环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌

摘要

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，目前，微生物的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。本发明组成包括：预处理、检测过程、结果检测、结果判断，选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物，通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。本发明应用于对食源性致病菌的检测。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌。

背景技术：

目前，对食源性致病菌的检测主要有标准方法、生化仪器法(API，VETEK)、酶联荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金试纸法、PCR法、基因芯片法等。微生物的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。

随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感致病菌检测方法。免疫学方法简单快速，但灵敏性差，假阳性高；分子生物学技术简单快速，灵敏度高，但设备投入高，不易推广使用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种检测方便、快捷的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因、检测过程、结果检测、结果判断，选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物：

内引物为：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA

          BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA

外引物为：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC

          B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA

通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、检测过程、结果检测、结果判断，所述的检测过程是将22.5μLLAMP反应液、0.5μLBst酶，DNA(单核细胞增生李斯特菌)加入到洁净的1.5mL离心管中，混合均匀，以2000r/min转速离心10sec，向一组反应管中分别加入22.5μL上述反应液，向PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2μL，盖紧管盖并做好标记，置65℃恒温反应60min。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的预处理是将环介导恒温扩增LAMP反应液在使用前在室温融化振荡混匀后，以2000r/min转速离心10sec，其余室温融化后，以2000r/min转速离心10sec。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果检测是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所需LAMP反应管数的计算方法为：设LAMP反应管数为n，则n＝样品数+1(阳性对照)+1(阴性对照)+1。

这个技术方案有以下有益效果：

LAMP方法的特点：(1)扩增产物的检测方便、快捷。LAMP反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀，肉眼即可观察，是鉴定反应是否进行的最直接的参照。另外，LAMP扩增产物可以像PCR反应一样利用凝胶电泳并结合成像系统进行检测。(2)LAMP反应特异性强、灵敏度高。针对病原微生物特异性基因靶核酸序列设计的两对内外引物，可以严格地识别靶核酸序列上的6个独立区域，所以LAMP反应不会受到反应混合物中存在的非靶序列DNA存在的影响。(3)LAMP反应扩增效率高。此反应是在恒温条件下(60～65℃)进行，没有温度循环变化上的时间损失。(4)实验装置简单。LAMP反应由于不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可进行，因此，不需要温度循环装置。在操作过程中，仅需要普通水浴锅或者其他可以得到稳定热源的设备就可以。由此可见，此方法设备投资少，便于检测和操作，具有广泛推广性，可以成为普通实验室的检测方法。

1.LAMP反应特异性强、灵敏度高。设计的两对内外引物，可以严格地识别靶核酸序列上的6个独立区域。检测单核细胞增生李斯特菌的灵敏度达到102cfu/mL。

2.本发明扩增产物的检测方便、快捷。LAMP反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀，肉眼即可观察，是鉴定反应是否进行的最直接的参照。另外，LAMP扩增产物可以通过荧光物质不开盖检测。也可以利用凝胶电泳进行检测。

3.本发明LAMP反应扩增效率高。此反应在恒温条件下65℃进行60min，即可出结果。

4设备要求不高。LAMP反应在恒温下就可进行，因此，不需要温度循环装置。在操作过程中，仅需要普通水浴锅或者其他可以得到稳定热源的设备就可以。由此可见，此方法设备投资少，便于检测和操作，具有广泛推广性，可以成为普通实验室的检测方法。

本发明的具体实施方式：

实施例1：

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因、检测过程、结果检测、结果判断，选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物：

内引物为：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA

          BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA

外引物为：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC

          B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA

通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。

实施例2：

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、检测过程、结果检测、结果判断，所述的检测过程是将22.5μLLAMP反应液、0.5μLBst酶，DNA(单核细胞增生李斯特菌)加入到洁净的1.5mL离心管中，混合均匀，以2000r/min转速离心10sec，向一组反应管中分别加入22.5μL上述反应液，向PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2μL，盖紧管盖并做好标记，置65℃恒温反应60min。

实施例3：

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的预处理是将环介导恒温扩增LAMP反应液在使用前在室温融化振荡混匀后，以2000r/min转速离心10sec，其余室温融化后，以2000r/min转速离心10sec。

实施例4：

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果检测是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。

实施例5：

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

实施例6：

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所需LAMP反应管数的计算方法为：设LAMP反应管数为n，则n＝样品数+1(阳性对照)+1(阴性对照)+1。