抗刻缺蛋白1NRR抗体及其使用方法

摘要

本发明提供了抗刻缺蛋白1NRR抗体，及包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。

说明书

发明领域

一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体的说，本发明关注抗刻缺蛋白1负调节区(NRR)抗体，及其用途。

发明背景

刻缺蛋白(Notch)受体家族是一类进化上保守的跨膜受体，它们在多种生物体中(像海胆和人类)传送影响发育的信号。刻缺蛋白受体和及其配体家族德耳塔(Delta)和锯齿蛋白(Serrate)(在哺乳动物中也称作Jagged)，都具有大跨膜结构域(其含有表皮生长因子(EGF)样重复)的跨膜蛋白质。各物种间刻缺蛋白旁系同源物的数目有所不同。例如，哺乳动物中有四种刻缺蛋白受体(刻缺蛋白1-刻缺蛋白4)，秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中有两种(LIN-12和GLP-1)，而黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中有一种(刻缺蛋白)。刻缺蛋白受体在转运至细胞表面期间被弗林蛋白酶样蛋白酶在跨膜结构域以外的位点S1处蛋白水解切割，产生胞外刻缺蛋白(ECN)亚基和刻缺蛋白跨膜亚基(NTM)。这两个亚基仍然非共价结合并构成成熟异二聚体细胞表面受体。刻缺蛋白1 ECN亚基含有36个N端EGF样重复，接着是三个串联重复的Lin 12/刻缺蛋白重复(LNR)模块，之后是S1位点。每个LNR模块含有三个二硫键和一组保守的酸性和极性残基，预测这些残基与钙离子配位。在EGF重复区内有供活化性配体结合的位点。包含刻缺蛋白受体的一个独特结构域的LNR模块参与配体诱导的活化之前处于静息构象的刻缺蛋白的维持。刻缺蛋白1 NTM包含胞外区(其包含S2切割位点)、跨膜区段(其包含S3切割位点)、和大的胞内部分(其包含RAM域、锚蛋白重复、反式激活域和羧基末端PEST序列)。ECN与NTM亚基的稳定结合依赖于包含ECN的羧基末端(称作HD-C)和NTM的胞外氨基末端(称作HD-N)的异二聚化结构域(HD)。刻缺蛋白配体对ECN亚基的结合启动经由受调节的膜内蛋白水解发生的两步连续蛋白水解切割。金属蛋白酶在位点S2处的第一步切割使得刻缺蛋白跨膜亚基对接近质膜内小叶的位点S3处的第二步切割易感。由含有早老蛋白和呆蛋白的多蛋白复合物催化的位点S3切割释放刻缺蛋白跨膜亚基的胞内部分，容许它易位至细胞核并激活靶基因的转录。

已经在人类中鉴定出锯齿蛋白类和德耳塔样类的五种刻缺蛋白配体，即锯齿蛋白1(Jagged 1或Serrate 1)、锯齿蛋白2(Jagged 2或Serrate2)、德耳塔样1(Delta-like 1或DLL1)、德耳塔样3(Delta-like 3或DLL3)、和德耳塔样4(Delta-like 4或DLL4)。每种配体是单次跨膜蛋白质，具有对结合刻缺蛋白而言至关重要的保守的N端德耳塔、基质蛋白、LAG-2(DSL)基序。位于DSL基序C端的一系列EGF样模块位于跨膜区段之前。与刻缺蛋白受体不同，这些配体在C端具有70-215个氨基酸的短的胞质尾。另外，已经报告了其它类型的配体(例如DNER、NB3、和F3/接触蛋白)。

刻缺蛋白途径在多种发育和生理过程中发挥功能，包括那些在蝇和脊椎动物中影响神经发生的发育和生理过程。一般而言，刻缺蛋白信号传导涉及各群细胞间的侧抑制、边界确立和谱系决定(参见例如Bray，Molecular CellBiology 7：678-679，2006)。多种人类疾病(包括癌症和神经变性性病症)已经显示出源自编码刻缺蛋白受体或其配体的基因中的突变(参见例如Nam etal.，Curr.Opin.Chem.Biol.6：501-509，2002)。当在一个人类急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)子集中鉴定到创建人刻缺蛋白1的一种截短的、组成性有活性的变体的频发(recurrent)t(7；9)(q34；q34.3)染色体易位时候，首次认识到不受限制的刻缺蛋白信号传导与恶性肿瘤之间的联系。在小鼠模型中，刻缺蛋白1信号传导已经显示出对于T细胞发育而言是至关重要的，而且刻缺蛋白1介导的信号以B细胞发育为代价而促进T细胞发育。而且，在小鼠模型中，发育期间过量的刻缺蛋白信号传导导致T细胞瘤形成。

此外，刻缺蛋白受体在极其多种人类癌症和肿瘤衍生细胞系中表达，而且在人胚胎干细胞中促进神经命运。例如，刻缺蛋白在人宫颈癌细胞和人肾细胞癌细胞中高度表达。鉴于刻缺蛋白信号传导涉及极其多种人类疾病，清楚的是仍然需要能调节刻缺蛋白信号传导、具有最适于开发成治疗剂的临床属性的药剂。本文所述发明满足了此需求并提供了其它好处。

通过述及将本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)完整收入本文。

发明概述

本发明部分基于多种刻缺蛋白1负调节区(NRR)结合剂(诸如抗体，及其片段)的鉴定。刻缺蛋白1NRR代表了一种重要的且有利的治疗靶，而且本发明提供了基于结合刻缺蛋白1NRR的组合物和方法。如本文中所描述的，本发明的刻缺蛋白1NRR结合剂提供了重要的治疗剂和诊断剂，供靶向与刻缺蛋白1信号传导途径的表达和/或活性有关的病理性疾患中使用。因而，本发明提供了与刻缺蛋白1NRR结合有关的方法、组合物、试剂盒、和制品。

本发明提供了结合刻缺蛋白1NRR的抗体。在一个方面，本发明的特征是一种分离的结合刻缺蛋白1NRR的抗体。在一个具体的方面，本发明的特征是一种分离的抗刻缺蛋白1NRR抗体，其以1x10^-7或更强的Kd结合刻缺蛋白1NRR。在想要的实施方案中，所述抗刻缺蛋白1NRR抗体以1x10^-8或更强的Kd或1x10^-9或更强的Kd结合刻缺蛋白1NRR。在另一个方面，本发明提供了一种分离的抗刻缺蛋白1NRR抗体，其中所述抗体的全长IgG形式以1x10^-7或更强的Kd结合人和小鼠刻缺蛋白1NRR。如本领域完全确立的，配体对其受体的结合亲和力可以使用多种测定法来测定，而且以多种定量数值来表述。因而，在一个实施方案中，结合亲和力表述成Kd值，而且反映了内在结合亲和力(例如具有最小化的亲合效应)。通常且优选的是，结合亲和力是在体外测量的，无论是在无细胞背景下还是在细胞相关背景下。可以使用本领域已知的多种测定法之任一来获得结合亲和力测量，包括本文中所描述的测定法，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)、和ELISA。

在一个方面，本发明的特征是一种分离的抗刻缺蛋白1NRR抗体，其包含：

(a)至少一种、两种、三种、四种、或五种选自下组的高变区(HVR)序列：

(i)包含序列A1-A11的HVR-L1，其中A1-A11是RASQDVSTAVA(SEQID NO：7)

(ii)包含序列B1-B7的HVR-L2，其中B1-B7是SASFLYS(SEQ ID NO：8)

(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9是QQSYTTPPT(SEQ IDNO：9)

(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10是GFTFSSYWIH(SEQ IDNO：1)

(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18是ARINPSNGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：2)和

(vi)包含序列F1-F14的HVR-H3，其中F1-F14是ARGSGFRWVMDY(SEQ ID NO：6)；和

(b)至少一种变体HVR，其中该变体HVR序列包含SEQ ID NO：1-12所示序列的至少一个残基的修饰。所述修饰是替代、插入、或删除。

在想要的实施方案中，HVR-L3变体在以下位置的任意组合中包含1-4(1、2、3、或4)处替代：C3(S或F)，C4(Y或F)，C5(T或S)，和C8(P或A或S)。在另一个想要的实施方案中，HVR-H2变体在以下位置的任意组合中包含1-4(1、2、3或4)处替代：E6(S或P或A)；E8(G或R)；E10(T或A或N)；和E11(N或H或Q或R)。

在另一个方面，本发明的特征是一种分离的抗刻缺蛋白1NRR抗体，其包含一种、两种、三种、四种、五种、或六种HVR，其中每种HVR包含选自SEQ ID NO：1-12的序列、由选自SEQ ID NO：1-12的序列组成、或基本上由选自SEQ ID NO：1-12的序列组成，且其中SEQ ID NO：7对应于HVR-L1，SEQ IDNO：8对应于HVR-L2，SEQ ID NO：9、10、11、或12对应于HVR-L3，SEQ IDNO：1对应于HVR-H1，SEQ ID NO：2、3、4、或5对应于HVR-H2，而SEQ IDNO：6对应于HVR-H3。

在一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含HVR-H1区，该HVR-H1区包含序列SEQ ID NO：1。在一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含HVR-H2区，该HVR-H2区包含序列SEQ ID NO：2、3、4、或5。在一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含HVR-H3区，该HVR-H3区包含序列SEQ IDNO：6。在一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含HVR-L3，该HVR-L3包含序列SEQ ID NO：10、11、或12。

在一个方面，本发明提供了一种抗体，其包含以下至少一项、至少两项、至少三项、或所有四项：

(i)包含序列SEQ ID NO：1的HVR-H1序列；

(ii)包含序列SEQ ID NO：2、3、4、或5的HVR-H2序列；

(iii)包含序列SEQ ID NO：6的HVR-H3序列；和

(iv)包含序列SEQ ID NO：10、11或12的HVR-L3序列。

在一个想要的实施方案中，所述抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每项依次包含SEQ ID NO：7、8、9、1、2、6。在另一个想要的实施方案中，该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每项依次包含SEQ ID NO：7、8、10、1、3、6。在又一个想要的实施方案中，该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每项依次包含SEQ ID NO：7、8、11、1、4、6。在另一个想要的实施方案中，该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每项依次包含SEQ ID NO：7、8、12、1、5、6。

SEQ ID NO：1-12的氨基酸序列是如图1所示关于各HVR(即H1、H2或H3)编号的，编号方式符合Kabat编号系统，如下文所描述的。

在一个具体的方面，本发明提供了一种分离的抗刻缺蛋白1NRR抗体，其抑制、降低、和/或阻断刻缺蛋白1信号传导。本发明抗体的有些实施方案包含人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(Genentech，Inc.，SouthSan Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-1093中也有提及)的轻链可变域，如下文SEQ ID NO：53所描绘的。

1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp ValThr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly SerSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr Thr Thr ProPro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：53)(HVR残基标有下划线)

在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域序列在第30位、第66位、和第91位中一个或多个位置处被修饰(分别为Asn、Arg、和His，如上文以粗体/斜体标示的)。在一个具体的实施方案中，经修饰的huMAb4D5-8序列包含第30位Ser、第66位Gly、和/或第91位Ser。因而，在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含下文SEQ ID NO：54所示序列：

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp ValThr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly SerSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr Thr Thr ProPro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：54)(HVR残基标有下划线)

相对于huMAb4D5-8的替代残基以粗体/斜体标示。

本发明的抗体可包含任何合适的可变域框架序列，前提是对刻缺蛋白1NRR的结合亲和力得到基本上保留。例如，在有些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71位、第73位和/或第78位处的替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213&5,821,337，及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-1093中也有提及)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在一个具体的实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的轻链HVR序列，如美国专利No.6,407,213&5,821,337中所记载的。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)(在美国专利No.6,407,213&5,821,337，及Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-1093中也有提及)的轻链可变域序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、和/或37，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、2、和/或6。在另一个实施方案中，框架序列包含序列SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、和/或37，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、3、和/或6。在又一个实施方案中，框架序列包含序列SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、和/或37，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、4、和/或6。在另一个实施方案中，框架序列包含序列SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、和/或37，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQID NO：1、5、和/或6。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：38、39、40、和/或41，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或9。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：38、39、40、和/或41，而HVRL1、L2、和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或10。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：38、39、40、和/或41，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或11。在又一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：38、39、40、和/或41，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQID NO：7、8、和/或12。

在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、44、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、2、和/或6。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、44、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、3、和/或6。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、44、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、4、和/或6。在又一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、44、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ IDNO：1、5、和/或6。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、17、和/或18，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQID NO：7、8、和/或9。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、17、和/或18，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或10。在又一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、17、和/或18，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或11。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、17、和/或18，而HVR L1、L2、和L3序列分别是SEQ IDNO：7、8、和/或12。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、47、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、2、和/或6。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、47、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、3、和/或6。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、47、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ ID NO：1、4、和/或6。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：42、43、47、和/或45，而HVR H1、H2、和H3序列分别是SEQ IDNO：1、5、和/或6。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、47、和/或18，而HVR L1、L2和L3序列分别是SEQID NO：7、8、和/或9。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、47、和/或18，而HVR L1、L2和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或10。在又一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ ID NO：15、16、47、和/或18，而HVR L1、L2和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或11。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，其中框架序列包含序列SEQ IDNO：15、16、47、和/或18，而HVR L1、L2和L3序列分别是SEQ ID NO：7、8、和/或12。

在又一个实施方案中，对本发明的抗体进行亲和力成熟以获得想要的靶结合亲和力。在一个例子中，本发明的亲和力成熟的抗体包含氨基酸位置H53、H55、H57、H58、L91和L96中一个或多个位置处的替代。在一个例子中，本发明的亲和力成熟的抗体包含一处或多处以下替代：(a)重链中的S53P、S53A、G55R、T57A、T57N、N58H、N58Q和N58R，或(b)轻链中的S91F、P96A和P96S。

在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO：58。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：59。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO：58且该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：59。在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO：60。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：61。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含序列SEQ IDNO：60且该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：61。在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO：62。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：63。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO：62且该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：63。在另一个方面，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含序列SEQ IDNO：64。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：65。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含序列SEQ ID NO：64且该轻链可变域包含序列SEQ ID NO：65。

在一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上文所述任何抗体竞争对刻缺蛋白1 NRR的结合。在一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上文所述任何抗体结合刻缺蛋白1NRR上相同或相似表位。

如本领域所知道的，和如下文更详细描述的，描述抗体高变区的氨基酸位置/边界可以有所变化，这取决于本领域中已知的背景和各种定义(如下文所述的)。可变域(区)内的有些位置可以看作杂合高变位置，因为这些位置在一组标准下可认为在高变区内，而在不同的一组标准下被认为在高变区外。在延伸的高变区中也能找到这些位置中的一处或多处(如下文进一步定义的)。

在有些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在其它实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在有些实施方案中，该抗体选自下组：嵌合抗体，亲和力成熟抗体，人源化抗体和人抗体。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。在有些实施方案中，该抗体是Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)₂、或scFv。

在一个实施方案中，该抗体是嵌合抗体，例如如下的抗体，其包含来自非人供体的抗原结合序列，且该序列被嫁接至异源的非人、人、或人源化序列(例如框架和/或恒定域序列)。在一个实施方案中，该非人供体是小鼠。在另一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变得到的(例如噬菌体展示筛选等)。在一个具体的实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，该鼠轻链V区是融合至人卡帕(κ)轻链的。在另一个实施方案中，该鼠重链V区是融合至人IgG1 C区的。

本发明的人源化抗体包括那些在框架区(FR)中具有氨基酸替代的及在所嫁接的CDR中具有改变的亲和力成熟变体。CDR或FR中的替代氨基酸不限于那些存在于供体或受体抗体中的。在其它实施方案中，本发明的抗体进一步包含Fc区中的、导致改善的效应器功能(包括增强的CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤)的氨基酸残基改变。本发明的其它抗体包括那些具有增强稳定性的特定改变的那些抗体。在其它实施方案中，本发明的抗体包含Fc区中的、导致降低的效应器功能(例如降低的CDC和/或ADCC功能和/或降低的B细胞杀伤)的氨基酸残基改变。在有些实施方案中，本发明的抗体以降低的对人补体因子C1q和/或天然杀伤(NK)细胞上人Fc受体的结合为特征。在有些实施方案中，本发明的抗体以降低的对人FcγRI、FcγRIIA、和/或FcγRIIIA的结合(诸如结合缺失)为特征。在有些实施方案中，本发明的抗体是属于IgG类的(例如IgG1或IgG4)且包含E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331、和/或P329(编号方式依照EU索引)中的至少一处突变。在有些实施方案中，该抗体包含突变L234A/L235A或D265A/N297A。

在一个方面，本发明提供了抗刻缺蛋白1NRR多肽，其包含本文中所提供的任何抗原结合序列，其中该抗刻缺蛋白1NRR多肽特异性结合刻缺蛋白1NRR，例如人或小鼠刻缺蛋白1NRR。

本发明的抗体结合(诸如特异性结合)刻缺蛋白1NRR，而在有些实施方案中，其可调控以下的一个或多个方面：刻缺蛋白1信号传导和/或任何生物学重要的刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体生物学途径的破坏，和/或肿瘤、细胞增殖性病症或癌症的治疗和/或预防；和/或与刻缺蛋白1表达和/或活性(诸如升高的刻缺蛋白1表达和/或活性)有关的病症的治疗或预防。在有些实施方案中，该刻缺蛋白1NRR抗体特异性结合由刻缺蛋白1NRR(例如人或小鼠刻缺蛋白1NRR)组成的或基本上由刻缺蛋白1NRR(例如人或小鼠刻缺蛋白1NRR)组成的多肽。在有些实施方案中，该抗体以1x10^-7或更强的Kd特异性结合刻缺蛋白1。在有些实施方案中，本发明的抗体在体内和/或在体外降低、抑制、和/或阻断刻缺蛋白1活性。

在一个方面，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，该病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，该病症是与血管发生有关的病理学疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理学疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理学疾患是眼内新血管疾病。

在一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的抗体及载体。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。

在另一个方面，本发明提供了核酸，其编码本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在又一个方面，本发明提供了载体，其包含本发明的核酸。

在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的核酸及载体。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。

在一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞中任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在另一个方面，本发明提供了制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供了制备抗刻缺蛋白1NRR抗体(如本文中所定义的，其包括全长抗体及其片段)的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码该抗体(或其片段)的本发明重组载体，并回收该抗体。

在一个方面，本发明提供了一种制品，其包含容器；和装在该容器内的组合物，其中所述组合物包含一种或多种本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在另一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，所述载体在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品进一步包含关于对个体施用组合物(例如抗体)的指示(诸如关于本文中所描述的任何方法的指示)。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含装有组合物的第一容器，所述组合物包含一种或多种本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体；和装有缓冲液的第二容器。在一个实施方案中，所述缓冲液是药学可接受的。在一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步包含载体，所述载体在有些实施方案中是药学可接受的。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于对个体施用组合物(例如抗体)的指示。

在另一个方面，本发明提供了本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，所述病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，所述病症是与血管发生有关的病理性疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在一个方面，本发明提供了本发明的核酸在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，所述病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，所述病症是与血管发生有关的病理性疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在另一个方面，本发明提供了本发明的表达载体在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，所述病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，所述病症是与血管发生有关的病理性疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在又一个方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，所述病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，所述病症是与血管发生有关的病理性疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在另一个方面，本发明提供了本发明的制品在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，所述病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，所述病症是与血管发生有关的病理性疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在一个方面，本发明还提供了本发明的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于病症(诸如癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症)的治疗性和/或预防性处理。在有些实施方案中，所述病症是神经病或神经变性性疾病。在其它想要的实施方案中，所述病症是与血管发生有关的病理性疾患。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，该与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

本发明提供了对于调控与刻缺蛋白1的表达和/或信号传导(诸如升高的或降低的表达和/或信号传导或不想要的表达和/或信号传导)有关的病症有用的方法和组合物。

本发明还提供了对于调控与活化的刻缺蛋白1受体有关的病症有用的方法和组合物。此类病症可以是与刻缺蛋白1氨基酸序列中的易位或活化性突变有关的。与活化的刻缺蛋白1受体有关的例示性病症包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)。

在一个方面，本发明提供了用于治疗个体中与升高的刻缺蛋白1表达和/或活性有关的肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。在一个实施方案中，所述肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症涉及刻缺蛋白1活化性突变。

在一个方面，本发明提供了杀伤个体中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤细胞)的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗、抑制、阻断、或预防个体中肿瘤或癌症生长的方法，所述方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在另一个方面，本发明提供了用于降低、抑制、阻断、或预防个体中血管发生的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗个体中与血管发生有关的病理性疾患的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。在有些实施方案中，所述与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，所述与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防个体中神经病或神经变性性疾病(neurodegenerative disease)、或修复受损的神经细胞或治疗或预防导致轴突断开和/或脱髓鞘的疾病方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在一个方面，本发明提供了用于促进个体中神经元发育、增殖、维持或再生的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在另一个方面，本发明提供了用于增强个体中的免疫应答的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。在有些实施方案中，将免疫应答所针对的抗原与所述抗刻缺蛋白1NRR抗体同时施用。在其它实施方案中，本发明提供了增强个体中对抗原的免疫应答的方法，包括对个体施用抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体；且其中对个体施用组合物，使得抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体在抗原激发免疫细胞(诸如T细胞)期间或之后不久被呈递给个体的免疫细胞(诸如T细胞)，由此增强免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原是癌症的抗原。

在另一个方面，本发明提供了用于促进个体中组织再生和/或修复(诸如骨骼肌或心肌或骨的再生)的方法，该方法包括给个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体。

在另一个方面，本发明提供了用于降低、抑制、阻断、或预防个体中针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体。在一个实施方案中，所述免疫应答是由于异常T细胞发育或调节引起的免疫学病症。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗个体中自身免疫性病症的方法，该方法包括对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体。在有些实施方案中，所述自身免疫性病症是自身免疫性糖尿病、多发性硬化、移植物排斥、或类风湿性关节炎。

本发明的方法可用于影响任何合适的病理性状态。例示性的病症在本文中有描述，而且包括选自下组的癌症：小细胞肺癌，脑癌(例如成神经细胞瘤或脑膜瘤)，皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、或鳞状细胞癌)，乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，肝细胞癌，宫颈癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，和血液学恶性肿瘤(例如T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、B细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、何杰金淋巴瘤、和多发性骨髓瘤)。

在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是癌细胞。例如，所述癌细胞可以是选自下组的癌细胞：乳腺癌细胞，结肠直肠癌细胞，肺癌细胞，乳头状癌细胞，结肠癌细胞，胰腺癌细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，中枢神经系统癌细胞，骨源性肉瘤细胞，肾癌细胞，肝细胞性癌细胞，膀胱癌细胞，胃癌细胞，头颈鳞癌细胞，黑素瘤细胞，白血病细胞，和结肠腺瘤细胞。在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是过度增生的和/或增生的细胞。在另一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是发育不良的细胞。在又一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是转移的细胞。

本发明的方法可进一步包含别的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，该方法进一步包含将被靶定的细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于辐射处理(radiation treatment)或化疗剂的步骤。

在一个方面，本发明提供了如下的方法，其包括与有效量的另一种治疗剂组合地施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体，所述另一种治疗剂诸如抗血管发生剂、另一抗体、化疗剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞毒性放疗、类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药、或生长抑制剂。例如，与抗癌剂或抗血管发生剂组合地使用抗刻缺蛋白1NRR抗体以治疗各种赘生性或非赘生性疾患。在具体的例子中，与他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、伊立替康、西妥昔单抗、氟维司群、长春瑞滨、erlotinib、贝伐单抗、长春新碱、imatinib、sorafenib、lapatinib、或曲妥单抗组合地使用抗刻缺蛋白1NRR抗体。

可以连续地或与对那些对目的有效的其它治疗剂组合地施用抗刻缺蛋白1NRR抗体，或是在同一组合物中或是在分开的组合物中。抗刻缺蛋白1NRR抗体和其它治疗剂(例如抗癌剂)的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或更多种不同的组合物，使用相同的或不同的施用路径。或者/另外，所述施用可以以任意次序序贯进行。或者/另外，所述步骤可以作为序贯和同时二者的、任意次序的组合来实施。在某些实施方案中，两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为几分钟到几天、到几周到几月的时间间隔。例如，可以先施用抗癌剂，接着施用抗刻缺蛋白1NRR抗体。然而，也涵盖同时施用或先施用抗刻缺蛋白1NRR抗体。在某些实施方案中，两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为几分钟到几天、到几周到几月的时间间隔。

在某些方面，本发明提供了通过施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体和/或血管发生抑制剂和一种或多种化疗剂来治疗病症(诸如肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症)的方法。可以在本发明的组合治疗方法中使用多种化疗剂。本文中在“定义”下提供了所涵盖的化疗剂的例示性和非限制性列表。抗刻缺蛋白1NRR抗体和化疗剂的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或更多种不同的组合物，使用相同的或不同的施用路径。或者/另外，所述施用可以以任意次序序贯进行。或者/另外，所述步骤可以作为序贯和同时二者的、任意次序的组合来实施。在某些实施方案中，两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为几分钟到几天、到几周到几月的时间间隔。例如，可以先施用化疗剂，接着施用抗刻缺蛋白1NRR抗体。然而，也涵盖同时施用或先施用抗刻缺蛋白1NRR抗体。因而，在一个方面，本发明提供了如下的方法，包括施用抗刻缺蛋白1NRR抗体，接着施用化疗剂。在某些实施方案中，两个或更多个组合物的施用之间可以存在范围为几分钟到几天、到几周到几月的时间间隔。

在另一个方面，本发明提供了用于检测刻缺蛋白1的方法，该方法包括在样品中检测刻缺蛋白1-抗刻缺蛋白1NRR抗体复合物。如本文中所使用的，术语“检测”包括参照或不参照对照的情况中的定性和/或定量检测(测量水平)。

在另一个方面，本发明提供了用于诊断与刻缺蛋白1表达和/或活性有关的病症的方法，该方法包括在来自患有或怀疑患有该病症的个体的生物学样品中检测刻缺蛋白1-抗刻缺蛋白1NRR抗体复合物。在有些实施方案中，刻缺蛋白1表达是升高的表达或异常的表达。在有些实施方案中，所述病症是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症的个体的方法，其通过对个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体来进行，且其中在施用抗刻缺蛋白1NRR抗体之前、期间、或之后在个体的生物学样品中检测刻缺蛋白1表达和/或刻缺蛋白1配体表达。在有些实施方案中，所述生物学样品是癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症的生物学样品。在有些实施方案中，在施用抗刻缺蛋白1NRR抗体之前、期间、和/或之后检测刻缺蛋白1过表达。在有些实施方案中，在施用抗刻缺蛋白1NRR抗体之前、期间、和/或之后检测刻缺蛋白1配体表达。可以在施用抗刻缺蛋白1NRR抗体之前；期间；之后；之前和期间；之前和之后；期间和之后；或之前、期间、和之后检测表达。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有癌症、肿瘤、和/或细胞增殖性病症的个体的方法，其通过对个体施用有效量抗刻缺蛋白1NRR抗体来进行，其中所述癌症、肿瘤、和/或细胞病症或肝病症的生物学样品表达刻缺蛋白1或刻缺蛋白1配体。

在另一个方面，本发明提供了用于为个体选择治疗方法的方法，该方法包括：(a)在个体的生物学样品中检测刻缺蛋白1表达或刻缺蛋白1配体表达(如果有的话)；并(b)在步骤(a)之后，为个体选择治疗方法，其中治疗方法的选择基于在步骤(a)中检测的刻缺蛋白1或刻缺蛋白1配体表达。有些实施方案中，检测到个体生物学样品中的刻缺蛋白1或刻缺蛋白1配体表达相对于参照值或对照样品升高。在有些实施方案中，在个体中检测到个体生物学样品中的刻缺蛋白1或刻缺蛋白1配体表达相对于参照值或对照样品降低。在有些实施方案中，检测到刻缺蛋白1或刻缺蛋白1配体表达，并选择用抗刻缺蛋白1抗体进行的治疗方法。在有些实施方案中，所述个体患有肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。

在涉及检测的有些实施方案中，刻缺蛋白1的表达包含刻缺蛋白1基因删除、基因扩增、和/或基因突变的检测。在涉及检测的有些实施方案中，刻缺蛋白1配体的表达包含刻缺蛋白1基因删除、基因扩增、和/或基因突变的检测。

本文中描述了生物学样品，例如在生物学样品的定义中。在有些实施方案中，所述生物学样品是血清或肿瘤的生物学样品。

在涉及刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体(例如锯齿蛋白1、锯齿蛋白2、德耳塔样1、德耳塔样3、和/或德耳塔样4)表达的检测的实施方案中，可以检测刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体多核苷酸表达和/或刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体多肽表达。在涉及刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体表达的检测的有些实施方案中，检测刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体mRNA表达。在其它实施方案中，使用抗刻缺蛋白1NRR试剂和/或抗刻缺蛋白1配体试剂来检测刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体多肽表达。在有些实施方案中，使用抗体来检测刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体多肽表达。任何合适抗体可用于检测和/或诊断，包括单克隆和/或多克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、亲和力成熟抗体、人源化抗体、和/或抗体片段。在有些实施方案中，本文所述抗刻缺蛋白1NRR抗体用于检测。在有些实施方案中，使用免疫组织化学(“IHC”)来检测刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体多肽表达。在有些实施方案中，使用IHC测定法将刻缺蛋白1表达评分为2或更高。

在涉及刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体表达的检测的有些实施方案中，可检测刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体表达的存在和/或缺失和/或水平。刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体表达可以是升高的。应当理解，刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体表达的缺失包括不显著的或最低的水平。在有些实施方案中，测试生物学样品中的刻缺蛋白1表达高于对对照生物学样品所观察到的(或对照或参照表达水平)。在有些实施方案中，测试生物学样品中的刻缺蛋白1表达比对照生物学样品中高至少约2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍或更高。在有些实施方案中，刻缺蛋白1多肽表达在免疫组织化学(“IHC”)测定法中测定为染色强度得分至少为2或更高水平。在有些实施方案中，刻缺蛋白1多肽表达在IHC测定法中测定为染色强度得分至少为1或更高、或至少为3或更高。在有些实施方案中，测试生物学样品中的刻缺蛋白1表达低于对对照生物学样品所观察到的(或对照表达水平)。

在另一个方面，本发明提供了本文所述任何抗刻缺蛋白1NRR抗体，其中该抗刻缺蛋白1NRR抗体包含可检测标记物。

在另一个方面，本发明提供了本文所述任何抗刻缺蛋白1NRR抗体与刻缺蛋白1的复合物。在有些实施方案中，该复合物是在体内的或在体外的。在有些实施方案中，该复合物包含癌细胞。在有些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1NRR抗体是可检测标记的。

附图简述

图1-1和1-2：抗刻缺蛋白1NRR抗体的重链和轻链HVR环序列。该图显示重链HVR序列，H1、H2和H3，及轻链HVR序列，L1、L2和L3。序列编号方式如下：抗体A(HVR-H1是SEQ ID NO：1；HVR-H2是SEQ ID NO：2；HVR-H3是SEQ ID NO：6；HVR-L1是SEQ ID NO：7；HVR-L2是SEQ ID NO：8；HVR-L3是SEQ ID NO：9)；抗体A-1(HVR-H1是SEQ ID NO：1；HVR-H2是SEQ ID NO：3；HVR-H3是SEQ ID NO：6；HVR-L1是SEQ ID NO：7；HVR-L2是SEQ ID NO：8；HVR-L3是SEQ ID NO：10)；抗体A-2(HVR-H1是SEQ IDNO：1；HVR-H2是SEQ ID NO：4；HVR-H3是SEQ ID NO：6；HVR-L1是SEQ IDNO：7；HVR-L2是SEQ ID NO：8；HVR-L3是SEQ ID NO：11)；及抗体A-3(HVR-H1是SEQ ID NO：1；HVR-H2是SEQ ID NO：5；HVR-H3是SEQ IDNO：6；HVR-L1是SEQ ID NO：7；HVR-L2是SEQ ID NO：8；HVR-L3是SEQ IDNO：12)。氨基酸位置是如下文所述依照Kabat编号系统给编号的。

图2描述了抗体A、A-1、A-2、和A-3的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：58-65)。

图3A、3B、和4描绘了例示性的受体人共有框架序列，用于以如下序列标识符实施本发明。

重链可变域(VH)共有框架(图3A、3B)

人VH亚组I共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：19)

人VH亚组I共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO：20-22)

人VH亚组II共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：23)

人VH亚组II共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO：24-26)

人VH亚组II共有框架减去延伸的

人VH亚组III共有框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：27)

人VH亚组III共有框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO：28-30)

人VH受体框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：31)

人VH受体框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO：32-33)

人VH受体2框架减去Kabat CDR(SEQ ID NO：34)

人VH受体2框架减去延伸的高变区(SEQ ID NO：35-37)

轻链可变域(VL)共有框架(图4)

人VLκ亚组I共有框架(SEQ ID NO：38)

人VLκ亚组II共有框架(SEQ ID NO：39)

人VLκ亚组III共有框架(SEQ ID NO：40)

人VLκ亚组IV共有框架(SEQ ID NO：41)

图5描绘了huMAb4D5-8轻链(SEQ ID NO：15-18)和重链(SEQ IDNO：42-45)的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。

图6描绘了huMAb4D5-8轻链(SEQ ID NO：15、16、18、和46)和重链(SEQ ID NO：42、43、45、和47)的修饰的/变异的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。

图7显示了抗体A是有力的刻缺蛋白1抑制剂，如使用萤光素酶报告物基因所测量的。在A-L每个柱中，受体细胞是NIH-3T3-刻缺蛋白1。在A中，配体细胞是NIH-3T3-亲本，而在B-L中，配体细胞是NIH-3T3-锯齿蛋白1。在A、B、和K中，没有添加抗体或化合物E(一种γ-分泌酶抑制剂)；在C中，添加了400ng/ml同种型对照抗体；在D中，添加了16ng/ml抗体A；在E中，添加了80ng/ml抗体A；在F中，添加了400ng/ml抗体A；在G中，添加了2000ng/ml抗体A；在H中，添加了400ng/ml抗体A；在I中，添加了400ng/ml抗体A；在J中，添加了400ng/ml同种型对照抗体；在K中，添加了0.01％DSMO；而在L中，添加了在0.01％DSMO中的1μM化合物E。在H中，添加5μg/ml(100μl)刻缺蛋白1NRR蛋白质；在I中，添加了6.5μg/ml(100μl)BSA(牛血清白蛋白)蛋白质；在J中，添加了5μg/ml(100μl)刻缺蛋白1NRR蛋白质；在A-G、K、和L中，没有添加蛋白质。

图8显示了抗体A、A-1、A-2、和A-3抑制刻缺蛋白1，如使用萤光素酶报告物测定法所测量的。黑色柱显示使用亲本抗体抗体A得到的结果，而其它柱显示使用抗体A-1(水平条纹)、抗体A-2(灰色阴影)、和抗体A-3(对角条纹)得到的结果。如80ng/ml抗体所揭示的，抗体A-1和A-2显示出比亲本抗体A更加有力的对刻缺蛋白1信号的阻断。该图的X轴代表抗体浓度(ng/ml)，而该图的Y轴代表萤火虫/海肾(Renilla)萤光素酶发光。

图9显示了抗体A减轻由刻缺蛋白信号传导活化引起的对小鼠C2C12肌细胞分化的阻断。在A-F中，培养基是分化培养基。在A中，没有将小鼠C2C12成肌细胞与表达NIH-3T3锯齿蛋白1配体的细胞共培养，而在B-F中，将小鼠C2C12成肌细胞与表达NIH-3T3锯齿蛋白1配体的细胞共培养。添加至细胞的抗体/处理如下：A和B没有，C用同种型对照，D用200ng/ml抗体A，E用DSMO，而F用1μM化合物E。

图10A-10F是用MHC/488(顶行)或DAPI(4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚盐酸化物；底行)染色小鼠C2C12肌细胞的图像。对于A-F，培养基是分化培养基。在A中，没有将小鼠C2C12成肌细胞与表达NIH-3T3锯齿蛋白1配体的细胞共培养，而在B-F中，将小鼠C2C12成肌细胞与表达NIH-3T3锯齿蛋白1配体的细胞共培养。添加至细胞的抗体/处理如下：A和B没有，C用同种型对照，D用200ng/ml抗体A，E用DSMO，而F用1μM化合物E。

图11-1至11-4是人和小鼠刻缺蛋白1氨基酸序列(SEQ ID NO：56和57)的比对。使用SIM比对工具(可在ExPASy万维网站得到)来比对人和鼠刻缺蛋白1蛋白质的完整序列。选择了默认参数，其中空隙罚分(gap open penalty)为12，延伸罚分为4，而BLOSUM62作为比较矩阵。蛋白质域划有下划线和做有标记。信号肽、跨膜和EGF域边界是基于Expasy.org处的人刻缺蛋白1的结果；LNR边界是基于Vardar et al.(Biochemistry，42：7061-7067，2003)；HD-N和HD-C边界是基于Malecki et al.(Mol.Cell Biol.26：4642-4651，2006)。负调节区(NRR)对应于在LNR_A处开始和在HD-C后结束的序列。用于生成刻缺蛋白1NRR抗体的免疫原序列用阴影线划有上划线，而且包括EGF重复34-36加NRR。缩写：氨基酸以单字母代码显示；TM，跨膜；EGF，表皮生长因子重复；LNR，Lin12-刻缺蛋白重复；HD-N，异二聚化结构域-在S1切割位点的氨基末端侧上；HD-C，异二聚化结构域-在S1切割位点的羧基末端侧上；S1，供弗林蛋白酶使用的S1切割位点；S2，供ADAM蛋白酶(解联蛋白和金属蛋白酶家族)使用的S2切割位点。

图12A-12C显示了抗体A(图12A)、抗体A-1(图12B)、和抗体A-2(图12C)的表位作图实验结果。

图13显示了抗刻缺蛋白1-NRR抗体抑制野生型和突变型刻缺蛋白1受体的信号传导。实心黑柱显示使用2000ng/ml对照抗体得到的结果；粗虚线柱显示使用80ng/ml抗体A得到的结果；细条纹柱显示使用400ng/ml抗体A得到的结果；粗条纹柱显示使用2000ng/ml抗体A得到的结果；交叉线柱显示使用10μM化合物E得到的结果；而细虚线柱显示使用DMSO(化合物E的媒介物)得到的结果。每种条件的结果是在八个复制品中测量得到的，然后表述成均值，误差条指示标准偏差。

图14A是显示抗刻缺蛋白1NRR处理和抗Dll4处理在HUVEC(人脐静脉内皮细胞)细胞萌芽测定法中引起血管萌芽和长度显著增加的一系列图像。显示了用作为对照的PBS(磷酸盐缓冲盐水)或用抗刻缺蛋白1NRR抗体A或A-2处理的细胞的结果。

图14B是显示使用角膜袋测定法抗刻缺蛋白1NRR抗体对血管形成和血管发生的影响的一系列图像。抗刻缺蛋白1NRR处理(抗体A-2)显著提高血管网络密度。

图14C是显示在角膜测定法中抗Dll4和抗刻缺蛋白1NRR处理对穿过血管的血流的影响的一系列图像。穿过抗Dll4处理的血管和穿过抗刻缺蛋白1NRR处理的血管的灌注都受到限制。

图14D是显示抗刻缺蛋白1NRR抗体在血管发生的小鼠视网膜模型中的影响的一系列图像。抗刻缺蛋白1NRR抗体处理(抗体A-2)提高血管系统密度并产生超萌芽(hyper-sprouting)表型。

图14E是显示在血管发生的小鼠视网膜模型中抗刻缺蛋白1NRR处理(抗体A-2)引起细胞核数目增加(这与细胞增殖的增强一致)的一系列图像。

图15A显示了在体内小鼠模型中抗刻缺蛋白1NRR抗体对肿瘤生长的影响。抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2处理阻滞肿瘤生长。

图15B显示了在体内小鼠模型中各种剂量的抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2阻滞或减缓肿瘤生长。

图15C显示了在体内小鼠模型中抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2缩小肿瘤体积。

图15D显示了在体内小鼠模型中抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2以剂量依赖性方式引起体重减轻。

图15E显示了免疫缺陷小鼠(Balb-C Nu/Nu)的血清中抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2随时间的清除。

图16A和16B是显示来自用对照抗体(媒介物)或用10mg/kg浓度的抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2处理的小鼠的小肠(图16A)或大肠(图16B)的肠隐窝和绒毛的系列图像。

图17显示了抗刻缺蛋白1NRR抗体和γ-分泌酶抑制剂降低某些癌细胞系的存活力。使用了抗刻缺蛋白1NRR抗体A-2和γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁基酯(DAPT)和化合物E(CmpE)。癌细胞系标示在x轴上。

发明详述

本文中的发明提供了抗刻缺蛋白1NRR抗体，其对于例如与刻缺蛋白的表达和/或活性(诸如升高的表达和/或活性或不想要的表达和/或活性)有关的疾病状态的治疗或预防是有用的。在有些实施方案中，本发明的抗体用于治疗肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。

在另一个方面，本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体作为用于刻缺蛋白1的检测和/或分离，诸如各种组织和细胞类型中刻缺蛋白1的检测的试剂找到了效用。

本发明进一步提供了制备抗刻缺蛋白1NRR抗体的方法，及编码抗刻缺蛋白1NRR抗体的多核苷酸。

通用技术

本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法：Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel，et al.eds.，(2003))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))；Harlow and Lane，eds.(1988)ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL；及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed.(1987))。

定义

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)及使用Coomassie蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“分离的”核酸分子指已经鉴定且与核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该核酸(例如抗体编码核酸)的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50％、优选小于约40％、优选小于约30％、优选小于约20％、或优选小于约10％。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。希望Kd是1x10^-7、1x10^-8、5x10^-8、1x10^-9、3x10^-9、5x10^-9、或甚至1x10^-10或更强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的¹²⁵I标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen等，J Mol Biol 293：865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Software 3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen，Y.等，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶ M^-1 S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate)或“k_on”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software 3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen，Y.等，J Mol Biol 293：865-881(1999)。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶ M^-1S^-1，那么结合速率优选使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomericnucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR₂(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代的或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。

关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表A中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以自例如WO2007/001851中提供的源代码来汇编。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y 乘 100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。

希望两种或更多种氨基酸序列是至少50％、60％、70％、80％、或90％相同的。更希望，两种或更多种氨基酸序列是至少95％、97％、98％、99％、或甚至100％相同的。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中所使用的，除非另有明确的或上下文说明，术语“刻缺蛋白1”指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)刻缺蛋白1多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式(例如胞外结构域序列或跨膜亚基序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白1”通常指包含天然存在刻缺蛋白1蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白1序列”通常指在天然存在刻缺蛋白1中找到的氨基酸序列。

如本文中所使用的，除非另有明确的或上下文说明，术语“刻缺蛋白1配体”指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)刻缺蛋白1配体(例如锯齿蛋白1、锯齿蛋白2、德耳塔样1、德耳塔样3、和/或德耳塔样4)多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式(例如胞外结构域序列或跨膜亚基序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白1配体”通常指包含天然存在刻缺蛋白1配体蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白1配体序列”通常指在天然存在刻缺蛋白1配体中找到的氨基酸序列。

如本文中所使用的，除非另有明确的或上下文说明，术语“刻缺蛋白1NRR”指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)刻缺蛋白1多肽区域，其由3个LNR模块和LNR模块羧基端的、延伸至跨膜结构域的氨基酸序列(例如人刻缺蛋白1氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的氨基酸编号大约1446至大约1735和小鼠刻缺蛋白1氨基酸序列(SEQ ID NO：57)的氨基酸编号大约1446至大约1725)组成。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白1NRR””通常指包含天然存在刻缺蛋白1NRR的氨基酸序列的多肽。在有些实施方案中，刻缺蛋白1NRR是包含SEQ ID NO：56的氨基酸1446-1735或SEQ ID NO：57的氨基酸1446-1725的多肽。在有些实施方案中，刻缺蛋白1NRR被包含在刻缺蛋白1中，诸如例如在S1、S2和/或S3位点处遭到加工的刻缺蛋白1，或未加工的刻缺蛋白1。在有些实施方案中，刻缺蛋白1NRR包含两个或更多个非共价连接的刻缺蛋白1NRR氨基酸序列片段，例如包含SEQ ID NO：56的氨基酸1446-1664的片段非共价连接至包含SEQ IDNO：56的氨基酸1665-1735的片段。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：57的氨基酸1446-1654的片段非共价连接至包含SEQ ID NO：57的氨基酸1655-1725的片段。

如本文中所使用的，术语“升高的刻缺蛋白1信号传导”指高于在相同条件下在对照中观察到的刻缺蛋白1信号传导水平至少两倍的刻缺蛋白1信号传导升高，这例如使用本文实施例5和6中描述的萤光素酶测定法来测量。希望的是，刻缺蛋白1信号传导的升高高于在对照中观察到的水平至少三倍、四倍、五倍、或甚至十倍(或更高)。

如本文中所使用的，术语“降低的刻缺蛋白1信号传导”指低于在相同条件下在对照中观察到的刻缺蛋白1信号传导水平至少两倍的刻缺蛋白1信号传导降低，这例如使用本文实施例5和6中描述的萤光素酶测定法来测量。希望的是，刻缺蛋白1信号传导的降低低于在对照中观察到的水平至少三倍、四倍、五倍、或甚至十倍(或更多)。

术语“刻缺蛋白1活化性突变”和“活化刻缺蛋白1信号传导的突变”指相对于刻缺蛋白1野生型氨基酸序列而言，一个或多个氨基酸的插入、一个或多个氨基酸的删除、或一个或多个氨基酸的替代，所述插入、删除或替代导致刻缺蛋白1信号传导与来自相应刻缺蛋白1野生型氨基酸序列的刻缺蛋白1信号传导相比升高，或者指相对于刻缺蛋白1野生型核酸序列而言，一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的删除、或一个或多个核苷酸的替代，该插入、删除或替代导致含有突变型核酸序列的细胞中的刻缺蛋白1信号传导与含有相应刻缺蛋白1野生型核酸序列的细胞中的刻缺蛋白1信号传导相比升高。来自含有活化性突变的刻缺蛋白1受体的刻缺蛋白1信号传导可以是依赖配体的或不依赖配体的。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链能在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact)”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。

环           Kabat              AbM             Chothia            接触

---          -----------        -----------     -----------        -----------

L1           L24-L34            L24-L34         L26-L32            L30-L36

L2           L50-L56            L50-L56         L50-L52            L46-L55

L3           L89-L97            L89-L97         L91-L96            L89-L96

H1           H31-H35B           H26-H35B        H26-H32            H30-H35B

             (Kabat编号方式)

H1           H31-H35            H26-H35         H26-H32            H30-H35

             (Chothia编号方式)

H2    H50-H65     H50-H58     H53-H55     H47-H58

H3    H95-H102    H95-H102    H96-H101    H93-H101

高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等，见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。

“嵌合”抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，在Rosenburg和Moore编的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

“抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。优选地，靶抗原是多肽。

术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等，PNAS(USA)91：3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所披露的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源例如血液分离。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入该专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。

测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。

具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551 B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。希望生物学活性降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、或甚至100％。

“激动性抗体(agonist antibody)”在用于本文时指模拟感兴趣多肽的至少一项功能性活性的抗体。

就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。当存在预先存在的氨基酸变化时，优选存在不超过5个，优选4个或更少，或者3个或更少预先存在的氨基酸变化。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只位于71H、73H和78H中的三个、两个、或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T、和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如Kabat等的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如Kabat等的亚组III。

“VH亚组III共有框架”包含从Kabat等的可变重链亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚组III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：42)-H1-

WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：43)-H2-

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：44)-H3-

WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：45)。

“VL亚组I共有框架”包含从Kabat等的可变轻链κ亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚组I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：15)-L1-

WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：16)-L2-

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：17)-L3-

FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：18)。

“病症”或“疾病”指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头和颈癌。血管发生失调可导致可通过本发明的组合物和方法来治疗的许多病症。这些病症包括非赘生性的和赘生性的疾患。赘生性疾患包括但不限于上文所描述的那些。非赘生性病症包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新血管性青光眼(neovascular glaucoma)、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的)、滑膜炎症(synovialinflammation)、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rdspacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫纤维瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌性的)、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液。

术语“神经变性性疾病”和“神经变性性病症”以最广义使用，包括其病理学涉及神经原变性和/或功能障碍的所有病症，包括但不限于周围神经病；运动神经元病症，诸如肌萎缩侧索硬化amylotrophic lateral sclerosis(ALS，Lou Gehrig氏病)、贝耳氏(Bell)麻痹、和涉及脊髓性肌萎缩或麻痹的各种疾患；及其它人神经变性疾病，诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫、多发性硬化、亨廷顿氏舞蹈症、唐氏综合征、神经性聋、和梅尼尔氏(Meniere)病。

“周围神经病”指影响周围神经的神经变性病症，最常表现为运动、感觉、感觉运动、或自主功能障碍中的一项或组合。周围神经病可以是例如通过遗传获得的，可以源自系统疾病，或者可以是毒剂诸如神经毒性药物例如抗肿瘤剂或者工业或环境污染物诱发的。

“周围感觉神经病”的特征为周围感觉神经元的变性，这可以是特发性的，可以是作为例如糖尿病(糖尿病性神经病)、癌症的细胞抑制药疗法(例如使用化疗剂的治疗，诸如长春新碱、顺铂、甲氨蝶呤、3′-叠氮-3′-脱氧胸苷、或紫杉烷，例如帕利他塞(paclitaxel)[Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.]和多西他塞(doxetaxel)[-Poulenc Rorer，Antony，France])、酒精中毒、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、或遗传素因(genetic predisposition)的后果而发生的。通过遗传获得的周围神经病包括例如雷弗素姆氏(Refsum)病、克腊比氏(Krabbe)病、异染性脑白质营养不良、法布里氏(Fabry)病、代-索二氏(Dejerine-Sottas)综合征、无β脂蛋白血症、和夏科-马里-图思(Charcot-Marie-Tooth，CMT)病(也称为Proneal肌萎缩或遗传性运动感觉神经病(HMSN))。大多数类型的周围神经病缓慢发生/发展，病程数月或数年。在临床实践中，此类神经病称作慢性的。有时周围神经病快速发生/发展，病程数天，称作急性的。周围神经病常常一起影响感觉和运动神经，从而引起混合型感觉和运动神经病，但是纯感觉的和纯运动的神经病也是已知的。

如本文中所使用的，“自身免疫性疾病”指其病理学涉及针对个体自身组织的免疫应答的任何病症。自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎性肠病、腹部疾病、变应性鼻炎、变应性荨麻疹、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、赫希施普龙氏病(Hirschsprung’sdisease)、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、格巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病(Hashimoto’s disease)、变应性眼内炎性疾病、强直性脊柱炎、特应性皮炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、贝切特氏病(Behcet’s disease)、寇甘氏综合征(Cogan’ssyndrome)、接触性皮炎、柯兴氏综合征(Cushing’s syndrome)、皮肌炎、糖尿病、盘状红斑狼疮、狼疮肾炎、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、剥脱性皮炎、局灶性或节段性肾小球硬化、巨细胞性动脉炎、痛风、痛风性关节炎、手湿疹、亨舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、多毛症、特发性角膜-巩膜炎、特发性血小板减少性紫癜、炎性皮肤病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、骨关节炎、胰腺炎、妊娠性类天疱疮、寻常型天疱疮、牙周炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、阴囊搔痒、瘙痒症/炎症、银屑病、银屑病关节炎、肺组织胞浆菌病、复发性多软骨炎、酒渣鼻、结节病、硬皮病、感染性休克综合征、肩腱炎或滑囊炎、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’ssyndrome)、斯提耳氏病(Still’s disease)、斯威特氏病(Sweet’s disease)、系统性红斑狼疮、系统性硬化、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎、中毒性表皮坏死松解症、移植物排斥、结核病、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)。

如本文中所使用的，“免疫学病症”指个体中其病理学涉及免疫系统异常发育或调控的任何病症。优选，所述免疫学病症涉及异常T细胞发育或调控。

“药物”指用于治疗所讨论病症或其症状、或副作用的活性药物。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。

“个体”指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。

为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物指人。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于个体的，因此预防有效量低于治疗有效量。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烃基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)()、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)()；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)()；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)()；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)()；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)()；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)()；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、阿伦膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(诸如表达刻缺蛋白1的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞(诸如表达刻缺蛋白1的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cellcycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等，WBSaunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。

“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione

术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂，在本文中也称为“抗肿瘤剂”)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、毒素、和其它用于治疗癌症的药剂例如抗VEGF中和性抗体、VEGF拮抗剂、抗HER-2、抗CD20、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂、erlotinib、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、血小板衍生生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCF)的受体酪氨酸激酶的抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Novartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。

术语“前体药物”或“药物前体”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman，“Prodrugs in CancerChemotherapy”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)及Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt等编，pp.247-267，HumanaPress(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。

“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或是直接或是间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、或阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinib malate)、AMG706)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun和D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53：217-39(1991)；Streit和Detmar，Oncogene，22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara和Alitalo，NatureMedicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等，Oncogene，22：6549-6556(2003)(例如列举抗血管发生因子的表2)；及Sato Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。

“生物学样品”(可互换地称作“样品”或“组织或细胞样品”)涵盖自个体获得的且可用于诊断或监测测定法的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物学起源的其它液体样品、固体组织样品诸如活检标本或组织培养物或自其衍生的细胞、及其后代。该定义还涵盖在获得它们后已经进行过操作的样品，诸如用试剂处理、增溶、或富集某些成分诸如蛋白质或多核苷酸、或为切片目的而埋藏在半固体或固体基质中。术语“生物学样品”涵盖临床样品，而且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物学流体、和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液；来自妊娠或个体发育中任何时间的细胞。在有些实施方案中，生物学样品是自原发性或转移性肿瘤获得的。生物学样品可含有在自然界中不与该组织天然混和的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、诸如此类。

为本发明目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切下来的一薄片组织或细胞。应当了解，可以制作多片组织样品切片并依照本发明进行分析。在有些实施方案中，将组织样品的同一切片用于形态学和分子两个水平的分析或者针对蛋白质和核酸二者进行分析的方法。

术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

刻缺蛋白1受体和活化性突变

刻缺蛋白受体在转运至细胞表面期间被弗林蛋白酶样蛋白酶在跨膜结构域以外约70个氨基酸处的位点S1处蛋白水解加工，产生胞外刻缺蛋白(ECN)亚基和刻缺蛋白跨膜亚基(NTM)。这两个亚基仍然非共价结合并构成成熟异二聚体细胞表面受体。刻缺蛋白1ECN亚基含有36个N端EGF样重复，接着是三个串联重复的LNR模块(LNR_A、LNR_B、和LNR_C)。每个LNR模块含有三个二硫键和一组保守的酸性和极性残基，预测这些残基与钙离子配位。在EGF重复区内有供活化性配体结合的位点。LNR模块参与配体诱导的活化之前处于静息构象的刻缺蛋白的维持。刻缺蛋白1NTM包含胞外区、跨膜区段、和大的胞内部分(其包含RAM(RBP Jκ结合分子)域、锚蛋白重复、反式激活域和羧基末端PEST序列)。ECN与NTM亚基的稳定结合依赖于包含ECN的羧基末端(称作HD-C)和NTM的胞外氨基末端(称作HD-N)的异二聚化结构域(HD)。刻缺蛋白配体对ECN亚基的结合启动经由受调节的膜内蛋白水解发生的两步连续蛋白水解切割。金属蛋白酶在位点S2(位于NTM中)处的第一步切割使得刻缺蛋白跨膜亚基对接近质膜内小叶的位点S3处的第二步切割易感。由含有早老蛋白和呆蛋白的多蛋白复合物催化的位点S3切割释放刻缺蛋白跨膜亚基的胞内部分(也称作胞内刻缺蛋白；“ICN”)，容许它易位至细胞核并激活靶基因的转录。

图11-1至11-4显示了人(SEQ ID NO：56)和小鼠(SEQ ID NO：57)刻缺蛋白1氨基酸序列之间的比对。信号肽大致跨越SEQ ID NO：56或57的氨基酸1-18，EGF重复(EGF1至EGF36)大致跨越SEQ ID NO：56或57的氨基酸20-1426，LNR_A大致跨越SEQ ID NO：56或57的氨基酸1446-1489，LNR_B大致跨越SEQ ID NO：56或57的氨基酸1490-1527，LNR_C大致跨越SEQ ID NO：56或57的氨基酸1528-1562，HD-N大致跨越SEQ ID NO：56的氨基酸1563-1664或SEQID NO：57的氨基酸1563-1654，HD-C大致跨越SEQ ID NO：56的氨基酸1665-1733或SEQ ID NO：57的氨基酸1655-1723，而PEST结构域大致跨越SEQID NO：56的氨基酸2484-2555或SEQ ID NO：57的氨基酸2459-2530。HD结构域(其包括HD-N和HD-C)大致跨越SEQ ID NO：56的氨基酸1563-1733或SEQID NO：57的氨基酸1563-1723。S1切割位点介于SEQ ID NO：56的氨基酸1664与1665之间和介于SEQ ID NO：57的氨基酸1654与1655之间。S2切割位点介于SEQ ID NO：56的氨基酸1720与1721之间及介于SEQ ID NO：57的氨基酸1710与1711之间。跨膜部分大致跨越SEQ ID NO：56的氨基酸1736-1747和SEQ IDNO：57的氨基酸1726-1737。

已经鉴定和表征了影响刻缺蛋白1信号传导的数种类型的刻缺蛋白1突变。活化刻缺蛋白1信号传导的刻缺蛋白1突变分成两大类-即不依赖配体的和依赖配体的活化性突变。此外，一些不依赖配体的活化性突变仍然对配体有响应。已经将活化刻缺蛋白1信号传导的突变与T-ALL联系起来(Weng etal.，Science 306：269-271，2004；Malecki et al.，Mol.Cell.Biol.26：4642-4651，2006)。具体而言，已经在HD区中和在PEST域中鉴定出与T-ALL有关的刻缺蛋白1活化性突变。另外，易位可导致异常刻缺蛋白1信号传导。例如，发现刻缺蛋白1是(7；9)(q34；q34.3)染色体易位中的配偶基因。此易位见于罕见的T-ALL子集中，而且将刻缺蛋白1基因的3’端融合至T细胞受体β启动子/增强子(Weng et al.，Science 306：269-271，2004)。

例示性的、在没有配体结合的情况中发信号但保留对配体结合做出响应的能力的不依赖配体的突变是刻缺蛋白1HD区中的突变。人刻缺蛋白1的HD-N区中的活化性突变包括例如L1575P、V1577E、F1593S、L1594P、L1597H、R1599P、L1601P和I1617T/N。人刻缺蛋白1的HD-C区中的例示性活化性突变包括V1677D、L1679P、I1681N、A1702P、I1719T、和S2切割位点处的插入(ARLGSLNIPYKIEA；SEQ ID NO：52)(P12插入)。L1575P、V1577E、F1593S、L1594P、L1597H、R1599P、L1601P、I1617T/N、V1677D、L1679P、I1681N、A1702P、和I1719T突变及P12插入引起升高的S2和S3切割，而且刻缺蛋白1信号传导大于野生型刻缺蛋白1受体的信号传导。

刻缺蛋白1活化性突变子集降低异二聚体稳定性-它们削弱了ECN区与NTM的相互作用。例示性的、人刻缺蛋白1中降低异二聚体稳定性的突变包括L1575P、V1577E、F1593S、L1594P、L1597H、R1599P、I1617T、I1617N、I1681N、A1702P和I1719T。P12插入来源于直接重复，该重复被预测为将内源HD-C域远离S2切割位点复位且可增强S2位点对金属蛋白酶的可及性(Malecki et al.，Mol.Cell.Biol.26：4642-4651，2006)。

例示性的、依赖配体的刻缺蛋白1活化性突变包括PEST域中的突变，诸如插入或删除，包括读码框的移位或创建过早终止密码子的点突变。抑制性PEST域的消除被认为是延长ICN的半衰期。例示性的、PEST域中的突变是DelPEST，其是于人刻缺蛋白1氨基酸序列的氨基酸2473开始的羧基末端删除(SEQ ID NO：57)。PEST域中的其它突变是本领域已知的，而且记载于例如Weng et al.，Science 306：269-271，2004。

本发明的组合物及其制备方法

本发明涵盖组合物(包括药物组合物)，其包含抗刻缺蛋白1NRR抗体；和包含编码抗刻缺蛋白1NRR抗体的序列的多核苷酸。如本文中所使用的，组合物包含一种或多种结合刻缺蛋白1NRR的抗体，和/或一种或多种包含编码一种或多种结合刻缺蛋白1NRR的抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受的赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域公知的。

本发明还涵盖分离的抗体和多核苷酸的实施方案。本发明还涵盖基本上纯的抗体和多核苷酸的实施方案。

本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体优选是单克隆的。本发明的范围还涵盖本文中所提供的抗刻缺蛋白1NRR抗体的Fab、Fab′、Fab′-SH和F(ab′)₂片段。这些抗体片段可通过传统手段来制备，诸如酶促消化，或者可以通过重组技术来生成。此类抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文所列的诊断和治疗目的。

单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变。如此，修饰语“单克隆”指明抗体的特征，即不是不同抗体的混合物。

本发明的抗刻缺蛋白1NRR单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。刻缺蛋白1NRR的抗体一般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射刻缺蛋白1NRR和佐剂来生成。刻缺蛋白1NRR可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，人和小鼠刻缺蛋白1NRR的重组生产在下文中有描述。在一个实施方案中，将动物用融合至免疫球蛋白重链Fc部分的刻缺蛋白1NRR免疫。在一个优选的实施方案中，将动物用刻缺蛋白1NRR-IgG1融合蛋白免疫。通常将动物针对刻缺蛋白1NRR的免疫原性偶联物或衍生物和单磷酰脂质A(MPL)/二棒分枝菌酸海藻糖(trehalose dicrynomycolate，TDM)Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，MT)进行免疫，将溶液皮内注射于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗刻缺蛋白1NRR滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。

或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对刻缺蛋白1NRR的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。

本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体可以通过使用组合文库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的噬菌体。通过针对期望抗原的亲和层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗刻缺蛋白1NRR抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗刻缺蛋白1NRR抗体克隆。

抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自重链(VL)和轻链(VH)，都呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性的肽共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因片段，使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。

通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，而另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过取代一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)所述。

一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗刻缺蛋白1NRR克隆，那么可以给个体免疫刻缺蛋白1NRR以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗刻缺蛋白1NRR克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗刻缺蛋白1NRR抗体应答，使得刻缺蛋白1NRR免疫产生生成针对刻缺蛋白1NRR的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的产生在下文中有描述。

可以如下获得抗刻缺蛋白1NRR反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达刻缺蛋白1NRR特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过用刻缺蛋白1NRR亲和层析或者细胞对荧光染料标记的刻缺蛋白1NRR的吸附及后续的流动激活细胞分选(FACS)进行的细胞分离。

或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用刻缺蛋白1NRR在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构建抗体文库。为了体外掺入抗体基因的文库构建，从个体收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和鸟类等)获得感兴趣的免疫细胞。

从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等，Nature，341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子(leader exon)内，如Jones等，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。优选的是，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)或Orum等，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法所述。为了将所扩增的DNA克隆到表达载体中，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)所述。

人工合成的重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992))，并定位(Matsuda等，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构型)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的轻链全集。基于一系列VH和VL折叠及L3和H3长度的合成的V基因全集会编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。

抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等，Gene，128：119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分别克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含不同的组合来联合两种文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10¹²个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd^-1为约10^-8M)的多样性抗体。

或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述。

未免疫文库(naive library)(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd^-1为约10⁶-10⁷M^-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，如Winter等(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 96/07754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体组合，并在数轮链重新改组中筛选更高亲和力，如Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力在10^-9M范围的抗体和抗体片段。

刻缺蛋白1NRR核酸和氨基酸序列是本领域已知的。可以使用想要的刻缺蛋白1NRR区的氨基酸序列来设计编码刻缺蛋白1NRR的核酸序列。所述序列可以包括序列SEQ ID NO：55、13、或14。或者，可以使用GenBank登录号NM_017617的cDNA序列。编码刻缺蛋白1NRR的核酸可以通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于通过Engels等，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-734(1989)中记载的任何方法，诸如三酯、亚磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法进行的化学合成。在一个实施方案中，编码刻缺蛋白1NRR的DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码子。或者，编码刻缺蛋白1NRR的DNA可以从基因组或cDNA文库分离。

构建编码刻缺蛋白1NRR的DNA分子后，将该DNA分子与表达载体，诸如质粒中的表达控制序列可操作连接，其中所述控制序列受到该载体转化的宿主细胞的识别。一般而言，质粒载体包含复制和控制序列，其衍生自与宿主细胞相容的物种。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。适于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的，有些在本文中有进一步描述。可以使用真核生物体，诸如酵母或衍生自多细胞生物体诸如哺乳动物的细胞。

任选的是，编码刻缺蛋白1NRR的DNA与分泌前导序列可操作连接，导致表达产物被宿主细胞分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括stII、ecotin、lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶、和α-因子。适用于此处的还有蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen等，EMBO J.，4：3901(1985))。

宿主细胞用上文所述本发明的表达或克隆载体转染，优选转化，并在常规营养培养基中培养，培养基可以为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而适当修改。

转染指宿主细胞摄取表达载体，无论任何编码序列事实上是否表达。本领域普通技术人员知道许多转染方法，例如CaPO₄沉淀和电穿孔。若宿主细胞内存在此载体运转的任何指示，则认为转染成功。用于转染的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。

转化指将DNA导入生物体，使得DNA可进行复制，或是作为染色体外元件，或是通过染色体整合。根据所用宿主细胞，使用适于所述细胞的标准技术进行转化。用于转化的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。

用于生成刻缺蛋白1NRR的原核宿主细胞可以如Sambrook等，见上文一般所述进行培养。

用于生成刻缺蛋白1NRR的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养，所述培养基是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。

本发明公开的宿主细胞涵盖体外培养物中的细胞以及宿主动物体内的细胞。

刻缺蛋白1NRR的纯化可以使用本领域公认的方法来实现，本文描述了其中一些。

纯化的刻缺蛋白1NRR可以附着于合适的基质，诸如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体、诸如此类，用于噬菌体展示克隆的亲和层析分离。刻缺蛋白1NRR蛋白对基质的附着可以通过Methods in Enzymology，卷44(1976)中记载的方法来实现。将蛋白质配体附着于多糖基质，例如琼脂糖、右旋糖苷或纤维素的常用技术涉及用卤化氰活化载体，随后将肽配体的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶联至活化后的基质。

或者，刻缺蛋白1NRR可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于本领域已知的用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。

在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的刻缺蛋白1NRR。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者通过刻缺蛋白1NRR抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。

选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass等，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。

有可能在对刻缺蛋白1NRR具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些上文所述亲和力成熟技术进行)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制刻缺蛋白1NRR，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化刻缺蛋白1NRR一起温育，但是生物素化刻缺蛋白1NRR的摩尔浓度低于刻缺蛋白1NRR的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。

抗刻缺蛋白1NRR克隆可以进行活性选择。在一个实施方案中，本发明提供了阻断刻缺蛋白1受体与其配体(诸如锯齿蛋白1、锯齿蛋白2、德耳塔样1、德耳塔样3和德耳塔样4)之间结合或配体结合后诱导的对刻缺蛋白1的蛋白水解切割的抗刻缺蛋白1NRR抗体。对应于此类抗刻缺蛋白1NRR抗体的Fv克隆可以如下选择：(1)如上所述自噬菌体文库分离抗刻缺蛋白1NRR克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所述群体来扩增所分离的噬菌体克隆群体；(2)对想要阻断活性的刻缺蛋白1NRR和想要不阻断活性的第二蛋白质进行选择；(3)将抗刻缺蛋白1NRR噬菌体克隆吸附至固定化的刻缺蛋白1NRR；(4)使用过量的所述第二蛋白质洗脱任何不想要的克隆，它们识别与所述第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享的刻缺蛋白1NRR结合决定簇；并(5)洗脱在步骤(4)后保持吸附的克隆。任选地，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。

本发明的编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得期望单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Rev.，130：151(1992)。

本发明的编码Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长或部分重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在一个优选的实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成完全人的、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。

还可以修饰本发明的编码衍生自杂交瘤的抗刻缺蛋白1NRR抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。通过共价接合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列，可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

抗体片段

本发明涵盖抗体片段。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如WO 93/16185；美国专利No.5,571，894；及5,587,458)。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合物。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

人源化抗体

本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，即用(非人)高变区序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质性地涉及对抗原结合的影响。

人抗体

本发明的人抗刻缺蛋白1NRR抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗刻缺蛋白1NRR抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991).

现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year inImmunol.7：33(1993)。

基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如上所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复了在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后遭到破坏的抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。

双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体。在本案中，结合特异性之一针对刻缺蛋白1NRR，另一结合特异性针对任何其它抗原。例示性的双特异性抗体可结合刻缺蛋白1NRR的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达刻缺蛋白1NRR的细胞。这些抗体拥有刻缺蛋白1NRR结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异性抗体)。

用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991)。

依照一种不同且更优选的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、C_H2和C_H3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(C_H1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相等比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methodsin Enzymology 121：210(1986)。

依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域C_H3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/00373；和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。

文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。

还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。

涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。

多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，所述多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL域。

抗体变体

在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成而制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体氨基酸序列。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展示出功能敏感性的氨基酸位置。如此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。

多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。

若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US 2003/0157108(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利No.6,602,684(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改的碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana等)。

本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；及WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004))。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表1中称为“例示替代”的更多实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。

表1

对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；及

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改良的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。将如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在本发明的免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄Fc区)。

依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

抗体衍生物

可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了一个以上的聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗等。

筛选具有期望性质的抗体

本发明的抗体可以用本领域已知的各种测定法对其物理/化学性质和生物学功能进行表征。在有些实施方案中，抗体表征为如下任一项或多项：减弱或者阻断刻缺蛋白1活化，减弱或者阻断刻缺蛋白1下游分子信号传导，破坏或者阻断刻缺蛋白1结合配体(例如锯齿蛋白1、锯齿蛋白2、德耳塔样1、德耳塔样3、或德耳塔样4)，和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增殖性病症或癌症，和/或治疗或预防与刻缺蛋白1表达和/或活性(诸如升高的刻缺蛋白1表达和/或活性)有关的病症。在其它实施方案中，抗体表征为如下任一项或多项：诱导或提高刻缺蛋白1活化，诱导或提高刻缺蛋白1下游分子信号传导、和/或治疗或预防与刻缺蛋白1表达和/或活性有关的病症。

纯化的抗体还可以通过一系列测定法进行表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。

在本发明的某些实施方案中，对此处制备的抗体分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的抗体检验它们的抗原结合活性。本领域已知的并且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括但不限于利用诸如以下技术的任何直接的或竞争性的结合测定法：Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心式/三明治式”免疫测定法、免测沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。在下面的实施例部分提供例示性的抗原结合测定法。

在又一个实施方案中，本发明提供了与抗体A、抗体A-1、抗体A-2、或/或抗体A-3竞争与刻缺蛋白1NRR结合的抗刻缺蛋白1NRR单克隆抗体。此类竞争抗体包括识别与抗体A、抗体A-1、抗体A-2、和/或抗体A-3所识别的刻缺蛋白1NRR表位相同或交叠的刻缺蛋白1NRR表位的抗体。此类竞争抗体可通过对抗刻缺蛋白1NRR杂交瘤上清液筛选在与经标记抗体A、抗体A-1、抗体A-2、和/或抗体A-3的竞争中对固定化刻缺蛋白1NRR的结合来得到。含有竞争抗体的杂交瘤上清液，与在含有无关抗体(或不含抗体)的对照结合混合液中检测到结合的经标记抗体的量相比，降低在受试竞争结合混合液中检测到的结合的经标记抗体的量。本文所述任何竞争结合测定法均适合于在上述规程中使用。

在另一个方面，本发明提供了包含抗体A、抗体A-1、抗体A-2、和/或抗体A-3的一个或多个(诸如2、3、4、5、和/或6个)HVR的抗刻缺蛋白1NRR单克隆抗体。包含抗体A、抗体A-1、抗体A-2、和/或抗体A-3的一个或多个HVR的抗刻缺蛋白1NRR单克隆抗体可通过将抗体A、抗体A-1、抗体A-2、和/或抗体A-3的一个或多个HVR嫁接到模板抗体序列(例如最接近亲本抗体鼠序列的人抗体序列、或特定亚组亲本抗体轻链或重链的所有人抗体的共有序列)上并在重组宿主细胞中表达所得嵌合轻链和/或重链可变区(有或无伴随的恒定区序列)来构建，如本文中所描述的。

具有本文所述独特特性的本发明抗刻缺蛋白1NRR抗体可以如下得到，即通过任何便利的方法，根据期望特性，对抗刻缺蛋白1NRR杂交瘤克隆筛选。例如，如果需要阻断或不阻断刻缺蛋白1配体结合刻缺蛋白1的抗刻缺蛋白1NRR单克隆抗体，那么可以在结合竞争测定法中测试候选抗体，诸如竞争性结合ELISA，其中板孔用刻缺蛋白1包被，将刻缺蛋白1过量的抗体溶液铺到经过包被的板上，并酶法检测结合的抗体，例如使结合的抗体接触偶联有HRP的抗Ig抗体或生物素化抗Ig抗体并显现HRP显色反应，例如通过用链霉亲合素-HRP和/或过氧化氢使板显色并通过分光光度法用ELISA读板仪在490nm检测HRP显色反应。

如果想要抑制细胞生长的抗刻缺蛋白1NRR抗体，那么可以在测量细胞生长抑制的体外和/或体内测定法中测试候选抗体。此类测定法是本领域已知的，而且在本文中有描述和例示。

在一个实施方案中，本发明涵盖具有一些但不是全部效应器功能的已有变化的抗体，这使其成为许多应用的期望候选物，其中抗体在体内的半衰期很重要但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或者是有害的。在某些实施方案中，测量所生成的免疫球蛋白的Fc活性以确保只有期望性质得到保留。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺失FcγR结合(因此可能缺失ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页的表3概述了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362或5,821,337描述了用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的一个例子。可用于这些测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q从而缺失CDC活性。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述。也可以利用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定，例如实施例部分所描述的那些。

载体、宿主细胞、和重组方法

为了重组生产本发明抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因性特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。

a.使用原核宿主细胞生成抗体：

i.载体构建

可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于：复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，如此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的例子。

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM^TM-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。

本发明的表达载体可包含两种或更多启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(例如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等，Cell 20：269(1980))。

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA、和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。

在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba和Pluckthun，Gene 159：203(1995))。

适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的例子包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利No.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些例子只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。

ii.抗体生成

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因而，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等，J.Immunol.Methods 263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。

在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗透压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定法进一步分离和鉴定所表达多肽。

在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养较短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；Georgiou等人，美国专利No.6,083,715；Georgiou等人，美国专利No.6,027,888；Bothmann和Plückthun，J.Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm和Plückthun，J.Biol.Chem.275：17106-17113(2000)；Arie等，Mol.Microbiol.39：199-210(2001))。

为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI、及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly等，(1998)见上文；Georgiou等人，美国专利No.5,264,365；Georgiou等人，美国专利No.5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。

在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

iii.抗体纯化

可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的规程是合适纯化规程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

在一个方面，将固定化在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白A固定化其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异性粘附。

作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得感兴趣抗体特异性结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异性结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收感兴趣抗体。

b.使用真核宿主细胞生成抗体：

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(i)信号序列构件

在真核宿主细胞中使用的载体还可在感兴趣成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。

将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。

(ii)复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。

(iii)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。

选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，如此幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No.4,965,199。

(iv)启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便地以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便地以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改形式。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子元件构件

常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。

(vi)转录终止构件

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝肉瘤(hepatoma)系(Hep G2)。

为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

(viii)宿主细胞的培养

可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。

(ix)抗体的纯化

在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可将含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行。

免疫偶联物

本发明还提供了包含偶联有细胞毒剂的本文所述任何抗刻缺蛋白1NRR抗体的免疫偶联物(可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。

抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos，AnticancerResearch 19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer，Adv.Drug Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利No.4,975,278)容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等，Lancet 603-05(1986年3月15日)；Thorpe，“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等，Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler等，Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler等，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lode等，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。

(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的¹¹¹In或⁹⁰Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman等，Blood99(12)：4336-42(2002)；Witzig等，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig等，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM(gemtuzumab ozogamicin，WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future25(7)：686(2000)；美国专利No.4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab mertansine(ImmunogenInc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZLBiologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的Lewis Y特异)和cAC10(对血液学恶性肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina等，Nature Biotechnology 21(7)：778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。

本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。

本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。

i.美登素和美登木素生物碱类

在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体(全长或片段)。

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。

美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。

例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利No.5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x10⁵个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物程度相似的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。

抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235B1；Chari等，CancerResearch 52：127-131(1992)；2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。

ii.Auristatin和多拉司他汀

在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的本发明抗体(美国专利No.5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO 02/088172)。

例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands”，2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。

典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.和K.Lübke，The Peptides，卷1，pp 76-136，1965，Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：美国专利No.US 5,635,483和5,780,588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit等Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340，将其完整收入本文作为参考(披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法)。

iii.加利车霉素

在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；和5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。

iv.其它细胞毒剂

可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394和5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利No.5,877,296)。

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本发明还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(例如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbookand Catalog)第467-498页。

v.抗体-药物偶联物的制备

在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物模块。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。

Ab-(L-D)p    I

接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(″MC″)、马来酰亚氨基丙酰基(″MP″)、缬氨酸-瓜氨酸(″val-cit″)、丙氨酸-苯丙氨酸(″ala-phe″)、对氨基苄氧羰基(″PAB″)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(″SPP″)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(″SMCC′)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(″SIAB″)。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340，将其完整内容收入本文作为参考。

在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、硫醇基、和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会如此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。

还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子模块。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，BioconjugateChem.3：138-146(1992)；美国专利No.5,362,852)。此类醛可与药物模块或接头亲核体反应。

同样，药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对个体施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。

药用配制剂

通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000))混合来制备水溶液、冻干或其它干燥配制剂形式的包含本发明抗体的治疗用配制剂，供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。

活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于例如Remington：The Science and Practiceof Pharmacy第20版(2000)。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的免疫球蛋白在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。

用途

本发明的抗体可用于例如体外、回体(ex vivo)和体内治疗方法。

在一个方面，本发明提供了治疗或预防与刻缺蛋白1表达和/或活性(信号传导)升高有关的肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症的方法，该方法包括给需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在另一个方面，本发明提供了降低、抑制、或预防肿瘤或癌生长的方法，该方法包括给需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

此外，本发明的至少一些抗体可结合来自其它物种的抗原。想要的是，刻缺蛋白1NRR抗体结合人和小鼠二者的刻缺蛋白1NRR；想要的是，以1x10^-7或更强的Kd结合。因而，本发明的抗体可用于结合特定抗原活性，例如，在包含抗原的细胞培养物中、在人类个体中或在具有本发明抗体与之交叉反应的抗原的其它哺乳动物受试者中(例如黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴，猪或小鼠)。在一个实施方案中，本发明的抗体可用于抑制抗原活性，通过使抗体与抗原接触使得抗原活性受到抑制。优选的是，所述抗原是人蛋白质分子。

在一个实施方案中，本发明的抗体可用于结合患有与抗原表达和/或活性(信号传导)升高有关的病症的个体身体中抗原的方法，包括给个体施用本发明的抗体使得个体身体中的抗原得到结合。应当理解，升高的刻缺蛋白1活性(信号传导)涵盖由于刻缺蛋白活性性突变引起的升高的刻缺蛋白1活性、由于刻缺蛋白配体的表达和/或活性升高引起的升高的刻缺蛋白1活性、以及由于其它机制引起的升高的刻缺蛋白1活性。优选的是，所述抗原是人蛋白质分子且所述个体是人。或者，个体可以是表达本发明抗体所结合的抗原的哺乳动物。又或者，个体可以是其中导入了抗原(例如通过施用抗原或通过表达抗原转基因)的哺乳动物。可出于治疗目的将本发明的抗体施用于人个体。此外，可出于兽医目的将本发明的抗体施用于表达免疫球蛋白与之交叉反应的抗原的非人哺乳动物(例如灵长类动物、猪、或小鼠)，或是人疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评估本发明抗体的治疗功效(例如测试施药的剂量和时程)。

本发明的抗体可用于治疗、抑制、延缓进展、预防/延缓复发、改善或预防与一种或多种抗原分子的表达和/或活性相关的疾病、病症或疾患。

例示性的病症包括癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑、以及头颈癌、及相关转移。在有些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、和肝细胞癌。

本发明的抗体还可用于治疗(包括预防)其病理学涉及细胞变性或功能障碍的病症，诸如治疗各种(慢性)神经变性性病症和急性神经细胞损伤。此类神经变性性病症包括但不限于周围神经病；运动神经元病症，诸如肌萎缩性侧索硬化(ALS，Lou Gehrig氏病)、贝耳氏麻痹(Bell’s palsy)、和各种涉及脊髓性肌萎缩或麻痹的疾患；及其它人神经变性性疾病，诸如阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、癫痫、多发性硬化、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’s chorea)、唐氏综合征(Down’s Syndrome)、神经性聋、和梅尼尔氏病(Meniere’s disease)，和急性神经细胞损伤，例如由于创伤或脊髓损伤引起的。

刻缺蛋白1活性涉及各种干细胞系统和早期祖细胞系统的发育，在发育期和成年期均如此。参见例如Chirba，S.(2006)Stem Cells 24：2437-2447。因而，在另一个方面，本发明提供了用于扩增非终末分化的细胞(“前体细胞”)的方法，其通过调控前体细胞中的刻缺蛋白途径使得前体细胞分化得到抑制来进行。如本文中所使用的，“前体细胞”应当指任何非终末分化的细胞。前体细胞优选是干细胞或祖细胞。在有些实施方案中，本发明提供了用于扩增含有前体细胞的群体中的前体细胞的方法，其通过活化细胞中的刻缺蛋白途径使得干细胞分化得到抑制来进行。另外，如果需要，可以在刻缺蛋白途径活化之前或之后自细胞群体分离前体细胞。刻缺蛋白途径的活化优选通过使细胞接触抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体来实现。

本发明的一个实施方案是用刻缺蛋白途径的激动剂处理期望细胞群体，然后让这些细胞在培养中增殖，之后将它们移植回适宜区域中，或直接移植它们而无需让它们在体外增殖。拮抗剂可用于逆转或中和刻缺蛋白功能激动剂的作用。

可以通过本领域已知的、对于所移植的干细胞类型和移植部位而言适宜的任何方法将经过扩增的本发明干细胞群体移植入个体中进行对疾病或损伤的治疗或者进行基因疗法。造血干细胞可以静脉内移植，正如会定位至肝的肝干细胞也能这样移植。神经干细胞可以在损伤或疾病部位处直接移植入脑中。

在本文所述抗刻缺蛋白1NRR拮抗性抗体的使用之外，抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体作为用于调控与刻缺蛋白1表达和/或活性和/或对任何生物学相关刻缺蛋白1和/或刻缺蛋白1配体生物学途径的破坏有关的疾病状态的治疗方法或组合物而言也是有用的。

在一个方面，本发明提供了用于治疗或预防免疫学病症的方法，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体。在有些实施方案中，所述免疫学病症是源自异常T细胞发育或调节的免疫学病症(参见例如McKenzie et al.，Expert.Opin.Ther.Targets 9：395-410，2005)。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防自身免疫性疾病的方法，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体。在有些实施方案中，所述自身免疫性疾病是自身免疫性糖尿病、多发性硬化、或类风湿性关节炎。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防移植物排斥的方法，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体(agonist antibody)。

在又一个方面，本发明提供了用于促进组织再生和/或修复的方法，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR激动性抗体。在有些实施方案中，该方法涉及促进骨骼肌或心肌或骨的再生和/或修复。

本发明还提供了对于调控与刻缺蛋白1表达和/或活性(诸如升高的或降低的表达和/或活性，或不想要的表达和/或活性)有关的疾病状态而言有用的方法和组合物。

在一个方面，本发明提供了用于治疗或预防与升高的刻缺蛋白1表达和/或活性有关的肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症的方法，该方法包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在一个方面，本发明提供了用于抑制血管发生的方法，包括对需要此类治疗的个体施用有效量的抗刻缺蛋白1NRR抗体。

在一个方面，本发明提供了用于治疗与血管发生有关的病理性疾患的方法，包括对需要此类治疗的个体施用有效量抗刻缺蛋白1NRR抗体。在有些实施方案中，所述与血管发生有关的病理性疾患是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，所述与血管发生有关的病理性疾患是眼内新血管疾病。

在某些实施方案中，将包含偶联有一种或多种细胞毒剂的抗体的免疫偶联物施用于个体。在有些实施方案中，免疫偶联物和/或它所结合的抗原由细胞内在化，导致免疫偶联物杀伤它所结合的靶细胞的治疗功效提高。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰微管聚合。此类细胞毒剂的例子包括本文所述任何化疗剂(诸如美登木素生物碱类、auristatin、多拉司他汀、或加利车霉素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA内切核酸酶。

在治疗中，本发明的抗体可单独使用，或者与其它组合物联用。例如，本发明的抗体可与另一种抗体、化疗剂(包括化疗剂混合物)、其它细胞毒剂、抗血管发生剂、细胞因子、和/或生长抑制剂共施用。当本发明的抗体抑制肿瘤生长时，可能特别希望将其联合一种或多种同样抑制肿瘤生长的其它治疗剂。或者/另外，个体可接受联合放射疗法(例如外部射束照射或使用放射性标记药剂诸如抗体的疗法)。上文所述此类联合疗法包括联合施药(当两种或多种药剂包含在相同或分开的配制剂中时)和分开施药，在后一种情况中，本发明抗体的施用可发生在辅助疗法的施用之前和/或之后。

联合疗法

如上所述，本发明提供了联合疗法，其中抗刻缺蛋白1NRR抗体与另一疗法一起施用。例如，抗刻缺蛋白1NRR抗体与抗癌治疗剂或抗新血管形成治疗剂联合使用以治疗各种赘生性或非赘生性疾患。在一个实施方案中，所述赘生性或非赘生性疾患的特征在于与异常或不想要的血管发生有关的病理学病症。抗刻缺蛋白1NRR抗体可以与对那些目的有效的另一药剂顺次或联合施用，或是在同一组合物中或是作为分开的组合物。或者/另外，可以施用刻缺蛋白1的多种抑制剂。

抗刻缺蛋白1NRR抗体的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或更多不同的组合物，使用相同或不同的施用路径。或者/另外，施药可以以任一次序顺次进行。

在某些实施方案中，两次或更多组合物施用之间可以有范围为数分钟、至数天、至数周、至数月的时间间隔。例如，可以先施用抗癌剂，接着是刻缺蛋白1抑制剂。然而，也涵盖同时施用或先施用抗刻缺蛋白1NRR抗体。

与抗刻缺蛋白1NRR抗体联合施用的治疗剂的有效量取决于医师或兽医的判断。完成剂量施用和调整以实现对待治疗疾患的最大控制。此外剂量取决于诸如待使用的治疗剂的类型和所治疗的特定个体等因素。抗癌剂的合适剂量就是当前所用的那些，而且可以由于抗癌剂与抗刻缺蛋白1NRR抗体的联合作用(协同作用)而降低。在某些实施方案中，抑制剂的组合增强单一抑制剂的功效。术语“增强”指治疗剂在其常用或批准的剂量功效得到提高。

典型的是，抗刻缺蛋白1NRR抗体和抗癌剂适于相同或相似的疾病以阻断或降低病理学病症，诸如肿瘤生长或癌细胞生长。在一个实施方案中，所述抗癌剂是抗血管发生剂。

例示性的抗癌剂包括烷化剂、叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、细胞毒性抗生素、铂化合物或基于铂的化合物、紫杉烷、长春花生物碱、c-Kit抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、抗血管发生抑制剂诸如抗VEGF抑制剂、HER-2抑制剂、EGFR抑制剂或双重EGFR/HER-2激酶抑制剂、抗雌激素诸如氟维司群(fulvestrant)、和激素疗法药剂诸如卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、表柔比星(epirubicin)、他莫昔芬(tamoxifen)、芳香酶抑制剂、和泼尼松(prednisone)。在一些实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌，且所述第二药物是EGFR抑制剂诸如erlotinib、抗VEGF抑制剂诸如贝伐单抗(bevacizumab)，或者是西妥昔单抗(cetuximab)、arinotecan、伊立替康(irinotecan)、或FOLFOX，或者所述癌症是乳腺癌，且所述第二药物是抗雌激素调控剂，诸如氟维司群、他莫昔芬或芳香酶抑制剂诸如来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、或阿那曲唑(anastrozole)，或者是VEGF抑制剂，诸如贝伐单抗，或者是化疗剂，诸如多柔比星(doxorubicin)和/或紫杉烷诸如帕利他塞(paclitaxel)，或者是抗HER-2抑制剂，诸如曲妥单抗(trastuzumab)，或双重EGFR/HER-2激酶抑制剂，诸如lapatinib或HER-2下调剂，诸如17AAG(格尔德霉素衍生物，是一种热休克蛋白[Hsp]90毒物)(例如用于用曲妥单抗治疗仍进展的乳腺癌)。在其它实施方案中，所述癌症是肺癌，诸如小细胞肺癌，且所述第二药物是VEGF抑制剂(诸如贝伐单抗)或EGFR抑制剂(诸如例如erlotinib)或c-Kit抑制剂(诸如例如imatinib)。

与癌症有关的抗血管发生疗法是致力于抑制为支持肿瘤生长而提供养分所需要的肿瘤血管发育的癌症治疗策略。因为血管发生涉及原发性肿瘤生长和转移二者，所以本发明提供的抗血管发生治疗不但能够在原发性位点抑制肿瘤的赘生性生长，而且能够预防肿瘤在继发性位点的转移，从而容许由其它治疗剂攻击肿瘤。

本领域已经鉴定和知道许多抗血管发生剂，包括本文所列的那些，例如定义中所列的，还可参见例如Carmeliet和Jain，Nature 407：249-257(2000)；Ferrara等，Nature Reviews：Drug Discovery，3：391-400(2004)；Sato，Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)。还可参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，抗刻缺蛋白1NRR抗体与抗VEGF中和性抗体(或片段)和/或另一VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂(包括但不限于例如可溶性VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、neuropillins(例如NRP1、NRP2))片段)、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制剂、VEGF的反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗性变体、及其任意组合联合使用。或者/另外，任选的是，可以在VEGF拮抗剂和其它药剂外对个体共施用两种或更多血管发生抑制剂。在某些实施方案中，可以与抗刻缺蛋白1NRR抗体、VEGF拮抗剂和抗血管发生剂联合施用一种或多种别的治疗剂，例如抗癌剂。

在本发明的某些方面，可用于抗刻缺蛋白1NRR抗体的联合肿瘤疗法的其它治疗剂包括其它癌症疗法(例如手术、放射学治疗(例如涉及照射或施用放射性物质)、化疗、本文所列和本领域知道的抗癌剂的治疗、或其组合)。或者/另外，结合本文披露的相同抗原或两种或更多本文披露的不同抗原的两种或更多种抗体可以共施用于个体。有时，还对个体施用一种或多种细胞因子可能是有益的。

化疗剂

在某些方面，本发明提供了阻断或降低肿瘤生长或癌细胞生长的方法，其通过给对癌症易感或诊断有癌症的个体施用有效量的刻缺蛋白1拮抗剂和/或血管发生抑制剂和一种或多种化疗剂来实现。多种化疗剂可用于本发明的联合治疗方法。本文在“定义”中提供了所涵盖的化疗剂的例示性和非限制性列表，而且上文描述了一些。

正如本领域普通技术人员会理解的，化疗剂的适宜剂量一般会在单独或联合其它化疗剂施用该化疗剂的临床疗法中早就采用的那些剂量附近。根据所治疗的疾患，剂量有可能发生变化。施行治疗的医师能够为个体确定适宜的剂量。

复发性肿瘤生长

本发明还提供了用于抑制或预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述正在接受一种或多种当前可用疗法(例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特别是特定癌症的标准治疗方案)或用一种或多种当前可用疗法治疗过的个体在临床上不足以治疗该个体或不再由该疗法取得任何有益效果使得这些个体需要别的有效疗法的状况。在用于本文时，该表述还指“无响应/顽固性”个体的状况，例如描述个体对疗法有响应但遭受副作用、形成抗性、对疗法不响应、对疗法的响应不令人满意等。在各种实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞数目没有显著的减少，或者增多了，或者肿瘤尺寸没有显著的缩小，或者增大了，或者癌细胞的尺寸或数目未能任何进一步缩小或减少。确定癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长可以在体内或在体外进行，通过本领域知道的用于测定治疗对癌细胞有效性的任何方法，在这样的语境中使用本领域公认的“复发性”或“顽固性”或“无响应”的含义。对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤是复发性肿瘤生长的一个例子。

本发明提供了在个体中阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，其通过施用一种或多种抗刻缺蛋白1NRR抗体以阻断或降低个体中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长来实现。在某些实施方案中，可以在癌症治疗剂之后施用拮抗剂。在其它实施方案中，与癌症疗法同时施用抗刻缺蛋白1NRR抗体。或者/另外，抗刻缺蛋白1NRR抗体疗法与另一癌症疗法交替施行，这可以以任意次序进行。本发明还涵盖施用一种或多种抑制性抗体来预防癌症在有癌症素因的个体中发作或复发的方法。一般地，所述个体当前正在接受癌症疗法。在一个实施方案中，癌症疗法是使用抗血管发生剂例如VEGF拮抗剂的治疗。抗血管发生剂包括本领域知道的那些和本文定义中所列的那些。在一个实施方案中，抗血管发生剂是抗VEGF中和性抗体或片段(例如人源化A4.6.1、(Genentech，South San Francisco，CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。参见例如美国专利6,582,959，6,884,879，6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请20030206899，20030190317，20030203409，20050112126；Popkov等，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)；及WO2005012359。别的药剂可以与VEGF拮抗剂和抗刻缺蛋白1NRR抗体联合施用以阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，例如见本文中标题为“联合疗法”的部分。

依照已知方法给个体(例如人类患者)施用本发明的化合物(例如抗刻缺蛋白1NRR抗体)，诸如静脉内施用(像推注或通过一段时间里的连续输注)，通过例如表面、或吸入路径，胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及(如果想要局部治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、脑脊髓内、滑膜内、鞘内、或皮下施用。如果对刻缺蛋白1信号传导的抑制与广泛的副作用或毒性有关，那么局部施用是特别想要的。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及例如用编码抗刻缺蛋白1NRR抗体的多核苷酸转染或转导自个体获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回个体。细胞可以是极其多种类型之任一，包括但不限于造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。

另外，合适的是，可以通过脉冲输注来施用抗体，特别是使用递减剂量的抗体。优选的是，通过注射给予剂量给药，最优选的是，通过静脉内或皮下注射给予剂量给药，这部分取决于施药是短期的还是长期的。

在另一个例子中，在病症或肿瘤位置允许时，局部施用抗刻缺蛋白1NRR抗体，例如通过直接注射，而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地/全身地将抗刻缺蛋白1NRR抗体投递至个体或直接投递至肿瘤细胞，例如肿瘤或肿瘤床，用以预防或降低局部复发或转移。

或者，可以将含有编码抗刻缺蛋白1NRR抗体的核酸序列的抑制性核酸分子或多核苷酸投递至个体中的适宜细胞。在某些实施方案中，可以将所述核酸导向肿瘤自身。

可以通过对于所采用的载体而言适宜的任何手段将核酸导入细胞中。许多此类方法是本领域公知的(Sambrook et al.，supra，和Watson et al.，Recombinant DNA，Chapter 12，2d edition，Scientific American Books，1992)。基因投递方法的例子包括脂质体介导的转染、电穿孔、磷酸钙/DEAE右旋糖苷法、基因枪、和显微注射。

剂量给药可以通过任何合适的路径来进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施药是短期的还是长期的。可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。

对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适宜剂量(当单独使用或者与其它药剂诸如化疗剂联用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、个体的临床史和对抗体的应答、及主治医师的判断。将抗体一次性或者在一系列治疗中适当的施用于个体。根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体是施用于个体的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约1μg/kg到100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。抗体的例示性剂量的范围为大约0.05mg/kg到大约10mg/kg。如此，可以给个体施用大约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。所述剂可以间歇施用，例如每周或每三周(一次)(例如使得个体接受大约2到大约20，例如大约6剂抗体)。可以施用一剂较高的初始加载剂(loading dose)，接着是一剂或多剂较低的后续剂。一种例示性的剂量给药方案包括施用一剂大约4mg/kg的初始加载剂，继之以每周一剂的大约2mg/kg抗体的维持剂。然而，其它剂量方案可能也是有用的。可以方便地通过常规技术和测定法来监测这种疗法的进展。

本发明的抗刻缺蛋白1NRR抗体也可用于检测特定细胞或组织中的刻缺蛋白1表达的测定法(诸如诊断或预后测定法)，其中所述抗体如下所述进行标记和/或固定化在不溶性基质上。

另一方面，本发明提供了用于检测刻缺蛋白1的方法，该方法包括检测样品中的刻缺蛋白1-抗刻缺蛋白1NRR抗体复合物。术语“检测”在用于本文时包括定性和/或定量检测(测量水平)，有或无参照对照。

另一方面，本发明提供了诊断与刻缺蛋白1表达和/或活性有关的病症的方法，该方法包括对来自患有或怀疑患有所述病症的个体的生物学样品检测刻缺蛋白1-抗刻缺蛋白1NRR抗体复合物。在一些实施方案中，刻缺蛋白1表达是升高的表达或异常(不想要)的表达。在一些实施方案中，所述病症是肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。作为检测刻缺蛋白1表达的替代/在检测刻缺蛋白1表达之外，在本文所述诊断或治疗方法中，可以测定生物学样品中刻缺蛋白1配体的表达。刻缺蛋白1配体表达可使用本领域标准方法来测定。

另一方面，本发明提供了本文所述任何抗刻缺蛋白1NRR抗体，其中所述抗刻缺蛋白1NRR抗体包含可检测的标记物。

另一方面，本发明提供了本文所述任何抗刻缺蛋白1NRR抗体与刻缺蛋白1的复合物。在一些实施方案中，复合物是体内的或体外的。在一些实施方案中，所述复合物包含癌细胞。在一些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1NRR抗体是可检测标记的。

抗刻缺蛋白1NRR抗体可用于大量公知检测测定法中任一种的刻缺蛋白1检测。例如，可以如下对生物学样品测定刻缺蛋白1，即从期望来源获得样品，将样品与抗刻缺蛋白1NRR抗体混合以允许抗体与混合物中存在的任何刻缺蛋白1形成抗体/刻缺蛋白1复合物，并检测混合物中存在的任何抗体/刻缺蛋白1复合物。可以通过本领域已知的适于特定样品的方法制备生物学样品供测定法用。根据所使用的测定法的类型来选择混合样品与抗体的方法和检测抗体/刻缺蛋白1复合物的方法。此类测定法包括免疫组织化学、竞争性和三明治/夹心式测定法、和空间阻抑测定法(steric inhibition assay)。

刻缺蛋白1的分析方法均使用一种或多种以下试剂：经过标记的刻缺蛋白1类似物、固定化的刻缺蛋白1类似物、经过标记的抗刻缺蛋白1NRR抗体、固定化的抗刻缺蛋白1NRR抗体和空间偶联物。经过标记的试剂还称为“示踪剂”。

使用的标记物是不干扰刻缺蛋白1与抗刻缺蛋白1NRR抗体结合的任何可检测官能团。许多标记物已知用于免疫测定法，例子包括可以直接检测的模块，诸如荧光染料、化学发光和放射性标记物，以及必须反应或衍生化才能检测的模块，诸如酶。此类标记物的例子包括放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联有使用过氧化氢来氧化染料前体的酶诸如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定自由基，等等。

已经有将这些标记物共价结合至蛋白质或多肽的常规方法。例如，偶联剂诸如二醛、碳二亚胺、双马来酰亚胺、双亚氨酸酯、双重氮化联苯胺等可用于给抗体标记上上述荧光、化学发光和酶标记物。参见例如美国专利No.3,940,475(荧光测定法)和3,645,090(酶)；Hunter等，Nature，144：945(1962)；David等，Biochemistry，13：1014-1021(1974)；Pain等，J.Immunol.Methods，40：219-230(1981)；及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407-412(1982)。本文中优选的标记物是酶，诸如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。将此类标记物(包括酶)与抗体偶联对于熟悉免疫测定技术的普通技术人员来说是一种标准操作规程。参见例如O′Sullivan等，″Methods for the Preparation ofEnzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay″，于Methods inEnzymology，J.J.Langone和H.Van Vunakis编，卷73(Academic Press，NewYork，New York，1981)，pp.147-166。

某些测定法需要试剂的固定化。固定化能够将抗刻缺蛋白1NRR抗体与仍然在溶液中游离的任何刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR分开。为此，或是通过吸附至不溶于水的基质或表面(Bennich等，美国专利No.3,720,760)、通过共价偶联(例如利用戊二醛交联)在测定法规程前使抗刻缺蛋白1NRR抗体或刻缺蛋白1NRR类似物不溶解，或是例如通过免疫沉淀，在测定法规程之后使抗刻缺蛋白1抗体或刻缺蛋白1NRR类似物不溶解。

可以利用免疫组织化学和染色方案来检查样品中的蛋白质表达。组织切片的免疫组织化学染色已经证明是一种评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体来探查和显现原位细胞抗原，通常通过显色或者荧光方法。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物(典型的是人)的组织或细胞样品。样品的例子包括但不限于癌细胞，诸如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、和白血病癌细胞。可以通过本领域已知的多种规程来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。可以通过常规方法来固定(即保存)组织样品。本领域普通技术人员将领会，固定剂的选择由样品是用于组织学染色还是其它分析的目的来决定。本领域普通技术人员还将领会，固定时长取决于组织样品的大小和所使用的固定剂。

IHC可以与别的技术诸如形态学染色和/或荧光原位杂交一起实施。现有两种常用的IHC方法：直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接测定抗体与靶抗原(例如刻缺蛋白1NRR)的结合。这种直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的第一抗体(primary antibody)，其不需要进一步的抗体相互作用就能显现。在一种典型的间接测定法中，未偶联的第一抗体结合至抗原，然后经过标记的第二抗体(secondary antibody)结合至第一抗体。若第二抗体偶联有酶标记物，则添加显色底物或荧光底物以提供抗原的显现。因为数个第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应，所以发生信号放大。

用于免疫组织化学的第一和/或第二抗体通常用可检测模块进行标记。现有多种标记物，它们通常可以分成下列类型：

在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行加热(参见例如Leong等Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。

在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选地，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化显色底物诸如3，3′-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是家兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗家兔抗体)。

可以将如此制备的标本放置好并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。染色强度标准可以如下评估：

表2

  染色样式  得分  在细胞中没有观察到染色。  0  在超过10％的细胞中检测到微弱/刚刚可察觉的染色。  1+  在超过10％的细胞中观察到弱至中等的染色。  2+  在超过10％的细胞中观察到中等至强的染色。  3+

典型的，在IHC测定法中得分为约2+或更高的染色样式是诊断性和/或预后性的。在有些实施方案中，得分为约1+或更高的染色样式是诊断性和/或预后性的。在其它实施方案中，得分为约3或更高的染色样式是诊断性和/或预后性的。应当理解，在使用IHC检查来自肿瘤或结肠腺瘤的细胞和/或组织时，一般测定或评估肿瘤细胞和/或组织(而非样品中可能存在的基质或周围组织)中的染色。

称为竞争性或者夹心测定法的其它测定法已经明确建立并广泛用于商业诊断工业。

竞争分析法依赖于显迹物刻缺蛋白1NRR类似物与待测样品刻缺蛋白1NRR竞争有限量的抗刻缺蛋白1NRR抗体抗原结合位点的能力。竞争前后抗刻缺蛋白1NRR抗体通常是不溶解的，然后将结合抗刻缺蛋白1NRR抗体的显迹物和刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR与未结合的显迹物和刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR分离。通过轻轻倒出(其中结合伴侣是预先不溶解的)或者通过离心(其中结合伴侣在竞争反应后沉淀)实现这种分离。待测样品刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR的量与结合的显迹物的量成反比，所述结合显迹物的量通过标记物质的量测定。绘制刻缺蛋白1NRR已知量的剂量应答曲线，与试验结果进行比较以定量确定待测样品中存在的刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR的量。当使用酶作为可检测标记物时，这些测定法被称为ELISA系统。

称为“均相”测定法的另一种竞争分析法不需要相分离。此处，制备并使用酶与刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR的偶联物，这样的话当抗刻缺蛋白1NRR抗体结合刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR时，抗刻缺蛋白1NRR抗体的存在改变酶活性。在这种情况下，刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR或者其免疫活性片段与双功能有机桥偶联到酶例如过氧化物酶上。选择偶联物以与抗刻缺蛋白1NRR抗体一起使用以便抗刻缺蛋白1NRR抗体的结合抑制或者增强标记物的酶活性。该方法本身被广泛使用，称作EMIT。

空间偶联物用于均相测定法的位阻方法。通过将低分子量半抗原共价连接到小刻缺蛋白1NRR片段来合成这些偶联物，以便针对半抗原的抗体基本上不会与抗刻缺蛋白1NRR抗体同时结合偶联物。在此测定步骤下待测样品中存在的刻缺蛋白1NRR将结合抗刻缺蛋白1NRR抗体，从而允许抗半抗原结合所述偶联物，导致偶联物的半抗原特性的变化，例如，当半抗原是荧光基团时荧光的变化。

夹心测定法尤其可用于刻缺蛋白1、刻缺蛋白1NRR或抗刻缺蛋白1NRR抗体的测定。在顺次夹心测定法(sequential sandwich assays)中固定化的抗刻缺蛋白1NRR抗体用于吸附待测样品刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR，通过洗涤去除待测样品，结合的刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR用于吸附经过标记的第二抗刻缺蛋白1NRR抗体，然后从残余显迹物中分离结合的材料。结合显迹物的量与待测样品刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR成正比。“平行”夹心测定法中在添加经过标记的抗刻缺蛋白1NRR前不分离待测样品。使用抗刻缺蛋白1NRR单克隆抗体作为一种抗体和多克隆抗刻缺蛋白1NRR抗体作为另一种抗体的顺次夹心测定法可用于检测样品中的刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR。

上文仅仅是刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR的示范性检测分析法。现在或者此后发展的使用抗刻缺蛋白1NRR抗体测定刻缺蛋白1或刻缺蛋白1NRR的其它方法均包括在本发明范围内，包括此处描述的生物测定法。

在一个方面，本发明提供了在来自个体(诸如人个体)的生物学样品中检测多核苷酸(例如刻缺蛋白1多核苷酸)(例如存在或缺失或者量)的方法。可采用多种用于检测多核苷酸的方法，包括例如RT-PCR、基因表达测定法、扩增法、多核苷酸微阵列、诸如此类。

用于检测多核苷酸(诸如mRNA)的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经标记刻缺蛋白1RNA探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(诸如使用对刻缺蛋白1特异性的互补引物的RT-PCR，及其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SPIA(单一引物等温扩增)、Ribo-SPIA、SISBA、NASBA(基于核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)等等)。

例如可以使用Northern印迹、点印迹、或PCR分析对来自哺乳动物的生物学样品测定刻缺蛋白1mRNA。例如，RT-PCR测定法(诸如定量PCR测定法)是本领域众所周知的。在本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中的刻缺蛋白1mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；使用刻缺蛋白1多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此生成的cDNA以扩增其中的刻缺蛋白1cDNA；并检测所扩增刻缺蛋白1cDNA的存在或缺失。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中刻缺蛋白1mRNA的量(水平)(例如通过同时检验“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。任选的是，可以测定所扩增刻缺蛋白1cDNA的序列。

探针和/或引物可以用可检测标记物标记，诸如例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此类探针和引物可用于检测样品中刻缺蛋白1多核苷酸的存在，及用作检测表达刻缺蛋白1蛋白的细胞的手段。正如技术人员将会理解的，例如基于本文中所提供的序列，可以制备很多种不同引物和探针，并有效用于扩增、克隆和/或测定刻缺蛋白1mRNA的存在或缺失和/或量。

本发明的任选方法包括如下方案，其包含使用微阵列技术检测组织或细胞样品中的多核苷酸，诸如刻缺蛋白1多核苷酸。例如，使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将所述探针杂交至在固体支持物上的固定化的核酸阵列。所述该阵列配置成阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将有可能在某些疾病状态中表达的基因选集在固体支持物上形成阵列。经标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在单一实验中评估数以千计基因的mRNA表达序型(expression profile)(参见例如2001年10月11日公布的WO 01/75166；参见例如美国专利No.5,700,637；美国专利No.5,445,934；美国专利No.5,807,522；Lockart，NatureBiotechnology，14：1675-1680(1996)；及Cheung，V.G.et al.，Nature Genetics21(Suppl)：15-19(1999)，关于阵列制作的讨论)。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段或是在玻璃或其它基质上直接合成或是点到玻璃或其它基质上。单一阵列中通常呈现数以千计的基因。一个典型的微阵列实验涉及以下步骤：(1)自分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物；(2)将经标记的靶物杂交至微阵列；(3)清洗，染色，和扫描阵列；(4)分析扫描图像；并(5)生成基因表达序型。当前使用两种主要类型的DNA微阵列：包含自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列和寡核苷酸(通常25-70聚物)阵列。在形成阵列时，寡核苷酸可以是预制并点到表面上的，或者是直接在表面上合成的(原位)。

Affymetrix系统是包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列的商品化微阵列系统。探针/基因阵列：寡核苷酸(“寡聚物”)(通常25聚物)通过组合基于半导体的光刻和固相化学合成技术直接合成到玻璃晶片上。每个阵列包含多至400,000种不同寡核苷酸，每种寡核苷酸以数以百万计拷贝存在。因为寡核苷酸探针是在阵列上已知位置合成的，所以杂交样式和信号强度可以通过Affymetrix Microarray Suite软件解读成基因身份和相对表达水平。每种基因通过一系列不同寡核苷酸探针呈现在阵列上。每个探针对由完全匹配寡核苷酸和错配寡核苷酸组成。完全匹配探针具有与特定基因精确互补的序列，因而测量该基因的表达。错配探针因中央碱基位置的单一碱基替代而不同于完全匹配探针，从而扰乱了靶基因转录物的结合。这有助于对促成对完全匹配寡核苷酸测得的信号的背景和非特异性杂交的测定。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配探针的杂交强度中扣除，以确定每个探针集的绝对或特异强度。探针的选择基于GenBank和其它核苷酸库的当前信息。认为其序列识别基因3’末端的独特区域。使用基因芯片杂交炉(“电转烤炉”)来进行多至64个阵列的同时杂交。射流站实施探针阵列的清洗和染色。它是完全自动化的，包括四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由Microarray Suite软件使用预编程射流方案独立控制。扫描仪是共聚焦激光荧光扫描仪，其测量由结合至探针阵列的经标记cRNA发射的荧光强度。安装有Microarray Suite软件的计算机工作站控制射流站和扫描仪。Microarray Suite软件可以控制多至八个射流站，使用探针阵列的预编程的杂交、清洗、和染色方案。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜的算法将其转变成每种基因的有/无呼叫(presence/absence call)。最后，该软件通过比较分析来检测各实验间基因表达的变化，并将输出格式化为.txt文件，其可以与其它软件程序一起用于进一步的数据分析。

在有些实施方案中，检测刻缺蛋白1基因删除、基因突变、或基因扩增。基因删除、基因突变、或扩增可以通过本领域已知的任一种或多种方案来测量，例如常规Southern印迹、Northern印迹(用以量化mRNA转录)(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交(例如荧光原位杂交(“FISH”))，其中使用适当标记的探针、细胞发生法(cytogenetic method)或比较性基因组杂交(CGH)，其中使用适当标记的探针。另外，这些方法可用于检测缺刻蛋白1配体基因删除、配体突变、或基因扩增。如本文中所使用的，“检测刻缺蛋白1表达”涵盖刻缺蛋白1基因删除、基因突变、或基因扩增的检测。

另外，可以检验组织或细胞样品中刻缺蛋白1基因的甲基化状态。基因5’调控区中CpG岛的异常脱甲基化和/或超甲基化频繁地在永生化和转化细胞中发生，而且可导致各种基因改变的表达。多种用于检验基因甲基化状态的测定法是本领域公知的。例如，可以在Southern杂交办法中利用甲基化敏感性限制酶，其不能切割含有甲基化CpG位点的序列，用以评估CpG岛的甲基化状态。另外，MSP(甲基化特异性PCR)能快速地对给定基因的CpG岛中存在的所有CpG位点的甲基化状态制谱。此规程涉及亚硫酸氢钠(其会将所有未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶)对DNA的初始修饰，继以使用对甲基化(较之未甲基化)DNA特异性的引物进行的扩增。涉及甲基化干扰的方案还可见于例如Current Protocols In Molecular Biology，Unit 12，Frederick M.Ausubel et al.编，1995；De Marzo et al.，Am.J.Pathol.155(6)：1985-1992(1999)；Brooks et al.，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.7：531-536(1998))；及Lethe et al.，Int.J.Cancer 76(6)：903-908(1998)。如本文中所使用的，“检测刻缺蛋白1表达”涵盖刻缺蛋白1基因甲基化的检测。

制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述病症的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含别的细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患例如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二(或第三)容器，其中装有药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。

实施例

实施例1：用于生成抗刻缺蛋白1NRR抗体的免疫原的生成

人刻缺蛋白1NRR

含有人刻缺蛋白1NRR(hNotch1 NRR)的免疫原是如下得到的。

表达亚克隆

使用人刻缺蛋白1的全长克隆(GenBank编号NM_017617)作为参照序列和模板，设计了一套4种PCR引物来扩增刻缺蛋白1中跨越SEQ ID NO：56氨基酸V1307至Q1733的区域。此区域包括EGF重复34-36且在跨膜结构域前不远结束。5’引物设计成就在该基因特定序列上游添加N端Flag标签。使用不依赖限制性的克隆(Restriction Independent Cloning，RIC)规程，将与此域对应的PCR产物克隆入载体B9.1中，用于自Sf-9昆虫细胞分泌性表达。简言之，引物含有向使用Pfu聚合酶(Stratagene)生成的两种独立PCR产物添加限制性位点BamHI和EcoRI部分所需要的5’延伸。这些PCR产物的变性和退火生成了一群DNA，其中25％的产物在它们的5’和3’末端分别含有适宜于呈现BamHI和EcoRI突出端的核苷酸。然后将此DNA混合物连接入通过BamHI和EcoRI限制性消化准备好的B9.1载体中。所得构建体在DNA序列方面得到检验并命名为696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9。载体B9.1是改良形式的pACGP67杆状病毒DNA转移载体(BD Pharmingen)，其含有BamHI克隆位点前的Gp 67分泌信号、C端凝血酶切割位点和His标签。

下文显示了与人刻缺蛋白1构建体的克隆有关的序列：

PCR引物：

正向：

[Phosp]gatccGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG(SEQ ID NO：48)

反向：

cCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG(SEQ ID NO：49)

正向：

cGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG(SEQ ID NO：50)

反向：

[phosp]aattcCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG(SEQ ID NO：51)

大写字母代表刻缺蛋白1基因具体序列；小写字母代表所添加的限制性位点；

下划线代表Flag标签。

所表达蛋白质的DNA序列：

atgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacacaagcaagatggta

agcgctattgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcggcggat

cttggatccgattacaaagatgacgatgacaagggctctgtGTCATCAATGGCTGCAAA

GGCAAGCCCTGCAAGAATGGGGGCACCTGCGCCGTGGCCTCCAACACCGCCCGCGGGTTC

ATCTGCAAGTGCCCTGCGGGCTTCGAGGGCGCCACGTGTGAGAATGACGCTCGTACCTGC

GGCAGCCTGCGCTGCCTCAACGGCGGCACATGCATCTCCGGCCCGCGCAGCCCCACCTGC

CTGTGCCTGGGCCCCTTCACGGGCCCCGAATGCCAGTTCCCGGCCAGCAGCCCCTGCCTG

GGCGGCAACCCCTGCTACAACCAGGGGACCTGTGAGCCCACATCCGAGAGCCCCTTCTAC

CGTTGCCTGTGCCCCGCCAAATTCAACGGGCTCTTGTGCCACATCCTGGACTACAGCTTC

GGGGGTGGGGCCGGGCGCGACATCCCCCCGCCGCTGATCGAGGAGGCGTGCGAGCTGCCC

GAGTGCCAGGAGGACGCGGGCAACAAGGTCTGCAGCCTGCAGTGCAACAACCACGCGTGC

GGCTGGGACGGCGGTGACTGCTCCCTCAACTTCAATGACCCCTGGAAGAACTGCACGCAG

TCTCTGCAGTGCTGGAAGTACTTCAGTGACGGCCACTGTGACAGCCAGTGCAACTCAGCC

GGCTGCCTCTTCGACGGCTTTGACTGCCAGCGTGCGGAAGGCCAGTGCAACCCCCTGTAC

GACCAGTACTGCAAGGACCACTTCAGCGACGGGCACTGCGACCAGGGCTGCAACAGCGCG

GAGTGCGAGTGGGACGGGCTGGACTGTGCGGAGCATGTACCCGAGAGGCTGGCGGCCGGC

ACGCTGGTGGTGGTGGTGCTGATGCCGCCGGAGCAGCTGCGCAACAGCTCCTTCCACTTC

CTGCGGGAGCTCAGCCGCGTGCTGCACACCAACGTGGTCTTCAAGCGTGACGCACACGGC

CAGCAGATGATCTTCCCCTACTACGGCCGCGAGGAGGAGCTGCGCAAGCACCCCATCAAG

CGTGCCGCCGAGGGCTGGGCCGCACCTGACGCCCTGCTGGGCCAGGTGAAGGCCTCGCTG

CTCCCTGGTGGCAGCGAGGGTGGGCGGCGGCGGAGGGAGCTGGACCCCATGGACGTCCGC

GGCTCCATCGTCTACCTGGAGATTGACAACCGGCAGTGTGTGCAGGCCTCCTCGCAGTGC

TTCCAGAGTGCCACCGACGTGGCCGCATTCCTGGGAGCGCTCGCCTCGCTGGGCAGCCTC

AACATCCCCTACAAGATCGAGGCCGTGCAGAGTGAGACCGTGGAGCCGCCCCCGCCGGCG

CAGgaattcggtctggttccgcgtggcagcggtcatcaccatcaccatcac(SEQ ID NO：55)

所表达的蛋白质序列：

mllvnqshqgfnkehtskmvsaivlyvllaaaahsafaadlgsdykddddkgsgVINGCKGKPCKNGGTCAVASNTARGFICK

CPAGFEGATCENDARTCGSLRCLNGGTCISGPRSPTCLCLGPFTGPECQFPASSPCLGGNPCYNQGTC

EPTSESPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHA

CGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQ

YCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVVVVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRV

LHTNVVFKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRR

ELDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSETVEPPPPA

Qefglvprgsghhhhhh(SEQ ID NO：13)

大写字母代表刻缺蛋白1基因具体序列，而小写字母代表Gp67分泌信号、N端Flag标签、凝血酶位点、C端Flag标签、和任何由表达载体添加的残基。

杆状病毒原种生成和蛋白质生产

在Sf-9细胞中表达编码人刻缺蛋白1氨基酸V1307-Q1733的构建体。使用DNA转移载体[101V-1]：696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1(见表达亚克隆部分)生成杆状病毒原种。将转移载体DNA与BacPak6^TM线性化病毒DNA(BD Clontech，Palo Alto CA)和Bacfectin^TM(BD Clontech)一起依照制造商的推荐共转染入在ESF921无蛋白质培养基(Expression Systems LLC，Woodland CA.)中于27℃培养的贴壁的Sf-9昆虫细胞。将所得P1病毒原种扩增两次以生成P3病毒原种，用于大规模蛋白质生产。使用估算的感染复数(MOI)0.3病毒颗粒/每个细胞感染在ESF921培养基中以细胞密度1-2x10⁶个细胞/ml悬浮培养的Sf-9细胞并在感染后3-5天收获。通过离心除去Sf-9细胞，将所得病毒原种过滤以确保无菌性，并添加3％热灭活的胎牛血清(FBS)以稳定病毒。所有病毒保存于4℃。含有[101V-1]：696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1构建体的病毒原种显示出有效感染Sf-9细胞且表达病毒重组蛋白。

在11升和16升规模的两次发酵运行中表达[101V-1]：696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1构建体。使用适应了在无蛋白质培养基中悬浮培养的Sf-9细胞来进行发酵运行。以约2x10⁶个细胞/ml的密度自以相似操作条件运行的种子生物反应器接种细胞至生产容器。于27℃在ESF 921培养基中实施发酵，并使用需要时的喷射氧气和持续的顶空通气将溶解氧水平控制在50％空气饱和。根据所使用的容器，使用2个斜叶片叶轮或一个平叶片桨，以100rpm搅动操作生物反应器。细胞在24-48小时的时间段里生长至感染点，密度为约2.0-2.7x 10⁶个细胞/ml，然后以MOI 0.5病毒颗粒/细胞用编码刻缺蛋白1多肽的病毒原种感染。对细胞监测感染的迹象(生长停止、细胞直径增大)，并再培养65-72小时。将所得培养液冷却，通过离心来收获，并进行立即蛋白质纯化。

含人刻缺蛋白1NRR的免疫原的纯化

将来自表达由构建体696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1编码的多肽的SF9细胞的培养物上清液用冰冷的缓冲液A(50mM Hepes，pH7.5，150mM NaCl，5mM CaCl₂，和0.5mM苯基甲基磺酰氟)稀释(v/v＝1∶4)，并以每升培养液2ml树脂的比例分批结合至预平衡的Ni-NTA SF树脂(superflow resin)(Qiagen，产品编号30450)15-20分钟。通过经由0.8μm滤器(Nalgene，产品编号450-0080)过滤来收集Ni-NTA亲和树脂并随后装入适宜的重力滴落柱(gravity drip column)(d∶h 1∶10)中。将柱用10个柱体积(CV)的冰冷的缓冲液B(50mM Hepes，pH 7.5，1000mM NaCl，5mM CaCl₂，和10mM咪唑)，接着用10个CV的不含PMSF的缓冲液A清洗。然后将柱用5个CV的含有250mM咪唑(不含PMSF)的缓冲液A洗脱。将所洗脱的蛋白质使用Amicon Ultra浓缩器(3,000MWCO)浓缩并使用PD-10柱(GE Healthcare)依照制造商的推荐交换缓冲液入贮存缓冲液(10mM Hepes pH 7.5，150mMNaCl和5mM CaCl₂)。根据SDS-PAGE及Coomassie染色，蛋白质纯度估算为大于90％。通过Bradford测定法(Coomassie Plus试剂盒，Pierce，产品目录编号23236)估算纯化的蛋白质的浓度，使用BSA作为标准品。使用通过胰蛋白酶消化物的质谱术进行的肽测序来证实身份。

小鼠刻缺蛋白1NRR

含有小鼠刻缺蛋白1NRR(mNotch1 NRR)的免疫原是如下得到的。

基本上如上文关于人刻缺蛋白1免疫原所描述的那样，亚克隆并表达跨越小鼠刻缺蛋白1(SEQ ID NO：57)氨基酸V1307-Q1723的序列。小鼠刻缺蛋白1的此区域包括EGF重复34-36且在跨膜域前不远结束。表达免疫原的构建体称作64794.G1.Notch1.V1307-Q1723(N-Flag，C-His).pRK5-GNE。用于生成针对小鼠刻缺蛋白1的抗体的免疫原的所表达的蛋白质的氨基酸序列如下且含有N端FLAG标签和C端His标签：

MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRGKDYKD DDDKLEVING

CRGKPCKNGG VCAVASNTAR GFICRCPAGF EGATCENDAR

TCGSLRCLNG GTCISGPRSP TCLCLGSFTG PECQFPASSP

CVGSNPCYNQ GTCEPTSENP FYRCLCPAKF NGLLCHILDY

SFTGGAGRDI PPPQIEEACE LPECQVDAGN KVCNLQCNNH

ACGWDGGDCS LNFNDPWKNC TQSLQCWKYF SDGHCDSQCN

SAGCLFDGFD CQLTEGQCNP LYDQYCKDHF SDGHCDQGCN

SAECEWDGLD CAEHVPERLA AGTLVLVVLL PPDQLRNNSF

HFLRELSHVL HTNVVFKRDA QGQQMIFPYY GHEEELRKHP

IKRSTVGWAT SSLLPGTSGG RQRRELDPMD IRGSIVYLEI

DNRQCVQSSS QCFQSATDVA AFLGALASLG SLNIPYKIEA

VKSEPVEPPL PSQGSGHHHH HH  (SEQ ID NO：14)

上述序列的N端(SEQ ID NO：14的氨基酸MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRG)被表达该蛋白质的细胞切掉。如此，用于生成小鼠刻缺蛋白1NRR特异性抗体的免疫原缺少此N端序列。

蛋白质生产

在已经适应了无血清悬浮培养的Freestyle 293-F细胞(FreeStyle 293-F细胞，Invitrogen产品目录编号R790-07)中瞬时表达编码小鼠刻缺蛋白1氨基酸V1307-Q1723的构建体。

在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen产品目录编号12338-018)中培养细胞。以0.3-3x10⁶个存活细胞/ml的密度在摇瓶中维持细胞，于37℃在8％CO₂的增湿气氛中在以125rpm旋转的轨道摇床平台上温育。在转染前一天，以5x10⁵个存活细胞/ml的密度接种细胞。在转染那天，对细胞检查存活力和密度(大于90％和1x10⁶个细胞/ml)。对于每次转染，如下制备脂质-DNA复合物：对于500ml 1x10⁶个细胞/ml的细胞，将500μg质粒DNA缓慢添加至40mlI(Invitrogen产品目录编号51985-034)、500μl1.5μg/ml聚乙撑亚胺溶液(PEI聚乙撑亚胺，线性，MW 25,000，Polysciences产品目录编号9002-98-6)。将混合物温和混匀并于室温温育20-30分钟以容许DNA-脂质复合物形成。然后将DNA-脂质复合物缓慢添加至细胞并温育3天，之后收获培养液。

在两次1升运行中表达小鼠刻缺蛋白1构建体。以0.9-1x 10⁶个细胞/ml的密度转染细胞，65-75小时后当细胞细胞密度为2.2-2.5x 10⁶/ml且75-78％存活时收获培养液。

将所得培养液冷却，通过离心来收获，并立即用于纯化含有NRR的小鼠刻缺蛋白1多肽。

含有小鼠刻缺蛋白1NRR的免疫原的纯化

通过分批模式使用抗FLAG M2琼脂糖(Sigma-Aldrich，产品编号A2220)自HEK 293分泌培养液纯化免疫原。以每升培养液5ml琼脂糖的比例将缓冲液B(50mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl₂)中的抗FLAG M2琼脂糖添加至含有Complete、不含EDTA蛋白酶抑制剂的分泌培养液(每升培养液20片，Roche)。然后将培养液于4℃在恒定旋转中温育3小时。通过经由0.8μm滤器(Nalgene，产品编号450-0080)过滤来收集抗FLAG琼脂糖并随后装入适宜的重力滴落柱(BioRad，产品编号731-0003)中。用10个柱体积的缓冲液B清洗琼脂糖，并随后用4个柱体积的含0.1mg/ml FLAG肽(Sigma-Aldrich，产品编号F3290)的缓冲液B洗脱蛋白质。将所洗脱的小鼠刻缺蛋白1多肽在Amicon Ultra浓缩器(10,000MWCO，Millipore，产品编号UFC 901096)中浓缩并使用PD-10柱(GE Healthsciences，产品编号17-0851-01)交换缓冲液入贮存缓冲液(10mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl₂，5％甘油)中。通过反相HPLC，纯度估算为大于92％。通过Bradford测定法(Coomassie Plus试剂盒，Pierce，产品编号23236)测定浓度，使用BSA作为标准品。通过以质谱术进行的蛋白质胰蛋白酶消化物的肽测序来证实蛋白质身份。

实施例2：抗刻缺蛋白1NRR抗体的生成

抗刻缺蛋白1NRR抗体是如下生成的。

用于鉴定抗刻缺蛋白1NRR抗体的文库分选和筛选

使用人刻缺蛋白1NRR蛋白质免疫原(如上所述)作为抗原。将Nunc 96孔Maxisorp免疫板于4℃用靶抗原(10μg/ml)包被过夜，并于室温用噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.05％(v/v)tween-20)封闭1小时。将展示Fab片段的抗体噬菌体文库(见例如Lee et al.，J.Immunol.Meth.284：119-132，2004)添加至抗原板并于室温温育过夜。次日，将抗原包被板用PBT(含0.05％Tween-20的PBS)清洗十次，用50mM HCl和500mM NaCl洗脱所结合的噬菌体30分钟并用等体积的1M Tris碱(pH7.5)中和。在大肠杆菌XL-1 Blue细胞中扩增所回收的噬菌体。在后续数轮选择期间，抗体噬菌体与抗原包被板的温育缩短至2-3小时，且板清洗的严格性逐渐升高。

4轮淘选后，观察到显著的富集。挑取190个克隆来测定它们是否特异性结合人刻缺蛋白1NRR，并对所有190个克隆的可变区PCR测序以鉴定独特的序列克隆。

为了鉴定结合人和小鼠二者刻缺蛋白1NRR的噬菌体抗体，通过ELISA对所有独特克隆测试对人和小鼠刻缺蛋白1的结合。使用单斑点竞争ELISA对噬菌体抗体的亲和力排序，如此实施例中下文所描述的。基本上如Lee，C.V.，et al.(2004)JMol Biol 340，1073-93所述，使用竞争性噬菌体结合ELISA进一步测定所述噬菌体抗体IC50值。简言之，将NUNC 96孔Maxisorp免疫板于4℃用1μg/ml人NRR1或鼠NRR1包被过夜，并于室温用封闭缓冲液PBST(PBS和1％BSA和0.05％Tween 20)封闭1小时。将噬菌体与连续稀释的人或鼠NRR1于室温混和1小时，之后将混合物添加至人和小鼠NRR1包被板。用抗M13 HRP偶联物检测所结合的噬菌体，用TMB底物显色大约5分钟，用1M H₃PO₄淬灭，并于450nm以分光光度法读数。用四参数非线性回归曲线拟合程序(Kaleidagraph，Synergy Software)拟合竞争曲线以确定IC50值，计算为在溶液结合阶段中抑制50％噬菌体展示抗体结合固定化抗原的抗原浓度。

如下将抗体A、B、和C重定形式成IgG，即将各个克隆的V_L和V_H区分别克隆入LPG3和LPG4载体中，在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达，并用蛋白A柱纯化。使用实施例5中描述的共培养测定法，对这些克隆测试对人和小鼠刻缺蛋白2NRR、刻缺蛋白3NRR、和刻缺蛋白4NRR中一种或多种的交叉反应性及阻断活性。此表征的结果显示于表3。

表3：抗刻缺蛋白1NRR IgG的表征

  抗刻缺蛋  白1NRR抗  体  结合人/小  鼠NRR1  结合人/小  鼠NRR2  结合人/小  鼠NRR3  结合人/小  鼠NRR4  共培养阻  断  抗体B  是  否  ND  ND  弱  抗体A  是  否  否  否  强^*  抗体C  是  否  ND  ND  弱

^*IC50约100ng/ml

ND＝未测定

用于改进自V_H文库衍生的克隆的亲和力的构建体文库

选择抗体A来改进亲和力。噬菌粒pW0703(衍生自噬菌粒pV0350-2b(Lee et al.，J.Mol.Biol 340，1073-1093(2004))，在所有CDR-L3位置含有终止密码子(TAA)且在M13噬菌体表面上展示单价)充当文库模板用于嫁接来自V_H文库的感兴趣克隆的重链可变域(V_H)以进行亲和力成熟。使用硬和软两种随机化策略来进行亲和力成熟。对于硬随机化，具有三个轻链CDR的选定位置的一个轻链文库使用设计用于模拟天然人抗体的氨基酸随机化，而且所设计的DNA简并性如Lee et al.(J.Mol.Biol 340，1073-1093(2004))中所述。对于软随机化，以CDR-L3第91-94位和第96位，CDR-H1第28-31位和第34-35位，CDR-H2第50位、第52位、和第53-58位，CDR-H3第95-99位和第100A位为靶；并且选择两种不同CDR环组合(即L3/H1/H2和L3/H3)来进行随机化。为了实现软随机化条件(其在选定位置以大约50％的比率引入突变)，以有利于野生型核苷酸的70-10-10-10碱基混合物(Gallop et al.，Journal ofMedicinal Chemistry 37：1233-1251(1994))合成诱变性DNA。

用于产生亲和力改进的噬菌体分选策略

对于亲和力成熟选择，对噬菌体文库进行第一轮板分选，接着是三轮溶液分选。在第一轮板分选时，于37℃针对靶物(人刻缺蛋白1NRR-ECD)包被的板(NUNC Maxisorp板)分开分选三个文库达2小时，噬菌体输入为1％BSA和0.05％Tween 20中约3 O.D./ml。第一轮板分选后，实施三到四轮溶液分选以提高选择的严格性。对于溶液分选，将自第一轮板分选繁殖的1O.D./ml噬菌体与20nM生物素化靶蛋白质(这里的浓度基于亲本克隆噬菌体IC50值)一起在100μl含有1％Superblock(Pierce Biotechnology)和0.05％Tween20的缓冲液中于室温温育30分钟。将所述混合物用1％Superblock进一步稀释10倍，并以100μl/孔施加至中性亲合素包被的孔(5μg/ml)，在温和摇动中于室温15分钟，使得生物素化靶物结合噬菌体。将孔用PBS-0.05％Tween20清洗十次。为了测定背景结合，在中性亲合素包被的板上捕捉含有噬菌体及未生物素化靶物的对照孔。将所结合的噬菌体用0.1N HCl洗脱20分钟，用1/10体积的1M Tris pH11中和，滴定，并扩增，用于下一轮。接着，用两种提高选择严格性的方法一起再实施两或三轮溶液分选。第一种方法用于结合速率(on-rate)选择，其通过将生物素化靶蛋白浓度自2nM降低至0.1nM来进行，而第二种方法用于解离速率(off-rate)选择，其通过添加过量的非生物素化靶蛋白(多100-1000倍)以竞争掉弱结合物来进行。还有，降低噬菌体输入(0.1-0.5O.D/ml)来降低背景噬菌体结合。

高通量亲和力筛选ELISA(单点竞争)

自第三轮和第四轮筛选挑取菌落并于37℃在含50μg/ml羧苄青霉素和1E10/ml KO7的150μl/孔2YT培养基中在96孔板(Falcon)中培养过夜。自同一块板挑取一个感染了亲本噬菌体的XL-1菌落作为对照。将96孔NuncMaxisorp板用100μl/孔含靶蛋白(2μg/ml)的PBS于4℃包被过夜或于室温包被2小时。将所述板用65μl 1％BSA封闭30分钟，并用40μl 1％Tween 20再封闭30分钟。

将噬菌体上清液在含或不含10nM靶蛋白的ELISA(酶联免疫吸附测定法)缓冲液(含0.5％BSA、0.05％Tween20的PBS)中1∶10稀释，总体积100μl，并在F板(NUNC)中于室温温育至少1小时。将75μl含或不含靶蛋白的混合液并排转移至靶蛋白包被的板。将该板温和摇动15分钟，以容许未结合的噬菌体被捕捉至靶蛋白包被的板。将板用PBS-0.05％Tween 20清洗至少五次。如下对结合定量，即添加ELISA缓冲液中的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗M13抗体(1∶5000)并于室温温育30分钟。将板用PBS-0.05％Tween 20清洗至少五次。接着，将100μl/孔比率1∶1的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))添加至孔并于室温温育5分钟。如下终止反应，即添加100μl 1M磷酸(H₃PO₄)至每个孔并容许于室温温育5分钟。使用标准ELISA读板仪于450nm测定每个孔中黄色的OD(光密度)。用如下方程式计算OD降低(％)。OD_450nm降低(％)＝[(含竞争物的孔的OD_450nm)/(无竞争物的孔的OD_450nm)]*100

与亲本噬菌体的孔的OD_450nm降低(％)(100％)相比，挑取OD_450nm降低(％)低于50％的克隆进行序列分析。选择独特克隆进行噬菌体制备，以通过与亲本克隆比较来测定结合亲和力(噬菌体IC50)(表4)。

表4：亲和力成熟的抗体克隆的表征

NRR1＝刻缺蛋白1NRR

实施例3：抗刻缺蛋白1NRR抗体的表征

为了进一步表征抗刻缺蛋白1NRR单抗的结合亲和力和结合动力学，使用BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)进行表面等离振子共振(SRP)测量。简言之，依照供应商的指示用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。将家兔抗人抗体(Pierce)用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至20μg/ml，之后以5μl/min的流速注射以实现大约3000个响应单位(RU)的偶联抗体。接着，注射1M乙醇胺以封闭未反应基团。抗NRR1单抗(形式定为全长IgG)被包被在芯片上的家兔抗人IgG捕获，以实现大约200个响应单位(RU)。对于动力学测量，于25℃以30μl/min的流速注射在PBT缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)中2倍连续稀释的人NRR1-ECD或小鼠NRR1-ECD蛋白质(3.9nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore评估软件，3.2版)计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。作为比率k_off/k_on来计算平衡解离常数(K_D)。

此实验的结果显示于表5。“NA”表示未实施测量。

表5：抗刻缺蛋白1NRR抗体对含人和小鼠刻缺蛋白1NRR的多肽的结合亲和力和结合动力学

实施例4：抗刻缺蛋白1NRR抗体表位的表征

为了检验抗体A、A-1、和A-2的结合决定簇，使用人和小鼠刻缺蛋白1片段实施结合实验。

在这些实验中使用以下蛋白质：

(1)hFLAG-EGF34+NRR-His6(101V)：人刻缺蛋白1免疫原，在上文实施例1中有描述。

(2)hFLAG-NRR-His6(102V)：含有人刻缺蛋白1氨基酸E1447-Q1733、FLAG标签、HIS标签和凝血酶切割位点。刻缺蛋白1部分包括来自LNR_A、LNR_B、LNR_C、HD_N、HD_C的序列。此蛋白质不包括任何EGF样重复序列。

(3)hFLAG-HD-His6(103V)：含有人刻缺蛋白1氨基酸R1568-Q1733、FLAG标签、凝血酶切割位点和His标签。刻缺蛋白1部分含有来自HD_N和HD_C的序列。此蛋白质不含有任何EGF样重复序列且不含有三个LNR区。

(4)mFLAG-EGF34+NRR-His6：鼠免疫原，在上文实施例1中有描述。

(5)mEGF34+NRR-L1597H-FLAG-TEV-Fc：含有带L1597H突变的小鼠刻缺蛋白1氨基酸V1307-Q1723、Flag标签、Fc标签、和TEV蛋白酶位点。L1597H突变导致刻缺蛋白1活化，且记载于例如Weng et al.，Science 306：269-271，2004。

(6)Flag对照：是包含Flag标签的对照多肽。

(7)His对照：是包含His标签的对照多肽。

ELISA方案：

将PBS，pH 7.4中的1μg/ml蛋白质于4℃包被到ELISA板(Nunc Maxisorp)上过夜。将板用PBS(磷酸盐缓冲盐水；Pierce)中的酪蛋白封闭剂于室温封闭1小时。将在PBST缓冲液(含0.5％(w/v)BSA的PBT缓冲液(PBS+0.05％(v/v)Tween 20))中连续3倍稀释的抗刻缺蛋白1NRR IgG或无关IgG添加至板并于室温温育1小时。然后将板用PBST清洗并用过氧化物酶偶联的山羊抗人Fab特异性IgG(Sigma)检测所结合的抗体。使用TMB底物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)并使用标准ELISA读板仪读取650nm吸光度。使用KaleidaGraph(Synergy Software)将吸光度对IgG浓度绘图。

此实验的结果显示于图12A(抗体A-hIgG1)、12B(抗体A-1-hIgG1)、和12C(抗体A-2-hIgG1)。抗体A、A-1、和A-2结合多肽hFLAG-EGF34+NRR-His6(101V)、hFLAG-NRR-His6(102V)、hFLAG-HD-His6(103V)、mFLAG-EGF34+NRR-His6，且不结合缺失刻缺蛋白1序列的对照多肽。这些结果证明了刻缺蛋白1NRR域足以供抗体A、抗体A-1、和抗体A-2结合。抗体A、A-1、和A-2还结合蛋白质mEGF34+NRR-L1597H-FLAG-TEV-Fc，其含有刻缺蛋白1活化性突变L1597H。此结果证明了这些抗体能够结合突变型刻缺蛋白1受体。

实施例5：抗刻缺蛋白1NRR抗体的功能测定法

刻缺蛋白1报告物测定法

实施了刻缺蛋白1报告物测定法(在本文中也称作“共培养测定法”)来测量抗刻缺蛋白1NRR抗体抑制刻缺蛋白信号传导的能力。简言之，该测定法包括以下步骤：

(1)用响应刻缺蛋白信号传导的萤光素酶报告物质粒转染表达人刻缺蛋白1的NIH-3T3细胞；

(2)用抗体或各种对照试剂处理细胞；

(3)通过添加稳定表达人锯齿蛋白1的NIH-3T3细胞来启动信号传导；并

(4)通过测量自报告物质粒表达的萤光素酶活性来评估刻缺蛋白信号传导水平。

更详细的说，如下实施该测定法：

(1)将稳定表达人刻缺蛋白1(N1)的NIH-3T3细胞在含10％FBS且不含抗生素的DMEM高葡萄糖培养基中以5000个细胞/孔分配到黑壁、透明孔的96孔板中。将细胞于37℃、5％CO₂温育16小时。然后将培养基更换成不含血清的DMEM，并用100ng/孔TP-1(CSL启动子，对刻缺蛋白活化有响应)萤光素酶质粒(见例如Minoguchi et al.，Mol.Cell.Biol.17：2679-2687(1997))和5ng/ml pRL-CMV海肾萤光素酶报告物(Promega)转染细胞。转染于37℃、5％CO₂持续6小时，在第4个小时开始时重新添加血清。

(2)在第6个小时结束时，通过抽吸来除去含有转染试剂的培养基，并添加50μl含有以下各项的DMEM/FBS：A.新鲜培养基(稍后接受对照NIH-3T3亲本细胞以进行模拟刺激)；B.新鲜培养基(含10％FBS的DMEM)；C.人IgG同种型对照抗体，400ng/ml；抗刻缺蛋白1NRR抗体A，四种不同浓度(D.16ng/ml，E.80ng/ml，F.400ng/ml，G.2000ng/ml)；H.抗刻缺蛋白1NRR抗体A，400ng/ml，与纯化的刻缺蛋白1NRR蛋白(5μg/孔)一起预温育30分钟；I.人IgG同种型对照抗体，400ng/ml，用刻缺蛋白1NRR蛋白如H中那样处理；J.抗刻缺蛋白1NRR抗体A，400ng/ml，与重新添加的BSA蛋白质(6.5μg/孔)一起预温育30分钟；K.化合物E(一种γ-分泌酶抑制剂；C₂₇H₂₄F₂N₄O₃；Seiffert et al.，J.Biol.Chem.275：34086，2000)，1μM；及L.DMSO对照(单独的化合物E溶剂)。将上文所列试剂与经转染的NIH-3T3-刻缺蛋白1细胞一起于37℃、5％CO₂温育1小时。

将5000个稳定表达人锯齿蛋白1配体的NIH-3T3细胞添加至每个孔，除了J，J中的细胞是NIH-3T3亲本系。然后将板于37℃、5％CO₂温育23小时。

用Dual-Glo萤光素酶试剂盒(Promega)测量萤火虫(TP1)和海肾(pRL-CMV)萤光素酶活性。通过萤火虫读数除以海肾读数并对每种条件的8个复制品取平均值来计算刻缺蛋白信号传导水平。结果显示于图7，其中误差条代表复制品的标准偏差。

如图7所示，抗体A是有力的刻缺蛋白1抑制剂。抗体A抑制刻缺蛋白信号传导，如使用TP1-Luc报告物所测量的。该图显示了抗体的滴定；在400ng/ml抗体的情况中，刻缺蛋白信号传导被抑制至对照即“开启”水平(使用400ng/ml同种型对照观察到的信号传导水平)的18％。进一步添加可溶性NRR蛋白质，而不是BSA对照，缓解了抗体诱导的对信号传导的阻断，证明了抗体对信号传导的抑制是由于抗体-刻缺蛋白1NRR相互作用。使用化合物E(一种γ-分泌酶抑制剂)作为对照来证明抑制。作为另一个对照，用亲本细胞(单独的NIH-3T3，没有锯齿蛋白1)替换表达锯齿蛋白1的细胞未能诱导完全的信号传导，证明了信号传导需要锯齿蛋白1。

使用上文所使用的共培养测定法来比较抗体A与其亲和力成熟的对应物抗体A-1、抗体A-2、和抗体A-3，处理以数个浓度进行。如80ng/ml抗体所揭示的，抗体A-2和抗体A-3显示出比抗体A更加有力的对刻缺蛋白信号传导的阻断(图8)。

C2C12成肌细胞分化测定法

小鼠C2C12成肌细胞在用分化培养基处理时分化成肌管。与表达锯齿蛋白1配体的细胞共培养通过刺激刻缺蛋白信号传导来抑制分化。如下文所详述的，与抗体A抑制刻缺蛋白1信号传导的能力一致，添加抗体A恢复分化。作为对照，γ-分泌酶抑制剂也恢复分化。

具体而言，以2.5x10⁴个细胞/ml使用1ml/孔将小鼠C2C12成肌细胞细胞分配到底部有无菌的、圆的、10mm盖玻片的24孔组织培养皿中。让细胞在生长培养基(含10％FBS的DMEM)于37℃、5％CO₂贴壁和生长22小时。然后吸掉生长培养基，并添加分化培养基(DM)(含6％马血清的DMEM)。用以下各项处理细胞：A.单独的DM；B.含3T3-J1细胞的DM；C.含NIH-3T3-锯齿蛋白1和人IgG同种型对照抗体的DM；D.含3T3-J1细胞和200ng/ml抗体A的DM；E.含NIH-3T3-锯齿蛋白1细胞和DMSO(媒介物)的DM；F.含3T3-J1细胞和1μM化合物E(γ-分泌酶抑制剂)的DM。将细胞于37℃、5％CO₂在这些条件下温育4天。收回盖玻片，并将细胞用4％低聚甲醛固定并用含0.2％Triton X-100的PBS透化。然后用含10％FBS的PBS封闭细胞。使用识别肌球蛋白重链的抗体(Millipore，抗肌球蛋白HC，克隆A4.1025腹水)和偶联至488(Molecular Probes)的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗来对已分化的肌管染色。使用DAPI对细胞核复染。对每种条件采集三个不同视野的图像。一组图像显示于图10。使用Metamorph软件(Molecular Devices)对细胞核数目和488染色面积计数。将488染色面积除以细胞核数目，取平均值，并绘图。误差条代表一式三份图像的标准偏差。这些结果显示于图9。

实施例6：抗刻缺蛋白1NRR抗体抑制由野生型和突变型刻缺蛋白1受体进行的信号传导

使用经编码L1594P突变型刻缺蛋白1受体、DelPEST突变型刻缺蛋白1受体、和野生型(wt)刻缺蛋白1受体的TP-1和pRL-CMV质粒瞬时转染(使用Lipofectamine和Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen)进行)的NIH-3T3细胞和稳定表达人锯齿蛋白-1的NIH-3T3细胞实施萤光素酶报告物共培养测定法，基本上如上文所述。L1594P突变表示HD-N域中氨基酸(aa)1594亮氨酸变成脯氨酸(见例如Weng et al.，Science 306：269-271，2004)。DelPEST表示PEST域自aa 2473开始的羧基末端删除(见例如Malecki et al.，Mol.Cell.Biol.26：4642-4651，2006)。与已发表的结果一致，图13所示结果证实了L1594P和DelPEST突变都活化刻缺蛋白1信号传导。相对于使用相同同种型的、无关噬菌体衍生单克隆抗体进行的阴性对照，抗体A以剂量依赖性方式抑制经由三种受体每一种的信号传导。使用溶解在DMSO中的γ-分泌酶抑制剂化合物E(CmpE)作为抑制刻缺蛋白信号传导的阳性对照。实心黑柱显示使用2000ng/ml对照抗体得到的结果；粗虚线柱显示使用80ng/ml抗体A得到的结果；细条纹柱显示使用400ng/ml抗体A得到的结果；粗条纹柱显示使用2000ng/ml抗体A得到的结果；交叉线柱显示使用10μM化合物E得到的结果；而细虚线柱显示使用DMSO(化合物E的媒介物)得到的结果。每种条件的结果是在八个复制品(replicate)中测量得到的，然后表述成均值，误差条指示标准偏差。

实施例7：抗刻缺蛋白1NRR抗体破坏血管形成和血管发生

使用HUVEC细胞萌芽测定法(cell sprouting assay)研究了抗刻缺蛋白1NRR抗体对血管形成和血管发生的影响。此测定法与Nakatsu et al.(Microvasc.Res.66(2)：102-112，2003)记载的测定法相似。将HUVEC细胞包被到Cytodex珠(Amersham Biosciences，Piscataway，New Jersey)上，然后将该珠植入纤维蛋白凝胶中。将人皮肤成纤维细胞铺到纤维蛋白凝胶层上，然后覆盖组织培养培养基。4-9天后检查自HUVEC细胞萌芽的血管。与对抗Dll4处理观察到的结果相似，抗刻缺蛋白1NRR处理引起血管萌芽和长度的显著增加，如图14A所示。显示了用作为对照的PBS或如所示的用抗体A或A-2处理的细胞的结果。通过增加血管萌芽和血管系统网络密度，抗刻缺蛋白1NRR破坏血管形成和血管发生。

还使用血管发生的角膜袋测定法(corneal pocket assay)研究了抗刻缺蛋白1NRR抗体对血管形成和血管发生的影响。如图14B中所概述的方案所示，用VEGF团粒(#63，#132和#390)来植入正常情况中无血管的啮齿动物角膜以诱导血管发生，或者不做处理，作为阴性对照(#381)。随后两个角膜用抗Dll4处理，作为血管网络密度增加的阳性对照(#132)，或者用抗体A-2处理(#390)。用基于抗CD31的免疫荧光染色技术(红色)来显现血管。如图14B所示，抗刻缺蛋白1NRR处理显著增加血管网络密度。如上文关于图14B所述处理的角膜中的血管还用FITC-右旋糖苷(绿色)灌注，以评估穿过血管的流动。穿过抗Dll4处理的血管和穿过抗刻缺蛋白1NRR处理的血管的灌注都受到限制，如图14C所示。

还调查了抗刻缺蛋白1NRR抗体在血管发生的小鼠视网膜模型中的影响。如图14D中所概述的方案所示，用所示浓度的抗豚草抗体(作为阴性对照)或抗体A-2处理来自P1(出生后第1天)或P3(出生后第3天)小鼠的小鼠视网膜。在P5(出生后第5天)收获视网膜。使用异凝集素B4来显现血管系统。与图14A-14C所示结果一致，抗刻缺蛋白1NRR处理增加血管系统密度并产生超萌芽表型。如上文关于图14D所述处理的小鼠视网膜用DAPI染色以显现细胞核DNA。如图14E所示，抗刻缺蛋白1NRR处理引起细胞核数目增加，提示增殖可能增加。

实施例8：抗刻缺蛋白1NRR抗体在体内抑制肿瘤生长

使用体内小鼠模型研究了抗刻缺蛋白1NRR抗体对肿瘤生长的影响。在使用HM7细胞系(结肠腺癌)进行的异种移植物研究中使用了免疫缺陷小鼠(Balb-C Nu/Nu)。植入了0.1ml Matrigel(BD Biosciences，San Jose，California)中的5x10⁶个细胞，用于皮下接种小鼠。让肿瘤生长至大约250-300m³，之后将小鼠随机分入三个处理组，开始服药，如所示的。抗体A-2处理阻滞肿瘤生长，如图15A所示。抗豚草和抗VEGF分别充当阴性和阳性对照。在一个与上文关于图15A所述实验相似的实验中，对多种剂量的抗体A-2测试阻滞或减缓肿瘤生长的能力。结果显示于图15B。在一个与上文关于图15A所述实验相似(只是使用CALU6细胞系(非小细胞肺癌细胞系)代替HM7细胞系)的实验中，发现抗体A-2缩小肿瘤体积，如图15C所示。总之，图15A-15C所示结果指明了抗刻缺蛋白1NRR抗体抑制肿瘤生长。

在一个与上文关于图15B所述实验相似的实验中，发现抗体A-2处理以剂量依赖性方式引起体重减轻，如图15D所示。在一个与上文关于图15B所述实验相似的实验中，通过在所示时间点测量处理小鼠的血清中人Fc的浓度来检验抗体A-2的清除。结果显示于图15E。

实施例9：抗刻缺蛋白1NRR抗体影响肠细胞的增殖和分化

调查了抗刻缺蛋白1NRR抗体对小鼠肠道中的细胞的影响。每3-4天服用抗体A-2大约10天后自对照(媒介物)和经处理小鼠分离肠。将样品用苏木精和曙红染色，加上对粘蛋白染色的Alcian Blue(蓝色，作为分泌细胞的标志物)或对常用增殖标志物蛋白Ki-67染色的抗Ki-67(褐色，基于抗体的免疫组织化学染色规程)。图16A和16B分别显示了来自用对照抗体(媒介物)或用抗体A-2在所示浓度处理的小鼠的分别来自小肠或大肠的隐窝和绒毛的例子。结果显示了抗刻缺蛋白1NRR阻滞移行扩增细胞的增殖并提高分泌细胞的数目，包括杯形细胞和帕内特(Paneth)细胞。

实施例10：抗刻缺蛋白1NRR抗体和γ-分泌酶抑制剂降低某些癌细胞系的存活力

检验了抗刻缺蛋白1NRR和γ-分泌酶抑制剂DAPT和“化合物E”(CmpE)对一组癌细胞系的影响。在存在或缺少抗体A-2、DAPT、CpmE、或DMSO(对照，γ-分泌酶抑制剂的媒介物)的情况中(如所示的)培养图17(x轴)所示细胞系，并使用CellTiter-Glo^TM发光细胞存活力测定法(Promega，Madison，WI)评估细胞的存活力。此测定法基于所存在的ATP的定量来测定培养物中存活细胞的数目，其中ATP是代谢活性的细胞的指征。将发光定量为图17(y轴)中的“相对发光单位”。如图17所示，在存在DAPT、CmpE或抗刻缺蛋白1NRR的情况中温育后，MT-3(据报告，是乳腺癌系)和OVCAR-3(一种卵巢癌细胞系)显示出降低的ATP水平，指示降低的增殖和/或升高的细胞死亡。

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。

序列表

<110>健泰科生物技术公司(Genentech，Inc)

 

<120>抗刻缺蛋白1NRR抗体及其使用方法

 

<130>50474/013WO3

 

<150>US 60/994,646

<151>2007-09-20

 

<150>US 60/933,072

<151>2007-06-04

 

<160>65

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>1

 

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile His

1               5                   10

 

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>2

 

Ala Arg Ile Asn Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

1               5                   10                  15

Lys Gly

 

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>3

 

Ala Arg Ile Asn Pro Pro Asn Gly Ser Ala His Tyr Ala Asp Ser Val

1               5                   10                  15

Lys Gly

<210>4

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>4

 

Ala Arg Ile Asn Pro Pro Asn Arg Ser Asn Gln Tyr Ala Asp Ser Val

1               5                   10                  15

Lys Gly

 

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>5

 

Ala Arg Ile Asn Pro Ala Asn Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

1               5                   10                  15

Lys Gly

 

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>6

 

Ala Arg Gly Ser Gly Phe Arg Trp Val Met Asp Tyr

1               5                   10

 

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>7

 

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1               5                   10

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>8

 

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1               5

 

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>9

 

Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1               5

 

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>10

Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Ala Thr

1               5

 

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>11

Gln Gln Phe Tyr Thr Thr Pro Ser Thr

1               5

 

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>12

Gln Gln Ser Phe Ser Thr Pro Ala Thr

1               5

 

<210>13

<211>497

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>13

 

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1               5                   10                  15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

            20                  25                  30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Leu Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp

        35                  40                  45

Asp Asp Lys Gly Ser Gly Val Ile Asn Gly Cys Lys Gly Lys Pro Cys

    50                  55                  60

Lys Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe

65                  70                  75                  80

Ile Cys Lys Cys Pro Ala Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp

                85                  90                  95

Ala Arg Thr Cys Gly Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile

            100                 105                 110

Ser Gly Pro Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Pro Phe Thr Gly

        115                 120                 125

Pro Glu Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Gly Gly Asn Pro

    130                 135                 140

Cys Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Ser Pro Phe Tyr

145                 150                 155                 160

Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile Leu

                165                 170                 175

Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro Pro Leu

            180                 185                 190

Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu Asp Ala Gly Asn

        195                 200                 205

Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly

    210                 215                 220

Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys Asn Cys Thr Gln

225                 230                 235                 240

Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Ser Gln

                245                 250                 255

Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys Gln Arg Ala

            260                 265                 270

Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe

        275                 280                 285

Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp

    290                 295                 300

Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly

305                 310                 315                 320

Thr Leu Val Val Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser

                325                 330                 335

Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val

            340                 345                 350

Val Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr

        355                 360                 365

Gly Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala Ala Glu

    370                 375                 380

Gly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys Ala Ser Leu

385                 390                 395                 400

Leu Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg Glu Leu Asp Pro

                405                 410                 415

Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln

            420                 425                 430

Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala

        435                 440                 445

Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr

    450                 455                 460

Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu Thr Val Glu Pro Pro Pro Pro Ala

465                 470                 475                 480

Gln Glu Phe Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly His His His His His

                485                 490                 495

His

 

<210>14

<211>462

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>14

 

Met Gly Gly Thr Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val

1               5                   10                  15

Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

            20                  25                  30

Asp Lys Leu Glu Val Ile Asn Gly Cys Arg Gly Lys Pro Cys Lys Asn

        35                  40                  45

Gly Gly Val Cys Ala Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys

    50                  55                  60

Arg Cys Pro Ala Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg

65                  70                  75                  80

Thr Cys Gly Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly

                85                  90                  95

Pro Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Ser Phe Thr Gly Pro Glu

            100                 105                 110

Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Val Gly Ser Asn Pro Cys Tyr

        115                 120                 125

Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Asn Pro Phe Tyr Arg Cys

    130                 135                 140

Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile Leu Asp Tyr

145                 150                 155                 160

Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro Pro Gln Ile Glu

                165                 170                 175

Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Val Asp Ala Gly Asn Lys Val

            180                 185                 190

Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp

        195                 200                 205

Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu

    210                 215                 220

Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Ser Gln Cys Asn

225                 230                 235                 240

Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys Gln Leu Thr Glu Gly

                245                 250                 255

Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp

            260                 265                 270

Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly

        275                 280                 285

Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu

    290                 295                 300

Val Leu Val Val Leu Leu Pro Pro Asp Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe

305                 310                 315                 320

His Phe Leu Arg Glu Leu Ser His Val Leu His Thr Asn Val Val Phe

                325                 330                 335

Lys Arg Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly His

            340                 345                 350

Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ser Thr Val Gly Trp

        355                 360                 365

Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gly Arg Gln Arg Arg

    370                 375                 380

Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile

385                 390                 395                 400

Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala

                405                 410                 415

Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu

            420                 425                 430

Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser Glu Pro Val Glu Pro

        435                 440                 445

Pro Leu Pro Ser Gln Gly Ser Gly His His His His His His

    450                 455                 460

<210>15

<211>23

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>15

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

            20

 

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>16

 

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1               5                  10                  15

 

<210>17

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>17

 

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>18

 

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1               5                   10

 

<210>19

<211>87

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>19

 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val

            20                  25                  30

Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Thr Ile

        35                  40                  45

Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

    50                  55                  60

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                85

 

<210>20

<211>81

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>20

 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr

        35                  40                  45

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

65                  70                  75                  80

Ser

<210>21

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>21

 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr

        35                  40                  45

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75                  80

 

<210>22

<211>79

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>22

 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr

        35                  40                  45

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75

 

<210>23

<211>87

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

 

<400>23

 

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Trp Ile

            20                  25                  30

Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Val Thr Ile

        35                  40                  45

Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val

    50                  55                  60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                85

 

<210>24

<211>81

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>24

 

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

65                  70                  75                  80

Ser

 

<210>25

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>25

 

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75                  80

 

<210>26

<211>79

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>26

 

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75

 

<210>27

<211>87

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val

            20                  25                  30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr Ile

        35                  40                  45

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

    50                  55                  60

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                85

 

<210>28

<211>81

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>28

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

65                  70                  75                  80

Ser

 

<210>29

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

<400>29

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75                  80

 

<210>30

<211>79

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>30

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75

 

<210>31

<211>87

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>31

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Trp Val

            20                  25                  30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr Ile

        35                  40                  45

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

    50                  55                  60

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gln Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                85

 

<210>32

<211>81

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>32

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

65                  70                  75                  80

Ser

 

<210>33

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>33

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75                  80

 

<210>34

<211>87

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>34

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Trp Val

            20                  25                  30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr Ile

        35                  40                  45

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

    50                  55                  60

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

                85

 

<210>35

<211>81

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>35

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

65                  70                  75                  80

Ser

 

<210>36

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>36

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75                  80

 

<210>37

<211>79

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>37

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys

        35                  40                  45

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

    50                  55                  60

Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

65                  70                  75

 

<210>38

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>38

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

            20                  25                  30

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

        35                  40                  45

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

    50                  55                  60

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

65                  70                  75                  80

 

<210>39

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>39

 

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

            20                  25                  30

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

        35                  40                  45

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

    50                  55                  60

Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

65                  70                  75                  80

 

<210>40

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>40

 

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

            20                  25                  30

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

        35                  40                  45

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp

    50                  55                  60

Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

65                  70                  75                  80

 

<210>41

<211>80

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>41

 

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

            20                  25                  30

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

        35                  40                  45

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp

    50                  55                  60

Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

65                  70                  75                  80

 

<210>42

<211>25

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>42

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

            20                  25

 

<210>43

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>43

 

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

1               5                   10

 

<210>44

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>44

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>45

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>45

 

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

<210>46

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>46

 

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>47

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>47

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>48

<211>62

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>48

gatccgatta caaagatgac gatgacaagg gctctggtgt catcaatggc tgcaaaggca    60

ag                                                                   62

 

<210>49

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>49

cctgcgccgg cgggggcggc tccacg                                         26

 

<210>50

<211>58

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>50

cgattacaaa gatgacgatg acaagggctc tggtgtcatc aatggctgca aaggcaag    58

 

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>51

aattcctgcg ccggcggggg cggctccacg                                   30

 

<210>52

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>52

 

Ala Arg Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala

1               5                   10

 

<210>53

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>53

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

 

<210>54

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>54

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1                5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

 

<210>55

<211>1491

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>55

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta   60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat  120

cttggatccg attacaaaga tgacgatgac aagggctctg gtgtcatcaa tggctgcaaa  180

ggcaagccct gcaagaatgg gggcacctgc gccgtggcct ccaacaccgc ccgcgggttc  240

atctgcaagt gccctgcggg cttcgagggc gccacgtgtg agaatgacgc tcgtacctgc  300

ggcagcctgc gctgcctcaa cggcggcaca tgcatctccg gcccgcgcag ccccacctgc  360

ctgtgcctgg gccccttcac gggccccgaa tgccagttcc cggccagcag cccctgcctg  420

ggcggcaacc cctgctacaa ccaggggacc tgtgagccca catccgagag ccccttctac  480

cgttgcctgt gccccgccaa attcaacggg ctcttgtgcc acatcctgga ctacagcttc    540

gggggtgggg ccgggcgcga catccccccg ccgctgatcg aggaggcgtg cgagctgccc    600

gagtgccagg aggacgcggg caacaaggtc tgcagcctgc agtgcaacaa ccacgcgtgc    660

ggctgggacg gcggtgactg ctccctcaac ttcaatgacc cctggaagaa ctgcacgcag    720

tctctgcagt gctggaagta cttcagtgac ggccactgtg acagccagtg caactcagcc    780

ggctgcctct tcgacggctt tgactgccag cgtgcggaag gccagtgcaa ccccctgtac    840

gaccagtact gcaaggacca cttcagcgac gggcactgcg accagggctg caacagcgcg    900

gagtgcgagt gggacgggct ggactgtgcg gagcatgtac ccgagaggct ggcggccggc    960

acgctggtgg tggtggtgct gatgccgccg gagcagctgc gcaacagctc cttccacttc   1020

ctgcgggagc tcagccgcgt gctgcacacc aacgtggtct tcaagcgtga cgcacacggc   1080

cagcagatga tcttccccta ctacggccgc gaggaggagc tgcgcaagca ccccatcaag   1140

cgtgccgccg agggctgggc cgcacctgac gccctgctgg gccaggtgaa ggcctcgctg   1200

ctccctggtg gcagcgaggg tgggcggcgg cggagggagc tggaccccat ggacgtccgc   1260

ggctccatcg tctacctgga gattgacaac cggcagtgtg tgcaggcctc ctcgcagtgc   1320

ttccagagtg ccaccgacgt ggccgcattc ctgggagcgc tcgcctcgct gggcagcctc   1380

aacatcccct acaagatcga ggccgtgcag agtgagaccg tggagccgcc cccgccggcg   1440

caggaattcg gtctggttcc gcgtggcagc ggtcatcacc atcaccatca c            1491

 

<210>56

<211>2555

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>56

 

Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro Ala

1               5                   10                  15

Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr Cys Leu

            20                  25                  30

Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys

        35                  40                  45

Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Gln Asp Pro Asn Pro Cys Leu

    50                  55                  60

Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp Arg Arg

65                  70                  75                  80

Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Ser Gly Pro

                85                  90                  95

Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Thr Asn Pro Cys Arg

            100                 105                 110

Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg

        115                 120                 125

Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys

    130                 135                 140

Ala Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ala

145                 150                 155                 160

Ser Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Ser Phe His Gly Pro Thr Cys Arg

                165                 170                 175

Gln Asp Val Asn Glu Cys Gly Gln Lys Pro Gly Leu Cys Arg His Gly

            180                 185                 190

Gly Thr Cys His Asn Glu Val Gly Ser Tyr Arg Cys Val Cys Arg Ala

        195                 200                 205

Thr His Thr Gly Pro Asn Cys Glu Arg Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro

    210                 215                 220

Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Val Thr

225                 230                 235                 240

His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Gln Asn Cys Glu Glu

                245                 250                 255

Asn Ile Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly Ala Cys

            260                 265                 270

Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Glu Trp Thr

        275                 280                 285

Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Met Pro Asn

    290                 295                 300

Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn

305                 310                 315                 320

Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Asn Ile

                325                 330                 335

Asp Asp Cys Ala Ser Ala Ala Cys Phe His Gly Ala Thr Cys His Asp

            340                 345                 350

Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu

        355                 360                 365

Leu Cys His Leu Asn Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly

    370                 375                 380

Ser Asn Cys Asp Thr Asn Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys

385                 390                 395                 400

Pro Ser Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys

                405                 410                 415

Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Ile Asn Thr

            420                 425                 430

Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg

        435                 440                 445

Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp

    450                 455                 460

Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Ile Cys Met Pro

465                 470                 475                 480

Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Val Asn Thr Asp Glu Cys Ala Ser

                485                 490                 495

Ser Pro Cys Leu His Asn Gly Arg Cys Leu Asp Lys Ile Asn Glu Phe

            500                 505                 510

Gln Cys Glu Cys Pro Thr Gly Phe Thr Gly His Leu Cys Gln Tyr Asp

        515                 520                 525

Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly Ala Lys Cys Leu

    530                 535                 540

Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr Glu Gly Tyr Thr Gly

545                 550                 555                 560

Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Asp Pro Asp Pro Cys His

                565                 570                 575

Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala Thr Phe Thr Cys Leu Cys Arg

            580                 585                 590

Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ser

        595                 600                 605

Ser Gln Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Arg Asp Asn Ala

    610                 615                 620

Tyr Leu Cys Phe Cys Leu Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cys Glu Ile

625                 630                 635                 640

Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu

                645                 650                 655

Asp Lys Ile Asp Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly

            660                 665                 670

Ser Met Cys Asn Ile Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Asn Pro Cys His

        675                 680                 685

Asn Gly Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Asn Gly Phe Thr Cys Arg Cys

    690                 695                 700

Pro Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys

705                 710                 715                 720

Asn Ser Asn Pro Cys Val His Gly Ala Cys Arg Asp Ser Leu Asn Gly

                725                 730                 735

Tyr Lys Cys Asp Cys Asp Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys Asp Ile

            740                 745                 750

Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys

        755                 760                 765

Lys Asp Met Thr Ser Gly Tyr Val Cys Thr Cys Arg Glu Gly Phe Ser

    770                 775                 780

Gly Pro Asn Cys Gln Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys

785                 790                 795                 800

Leu Asn Gln Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val Ala Gly Tyr Lys Cys Asn

                805                 810                 815

Cys Leu Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Val Val Leu Ala Pro

            820                 825                 830

Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn Gly Gly Glu Cys Arg Gln Ser Glu

        835                 840                 845

Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Cys Val Cys Pro Thr Gly Trp Gln Gly Gln

    850                 855                 860

Thr Cys Glu Val Asp Ile Asn Glu Cys Val Leu Ser Pro Cys Arg His

865                 870                 875                 880

Gly Ala Ser Cys Gln Asn Thr His Gly Gly Tyr Arg Cys His Cys Gln

                885                 890                 895

Ala Gly Tyr Ser Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asp Ile Asp Asp Cys Arg

            900                 905                 910

Pro Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Gly Ile Asn Thr

        915                 920                 925

Ala Phe Cys Asp Cys Leu Pro Gly Phe Arg Gly Thr Phe Cys Glu Glu

    930                 935                 940

Asp Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asp Pro Cys Arg Asn Gly Ala Asn Cys

945                 950                 955                 960

Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser

                965                 970                 975

Gly Ile His Cys Glu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Glu Ser Ser Cys

            980                 985                 990

Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys Leu

        995                 1000                1005

Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln His Asp Val Asn

    1010                1015                1020

Glu Cys Asp Ser Gln Pro Cys Leu His Gly Gly Thr Cys Gln Asp

    1025                1030                1035

Gly Cys Gly Ser Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Gly

    1040                1045                1050

Pro Asn Cys Gln Asn Leu Val His Trp Cys Asp Ser Ser Pro Cys

    1055                1060                1065

Lys Asn Gly Gly Lys Cys Trp Gln Thr His Thr Gln Tyr Arg Cys

    1070                1075                1080

Glu Cys Pro Ser Gly Trp Thr Gly Leu Tyr Cys Asp Val Pro Ser

    1085                1090                1095

Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Arg Gln Gly Val Asp Val Ala

    1100                1105                1110

Arg Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp Ala Gly Asn Thr

    1115                1120                1125

His His Cys Arg Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys Glu

    1130                1135                1140

Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser Pro Cys Gln Asn Gly Ala

    1145                1150                1155

Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser Cys Lys Cys Val Ala

    1160                1165                1170

Gly Tyr His Gly Val Asn Cys Ser Glu Glu Ile Asp Glu Cys Leu

    1175                1180                1185

Ser His Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Asp Leu Pro Asn

    1190                1195                1200

Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly Val His Cys

    1205                1210                1215

Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys Asn Pro Pro Val Asp Pro Val Ser

    1220                1225                1230

Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln Val

    1235                1240                1245

Gly Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Arg

    1250                1255                1260

Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp Ala

    1265                1270                1275

Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn Asp Phe His Cys

    1280                1285                1290

Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys Glu Ser Val Ile

    1295                1300                1305

Asn Gly Cys Lys Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly Gly Thr Cys Ala

    1310                1315                1320

Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys Lys Cys Pro Ala

    1325                1330                1335

Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys Gly

    1340                1345                1350

Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly Pro Arg

    1355                1360                1365

Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Pro Phe Thr Gly Pro Glu Cys

    1370                1375                1380

Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Gly Gly Asn Pro Cys Tyr

    1385                1390                1395

Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Ser Pro Phe Tyr Arg

    1400                1405                1410

Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile Leu

    1415                1420                1425

Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro Pro

    1430                1435                1440

Leu Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu Asp Ala

    1445                1450                1455

Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly

    1460                1465                1470

Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys

    1475                1480                1485

Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly

    1490                1495                1500

His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly

    1505                1510                1515

Phe Asp Cys Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp

    1520                1525                1530

Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly

    1535                1540                1545

Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu

    1550                1555                1560

His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Val Val Val

    1565                1570                1575

Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe Leu

    1580                1585                1590

Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg

    1595                1600                1605

Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly Arg Glu

    1610                1615                1620

Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala Ala Glu Gly Trp

    1625                1630                1635

Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys Ala Ser Leu Leu

    1640                1645                1650

Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg Glu Leu Asp Pro

    1655                1660                1665

Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg

    1670                1675                1680

Gln Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp

    1685                1690                1695

Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asn

    1700                1705                1710

Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu Thr Val Glu Pro

    1715                1720                1725

Pro Pro Pro Ala Gln Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala

    1730                1735                1740

Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg

    1745                1750                1755

Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly Phe

    1760                1765                1770

Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu Gly

    1775                1780                1785

Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly

    1790                1795                1800

Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu

    1805                1810                1815

Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp

    1820                1825                1830

Leu Asp Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu

    1835                1840                1845

Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro

    1850                1855                1860

Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg Gly

    1865                1870                1875

Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala Ser Cys Ser Gly Gly

    1880                1885                1890

Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu Asp Ala Pro Ala

    1895                1900                1905

Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser Leu His Asn Gln

    1910                1915                1920

Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr

    1925                1930                1935

Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ala Ser Ala Asp

    1940                1945                1950

Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala Ala

    1955                1960                1965

Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn

    1970                1975                1980

Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly Thr Thr Pro

    1985                1990                1995

Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu Glu Asp

    2000                2005                2010

Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Gly

    2015                2020                2025

Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala

    2030                2035                2040

Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln Asn

    2045                2050                2055

Asn Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser

    2060                2065                2070

Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp

    2075                2080                2085

Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Ile Ala Gln Glu

    2090                2095                2100

Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Leu

    2105                2110                2115

Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr Pro

    2120                2125                2130

Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser

    2135                2140                2145

Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg Lys Pro Ser Ser

    2150                2155                2160

Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys Asp Leu Lys Ala

    2165                2170                2175

Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys Leu Leu Asp Ser

    2180                2185                2190

Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Gly

    2195                2200                2205

Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro Phe

    2210                2215                2220

Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met Pro

    2225                2230                2235

Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro

    2240                2245                2250

Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu Thr

    2255                2260                2265

Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser

    2270                2275                2280

Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val

    2285                2290                2295

Gly Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser Arg

    2300                2305                2310

Leu Gln Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly

    2315                2320                2325

Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala Pro Ser Leu Gln

    2330                2335                2340

His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser Ser Leu Ala Ala Ser Ala

    2345                2350                2355

Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu Pro Ser Thr Arg Leu

    2360                2365                2370

Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln Val Gln Pro Gln

    2375                2380                2385

Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro Ala Asn Ile Gln

    2390                2395                2400

Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro His

    2405                2410                2415

Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg Ser Phe

    2420                2425                2430

Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val Gln Pro Leu Gly Pro

    2435                2440                2445

Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln Glu Ser Pro Ala

    2450                2455                2460

Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr Ala

    2465                2470                2475

Ala Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser Tyr Ser Ser Pro

    2480                2485                2490

Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val Pro Glu His Pro

    2495                2500                2505

Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser

    2510                2515                2520

Ser Pro His Ser Asn Val Ser Asp Trp Ser Glu Gly Val Ser Ser

    2525                2530                2535

Pro Pro Thr Ser Met Gln Ser Gln Ile Ala Arg Ile Pro Glu Ala

    2540                2545                2550

Phe Lys

    2555

 

<210>57

<211>2531

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

 

<400>57

 

Met Pro Arg Leu Leu Thr Pro Leu Leu Cys Leu Thr Leu Leu Pro Ala

1               5                   10                  15

Leu Ala Ala Arg Gly Leu Arg Cys Ser Gln Pro Ser Gly Thr Cys Leu

            20                  25                  30

Asn Gly Gly Arg Cys Glu Val Ala Ser Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys

        35                  40                  45

Ser Gly Ala Phe Val Gly Gln Arg Cys Gln Asp Ser Asn Pro Cys Leu

    50                  55                  60

Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp His Gly

65                  70                  75                  80

Gly Thr Val Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Pro Leu Gly Phe Ser Gly Pro

                 85                  90                  95

Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Ala Asn Pro Cys Arg

            100                 105                 110

Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg

        115                 120                 125

Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys

    130                 135                 140

Ala Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ser

145                 150                 155                 160

Ser Tyr Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe His Gly Pro Thr Cys Arg

                165                 170                 175

Gln Asp Val Asn Glu Cys Ser Gln Asn Pro Gly Leu Cys Arg His Gly

            180                 185                 190

Gly Thr Cys His Asn Glu Ile Gly Ser Tyr Arg Cys Ala Cys Arg Ala

        195                 200                 205

Thr His Thr Gly Pro His Cys Glu Leu Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro

    210                 215                 220

Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Thr Thr

225                 230                 235                 240

His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Gln Asn Cys Glu Glu

                245                 250                 255

Asn Val Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly Ala Cys

            260                 265                 270

Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Glu Trp Thr

        275                 280                 285

Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Met Pro Asn

    290                 295                 300

Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn

305                 310                 315                 320

Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Asn Ile

                325                 330                 335

Asp Asp Cys Ala Ser Ala Ala Cys Phe Gln Gly Ala Thr Cys His Asp

            340                 345                 350

Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu

        355                 360                 365

Leu Cys His Leu Asn Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly

    370                 375                 380

Ser Asn Cys Asp Thr Asn Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys

385                 390                 395                 400

Pro Ser Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys

                405                 410                 415

Ala Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Leu Asn Thr

            420                 425                 430

Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg

        435                 440                 445

Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Ile Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp

    450                 455                 460

Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Ile Cys Met Pro

465                 470                 475                 480

Gly Tyr Glu Gly Val Tyr Cys Glu Ile Asn Thr Asp Glu Cys Ala Ser

                485                 490                 495

Ser Pro Cys Leu His Asn Gly His Cys Met Asp Lys Ile Asn Glu Phe

            500                 505                 510

Gln Cys Gln Cys Pro Lys Gly Phe Asn Gly His Leu Cys Gln Tyr Asp

        515                 520                 525

Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly Ala Lys Cys Leu

    530                 535                 540

Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr Glu Gly Tyr Thr Gly

545                 550                 555                 560

Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Asp Pro Asp Pro Cys His

                565                 570                 575

Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala Thr Phe Thr Cys Leu Cys Gln

            580                 585                 590

Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys His

        595                 600                 605

Ser Gln Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Arg Asp Asn Ser

    610                 615                 620

Tyr Leu Cys Leu Cys Leu Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cys Glu Ile

625                 630                 635                 640

Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu

                645                 650                 655

Asp Lys Ile Asp Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly

             660                 665                 670

Ser Met Cys Asn Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Ser Pro Cys His

        675                 680                 685

Asn Gly Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Ala Gly Phe Thr Cys Arg Cys

    690                 695                 700

Pro Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys

705                 710                 715                 720

Asn Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Ala Cys Arg Asp Gly Leu Asn Gly

                725                 730                 735

Tyr Lys Cys Asp Cys Ala Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys Asp Ile

            740                 745                 750

Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys

        755                 760                 765

Lys Asp Met Thr Ser Gly Tyr Val Cys Thr Cys Arg Glu Gly Phe Ser

    770                 775                 780

Gly Pro Asn Cys Gln Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys

785                 790                 795                 800

Leu Asn Gln Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val Ala Gly Tyr Lys Cys Asn

                805                 810                 815

Cys Pro Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Val Val Leu Ala Pro

            820                 825                 830

Cys Ala Thr Ser Pro Cys Lys Asn Ser Gly Val Cys Lys Glu Ser Glu

        835                 840                 845

Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Cys Val Cys Pro Thr Gly Trp Gln Gly Gln

    850                 855                 860

Thr Cys Glu Val Asp Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Pro Cys Arg His

865                 870                 875                 880

Gly Ala Ser Cys Gln Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Leu Cys Gln

                885                 890                 895

Ala Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Glu Ser Asp Ile Asp Asp Cys Arg

            900                 905                 910

Pro Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Gly Ile Asn Thr

        915                 920                 925

Ala Phe Cys Asp Cys Leu Pro Gly Phe Gln Gly Ala Phe Cys Glu Glu

    930                 935                 940

Asp Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gln Asn Gly Ala Asn Cys

945                 950                 955                 960

Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Val Gly Phe Asn

                965                 970                 975

Gly Ile His Cys Glu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Glu Ser Ser Cys

            980                 985                 990

Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys Leu

        995                 1000                1005

Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln Tyr Asp Val Asn

    1010                1015                1020

Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu His Gly Gly Thr Cys Gln Asp

    1025                1030                1035

Ser Tyr Gly Thr Tyr Lys Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Gly

    1040                1045                1050

Leu Asn Cys Gln Asn Leu Val Arg Trp Cys Asp Ser Ala Pro Cys

    1055                1060                1065

Lys Asn Gly Gly Arg Cys Trp Gln Thr Asn Thr Gln Tyr His Cys

    1070                1075                1080

Glu Cys Arg Ser Gly Trp Thr Gly Val Asn Cys Asp Val Leu Ser

    1085                1090                1095

Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Lys Arg Gly Ile Asp Val Thr

    1100                1105                1110

Leu Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp Glu Gly Asp Lys

    1115                1120                1125

His Tyr Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys Glu

    1130                1135                1140

Asp Glu Val Asp Glu Cys Ser Pro Asn Pro Cys Gln Asn Gly Ala

    1145                1150                1155

Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Phe Ser Cys Lys Cys Val Ala

    1160                1165                1170

Gly Tyr His Gly Ser Asn Cys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Cys Leu

    1175                1180                1185

Ser Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile Asp Leu Thr Asn

    1190                1195                1200

Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly Val His Cys

    1205                1210                1215

Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys His Pro Pro Leu Asp Pro Ala Ser

    1220                1225                1230

Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln Val

    1235                1240                1245

Gly Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Arg

    1250                1255                1260

Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp Pro

    1265                1270                1275

Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn Asp Phe His Cys

    1280                1285                1290

Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys Glu Ser Val Ile

    1295                1300                1305

Asn Gly Cys Arg Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly Gly Val Cys Ala

    1310                1315                1320

Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Ala

    1325                1330                1335

Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys Gly

    1340                1345                1350

Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly Pro Arg

    1355                1360                1365

Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Ser Phe Thr Gly Pro Glu Cys

    1370                1375                1380

Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Val Gly Ser Asn Pro Cys Tyr

    1385                1390                1395

Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Asn Pro Phe Tyr Arg

    1400                1405                1410

Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile Leu

    1415                1420                1425

Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro Pro

    1430                1435                1440

Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Val Asp Ala

    1445                1450                1455

Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly

    1460                1465                1470

Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys

    1475                1480                1485

Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly

    1490                1495                1500

His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly

    1505                1510                1515

Phe Asp Cys Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp

    1520                1525                1530

Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly

    1535                1540                1545

Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu

    1550                1555                1560

His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val

    1565                1570                1575

Leu Leu Pro Pro Asp Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu

    1580                1585                1590

Arg Glu Leu Ser His Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg

    1595                1600                1605

Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly His Glu

    1610                1615                1620

Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ser Thr Val Gly Trp

    1625                1630                1635

Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gly Arg Gln Arg

    1640                1645                1650

Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu

    1655                1660                1665

Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser Ser Gln Cys Phe

    1670                1675                1680

Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser

    1685                1690                1695

Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser

    1700                1705                1710

Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr

    1715                1720                1725

Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly

    1730                1735                1740

Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp

    1745                1750                1755

Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg

    1760                1765                1770

Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys

    1775                1780                1785

Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp

    1790                1795                1800

Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro

    1805                1810                1815

Val Val Leu Pro Asp Leu Ser Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp

    1820                1825                1830

Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met

    1835                1840                1845

Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp

    1850                1855                1860

Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala

    1865                1870                1875

Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu

    1880                1885                1890

Glu Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala

    1895                1900                1905

Ser Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His

    1910                1915                1920

Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu

    1925                1930                1935

Glu Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr

    1940                1945                1950

Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln

    1955                1960                1965

Ile Leu Leu Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His

    1970                1975                1980

Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu

    1985                1990                1995

Gly Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala

    2000                2005                2010

Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val

    2015                2020                2025

Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn

    2030                2035                2040

Lys Asp Met Gln Asn Asn Lys Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala

    2045                2050                2055

Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His

    2060                2065                2070

Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg

    2075                2080                2085

Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu

    2090                2095                2100

Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Thr Ala

    2105                2110                2115

Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Thr Leu Cys Ser Pro Asn

    2120                2125                2130

Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Lys Ser Ala Thr Gln Gly Lys Lys Ala

    2135                2140                2145

Arg Lys Pro Ser Thr Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala

    2150                2155                2160

Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly

    2165                2170                2175

Cys Leu Leu Asp Ser Ser Ser Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu

    2180                2185                2190

Glu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu

    2195                2200                2205

Leu Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Met Pro Leu Ser His

    2210                2215                2220

Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Ser His Leu Asn

    2225                2230                2235

Val Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Ala Gly Gly Ser Arg

    2240                2245                2250

Leu Ala Phe Glu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val

    2255                2260                2265

Ala Ser Ser Ala Ser Thr Val Leu Ser Thr Asn Gly Thr Gly Ala

    2270                2275                2280

Met Asn Phe Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser Leu Asn Gly Gln Cys

    2285                2290                2295

Glu Trp Leu Pro Arg Leu Gln Asn Gly Met Val Pro Ser Gln Tyr

    2300                2305                2310

Asn Pro Leu Arg Pro Gly Val Thr Pro Gly Thr Leu Ser Thr Gln

    2315                2320                2325

Ala Ala Gly Leu Gln His Ser Met Met Gly Pro Leu His Ser Ser

    2330                2335                2340

Leu Ser Thr Asn Thr Leu Ser Pro Ile Ile Tyr Gln Gly Leu Pro

    2345                2350                2355

Asn Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln

    2360                2365                2370

Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Leu Gln Pro Gln Asn Leu Gln Pro

    2375                2380                2385

Pro Ser Gln Pro His Leu Ser Val Ser Ser Ala Ala Asn Gly His

    2390                2395                2400

Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val

    2405                2410                2415

Gln Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Pro Val His Thr Ile Leu Pro

    2420                2425                2430

Gln Glu Ser Gln Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Met Val

    2435                2440                2445

Pro Pro Met Thr Thr Thr Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His

    2450                2455                2460

Ser Tyr Ser Ser Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu

    2465                2470                2475

Gln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro

    2480                2485                2490

Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn Ile Ser Asp Trp

    2495                2500                2505

Ser Glu Gly Ile Ser Ser Pro Pro Thr Thr Met Pro Ser Gln Ile

    2510                2515                2520

Thr His Ile Pro Glu Ala Phe Lys

    2525                2530

 

<210>58

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

<400>58

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Arg Ile Asn Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Ser Gly Phe Arg Trp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>59

<211>108

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>59

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

 

<210>60

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>60

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Arg Ile Asn Pro Pro Asn Gly Ser Ala His Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Ser Gly Phe Arg Trp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>61

<211>108

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>61

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Ala

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

 

<210>62

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>62

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Arg Ile Asn Pro Pro Asn Arg Ser Asn Gln Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Ser Gly Phe Arg Trp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>63

<211>108

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的

 

<400>63

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Thr Thr Pro Ser

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

 

<210>64

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>64

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Arg Ile Asn Pro Ala Asn Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Ser Gly Phe Arg Trp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>65

<211>101

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>合成的

 

<400>65

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

    50                  55                  60

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

65                  70                  75                  80

Cys Gln Gln Ser Phe Ser Thr Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

                85                  90                  95

Val Glu Ile Lys Arg

            100