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法律状态
2015-12-16
专利权的转移 IPC(主分类):C12N5/071 登记生效日:20151124 变更前: 变更后: 申请日:20100610
专利申请权、专利权的转移
2013-03-13
授权
授权
2010-11-24
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/071 申请日:20100610
实质审查的生效
2010-10-13
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程领域，特别是涉及生物反应器、细胞组织工程、活性人工皮肤大规模产业化生产含有活化素A的无血清培养液。
背景技术
皮肤是人体最大的组织器官，也是人体最重要的器官之一，它主要有三部分组成，即最外面的表皮层，中间的真皮层和最下面的皮下组织构成。表皮层和真皮层之间含有基底膜，皮肤组织工程经历了从表皮替代物、真皮替代物到具有双层结构的复合组织工程皮肤的阶段，有关基础研究及应用研究有了很大的进展，但如何能够大规模地产业化地体外生产组织工程皮肤，一直是一个挑战，难题至今没能解决。阻碍了组织工程皮肤的临床应用及产业化。
目前，市场上还没有应用于生物反应器大规模产业化生产组织工程活性皮肤的培养液。目前现有的实验室用于组织工程皮肤研究的培养液在试剂的稳定性、细胞培养效果及细胞培养的时间等方面存在明显的不足。而且配制过程使用过程操作繁琐复杂，不能用于大规模皮肤细胞的培养，经检索，具有高稳定性，操作简单，能够用于生物反应器大规模及产业化生产组织工程活性人工皮肤的培养液至今还没有见到公开资料。
虽然目前有各种细胞培养液，但这些培养液一是成本高，二是不能用于大规模地产业化地生产和培养。含有活化素A的本培养液及其配制方法目前没有报道。
生物组织工程学是应用生命科学和组织工程学的原理与方法，研究发展用于修复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的一门新兴学科。是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一个新的里程碑。生物组织工程的核心，是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，其具体方法是将体外培养的高浓度的与功能相关的活细胞种植于细胞外基质上(ECM)，然后移植到动物体内达到新的有功能的组织目的。与传统的方法相比较，其最大的优点在于：(1)形成具有生命力的活体组织，对损伤或病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代；(2)可以用较少量的组织细胞(种子细胞)经体外培养扩增后，来修复大块的组织缺损；(3)可按组织、器官缺损情况任意塑形，达到完美的形态修复。
将组织工程学应用于人工皮肤的研发和生产，将会带来极大的社会效益和经济效益。据WHO统计，中国每年约有九百万烧烫伤病人的抢救治疗是目前临床上一大挑战，特别是目前经济处于快速发展和转型时期，工伤和意外事故频繁发生，常常导致人体大面积烧烫伤的发生。由于大面积深度烧烫伤，过多的全层皮肤毁坏，而导致屏障功能丧失及及免疫调节失衡，产生感染，水电解质系乱等造成病人因脓毒症和脏器功能衰竭而死亡。因此，早期创面覆盖和皮肤移植以减轻脱水和预防感染是目前临床上抢救治疗大面积烧烫伤病人的主要措施。对于大面积烧烫伤病人，由于自体健康皮肤有限，临床上最初采用猪皮或异体人类皮肤作为移植材料。但是免疫排斥反应使得移植皮肤难以成活。由此可见，烧烫伤病人皮肤移植所面临的挑战是皮源的紧张和免疫排斥反应。
自体皮源不足是大面积烧烫伤病人救治过程中的难题。尽早在功能和外观上修复创面对降低大面积烧烫伤病人的死亡率，提高生存质量和重返社会极为重要。因此，尽快地突破组织工程人工皮肤大规模研发和生产的瓶颈，是关系到整个人类社会和经济发展的大事情。该培养液的问世，从技术上解决了人工皮肤大规模化生产的难题，将极大地推动活性人工皮肤的发展。目前已研制出各种不同功能的人工皮肤替代品，部分已经商品化并应用于临床。
皮肤由表皮，真皮和皮下组织组成，是人体最大的组织器官，也是人体最重要的器官之一，它最重要的功能是屏障功能，保护人体免受外界的伤害，同时具有温度调节，感觉，防止紫外线辐射等其他重要的功能。烧烫伤是一种常见的创伤，特别是大面积烧烫伤，如果得不到及时的救治，病人将会发生体液流失，外来菌体入侵，因感染而死亡，而目前烧烫伤还没有有效的治疗方法。烧烫伤最主要的治疗手段就是皮肤移植，而大面积烧烫伤病人缺乏自己可利用的皮肤，没有足够的皮肤覆盖，将会危及病人的生命及引起一系列的并发症。
组织工程人工培养皮肤是一门具有非常广阔市场前景的学科，它解决了烧烫伤病人自体皮源不足的难题，但是没有很好的皮肤细胞培养液，限制组织工程皮肤的发展，现有的皮肤细胞培养液，不能进行大规模地组织工程皮肤生产及培养，往往仅限于实验室小规模地培养，且细胞培养的周期长，成本大，耗材高，细胞的传代能力也很短暂，而本发明解决了上述问题，是第一次公开了这种培养液可以用于大规模地组织工程皮肤培养及生产，该培养液也可以应用于生物器技术进行大规模地生产和培养。本发明的培养液配方解决了组织工程皮肤大规模生产的瓶颈问题，培养液配方在本领域是空白，经检索，尚未发现用于皮肤产业化生产的含有活化素A的这种培养液的配方。本发明的培养液可用于生物反应器，进行皮肤细胞培养，能进行大规模地产业化生产，降低生产成本。同时也可用于无血清培养，这样生产出来的产品更加安全，同时也降低了生产成本，配制的培养液保存期更长，可以长期保存，能够大规模地生产和配制。
本发明还第一次公开了将活化素A用于人类皮肤细胞培养液，经检索，没有任何人将活化素A加入培养液当中，因此具有很强的创新性。
活化素A又称为激活素A、转化生长因子A，是在两栖动物胚胎中发现的中胚层诱导因子，其生理功能相当广泛，包括中胚层诱导，血管再生，细胞分化等(参见附后的相关参考文献)。
现有培养液的缺点一是现配现用，时效性很差。二是含有小牛血清，成本高，风险大，容易导致疾病的传播，比如疯牛病等。三是不包括我们培养液的特有物质，因此皮肤细胞非常容易分化，细胞生长缓慢。四是培养液本身不能进行大规模地产业化配制。五是现有的培养液不能应用于生物反应器技术。六是不能大规模地进行组织工程皮肤的产业化生产，这是制约组织工程皮肤产业化的瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性高，操作简单，能够大规模地进行皮肤细胞培养的培养液及其配制方法，以及使用该培养液进行细胞培养后得到组织工程皮肤的方法。本发明的另一个目的是在培养液中加入一种防止皮肤细胞早期分化的物殊物质活化素A(即转化生长因子A)。
本发明用于大规模组织工程皮肤培养的培养液含有如下组分：细胞生长因子3-30ng/mL、胰岛素2-30μg/mL、氢化可的松0.2-0.6μg/mL、垂体提取物3-30μg/mL、钙离子0.5-5.5mmol/L、转铁蛋白3-30μg/mL、青霉素20-60U/mL、链霉素20-60mg/mL、活化素A 0.1-0.9ng/mL。该培养液的具体配制方法如下：第一步，将商用的F12粉剂和DMEM粉剂分别配制成F12培养液和DMEM培养液；第二步，将得到的两种培养液按照F12培养液体积百分数为15-25％、DMEM培养液体积百分数为75-85％且两者的体积百分数总和为100％的比例进行充分混合得到两者的混合液，其中所用F12和DMEM培养液的比例分别在上述范围内自由选择；第三步，在得到的混合液中加入细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、垂体提取物、可溶钙盐、转铁蛋白、青霉素、链霉素和活化素A，使最终得到的混合培养液中各组分的含量如下：细胞生长因子3-30ng/mL、胰岛素2-30μg/mL、氢化可的松0.2-0.6μg/mL、垂体提取物3-30μg/mL、可溶钙盐0.5-5.5mmol/L、转铁蛋白3-30μg/mL、青霉素20-60U/mL(U：unit单位)、链霉素20-60mg/mL、活化素A 0.1-0.9ng/mL，其中可溶钙盐为氯化钙。
其中将商用的F12粉剂配制成F12培养液的方法如下：(1)制备新鲜三蒸水或Millipore超纯水；(2)称取所需量的干粉培养基，加入终体积一半的三蒸水中，磁力搅拌或人工搅拌搅拌使之完全溶解；(3)补加碳酸氢钠；(4)加水定容到终体积；(5)用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节PH；(6)用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存；将商用的DMEM粉剂配制成DMEM培养液的方法如下：(1)制备新鲜三蒸水或Millipore超纯水；(2)称取所需量的干粉培养基，加入终体积一半的三蒸水中，磁力搅拌或人工搅拌搅拌使之完全溶解；(3)补加碳酸氢钠；(4)加水定容到终体积；(5)用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节PH；(6)用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。
本发明所说的培养液可以广泛地用于大规模地皮肤组织工程皮肤生产中，本发明具有以下创新点：
一是本发明的培养液不含有小牛血清，培养液的稳定性强，保质期长达24个月左右，而目前实验室现有的培养液只能现配现用。因此本发明的培养液也可以进行产业化生产。
二是本配方不含有小牛血清，因此大大降低了生产成本。
三是本配方不含有小牛血清，因此生产出来的产品更加安全。由于受疯牛病的影响，不同来源的小牛血清有可能存在被污染的可能性，科学界和工业界一直对使用小牛血清进行用于人体产品的生产存在争议。由于本配方不含有小牛血清，所以生产出来的人工皮肤会更加地安全。
四是由于该培养液含有特殊的物质活化素A，可使皮肤细胞保持在未分化阶段，细胞的增生能力非常强，使细胞培养的周期大大缩短。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，结合以下实例具体描述培养液的配制方法：
第一步，将商用的F12粉剂和DMEM粉剂分别配制成F12培养液和DMEM培养液；
第二步，将得到的两种培养液按照F12培养液体积百分数为15-25％、DMEM培养液体积百分数为75-85％且两者的体积百分数总和为100％的比例进行充分混合得到两者的混合液，其中所用F12和DMEM培养液的比例在上述范围内自由选择；
第三步，在得到的混合液中加入细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、垂体提取物、可溶钙盐、转铁蛋白、青霉素、链霉素、活化素A，使最终得到的混合培养液中各组分的含量如下：细胞生长因子3-30ng/mL、胰岛素2-30μg/mL、氢化可的松0.2-0.6μg/mL、垂体提取物3-30μg/mL、钙离子0.5-5.5mmol/L、转铁蛋白3-30μg/mL、青霉素20-60U/mL(U：unit单位)、链霉素20-60mg/mL、活化素A 0.1-0.9ng/mL，其中可溶钙盐为氯化钙。
商用的F12粉剂(即F12干粉培养基)的成分为：
[0027]F12培养液的配制方法为：
1、制备新鲜三蒸水或Millipore超纯水。
2、称取所需量的干粉培养基，加入约终体积一半的三蒸水中，若配制一个包装的培养液，在将整个包装的干粉倒入三蒸水后，需用水洗包装袋内面2次，倒入培养液中，以保证所有的干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌搅拌使之完全溶解。
3、根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠；
4、加水定容到终体积。
5、必要时用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节PH。
6、用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。
商用的DMEM粉剂(即DMEM干粉培养基)的成分为：
DMEM培养液的配制方法为：
1、制备新鲜三蒸水或Millipore超纯水。
2、称取所需量的干粉培养基，加入约终体积一半的三蒸水中，若配制一个包装的培养液，在将整个包装的干粉倒入三蒸水后，需用水洗包装袋内面2次，倒入培养液中，以保证所有的干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌搅拌使之完全溶解。
3、根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠；
4、加水定容到终体积。
5、必要时用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节PH。
6、用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。
大规模地培养合成得到组织工程皮肤
将皮肤干细胞和生物支架材料复合后用该培养液在35-38℃、3-6％二氧化碳环境下进行皮肤产品的合成，即得组织工程皮肤。
获得组织工程皮肤生产许可证
根据本发明培养液配方生产出来的组织工程皮肤产品制定了组织工程活性人工皮肤的产品标准，经国家食品药品监督管理局认证，现已取得应用本培养液配方生产组织工程活性人工皮肤的三类医疗器械生产许可证证书。(证书编号：苏食药监械生产许2010-0033号)
相关效果
由于本培养液中不含胎牛血清，一瓶500ml的胎牛血清价格在2000-4000元人民币之间，所以成本大大降低。
另外，由于本培养液含有特有物质活化素A，所以细胞活性，传代能力以及培养周期都比同类的其它培养液要有更大的优势。相关数据见下表：
[0051]可见，本发明的细胞活性很强，细胞传代能力增强，周期缩短，降低了成本。
以上所述的说明书内容仅仅是对本发明的最佳方案进行了描述，而不是对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明内容的前提下，本领域的科技及工程技术人员观看该说明书内容后可对培养液配方进行各种修改和变动，但任何修改、改进与变动都应落入本发明的权利要求书确定的保护范围之内。
附：相关参考文献
1、安丽，陈丽，赵平，激活素研究进展，医学综述，2005年第11卷第8期
2、Dov Zipori，Mira Barda-Saad，Role of activin A in negative regulation ofnormal and tumor B Lymphocytes，Journal of Leukocyte Biology，Volume 69，June 2001
3、CARLA DEMETERCO，GILLIAN M.BEATTIE，A Role for Activin A andBetacellulin in Human Fetal Pancreatic Cell Differentiation and Growth，TheJournal of Clinical Endocrinology &Metabolism，Vol.85，No.10，2000
4、Rebecca L.Jones，Lois A.Salamonsen，Activin A Promotes HumanEndometrial Stromal Cell Decidulization In Vitro，The Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism，2002，87(8)：4001-4004
5、YARON SHAV-TAL，DOV ZIPORI，The Role of Activin A in Regulation ofHemopoiesis ，STEM CELLS 2002；20：493-500
6、Yan Shi，Lingling Hou，Fuchou Tang，Inducing Embryonic Stem Cells toDifferentiate into Pancreatic βCells by a Novel Three-Step Approach withActivin A and All-Trans Retinoic Acid，Stem Cells 2005；23：656-662。
机译： 在哺乳动物中检测发作或易患病并监测通过调节激活素水平或生物活性而区分的病状的发作或进展，检测发作，易患病的形式或监测通过调制而区别的病况的方法活化素水平，调节异常细胞生长以及治疗和/或预防性病症或病症发展的易感性的指标，以不需要的，异常水平或其他不合适或活化素亚基的生物活性，组合物，诊断试剂盒和使用代理
机译： 含有特性不同的微生物并以其共生和代谢产物形式生活的微生物培养液，含有培养液活性成分的载体和吸附剂及其利用
机译： 在含有植物蛋白水解物的无血清细胞培养液中生产多肽
