哲罗鲑微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和哲罗鲑多态性微卫星标记

摘要

哲罗鲑微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和哲罗鲑多态性微卫星标记，它涉及一种微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和多态性微卫星标记。微卫星序列：一、提取哲罗鲑基因组DNA；二、哲罗鲑基因组DNA的酶切和微卫星富集文库的构建；三、菌落PCR扩增并进行阳性克隆检测和测序。哲罗鲑多态性微卫星标记：步骤一至三与上述方法相同；四、对哲罗鲑微卫星序列进行分析和引物设计；五、微卫星序列引物多态性鉴定。本发明哲罗鲑多态性微卫星标记共7对。本发明方法所获的生物材料可用于哲罗鲑的保护遗传学、亲缘关系分析、连锁图谱构建及养殖群体的遗传管理。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和多态性微卫星标记。

背景技术

哲罗鲑是我国土著的珍稀名贵的鱼类，是鲑科鱼类中体型最大的鱼类。由于环境恶化及过度捕捞等因素，其目前的资源量已十分稀少、濒临灭绝；因此，1998年哲罗鲑被列入《中国濒危动物红皮书(鱼类)》，2004年被列入《中国物种红色名录》。哲罗鲑同时也是一种优良的冷水性养殖鱼类，其具有生长快速、抗逆性强的特点，目前已成功进行了野生哲罗鲑的人工驯养，并在此基础上成功开展了规模化繁殖和养殖。但由于其自残严重、不耐高温、不耐低氧及在北方地区低温季节(如冬春季水温在10℃以下季节)生长缓慢等特性，限制了哲罗鲑的养殖区域及养殖产量，增加了养殖成本，因此有必要对目前人工驯养的哲罗鲑进行进一步选育。

随着生物技术领域的发展，分子标记已在物种的保护遗传学、进化遗传学及鱼类的选择育种中得到充足的发展，尤其是在动物的选择育种上的应用，大大促进了分子标记辅助选择技术的进步，在鱼类中成功的就有罗非鱼催乳素基因对耐盐性状的选择(专利号：ZL 02821303.3)。哲罗鲑作为濒危物种及优良的养殖种类，而可利用的分子标记数量却十分有限，目前Genbank中收录的哲罗鲑的核酸序列仅270多条，其中有153条为本发明发明人所在实验室提交的微卫星序列，其余大部分为哲罗鲑的线粒体部分基因序列，可利用的微卫星分子标记仅十几个，因此开发哲罗鲑的微卫星标记对这一物种进行保护遗传学、进化遗传学的研究是十分必要的，同时也为哲罗鲑的分子标记辅助选择提供充足的分子标记。

微卫星是基因组中由1～6个核苷酸组成的短串联重复3～6次以上的DNA序列，利用重复序列两侧的保守序列设计引物，以此开发微卫星标记(微卫星标记由微卫星序列和微卫星序列引物两部分组成)。由于微卫星标记多态性程度高且共显性遗传，通过它计算杂合度可以较好地反映群体内的变异，因此微卫星标记对于遗传学研究是十分重要的。微卫星标记的开发可以分为3步：一、从基因组中克隆或分离出含有短串联重复的DNA序列，即微卫星序列；二、在微卫星序列的两侧保守序列中设计PCR扩增的引物；三、采用合适的方法鉴定所设计引物的多态性。目前微卫星标记的开发费时费力，主要困难集中在微卫星序列的获得、引物设计及引物PCR扩增条件的优化上。微卫星序列的分离或克隆现有多种方法，如小片段基因组文库的杂交筛选、FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences)、磁珠富集法等，由于磁珠富集法具有阳性克隆率及微卫星序列的得率较高的特点，所以目前被广为应用，但该方法需采用同位素(缺点具有放射性)或生物素二次杂交(缺点毒性较大)技术，增加了微卫星序列分离的风险和成本，所以在使用中具有局限性。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前采用磁珠富集法分离或克隆微卫星序列存在放射性或毒性较大，增加了微卫星序列分离的风险和成本的问题，而提供的一种哲罗鲑微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和哲罗鲑多态性微卫星标记。

本发明哲罗鲑微卫星序列按以下步骤获得：一、提取哲罗鲑基因组DNA；二、哲罗鲑基因组DNA的酶切和微卫星富集文库的构建；三、菌落PCR扩增并进行阳性克隆检测和测序，即获得哲罗鲑微卫星序列。

本发明哲罗鲑多态性微卫星标记按以下步骤获得：一、提取哲罗鲑基因组DNA；二、哲罗鲑基因组DNA的酶切和微卫星富集文库的构建；三、菌落PCR扩增并进行阳性克隆检测和测序，获得哲罗鲑微卫星序列；四、对哲罗鲑微卫星序列进行分析和引物设计；五、微卫星序列引物多态性鉴定，获得具有哲罗鲑多态性微卫星序列及其引物。

本发明哲罗鲑多态性微卫星标记共7对；

微卫星标记HtaCa69的序列如SEQ ID NO：1所示，其正向引物序列为5’-GCAGGCTCTCGCACTAACA-3’，反向引物序列为5’-CTGTCCCATTTGATGTCTGATAA-3’；

微卫星标记HtaCa101的序列如SEQ ID NO：2所示，其正向引物序列为5’-GTCGTTTGCCTCACCTCATA-3’，反向引物序列为5’-CGTTACAGCCACATTCCTACAA-3’；

微卫星标记HtaCa109的序列如SEQ ID NO：7所示，其正向引物序列为5’-AGGGGATTCGGCTATTTCAC-3’，反向引物序列为5’-CCTCTCATTGTGTTGGAGCA-3’；

微卫星标记HtaCa172的序列如SEQ ID NO：3所示，其正向引物序列为5’-AACCGTCCCCTAACCCAAT-3’，反向引物序列为5’-TGCTTACCTCTCCCCAAAGT-3’；

微卫星标记HtaCa183的序列如SEQ ID NO：4所示，其正向引物序列为5’-TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3’，反向引物序列为5’-GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3’；

微卫星标记HtaCa185的序列如SEQ ID NO：5所示，其正向引物序列为5’-GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3’，反向引物序列为5’-TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3’；

微卫星标记HtaCa203的序列如SEQ ID NO：6所示，其正向引物序列为5’-AGCGGAAATAGCAGGAGGTT-3’，反向引物序列为5’-GAATACCACAGCCCAGCATT-3’。

本发明哲罗鲑微卫星序列的获取方法可以快速、方便的获得哲罗鲑微卫星序列；本发明哲罗鲑多态性微卫星标记的获取方法可以快速、方便的获得哲罗鲑多态性微卫星标记。

本发明方法中结合了FIASCO和磁珠富集法的优点，同时避免了磁珠富集法中放射性同位素或生物素二次杂交鉴定阳性克隆所带来的风险，具有成本低、安全性高的优点。本发明方法所获的生物材料可用于哲罗鲑的保护遗传学、亲缘关系分析、连锁图谱构建及养殖群体的遗传管理。

附图说明

图1是具体实施方式十二中选用限制性内切酶Tru9I和Tsp509I进行酶切，酶切片段连接后步骤二c回收的长度为500～900bp的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2是具体实施方式十二中限制性内切酶Sau3AI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图3是具体实施方式十二中限制性内切酶Tsp509I的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图4是具体实施方式十二中限制性内切酶Tru9I的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图5是具体实施方式十二中限制性内切酶CviQI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图6是具体实施方式十二中限制性内切酶BfaI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图7是具体实施方式十二中限制性内切酶TaqI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图8是具体实施方式十二中限制性内切酶Sau3AI的酶切片段和生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图。图9是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa101的检测结果图。图10是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa69的检测结果图。图11是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa172的检测结果图。图12是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa183的检测结果图。图13是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa185的检测结果图。图14是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa203的检测结果图。图15是具体实施方式十三中微卫星标记为HtaCa109的检测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式哲罗鲑微卫星序列按以下步骤获得：一、提取哲罗鲑基因组DNA；二、哲罗鲑基因组DNA的酶切和微卫星富集文库的构建；三、菌落PCR扩增并进行阳性克隆检测和测序，即获得哲罗鲑微卫星序列。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中采用限制性内切酶单酶切或双酶切哲罗鲑基因组DNA。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤二分以下步骤实现：

a、哲罗鲑基因组DNA的酶切：

哲罗鲑基因组DNA酶切体系为20μL，由2μL 10×酶切buffer、0.2μL浓度为10ng/μL的BSA、2.5U限制性内切酶、5μL浓度为100ng/μL的哲罗鲑基因组DNA和余量的灭菌去离子水组成；酶切孵育时间为4h；

b、连接：

连接体系为40μL，由20μL步骤a酶切片段、2μL粘末端双链接头、4μL10×buffer、6weiss单位T4DNA连接酶和余量的灭菌去离子水组成，并于4℃水浴中过夜连接；其中双链接头按以下步骤制备：等体积混合浓度均为10pmol/L的单链寡核苷酸连接头A和单链寡核苷酸连接头B，95℃变性10min，然后经过4h匀速冷却至10℃，即得到双链接头；

c、目的片段获取：

用单链寡核苷酸连接头A做扩增引物进行扩增，扩增反应体系为25μL，由3μL步骤b连接产物、1.5μL引物、2.5μL 10×Buffer、1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.3μL浓度为5U/μL的Taq酶和余量的无菌超纯水组成；扩增反应程序为：72℃2min，94℃预变性5min，循环设置为94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共14～20个循环，72℃延伸10min；扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用Promega PCR产物回收试剂盒切胶回收长度为500～900bp的DNA片段；

d、微卫星富集文库的构建：

I、杂交

取12μL步骤c回收的DNA片段置于95℃环境中变性10min，然后立即加入到68℃、体积为38μL的杂交液中杂交1h后得到杂交DNA；其中38μL的杂交液由1.5μL浓度为10μmol/L的生物素标记的含有重复序列的探针、5μL浓度为10pmol/L的单链寡核苷酸连接头A，15μL 20×SSC，0.5μL质量浓度为10％的SDS和16μL ddH₂O组成；

II、平衡磁珠

在1.0mL离心管中加入100μL链霉亲和素磁珠和200μL洗液C洗涤2次，然后将离心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，弃除上清液，再用200μL洗液D洗涤磁珠3～5次，之后加入150μL洗液D室温放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值为8.0的EDTA的浓度为1mmol/L、pH值为8.0的Tris-Cl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为2mmol/L；洗液D是用6×SSC液稀释的质量浓度为0.1％的SDS溶液；

III、亲和捕捉

将步骤I得到的杂交DNA加入步骤II平衡磁珠中25℃温浴20min，然后去除上清液，再用洗液D 25℃洗涤磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68℃洗涤磁珠2次，再用洗液F洗涤磁珠2次，而后用200μL 0.1×TE洗涤磁珠2次，再加入30μL 0.1×TE在95℃变性10min，然后收集上清液，即得到含有重复序列的单链DNA片段；其中洗液E是用3×SSC液稀释的质量浓度为0.1％的SDS溶液，洗液F为6×SSC液；

IV、PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段

PCR反应体系为25μL，由内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18μL、单链寡核苷酸连接头A为引物0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，步骤III收集的上清液4μL和余量的无菌水组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，循环设置为94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共20～30个循环，72℃延伸10min，用Promega PCR产物回收试剂盒纯化回收，去除多余的引物、dNTP和接头；

V、T-载体连接及克隆

T-载体连接反应体系为10μL，由5μL T-载体商业包装中2×连接缓冲液、1μL载体pMD18-T vector和4μL步骤IV纯化回收的DNA片段组成；同时以T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜；再用CaCl₂制备的感受态大肠杆菌DH5α进行转化，得到基因组微卫星富集文库，并将文库中的单菌落转移培养平板中按顺序排列。其它步骤及参数与实施方式二相同。

本实施方式内切酶从NEB公司购买。酶切孵育温度参见限制性内切酶使用说明。

T4DNA连接酶购自于美国Promega公司。pMD18-T vector购自于宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)。感受态大肠杆菌DH5α购自于盖宁生物科技(北京)有限公司。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中未注明的操作步骤参见试剂使用说明。

本实施方式步骤dIII中25℃温浴使生物素和链霉亲和素结合。

本实施方式步骤dV中连接缓冲液中包含连接酶。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤二d I中生物素标记的含有重复序列的探针为生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针或生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针。其它步骤及参数与实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点是：步骤二a中限制性内切酶为限制性内切酶Tsp509I、限制性内切酶Tru9I、限制性内切酶CviQI、限制性内切酶BfaI、限制性内切酶Sau3AI或限制性内切酶TaqI；步骤二中使用限制性内切酶Tsp509I其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；使用限制性内切酶Tru9I、CviQI或BfaI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-TACTCAGGACTCAT-3′；使用限制性内切酶Sau3AI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3′；使用限制性内切酶TaqI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-CGCTCAGGACTCAT-3′。其它步骤及参数与实施方式四相同。

本实施方式中限制性内切酶Tsp509I的粘末端序列为5′-AATT、酶切温度孵育为65℃，限制性内切酶Tru9I的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为65℃，限制性内切酶CviQI的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶BfaI的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶Sau3AI的粘末端序列为5′-GATC、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶TaqIGATC的粘末端序列为5′-CG、酶切温度孵育为65℃。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤三中用通用引物M13+或M13^-与含有重复序列的探针为引物进行菌落PCR扩增，PCR反应体系为15μL，由浓度为10μmol/L的正向引物、0.6μL浓度为10μmol/L的反向引物、1.5μL Taq DNA聚合酶商业包装中10×Buffer、0.9μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.12μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量的无菌去离子水组成；用无菌牙签按顺序将单菌落挑入反应管中进行菌落PCR，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5min，PCR反应产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，挑取PCR扩增产物为200～750bp的具有明显条带的阳性克隆进行测序。其它步骤及参数与实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤二d I中选用生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针，则步骤三PCR扩增引物为M13+和(CA)₁₀，或者M13-和(CA)₁₀；步骤二d I中选用生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针则步骤三PCR扩增引物为M13+和(CAG)₆，或者M13-和(CAG)₆。其它步骤及参数与实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式哲罗鲑多态性微卫星标记按以下步骤获得：一、提取哲罗鲑基因组DNA；二、哲罗鲑基因组DNA的酶切和微卫星富集文库的构建；三、菌落PCR扩增并进行阳性克隆检测和测序，获得哲罗鲑微卫星序列；四、对哲罗鲑微卫星序列进行分析和引物设计；五、微卫星序列引物多态性鉴定，获得哲罗鲑多态性微卫星标记。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八的不同点是：步骤二分以下步骤实现：

a、哲罗鲑基因组DNA的酶切：

哲罗鲑基因组DNA酶切体系为20μL，由2μL 10×酶切buffer、0.2μL浓度为10ng/μL的BSA、2.5U限制性内切酶、5μL浓度为100ng/μL的哲罗鲑基因组DNA和余量的灭菌去离子水组成；酶切孵育时间为4h；

b、连接：

连接体系为40μL，由20μL步骤a酶切片段、2μL粘末端双链接头、4μL10×buffer、6weiss单位T4DNA连接酶和余量的灭菌去离子水组成，并于4℃水浴中过夜连接；其中双链接头按以下步骤制备：等体积混合浓度均为10pmol/L的单链寡核苷酸连接头A和单链寡核苷酸连接头B，95℃变性10min，然后经过4h匀速冷却至10℃，即得到双链接头；

c、目的片段获取：

用单链寡核苷酸连接头A做扩增引物进行扩增，扩增反应体系为25μL，由3μL步骤b连接产物、1.5μL引物、2.5μL 10×Buffer、1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.3μL浓度为5U/μL的Taq酶和余量的无菌超纯水组成；扩增反应程序为：72℃2min，94℃预变性5min，循环设置为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共14～20个循环，72℃延伸10min；扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用Promega PCR产物回收试剂盒切胶回收长度为500～900bp的DNA片段；

d、微卫星富集文库的构建：

I、杂交

取12μL步骤c回收的DNA片段置于95℃环境中变性10min，然后立即加入到68℃、体积为38μL的杂交液中杂交1h后得到杂交DNA；其中38μL的杂交液由1.5μL浓度为10μmol/L的生物素标记的含有重复序列的探针、5μL浓度为10pmol/L的单链寡核苷酸连接头A，15μL 20×SSC，0.5μL质量浓度为10％的SDS和16μL ddH₂O组成；

II、平衡磁珠

在1.0mL离心管中加入100μL链霉亲和素磁珠和200μL洗液C洗涤2次，然后将离心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，弃除上清液，再用200μL洗液D洗涤磁珠3～5次，之后加入150μL洗液D室温放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值为8.0的EDTA的浓度为1mmol/L、pH值为8.0的Tris-Cl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为2mmol/L；洗液D是用6×SSC液稀释的质量浓度为0.1％的SDS溶液；

III、亲和捕捉

将步骤I得到的杂交DNA加入步骤II平衡磁珠中25℃温浴20min，然后去除上清液，再用洗液D 25℃洗涤磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68℃洗涤磁珠2次，再用洗液F洗涤磁珠2次，而后用200μL 0.1×TE洗涤磁珠2次，再加入30μL 0.1×TE在95℃变性10min，然后收集上清液，即得到含有重复序列的单链DNA片段；其中洗液E是用3×SSC液稀释的质量浓度为0.1％的SDS溶液，洗液F为6×SSC液；

IV、PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段

PCR反应体系为25μL，由内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18μL、单链寡核苷酸连接头A为引物0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，步骤III收集的上清液4μL和余量的无菌水组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，循环设置为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共20～30个循环，72℃延伸10min，用Promega PCR产物回收试剂盒纯化回收，去除多余的引物、dNTP和接头；

V、T-载体连接及克隆

T-载体连接反应体系为10μL，由5μL T-载体商业包装中2×连接缓冲液、1μL载体pMD18-T vector和4μL步骤IV纯化回收的DNA片段组成；同时以T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜；再用CaCl₂制备的感受态大肠杆菌DH5α进行转化，得到基因组微卫星富集文库，并将文库中的单菌落转移培养平板中按顺序排列；

步骤二d I中生物素标记的含有重复序列的探针为生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针或生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针；

步骤二a中限制性内切酶为限制性内切酶Tsp509I、限制性内切酶Tru9I、限制性内切酶CviQI、限制性内切酶BfaI、限制性内切酶Sau3AI或限制性内切酶TaqI；步骤二中使用限制性内切酶Tsp509I其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；使用限制性内切酶Tru9I、CviQI或BfaI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-TACTCAGGACTCAT-3′；使用限制性内切酶Sau3AI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3′；使用限制性内切酶TaqI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-CGCTCAGGACTCAT-3′；

步骤三中用通用引物M13+或M13^-与含有重复序列的探针为引物进行菌落PCR扩增，PCR反应体系为15μL，由0.6μL正向引物、0.6μL反向引物、1.5μL Taq DNA聚合酶商业包装中10×Buffer、0.9μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.12μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量的无菌去离子水组成；用无菌牙签按顺序将单菌落挑入反应管中进行菌落PCR，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5min，PCR反应产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，挑取PCR扩增产物为200～750bp的具有明显条带的阳性克隆进行测序；

步骤二d I中选用生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针，则步骤三PCR扩增引物为M13+和(CA)₁₀，或者M13-和(CA)₁₀；步骤二d I中选用生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针则步骤三PCR扩增引物为M13+和(CAG)₆，或者M13-和(CAG)₆。其它步骤及参数与实施方式八相同。

本实施方式内切酶从NEB公司购买。

T4DNA连接酶购自于美国Promega公司。pMD18-T vector购自于宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)。感受态大肠杆菌DH5α购自于盖宁生物科技(北京)有限公司。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中未注明的操作步骤参见试剂使用说明。

本实施方式步骤dIII中25℃温浴使生物素和链霉亲和素结合。

本实施方式步骤dV中连接缓冲液中包含连接酶。

本实施方式中限制性内切酶Tsp509I的粘末端序列为5′-AATT、酶切温度孵育为65℃，限制性内切酶Tru9I的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为65℃，限制性内切酶CviQI的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶BfaI的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶Sau3AI的粘末端序列为5′-GATC、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶TaqIGATC的粘末端序列为5′-CG、酶切温度孵育为65℃。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八或九的不同点是：步骤四对哲罗鲑微卫星序列进行分析和引物设计按以下步骤实现：

①根据步骤二限制性内切酶和粘末端双链接头序列分组；

②根据分组采用相对应的粘末端连接接头序列进行载体和接头去除，所用程序为DNA测序污染序列批量处理工具(专利申请公开号CN101149743)；

③对去除载体和接头序列后所获得的序列用tandem repeat finder软件进行重复序列筛选，用perl语言程序repeat.pl在tandem repeat finder的分析结果文件中查找重复序列、重复次数、重复序列的开始和终止位置，并确定序列的长度，产生一个包括序列号、序列长度、重复序列单元、重复次数、重复序列开始位置和终止位置的csv文件，借助csv文件进行微卫星引物的批量设计；

④根据步骤③中确定的序列长度和重复序列开始、终止位置，获得微卫星侧翼序列的长度，将其分为侧翼序列小于30bp、侧翼序列小于80bp和侧翼序列大于80bp的3类；

⑤将上述分类中的后两类用perl语言根据步骤③中建立的csv文件建立primer3输入文件，调用primer3引物设计软件进行批量引物设计。其它步骤及参数与实施方式八或九相同。

本实施方式步骤四③中用perl语言程序repeat.pl在tandem repeat finder的分析结果文件为后缀名为.dat文件。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式八、九或十的不同点是：步骤五微卫星标记多态性鉴定：进行PCR，PCR反应体系为15μL，由0.6μL浓度为10μmol/L的正向引物、0.6μL浓度为10μmol/L的反向引物、1.5μL TaqDNA聚合酶商业包装中10×Buffer、0.9μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.12μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量的无菌超纯水组成；PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、退火30s、72℃延伸1min，共25～30个循环，72℃延伸5min，退火温度在48～65℃之间进行梯度筛选；PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，选择具有清晰条带的扩增产物用浓度为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。其它步骤及参数与实施方式八、九或十相同。

具体实施方式十二：本实施方式哲罗鲑微卫星序列按以下步骤获得：一、提取哲罗鲑基因组DNA；二、哲罗鲑基因组DNA的酶切和微卫星富集文库的构建；三、菌落PCR扩增并进行阳性克隆检测和测序，即获得哲罗鲑微卫星序列；

其中步骤二分以下步骤实现：

a、哲罗鲑基因组DNA的酶切：

哲罗鲑基因组DNA酶切体系为20μL，由2μL 10×酶切buffer、0.2μL浓度为10ng/μL的BSA、2.5U限制性内切酶、5μL浓度为100ng/μL的哲罗鲑基因组DNA和余量的灭菌去离子水组成；酶切孵育时间为4h；

b、连接：

连接体系为40μL，由20μL步骤a酶切片段、2μL粘末端双链接头、4μL10×buffer、6weiss单位T4DNA连接酶和余量的灭菌去离子水组成，并于4℃水浴中过夜连接；其中双链接头按以下步骤制备：等体积混合浓度均为10pmol/L的单链寡核苷酸连接头A和单链寡核苷酸连接头B，95℃变性10min，然后经过4h匀速冷却至10℃，即得到双链接头；

c、目的片段获取：

用单链寡核苷酸连接头A做扩增引物进行扩增，扩增反应体系为25μL，由3μL步骤b连接产物、1.5μL引物、2.5μL 10×Buffer、1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.3μL浓度为5U/μL的Taq酶和余量的无菌超纯水组成；扩增反应程序为：72℃2min，94℃预变性5min，循环设置为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共14～20个循环，72℃延伸10min；扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用Promega PCR产物回收试剂盒切胶回收长度为500～900bp的DNA片段；

d、微卫星富集文库的构建：

I、杂交

取12μL步骤c回收的DNA片段置于95℃环境中变性10min，然后立即加入到68℃、体积为38μL的杂交液中杂交1h后得到杂交DNA；其中38μL的杂交液由1.5μL浓度为10μmol/L的生物素标记的含有重复序列的探针、5μL浓度为10pmol/L的单链寡核苷酸连接头A，15μL 20×SSC，0.5μL质量浓度为10％的SDS和16μL ddH₂O组成；

II、平衡磁珠

在1.0mL离心管中加入100μL链霉亲和素磁珠和200μL洗液C洗涤2次，然后将离心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，弃除上清液，再用200μL洗液D洗涤磁珠3～5次，之后加入150μL洗液D室温放置，即得到平衡磁珠；洗液C中pH值为8.0的EDTA的浓度为1mmol/L、pH值为8.0的Tris-Cl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为2mmol/L；洗液D是用6×SSC液稀释的质量浓度为0.1％的SDS溶液；

III、亲和捕捉

将步骤I得到的杂交DNA加入步骤II平衡磁珠中25℃温浴20min，然后去除上清液，再用洗液D 25℃洗涤磁珠2次，每次10min，之后用洗液E 68℃洗涤磁珠2次，再用洗液F洗涤磁珠2次，而后用200μL 0.1×TE洗涤磁珠2次，再加入30μL 0.1×TE在95℃变性10min，然后收集上清液，即得到含有重复序列的单链DNA片段；其中洗液E是用3×SSC液稀释的质量浓度为0.1％的SDS溶液，洗液F为6×SSC液；

IV、PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段

PCR反应体系为25μL，由内含4种dNTP的混合PCR缓冲液18μL、单链寡核苷酸连接头A为引物0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，步骤III收集的上清液4μL和余量的无菌水组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，循环设置为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共20～30个循环，72℃延伸10min，用Promega PCR产物回收试剂盒纯化回收，去除多余的引物、dNTP和接头；

V、T-载体连接及克隆

T-载体连接反应体系为10μL，由5μL T-载体商业包装中2×连接缓冲液、1μL载体pMD18-T vector和4μL步骤IV纯化回收的DNA片段组成；同时以T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜；再用CaCl₂制备的感受态大肠杆菌DH5α进行转化，得到基因组微卫星富集文库，并将文库中的单菌落转移培养平板中按顺序排列；

步骤二d I中生物素标记的含有重复序列的探针为生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针或生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针；

步骤二a中限制性内切酶为限制性内切酶Tsp509I、限制性内切酶Tru9I、限制性内切酶CviQI、限制性内切酶BfaI、限制性内切酶Sau3AI或限制性内切酶TaqI；步骤二中使用限制性内切酶Tsp509I其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；使用限制性内切酶Tru9I、CviQI或BfaI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-TACTCAGGACTCAT-3′；使用限制性内切酶Sau3AI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3′；使用限制性内切酶TaqI其单链寡核苷酸连接头A的碱基序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，单链寡核苷酸连接头B的碱基序列为5′-CGCTCAGGACTCAT-3′；

步骤三中用通用引物M13+或M13^-与含有重复序列的探针为引物进行菌落PCR扩增，PCR反应体系为15μL，由0.6μL浓度为10μmol/L的正向引物、0.6μL浓度为10μmol/L的反向引物、1.5μL Taq DNA聚合酶商业包装中10×Buffer、0.9μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.12μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量的无菌去离子水组成；用无菌牙签按顺序将单菌落挑入反应管中进行菌落PCR，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5min，PCR反应产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，挑取PCR扩增产物为200～750bp的具有明显条带的阳性克隆进行测序；

步骤二d I中选用生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针，则步骤三PCR扩增引物为M13+和(CA)₁₀，或者M13-和(CA)₁₀；步骤二d I中选用生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针则步骤三PCR扩增引物为M13+和(CAG)₆，或者M13-和(CAG)₆。

本实施方式内切酶从NEB公司购买。

T4DNA连接酶购自于美国Promega公司。pMD18-T vector购自于宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)。感受态大肠杆菌DH5α购自于盖宁生物科技(北京)有限公司。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中未注明的操作步骤参见试剂使用说明。

本实施方式步骤dIII中25℃温浴使生物素和链霉亲和素结合。

本实施方式步骤dV中连接缓冲液中包含连接酶。

本实施方式中限制性内切酶Tsp509I的粘末端序列为5′-AATT、酶切温度孵育为65℃，限制性内切酶Tru9I的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为65℃，限制性内切酶CviQI的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶BfaI的粘末端序列为5′-TA、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶Sau3AI的粘末端序列为5′-GATC、酶切温度孵育为37℃，限制性内切酶TaqIGATC的粘末端序列为5′-CG、酶切温度孵育为65℃。

本实施方式选用限制性内切酶Tru9I和Tsp509I进行酶切，酶切片段连接后步骤二c回收的长度为500～900bp的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，图1中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为Tru9I酶切连接后PCR扩增片段，“2”泳道标样为Tsp509I酶切连接后PCR扩增片段。

本实施方式限制性内切酶Sau3AI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图2所示；限制性内切酶Tsp509I的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图3所示；限制性内切酶Tru9I的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图4所示；限制性内切酶CviQI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图5所示；限制性内切酶BfaI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图6所示；限制性内切酶TaqI的酶切片段和生物素标记的(CA)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图7所示。

本实施方式限制性内切酶Sau3AI的酶切片段和生物素标记的(CAG)₁₆寡核苷酸探针构建的微卫星富集文库的菌落PCR电泳图如图8所示。

本实施方式选取微卫星富集文库中菌类PCR PCR扩增产物为200～750bp范围内并具有明显条带的菌落进行序列测定。

具体实施方式十三：本实施方式哲罗鲑多态性微卫星标记按以下步骤获得：

步骤一至步骤三与具体实施方式十二相同；

步骤四对哲罗鲑微卫星序列进行分析和引物设计按以下步骤实现：

①根据步骤二限制性内切酶和粘末端双链接头序列分组；

②根据分组采用相对应的粘末端连接接头序列进行载体和接头去除，所用程序为DNA测序污染序列批量处理工具(专利申请公开号CN101149743)；

③对去除载体和接头序列后所获得的序列用tandem repeat finder软件进行重复序列筛选，用perl语言程序repeat.pl在tandem repeat finder的分析结果文件中查找重复序列、重复次数、重复序列的开始和终止位置，并确定序列的长度，产生一个包括序列号、序列长度、重复序列单元、重复次数、重复序列开始位置和终止位置的csv文件，借助csv文件进行微卫星引物的批量设计；

④根据步骤③中确定的序列长度和重复序列开始、终止位置，获得微卫星侧翼序列的长度，将其分为侧翼序列小于30bp、侧翼序列小于80bp和侧翼序列大于80bp的3类；

⑤将上述分类中的后两类用perl语言根据步骤③中建立的csv文件建立primer3输入文件，调用primer3引物设计软件进行批量引物设计。

步骤五微卫星标记多态性鉴定：进行PCR，PCR反应体系为15μL，由0.6μL正向引物、0.6μL反向引物、1.5μL Taq DNA聚合酶商业包装中10×Buffer、0.9μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.12μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量的无菌超纯水组成；PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、退火30s、72℃延伸1min，共25～30个循环，72℃延伸5min，退火温度在48～65℃之间进行梯度筛选；PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，选择具有清晰条带的扩增产物用浓度为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。

本实施方式步骤四③中用perl语言程序repeat.pl在tandem repeat finder的分析结果文件为后缀名为.dat文件。

本实施方式共对906个序列进行了测定，经分析其中含有798个重复序列，重复序列得率为88.08％，共获得918个微卫星序列，统计结果如表1所示。

表1

步骤四⑤中批量引物设计采用Primer3软件默认参数，对侧翼序列大于30bp的部分进行引物设计，共设计出471对引物，引物可设计率为84.3％。

对本实施方式设计出的引物选择15对进行合成，经筛选其中10对引物能扩增出清晰的条带，对这10对引物进行多态性鉴定，有7对引物呈现多态性。

7对呈现多态性的引物所扩增的微卫星序列分别为HtaCa69(如SEQ IDNO：1所示)、HtaCa101(如SEQ ID NO：2所示)、HtaCa172(如SEQ ID NO：3所示)、HtaCa183(如SEQ ID NO：4所示)、HtaCa185(如SEQ ID NO：5所示)、HtaCa203(如SEQ ID NO：6所示)和HtaCa109(如SEQ ID NO：7所示)。

微卫星标记HtaCa69的正向引物序列为5’-GCAGGCTCTCGCACTAACA-3’，反向引物序列为5’-CTGTCCCATTTGATGTCTGATAA-3’，扩增退火温度为55℃。

微卫星标记HtaCa101的正向引物序列为5’-GTCGTTTGCCTCACCTCATA-3’，反向引物序列为5’-CGTTACAGCCACATTCCTACAA-3’，扩增退火温度为55℃。

微卫星标记HtaCa109的正向引物序列为5’-AGGGGATTCGGCTATTTCAC-3’，反向引物序列为5’-CCTCTCATTGTGTTGGAGCA-3’，扩增退火温度为52℃。

微卫星标记HtaCa172的正向引物序列为5’-AACCGTCCCCTAACCCAAT-3’，反向引物序列为5’-TGCTTACCTCTCCCCAAAGT-3’，扩增退火温度为60℃。

微卫星标记HtaCa183的正向引物序列为5’-TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3’，反向引物序列为5’-GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3’，扩增退火温度为60℃。

微卫星标记HtaCa185的正向引物序列为5’-GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3’，反向引物序列为5’-TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3’，扩增退火温度为60℃。

微卫星标记HtaCa203的正向引物序列为5’-AGCGGAAATAGCAGGAGGTT-3’，反向引物序列为5’-GAATACCACAGCCCAGCATT-3’，扩增退火温度为52℃。

PCR扩增体系为15μL，由0.6μL正向引物、0.6μL反向引物、1.5μL Taq DNA聚合酶商业包装中10×Buffer、0.9μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.2μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、0.12μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量的无菌超纯水组成；PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、退火30s(退火温度由引物而定)、72℃延伸1min，共25～30个循环，72℃延伸5min。PCR结束后用浓度为10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，微卫星标记为HtaCa101的检测结果如图9所示，微卫星标记为HtaCa69的检测结果如图10所示，微卫星标记为HtaCa172的检测结果如图11所示，微卫星标记为HtaCa183的检测结果如图12所示，微卫星标记为HtaCa185的检测结果如图13所示，微卫星标记为HtaCa203的检测结果如图14所示，微卫星标记为HtaCa109的检测结果如图15所示。

根据检测结果可知本实施方式获得的微卫星标记HtaCa69、HtaCa101、HtaCa172、HtaCa183、HtaCa185、HtaCa203和HtaCa109均表现出多态性，可用于哲罗鲑的保护遗传学、亲缘分析等养殖群体遗传管理等方面的研究。

本实施方式方法可快速、方便的获得哲罗鲑多态性微卫星序列及其引物。

具体实施方式十四：本实施方式哲罗鲑多态性微卫星标记共7对；

微卫星标记HtaCa69的序列如SEQ ID NO：1所示，其正向引物序列为5’-GCAGGCTCTCGCACTAACA-3’，反向引物序列为5’-CTGTCCCATTTGATGTCTGATAA-3’；

微卫星标记HtaCa101的序列如SEQ ID NO：2所示，其正向引物序列为5’-GTCGTTTGCCTCACCTCATA-3’，反向引物序列为5’-CGTTACAGCCACATTCCTACAA-3’；

微卫星标记HtaCa109的序列如SEQ ID NO：7所示，其正向引物序列为5’-AGGGGATTCGGCTATTTCAC-3’，反向引物序列为5’-CCTCTCATTGTGTTGGAGCA-3’；

微卫星标记HtaCa172的序列如SEQ ID NO：3所示，其正向引物序列为5’-AACCGTCCCCTAACCCAAT-3’，反向引物序列为5’-TGCTTACCTCTCCCCAAAGT-3’；

微卫星标记HtaCa183的序列如SEQ ID NO：4所示，其正向引物序列为5’-TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3’，反向引物序列为5’-GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3’；

微卫星标记HtaCa185的序列如SEQ ID NO：5所示，其正向引物序列为5’-GCCGAGCAGTGTGTGAGTTA-3’，反向引物序列为5’-TCTGAGCGTTTGTTGAATGTAA-3’；

微卫星标记HtaCa203的序列如SEQ ID NO：6所示，其正向引物序列为5’-AGCGGAAATAGCAGGAGGTT-3’，反向引物序列为5’-GAATACCACAGCCCAGCATT-3’。

序列表

<110>中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120>哲罗鲑微卫星序列与多态性微卫星标记的获取方法和哲罗鲑多态性微卫星标记

<160>29

<210>1

<211>350

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa69的序列。

<400>1

AGGGATGTTT GTTAGCTTGT TTATATTGGC GGTATTGGAG TAGAGTGATG GGTAGAGGTG 60

AGAGGTCAAC CAATGTAATG AGGACGGGCT GCTTATCACA GTACACAACA TGCAGGCTCT 120

CGCACTAACA AACACATTGG ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC 180

ACACACACAC ACAGAAGTAG GCAGCCAGAG GGAGTTGGAG CTATTGAAAA GGGCAGCGTG 240

TGTTTACAGT CAGATATCAG AAAAGGTTAT CAGACATCAA ATGGGACAGC CGTGTCTCAG 300

CCAATCACAC AGAGGGACCA GAGGCACGGT AACGAATCAC AGACAGACAG 350

<210>2

<211>892

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa101的序列。

<400>2

CTAAATAGCT AACAAAATGG CTACACTGAC TATCTGCGTT GACCCTTTTA TTTTGCACTG 60

ACTATCACAG GACTCCACAC ACACACGCAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC 120

ACACACACAC ACACACACAC ACACACTTAA TACACTGGGG AGGGACACCG AGACAGAGGA 180

GCAATGAGAA AGATACTGAA AGTGGATGAG ATAGAGAAGA TGAGGAAGAC AACATTTAGG 240

AGAGATAAGA TGTGTGCTGA TAATATTGAC GGAAATATAT GGTAATACAA AGTAGTAAAA 300

GAGAGAGATA AAGACGGCGA TAGAGAGGGA ATGAGAGACA GAAGGAAGGA AGGATGGTAA 360

AAGATTAATG ATGAGGGGAT GGCAGGCAAG GTCAGGGCAG AGCATGGAAG AAAGGAGTGA 420

TGATGCAGCT AGTGAACAAA ACCTAAGGAC AACAAGACTA ACATGCTGGT CAGGCACTCT 480

GTCCATACCA CACTTAAAGG ACAATGTGTC CCCCAAGCCA TACTAAACAA TAGGACATAC 540

AGTCACAAAA TAAACAGTGG AATCTGAGGT AAATAAGTGC TGCTGTCAGT GAGTGTATGA 600

TGATCTGAGT GAATATCTAG TCAAGTCCAT GCACTATACA GTATATCACA CTATAGTGAC 660

ATTATCACAT AGAAAGTTGT ACCTTGGTCA CATAAACAAA CTGGCAATCT CAAAGGGCTC 720

ATGTCGTTTG CCTCACCTCA TAACTTCTGT AAAGGACAGT AATGTGTATG CACGCAAGTA 780

CACTTACACA CACACACACA CACACAGAGG TTTATAGACC ACTCTCCATC AGTTTGGCAA 840

CCAGTTCTGA TTGTCTTGTA GGAATGTGGC TGTAACGGCC CTCCAGTGAA TT 892

<210>3

<211>677

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa172的序列。

<400>3

ATTACTTATT TATTGTACAA TGACGGCCTA CCCCGGCCAA ACCGTCCCCT AACCCAATTG 60

TGCGCCGTCC TATGGGACTC CGGATTACAG CCAGTTTGTG ATATAGCCCA GGATTGAACC 120

AGGGTCTGTA GTGACGCCTC TAGCACTGAG GTGCCATGCC TTAGACCGCT GCACCACTTG 180

GGAATGAATA CATGGTTTAC TCAGCTAATA TTTAGGGCCA AAATAGCATT TCATGAAATG 240

TCAAAAATGT AATTCTATAG GAGCTTGTGT GACACACGCT CACTCACTCA CGCACAGACA 300

CACTTGCGCG CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 360

CAGAGGCAAA GAGCACTGTG AGTCCATTGA GGATATGTGA ACTGGCTCAT TGACTTTGGG 420

GAGAGGTAAG CATTCCGTTT TTCCTCTACA AGTTATACCC TGATTTCTTT GGAATGTGTT 480

TTAGCTTGTG CAGGTGAGGG CTGACAAATT GTCTGTTGTA TTTTGTTGCC TTACATTCAA 540

CCGCAGATCA TCAGTGATTA CATAGTCCAT GTACTTGACA AAAGCTATCC TGCTGTTTTG 600

TGAGTGGTCA TGATTGAGGG ATGCTTTGGG GAATTTTGCT GATAGTCTTG ACCACCTGCT 660

ATTTGTTATG TGCTGCC 677

<210>4

<211>408

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa183的序列。

<400>4

ATTCACACAT GCGCGCCCAC ACAGACACAC ACACTTATGC ACCCCTACAA GCCAGGCGGA 60

TGTTCTTTGG GTCAGCTATC TTCTCTCAGA GTGAATTTGG ATGTCGTTTC CTCTTGATTT 120

GTGTCGTGTC TGAGCGTTTG TTGAATGTAA TTGTGTGGCA CAAAGCTGTA GACATCTCTC 180

TTTCTCTCTC TCTCTCCCTC CCACGGACAA GCATCCCTGC AGCTCACCCA TAATTCCACA 240

GTTTCTATCT CGACCATAAC TCACACACTG CTCGGCACTA ACTAAAGGGG CTGTCTGTAG 300

CGAGGCTGAT TGCATGTTTG TCCACCAAAT TGTGGGTGCA GCAGAGAGAG ACTGCAGAGA 360

GGAAGAGAGT ACACACACAG CCTGGCCATG CCAGGAGCCA GTAGTGTT 408

<210>5

<211>430

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa185的序列。

<400>5

AACACTACTG GCTCCTGGCA TGGCCAGGCT GTGTGTGTAC TCTCTTCCTC TCTGCAGTCT 60

CTCTCTGCTG CACCCACAAT TTGGTGGACA AACATGCAAT CAGCCTCGCT ACAGACAGCC 120

CCTTTAGTTA GTGCCGAGCA GTGTGTGAGT TATGGTCGAG ATAGAAACTG TGGAATTATG 180

GGTGAGCTGC AGGGATGCTT GTCCGTGGGA GGGAGAGAGA GAGAGAACGA GAGATGTCTA 240

CAGCTTTGTG CCACACAATT ACATTCAACA AACGCTCAGA CACGACACAA ATCAAGAGGA 300

AACGACATCC AAATTCACTC TGAGAGAAGA TAGCTGACCC AAAGAACATC CGCCTGGCTT 360

GTAGGGGTGC ATAAGTGTGT GTGTCTGTGT GGGCGCGCAT GTGTGTGCTT GTATGCGTGT 420

GTGTGTGAAT 430

<210>6

<211>568

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa203的序列。

<400>6

AATTGTTTAG CGGAAATAGC AGGAGGTTAT CACATACTCT GATGGTATCA GTGTCACAAC 60

AACAAACTAC TTGAAGAAAT ACACACATCA CACACACACA CTCCCACGAA CACAAATACT 120

CACACACTCC AATGCTGGGC TGTGGTATTC CACGGGAGCA ACTGAGAATA CTGGGACTGT 180

TATCACATGC TCATAGGAGC GCACCGTGTG GACAAAATAA CATACACATG CAGTATTCTG 240

TGCACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 300

CACACAATCG AACGAACACA CACACACACA CACACACATA CATGCATGCA CACACACACC 360

ATGGTGAGAC TGTCCCACAG CTTTAGCTGG ACAACACAAA CCACAGCAGA AGTGGCAACA 420

GAGCACACAC ACACACACTA ACCGCAGTAC TGTAACAGTG TCTTATCCAT GCTCCATGCA 480

GTCTTTGGGG AGGTGTGGAC CTAATGACTT CTAATATCAG CAAGCAGCCT CTCCTCGCTT 540

GGTTGACACA GACAACCCAG TCCTAATT 568

<210>7

<211>493

<212>DNA

<213>哲罗鲑(Hucho taimen)

<220>

<223>哲罗鲑多态性微卫星标记HtaCa109的序列。

<400>7

GTGTATAGTG CAATGTCCCT CTTAAATTTC AAATGCTCCA TATCCTTCCA CCGTGTTTCC 60

CACATGTTCA GACTACATTT TGAGATAATA CACAACATAT ACAAAAGTAT GTGGACACCC 120

CTTCAAATTA AGGGGATTCG GCTATTTCAC CCACACCTGT GTAGTTCCGT ACATCGGTAA 180

AGAGACAGGT GGGTCGGGGG GGGCTAATAC ACACACACAC ACACACACAC ACACTCACAC 240

ACAGACACAC ACACACACAC ACACCAGTCT AACTTCTGTG TGCTCCAACA CAATGAGAGG 300

GTAACGGCTA AACCAGCAGC CTATTGGTCG AAAAAACCCC AAAAGGTTAA CTTATAAACT 360

TGTGCGTAAT GGCATGGCGT TTCATATACG CCACACTTCC ACATGAAGTA GACTTATAGG 420

CCTATGCTTA TTGCCTTGTG ACTGTAGATC ACATTTTTAC TGATACTGTA GAACACTACA 480

GTACCATTGG ATT 493

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶Tsp509I其单链寡核苷酸连接头A序列。

<400>8

CTCGTAGACT GCGTACC  17

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶Tsp509I其单链寡核苷酸连接头B序列。

<400>9

AATTGGTACG CAGTCTAC  18

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶Tru9I、CviQI或BfaI其单链寡核苷酸连接头A序列。

<400>10

GACGATGAGT CCTGAG 16

<210>11

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶Tru9I、CviQI或BfaI其单链寡核苷酸连接头B序列。

<400>11

TACTCAGGAC TCAT  14

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶Sau3AI其单链寡核苷酸连接头A序列。

<400>12

GATCGTCGAC GGTACCGAAT TCT 23

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶Sau3AI其单链寡核苷酸连接头B序列。

<400>13

CAGCTGCCAT GGCTTAAGAA CTG 23

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶TaqI其单链寡核苷酸连接头A序列。

<400>14

GACGATGAGT CCTGAG 16

<210>15

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用限制性内切酶TaqI其单链寡核苷酸连接头B序列。

<400>15

CGCTCAGGAC TCAT 14

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa69的正向引物序列。

<400>16

GCAGGCTCTC GCACTAACA 19

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa69的反向引物序列。

<400>17

CTGTCCCATT TGATGTCTGA TAA 23

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa101的正向引物序列。

<400>18

GTCGTTTGCC TCACCTCATA 20

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa101的反向引物序列。

<400>19

CGTTACAGCC ACATTCCTAC AA 22

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa109的正向引物序列。

<400>20

AGGGGATTCG GCTATTTCAC 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa109的反向引物序列。

<400>21

CCTCTCATTG TGTTGGAGCA 20

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa172的正向引物序列。

<400>22

AACCGTCCCC TAACCCAAT  19

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa172的反向引物序列。

<400>23

TGCTTACCTC TCCCCAAAGT 20

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa183的正向引物序列。

<400>24

TCTGAGCGTT TGTTGAATGT AA 22

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa183的反向引物序列。

<400>25

GCCGAGCAGT GTGTGAGTTA 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa185的正向引物序列。

<400>26

GCCGAGCAGT GTGTGAGTTA 20

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa185的反向引物序列。

<400>27

TCTGAGCGTT TGTTGAATGT AA 22

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa203的正向引物序列。

<400>28

AGCGGAAATA GCAGGAGGTT 20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>微卫星标记HtaCa203的反向引物序列。

<400>29

GAATACCACA GCCCAGCATT 20