稻蝗属特异性分子标记DNA序列及其应用

摘要

本发明通过大量筛选RAPD分子标记，获得一条667bp稻蝗属物种共有的DNA条带，经对其克隆、测序和同源比较，设计引物并进行PCR扩增，获得550bp稻蝗属物种特异性DNA条带，该条带可作为分子遗传学标记，用于稻蝗属物种鉴别。本发明克服了常规形态性状及细胞学鉴定方法的不足，提供了对稻蝗属物种快速、准确鉴定的分子标记方法，为物种准确分类和害虫有效防治提供依据。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫DNA序列，具体涉及稻蝗属物种DNA分子标记序列及其应用。

背景技术

稻蝗属昆虫是农业生产上的重要害虫，喜食水稻，对水稻生产为害极大，该属物种的准确鉴定是对其有效防治的前提。稻蝗属物种鉴定一直依赖于形态学和细胞学手段，由于该属物种形态性状存在多态性，在实际应用中很难获得稳定、统一的鉴定标准；细胞学方法由于制样程序和技术的要求较高，也难以得到该属物种特异性细胞学标记，因此，目前稻蝗属物种分类仍存在一定争议。同时，稻蝗属与斑腿蝗科内其它属的分类鉴定也存在一定的问题，例如，稻蝗属与伪稻蝗属、拟稻蝗属、籼蝗属、芋蝗属等形态上比较相似，难以准确区分，导致分类困难。

发明内容

本发明的目的是从稻蝗属基因组中克隆出稻蝗属物种特异性DNA分子遗传学标记，并用于稻蝗属物种鉴别。

本发明通过大量筛选RAPD分子标记，获得一条667bp稻蝗属物种共有的DNA条带，经对其克隆、测序和同源比较，设计引物并进行PCR扩增，获得550bp稻蝗属物种特异性DNA条带，该条带可作为分子遗传学标记，用于稻蝗属物种鉴别。

本发明获得的稻蝗属物种特异性分子标记DNA核苷酸序列为：

cgcgtacttc cgacttaagt ttatcatccc tgaaataaaa tcacataatc accatctgca    60

tgtagtgaca ctgtccatca gagcttctgt cctgctgtta actgtaagtg atttagtgcc    120

acacattctg cagtgtgaaa gtgaagttca cacttggaaa cgttgcgttc ttttaccgtt    180

tcagacggca tttcgctttt gtgcttagag tggcactctg ctggtagatc aaaataaatt    240

acttgacttt gttacttgtg actatcaata tatcacgtta cttttctgtc atattacctt    300

tttttagaga cgattcttat tgttagtttt cttcaaaggt tcgtatgctt tcatcaagcc    360

atagtaagtg tcatgtaaaa gctgttcttg ccgttgtttg tttcctcata gtaattgtat    420

gtgataaact gtgtgaatac ctcagagtgc atgctttgta acaaagctaa tacactgcac    480

gtctggacgt ccacgtaagg agtcgtggac tacttaatac tgatagaaag taatatatag    540

ggtattcaat tagattcaca cgaacaaaac tggttatttt aagaactaga cagagtggaa    600

ggtagtggat agcgactgag tctgcaaccg tctacagact caagtataca tcgctttgaa    660

gtacgcg                                                              667

本发明在对稻蝗属物种遗传分化的研究中，发现随机引物S823 5′-CGC GTA CTT C-3′可在稻蝗属不同物种扩增出一条667bp的稳定条带；根据DNA序列设计了一对可特异扩增稻蝗属物种的引物：

上游引物：TGTCCATCAGAGCTTCTGTCCTGCTG

下游引物：TGCAGACTCAGTCGCTATCCACTACC

用该引物扩增蝗总科各物种基因组DNA样本，有550bp扩增条带的，为稻蝗属物种样本。

本发明克服了常规形态性状及细胞学鉴定方法的不足，提供了对稻蝗属物种快速、准确鉴定的分子标记方法，为物种准确分类和害虫有效防治提供了方法和依据。

附图说明

图1用设计的引物对蝗总科11个物种DNA样本进行PCR检测的电泳图。1-12泳道依次为：中华稻蝗(Oxya chinensis)、日本稻蝗(Oxya japonica)、山稻蝗(Oxya agavisa)、小稻蝗(Oxya intricata)、短翅稻蝗(Oxya brachyptera)、无齿稻蝗(Oxya adentata)、稻蝗属待定种、赤胫伪稻蝗(Pseudoxya diminuta)、隆额网翅蝗(Arcyptera coreana Shiraki)、宽翅曲背蝗(Pararcyptera microptera meridionalis(Ikonn))、亚洲小车蝗(Oedaleus decorus asiaticusBei Bienko)、空白对照。Marker：200bp ladder

具体实施方式

实施例1稻蝗属物种DNA分子标记序列获得及应用

1、采用饱和NaCl法提取蝗虫基因组DNA

取中华稻蝗、日本稻蝗、山稻蝗、小稻蝗、短翅稻蝗、无齿稻蝗、稻蝗属待定种、赤胫伪稻蝗、隆额网翅蝗、宽翅曲背蝗、亚洲小车蝗后足股节肌肉，冷冻蝗虫标本用无菌三蒸水冲洗2～3次；100％乙醇固定标本用无菌三蒸水浸泡48h以上，弃水；对干标本，用500μl浸泡液(10mmol/L Tris-HCl，200mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl pH 8.0)浸泡48h以上，弃去浸泡液；剪碎材料；加400μl消化液(STE(pH8.0)，1％SDS，200μg/ml Proteinase K)于55℃消化8～12h以上，加300μl饱和NaCl，涡旋30s，10,000r/min离心30min，转移上清，等体积异丙醇沉淀DNA，TE(pH 8.0)溶解后，于-20℃保存备用。

2、采用RAPD-PCR技术扩增蝗虫基因组DNA，进行稻蝗属特异性分子标记的筛选

本实验共对78条随机引物进行筛选，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公合成实验中共筛选出28条引物，其中10条用于本实验中所有供试蝗虫组织DNA的扩增。所筛选引物S823的序列为：5′-CGC GTA CTT C-3′

PCR反应体系为25μl，其中模板DNA 20～50ng，10×buffer 2.5μl，Mg²⁺2～2.5mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，dNTP 0.2mmol/L(10×缓冲液、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTP均为华美生物工程公司提供)，引物0.4μmol/L。反应条件：94℃预变性1min 45s；94℃变性30s，37℃复性1min 30s，72℃延伸2min；45个循环后，72℃延伸10min。

扩增产物用含有EB(0.5μg/ml)的1.2％琼脂糖凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，取样品DNA 10μl加入2μl上样缓冲液，混匀后点入胶孔。标准分子量为200bp DNA Ladder(为华美生物工程公司提供)，100V恒压电泳1.5h，凝胶成像系统观察拍照。

3、应用DNA胶回收试剂盒，选择回收稻蝗属共有DNA条带

在紫外灯下将所需的目的片段从胶上切下，置于干净的EP管中。94℃溶化胶块，取1.5μl为模板，用引物S823进行PCR。将PCR产物进行电泳后，切下目的条带，用上海华舜生物工程有限公司的产品小量胶回收试剂盒按照其步骤回收PCR产物。

4、应用DNA重组技术回收克隆DNA条带

将回收产物插入pGEM-T载体，转化大肠杆菌进行克隆，酶切验证后送往北京奥科生物公司测序，进一步对序列在NCBI上做Blast分析。

(1)在0.5ml低DNA结合力的离心管中按照T载体说明将回收DNA条带与T载体连接，具体连接步骤如下：10μl反应体系中含有5μl T₄ DNA连接酶2×快速连接缓冲液，1μlPGEM-T Easy vector(50ng)，3μl PCR产物，1μl T₄ DNA连接酶(3Weiss/μl)。用移液器吹打连接反应液使之混匀，4℃孵育过夜，待用。

(2)转化反应和细菌培养

1)从-70℃冰箱中取出50μl感受态细胞DH5α，冰水解冻，轻掸管壁以混匀细胞；

2)短暂离心连接反应管(4,000g，30s)，取一半体积的连接反应物于解冻后的感受态细胞中，轻掸混匀，冰水浴30min；

3)取出离心管，于42℃水浴50-90s；

4)冰水浴2min；

5)离心管中加入950μl SOC液体培养基；

6)37℃，温和地振摇1.5h(150转/分)，使细菌复苏，并使质粒编码的抗性基因表达；

7)1,000g，常温10min离心，倒去绝大部分上清液(留存150μl左右)，重新温和地悬浮细菌，涂于预先处理好的平板培养基上(提前半小时涂100μl 100mM IPTG和20μl50μg/ml X-gal于平板培养基中)。待吸收后倒置放入37℃烘箱中，16h左右观察蓝、白菌落，可置4℃短期保存待用；

8)取经灭菌的试管若干，加入约4ml左右的液体LB培养基(含0.1％氨苄抗生素)；

9)用灭菌牙签小心挑取白色菌落，丢于试管中；

10)37℃，250转/分振荡培养过夜，至溶液混浊。

(3)质粒回收

经蓝白斑和氨苄筛选，重组质粒扩大培养，采用上海华舜生物工程有限公司的产品小量质粒快速抽提纯化试剂盒按照其步骤回收质粒；具体步骤如下：

1)从试管中向1.5ml EP管中倒入菌液，9000g离心1分钟，弃去上清液。

2)在细菌沉淀中加入250μl P1液(细菌悬浮液)，震荡至彻底悬浮。注：一定要使细菌彻底悬浮，否则将影响得率与质量。

3)加入250μl P2液(碱裂解液)，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀，室温静置0-4分钟。注：若同时抽提多个样品，加一管，混匀一管，计时从第一管开始。待彻底澄清后即可加入P3液(中和液)，决不要超过5分钟。

4)加入350μl P3液(中和液)，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀。注：若同时抽提多个样品，加一管，混匀一管。

5)12000g～13000g离心20分钟，将上清液小心移入吸附柱，9000g离心15S，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管中。注：量多可以分次上柱；决不要把沉淀移入吸附柱，否则将出现蛋白质污染。

6)在吸附柱中加入500μl B1液(清洗液)，离心15S，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管中。

7)在吸附柱中加入250μl SW液(清洗液)，静置1分钟，离心15S，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管中。

8)在吸附柱中加入500μl W1液(洗涤液)，离心15S，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管中。注：若事温低于20℃，离心前先静置1分钟。

9)在吸附柱中加入500μl W1液(清洗液)，静置1分钟，离心15S，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管中。

10)离心1分钟，弃收集管，将吸附柱放入干净的EP管中，在吸附膜中央加入50ulT1(2mM Tris)液(洗脱液)，静置5分钟，离心1分钟(9000g)。弃吸附柱。将质粒回收产物贮存于-20℃

(4)酶切检测

将第(3)步获得的质粒，用EcoR I进行酶切鉴定，10ul的酶切体系中含有：1ul 10×buffer，5ul PCR产物，0.208ul EcoR I(12U/ul)和3.792ul无菌水。37℃温浴120min，取5ul电泳检测。

(5)目的片段测序

将含有目的片段的菌液约1.5ml送往北京奥科生物公司进行测序。

5、序列分析

对所获得的中华稻蝗(Oxya chinensis)、日本稻蝗(O.japonica)、短翅稻蝗(O.brachyptera)S823扩增的序列比对分析，序列同源度达到94％-97％，再NCBI网站Blast搜索，确定为新发现的DNA序列。

6、DNA序列标记用于稻蝗属物种的鉴定

根据新发现的DNA序列设计引物，先对3条DNA序列同源分析，基于同源区域核苷酸序列设计引物。引物G+C＞50％，长度为26bp，退火温度为65℃，保证了扩增的特异性。以饱和NaCl法提取蝗虫基因组DNA为模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系为25μl，包括17.9μl的灭菌水，2.5μl的buffer，1.7μl的Mg²⁺(25mM)，0.5μl dNTP(10mM)，上游引物和下游引物(10mM)各1μl，0.2μl Taq DNA聚合酶(5U/μl，Promega)。循环条件为：94℃预变性30s，94℃变性30s，60℃复性45s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min。然后琼脂糖凝胶电泳分离检测。根据所选取的蝗虫样本有无550bp的扩增条带，确定DNA序列为稻蝗属物种共有的特异分子标记。

本发明DNA分子标记是利用10个随机引物扩增7个稻蝗属物种和1个伪稻蝗属物种35个种群共305个标本基因组DNA，分析稻蝗属物种遗传多样性及分化。回收稻蝗属7个物种共有的DNA序列，加以克隆鉴定得到。与共有序列相关的随机引物是：S823 5′-CGC GTA CTTC-3′

对克隆和鉴定的DNA序列，检索美国NCBI基因数据库，确定为新发现的DNA序列。经序列同源比对，在同源区域设计特异引物。对7个稻蝗属物种和4个非稻蝗属物种样本DNA进行扩增。

引物序列及扩增结果如下：

上游引物序列：TGTCCATCAGAGCTTCTGTCCTGCTG

下游引物序列：TGCAGACTCAGTCGCTATCCACTACC

用这对引物和PCR技术对各种稻蝗和其它蝗虫样本基因组DNA的扩增结果为：所有稻蝗属物种的样本均有一个550bp的条带，其它蝗虫样本无该特异扩增条带(见图1)。因此，该DNA序列可做为稻蝗属分子遗传标记，用于稻蝗属与其它蝗虫物种的鉴别。

SEQUENCE LISTING

<110>山西大学

<120>稻蝗属特异性分子标记DNA序列及其应用

<210>1

<211>667

<212>DNA

<213>稻蝗属特异性分子标记DNA序列

<220>

<400>1

cgcgtacttc cgacttaagt ttatcatccc tgaaataaaa tcacataatc accatctgca    60

tgtagtgaca ctgtccatca gagcttctgt cctgctgtta actgtaagtg atttagtgcc    120

acacattctg cagtgtgaaa gtgaagttca cacttggaaa cgttgcgttc ttttaccgtt    180

tcagacggca tttcgctttt gtgcttagag tggcactctg ctggtagatc aaaataaatt    240

acttgacttt gttacttgtg actatcaata tatcacgtta cttttctgtc atattacctt    300

tttttagaga cgattcttat tgttagtttt cttcaaaggt tcgtatgctt tcatcaagcc    360

atagtaagtg tcatgtaaaa gctgttcttg ccgttgtttg tttcctcata gtaattgtat    420

gtgataaact gtgtgaatac ctcagagtgc atgctttgta acaaagctaa tacactgcac    480

gtctggacgt ccacgtaagg agtcgtggac tacttaatac tgatagaaag taatatatag    540

ggtattcaat tagattcaca cgaacaaaac tggttatttt aagaactaga cagagtggaa    600

ggtagtggat agcgactgag tctgcaaccg tctacagact caagtataca tcgctttgaa    660

gtacgcg                                                              667