。综合粘质沙雷氏菌(S.marcescens H3010)D-乳酸脱氢酶的这种温度影响特性，可知不适合在最适反应温度的条件下进行底物丙酮酸的催化反应生产D-乳酸，最好在30-40℃进行，这样可以保证酶的稳定性使酶反应持续进行。

3、pH对酶稳定性的影响

将D-乳酸脱氢酶于不同pH的缓冲液中，4℃保存24h，在37℃，pH 7.0条件下测定酶活力，以酶活最高时pH所对应的酶活力为100％。

结果见图11所示。可见该酶在pH 6.5-8.0最为稳定，酶活损失均不到5％，其中pH 7.0左右最稳定。

4、pH对D-乳酸脱氢酶反应的影响

将底物丙酮酸和辅酶NADH混合于不同pH的磷酸缓冲液中，于37℃预热2min，再将一定量的D-乳酸脱氢酶液加入反应体系中混均，测定酶活，以酶活力最高时pH所对应的酶活力为100％。

结果如图12所示。该D-乳酸脱氢酶在pH 7.0-8.5范围内酶活较高，均在70％以上，其最适pH为7.5，当pH＜6或pH＞8.5时，酶活性急剧下降。

5、金属离子对酶稳定性的影响

分别于酶液中加入终浓度为2mmol/L的二价金属离子Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、室温放置15min，使之充分结合后，然后分别在37℃，pH7.0的磷酸缓冲液中测定酶活，以未加入金属离子的酶反应为对照，设其酶活力为100％。

结果如图13所示。Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺对酶仅有很弱的抑制作用；Zn²⁺和Ba²⁺抑制作用最弱，酶活损失不到5％，而Cu²⁺和Fe²⁺均有较强的抑制作用，其中与Fe²⁺相互作用后的酶活力只有对照的1.53％。

实施例8D-乳酸脱氢酶酶反应动力学的影响

1、底物丙酮酸浓度对酶活力的影响

设定反应体系中不同的底物丙酮酸终浓度，将一定量的酶加入反应体系，于37℃，pH7.0的磷酸缓冲液中测定酶活。

结果如图14所示。酶活力可以体现出反应速率，可见，当底物丙酮酸浓度低于5mmol/L时，其浓度为酶反应的限制因素，结果显示为一级反应动力学，酶活力随底物浓度呈正比例增加。当底物丙酮酸浓度超过5mmol/L时，由于底物开始渐渐过量，不再是酶反应的限制因素，此时酶达到饱和，酶反应速度渐缓，随着底物浓度进一步的提高，酶反应速度不再增加，呈现出零级反应动力学。当底物丙酮酸浓度超过30mmol/L时，由于过多的底物与酶、底物、辅酶的复合中间体相结合，从而抑制了复合中间体释放出底物，而使酶呈现饱和状态，因此酶反应速率反而下降。

2、D-乳酸脱氢酶D-LDH对底物丙酮酸的动力学参数

于图12中的直线范围内取几点对应的底物丙酮酸浓度与其对应的反应速度，按Lineweaver-Burk法以1/V对1/[S]作图得图15。可求得D-LDH在37℃，pH＝7.0，0.2mol/L磷酸缓冲体系中对丙酮酸的米氏常数Km为3.39mmol/L，Vmax＝0.94mmol/(L·min)。以催化所用的纯酶量来表示为Vmax＝6.87mmol/(mg·min)

3、辅酶NADH浓度对酶活力的影响

设定反应体系中不同的辅酶NADH终浓度，将一定量的酶加入反应体系，于37℃，pH7.0的磷酸缓冲液中测定酶活。

结果如图16所示。酶活力可以体现出反应速率，可见，当辅酶NADH浓度低于0.4mmol/L时，其浓度为酶反应的限制因素，结果显示为一级反应动力学，酶活力随辅酶NADH浓度呈正比例增加。当辅酶NADH浓度介于0.4～0.5mmol/L之间时，酶反应速度渐缓。当辅酶NADH浓度超过0.5mmol/L且进一步的提高，酶活力迅速下降，直至辅酶NADH浓度超过1.0mmol/L时，酶活力几乎为0，即酶不再表现出反应速度，这表明高于一定浓度(在此为0.5mmol/L)的辅酶NADH对酶具有很强的抑制作用，这是由于过多的辅酶NADH与酶、底物、辅酶的复合中间体相结合，阻止其释放出底物，而使酶呈现饱和状态，从而酶的催化能力被强烈抑制。

4、D-乳酸脱氢酶D-LDH对辅酶NADH的动力学参数

于图16中的直线范围内取几点对应的辅酶NADH浓度与其对应的反应速度，按Lineweaver-Burk法以1/V对1/[S]作图得图17。可求得D-LDH在37℃，pH＝7.0，0.2mol/L磷酸缓冲体系中对辅酶NADH的米氏常数Km为1.43mmol/L，Vmax＝0.22mmol/(L·min)。以催化所用的纯酶量来表示为Vmax＝1.61mmol/(mg·min)。

实施例9抗D-LDH蛋白抗体的产生

将实施例4中获得的重组粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀粘质沙雷氏菌D-LDH蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例10

D-乳酸脱氢酶变异体的制备

重复实施例3和4，不同点在于，用定点突变的方法改变SEQ ID NO：1的核苷酸序列，从而制得以下D-乳酸脱氢酶变异体。

变异体a：SEQ ID NO：2中第3位的Leu被Ile替换的变异体；

变异体b：SEQ ID NO：2中第4位的Ala被缺失的变异体；

变异体c：SEQ ID NO：2中第4位和第5位之间添加Leu的变异体。

对于重组获得的上述变异体a-c的活性测定表明，这些变异体都能够催化丙酮酸形成D-乳酸，活性与野生型(SEQ ID NO：2)相近，酶活为300-350U/mg(测定条件为37℃，pH 7.0)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>华东理工大学

<120>粘质沙雷氏菌D-乳酸脱氢酶基因，克隆、表达重组菌株及重组酶的研究

<130>092019

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(990)

<400>1

atg aaa ttg gcg ata tac agt acc aaa cag tat gac cgt aaa tac ctc    48

Met Lys Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Arg Lys Tyr Leu

1               5                   10                  15

gaa ctg gtg aac cag cag ttt ggc tat gag ctg gaa ttc ctc gac ttt    96

Glu Leu Val Asn Gln Gln Phe Gly Tyr Glu Leu Glu Phe Leu Asp Phe

            20                  25                  30

tta ctc agt aaa aaa acc gcc aaa acg gcc gcc ggt tgc aag gcg gtg    144

Leu Leu Ser Lys Lys Thr Ala Lys Thr Ala Ala Gly Cys Lys Ala Val

        35                  40                  45

tgt atc ttc gtc gac gac gac ggc agc cgt gaa gtg ctc gaa gaa ctg    192

Cys Ile Phe Val Asp Asp Asp Gly Ser Arg Glu Val Leu Glu Glu Leu

    50                  55                  60

gcg gcg ctg ggc gtc gaa att ctc gcc ctg cgc tgc gcc ggt ttt aat    240

Ala Ala Leu Gly Val Glu Ile Leu Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn

65                  70                  75                  80

aac gtc gat ctg gac gcc gcc aaa gaa ctg ggc atc aag gtg gtg cgc    288

Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Lys Val Val Arg

                85                  90                  95

gtg ccg gcc tac tcg ccg gag gcc gtg gcg gaa cac gcg gta ggc atg    336

Val Pro Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Val Gly Met

            100                 105                 110

atg atg tgc ctg aac cgc cgt att cac cgc gct tat cag cgt acc cgt    384

Met Met Cys Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg

        115                 120                 125

gac gcc aac ttc tcg ctg gaa ggg ctg atc ggt ttt aac atg cac aat    432

Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Ile Gly Phe Asn Met His Asn

    130                 135                 140

cgc acc gcc ggc gtg atc ggc acc ggt aaa atc ggc gtg gcg aca atg    480

Arg Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Ala Thr Met

145                 150                 155                 160

cgc att ctg aaa ggc ttc ggc atg aag ctg ctg gcc tac gat ccg ttc    528

Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Lys Leu Leu Ala Tyr Asp Pro Phe

                165                 170                 175

ccg agc gaa cag gcg ctg gaa ctg ggc gcg gag tat gtc gat ctg aag    576

Pro Ser Glu Gln Ala Leu Glu Leu Gly Ala Glu Tyr Val Asp Leu Lys

            180                 185                 190

acg ctg tac gcg caa tcc gac gtg atc acc ctg cac tgc ccg ctg acg    624

Thr Leu Tyr Ala Gln Ser Asp Val Ile Thr Leu His Cys Pro Leu Thr

        195                 200                 205

ccg gag aac cac cat ttg ctg aat gcc gac gcc ttc gcg atg atg aaa    672

Pro Glu Asn His His Leu Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ala Met Met Lys

    210                 215                 220

aac ggc gta atg gtg atc aac acc agc cgc ggc gcg ctc atc gac tcc    720

Asn Gly Val Met Val Ile Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser

225                 230                 235                 240

acc gcc gcc atc gat gcg ctg aag cag caa aaa atc ggc gcc ctc ggg    768

Thr Ala Ala Ile Asp Ala Leu Lys Gln Gln Lys Ile Gly Ala Leu Gly

                245                 250                 255

atg gac gtc tac gag aac gaa cgc gac ctg ttc ttt gag gac aag tct    816

Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser

            260                 265                 270

aac gac gtg att cag gat gac gtg ttc cgc cgc ctg tcg gcc tgc cac    864

Asn Asp Val Ile Gln Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His

        275                 280                 285

aac gtg ctg ttc acc ggc cat cgg gct ttc ctg acc gaa gag gcg ttg    912

Asn Val Leu Phe Thr Gly His Arg Ala Phe Leu Thr Glu Glu Ala Leu

    290                 295                 300

acc agc att tcc caa acc acg ctg cag aac atc agc cag ttg gat cgc    960

Thr Ser Ile Ser Gln Thr Thr Leu Gln Asn Ile Ser Gln Leu Asp Arg

305                 310                 315                 320

ggc gaa gcc tgc ccg aac cag ctg aac gcc tga                        993

Gly Glu Ala Cys Pro Asn Gln Leu Asn Ala

                325                 330

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

<400>2

Met Lys Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Arg Lys Tyr Leu

1               5                   10                  15

Glu Leu Val Asn Gln Gln Phe Gly Tyr Glu Leu Glu Phe Leu Asp Phe

            20                  25                  30

Leu Leu Ser Lys Lys Thr Ala Lys Thr Ala Ala Gly Cys Lys Ala Val

        35                  40                  45

Cys Ile Phe Val Asp Asp Asp Gly Ser Arg Glu Val Leu Glu Glu Leu

    50                  55                  60

Ala Ala Leu Gly Val Glu Ile Leu Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn

65                  70                  75                  80

Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Lys Val Val Arg

                85                  90                  95

Val Pro Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Val Gly Met

            100                 105                 110

Met Met Cys Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg

        115                 120                 125

Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Ile Gly Phe Asn Met His Asn

    130                 135                 140

Arg Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Ala Thr Met

145                 150                 155                 160

Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Lys Leu Leu Ala Tyr Asp Pro Phe

                165                 170                 175

Pro Ser Glu Gln Ala Leu Glu Leu Gly Ala Glu Tyr Val Asp Leu Lys

            180                 185                 190

Thr Leu Tyr Ala Gln Ser Asp Val Ile Thr Leu His Cys Pro Leu Thr

        195                 200                 205

Pro Glu Asn His His Leu Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ala Met Met Lys

    210                 215                 220

Asn Gly Val Met Val Ile Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser

225                 230                 235                 240

Thr Ala Ala Ile Asp Ala Leu Lys Gln Gln Lys Ile Gly Ala Leu Gly

                245                 250                 255

Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser

            260                 265                 270

Asn Asp Val Ile Gln Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His

        275                 280                 285

Asn Val Leu Phe Thr Gly His Arg Ala Phe Leu Thr Glu Glu Ala Leu

    290                 295                 300

Thr Ser Ile Ser Gln Thr Thr Leu Gln Asn Ile Ser Gln Leu Asp Arg

305                 310                 315                 320

Gly Glu Ala Cys Pro Asn Gln Leu Asn Ala

                325                 330

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>3

cccatatgaa attggcgata tc    22

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>4

tcaggcgttc agctggttc        19