一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法。该方法由植物病样制备、肉眼观察和PCR验证三个阶段组成，可在4小时内完成检测与鉴定，而且检测鉴定成本低。该方法突破了传统的植物细菌病害鉴定周期长、专业性强和成本较高等局限性，也克服了从国外进口的微生物鉴定系统需要专用仪器设备和耗材、成本高和鉴定周期较长的不足，将病样品的特殊表症与分子生物技术有机地结合起来，结果准确可靠，从而达到实际生产中对植物病害鉴定快速、准确的要求。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害鉴定技术领域，特别涉及茄科青枯菌(Ralstoniasolanacearum)侵染引起的青枯病的快速检测鉴定方法。

背景技术

对于茄科青枯菌侵染引起的青枯病检测鉴定，现有技术有三种：传统的植物病原细菌分离鉴定方法、BIOLOG微生物鉴定系统和梅里埃微生物鉴定方法。

传统的植物细菌性青枯病鉴定方法，主要包括从病样中分离病原菌、获得分离菌株的纯培养、菌落与菌体形态特征观察、生理生化特性测定和致病性测定等步骤，该鉴定过程至少需要1个月以上，工作量大，鉴定时间长，而且专业性强。

至于目前市面上销售的国外进口的微生物鉴定系统，代表性的有美国BIOLOG公司和法国梅里埃公司开发的微生物鉴定系统。前者是以检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的酶与四唑类物质发生颜色反应和浊度差异为基础，建立起指纹图谱与微生物种类相反应的数据库，通过智能软件将待鉴定微生物的图谱与数据库参比，得出鉴定结果。后者是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果，与种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值。上述这二种鉴定系统的鉴定过程均需要18小时以上，还需要购买昂贵的进口专用鉴定材料和仪器设备，而且该系统主要适用于人、动物及环境微生物鉴定，少见用于植物病原微生物的鉴定，目前文献也未见有用于茄科青枯病鉴定的报道。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种操作简便、快速准确、成本低廉的茄科青枯病鉴定方法。本发明将病样特殊表症与聚合酶链式反应(PCR)技术有机地结合起来，以茄科青枯菌特有的FliC基因(装配茄科青枯菌鞭毛的主要基因之一，FliC基因在茄科青枯菌鞭毛装配中的位置及作用如图1所示)序列设计特异性引物，建立茄科青枯菌PCR反应体系，结合受茄科青枯菌侵染的植物病组织在水介质中所表现的喷雾特征进行鉴别，结果可靠，可应用到实际生产中，对植物病害进行准确有效的快速检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法，包括以下操作步骤：

(1)检测病样品的准备：用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部，从茎基部取一小块大小为1.5-2mm×2.5-3mm的维管束组织；

(2)肉眼观察病样组织在载玻片水滴中表型：吸取80～100μL的灭菌水，滴在干净的载玻片上，将步骤(1)中维管束组织放入载玻片的水滴中，并稍用力压入水滴中，静置，观察有无雾状菌浓从病样组织中喷出；如有，继续下一步试验，如无，说明该病样品不是由茄科青枯菌侵染引起的；

(3)PCR进一步检测验证：从上述水滴里的病样组织喷出的雾状菌浓作为模板，进行PCR反应；所述上游引物为5′-atgattctgcggcctacgcggcat-3′，所述下游引物为5′-agtcgggtctggcgtcgaccatcaa-3′；

(4)结果鉴别：将步骤(3)所得的反应产物在琼脂糖凝胶上电泳；在凝胶成像系统中观察，如有517bp大小的特异性条带，即确认病样品是由茄科青枯菌侵染引起的，如无该特异条带，则该病样品不是茄科青枯菌侵染引起的。

步骤(2)中所述茄科青枯菌侵染引起的病样品维管束组织在水中肉眼可见“喷雾”现象。

步骤(3)中所述PCR反应是从上述水滴里的病样组织喷出的雾状菌浓中吸取1μL作为模板，加入到PCR管中，再分别加入1单位(U)Taq酶、200μmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTP)、上游引物及下游引物各0.5μmol/L、1倍PCR反应缓冲液，用双蒸水补足至总体积为25μL，于PCR仪中进行PCR反应。

步骤(3)所述PCR反应条件为94℃预变性4min，94℃变性1min、52℃退火45s、72℃延伸50s，30个循环，最终延伸10min。

步骤(4)中反应产物是在质量体积百分比为(w/v)0.8～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，50～75V恒压电泳50～70min。

所述待检病样品为茄科青枯菌侵染引起的茄子、番茄、花生、马铃薯、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、菊花或桑树等病样组织。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)快速简便：本发明的方法鉴定周期为4小时内，而且非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强；而无论是传统的植物病原细菌鉴定方法还是BIOLOG或梅里埃的微生物鉴定系统，鉴定周期均较长，前者需要1个月以上，而后者至少也需要18个小时以上。

(2)准确：本发明根据被茄科青枯菌侵染的病组织特征性反应和茄科青枯菌特异的PCR检测方法相结合，获得的鉴定结果更准确可靠；而微生物鉴定系统所依据的是生化反应及颜色差异，有时因操作差异和检测板不同等原因，导致获得的数据中部分与标准库不一致，难以定论。

(3)低成本：本发明创造所使用的材料均较低廉，载玻片不仅价格低，而且还可反复使用；所用的PCR仪目前在国内已很普及，PCR所用的酶、底物及琼脂糖等试剂和药品均是开放式，鉴定一个样品的成本在9.5元以内；BIOLOG或梅里埃微生物鉴定系统，不仅需要专门仪器设备并由专门鉴定机构完成，而且还需要购买该公司专用鉴定耗材，目前专业鉴定机构鉴定一个样品的收费标准是800元，而传统的鉴定方法也因为要进行复杂的生理生化特性测定以及致病性测定等操作，其成本也要154元左右。

附图说明

图1为茄科青枯菌鞭毛装配的各基因简图。

其中FliC基因标识为红色。该简图来源于日本京都大学KanehisaLaboratories KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(http://www.genome.jp/kegg-bin/showpathway+rso02040)。

图2为检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的工艺流程图。

图3为实施例1的病样组织在水滴中喷雾现象图。

其中，3A为已知茄子青枯病样组织样品；3B为对照健康茄子组织样品。

图4为实施例1的PCR产物电泳检测图。

其中，1.标准分子量(100bp梯度)；2-9.不同病样组织；10.阴性对照。

图5为实施例2的病样组织在水滴中喷雾现象图。

其中，5A为2号病样品；5B为12号病样品。

图6为实施例2的PCR产物电泳检测图。

其中，1.标准分子量(100bp梯度)；2-18.不同的待检样品。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：对已知病样品的检测鉴定

一、实验材料：应用已知茄科青枯菌侵染引起的茄子和番茄病样组织以及已知健康的茄子组织为材料。

二、实验方法：

(1)用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部，从待检病样品的茎基部取大小约为1.5～2mm×2.5～3mm的维管束组织，8份待检样品中包括4份茄子病样品和4份番茄病样品，另取一份健康茄子样品作对照；

(2)用无菌的移液器吸取100μL的灭菌水，滴在干净的载玻片上，用灭菌的镊子将病组织放入干净的载玻片上100μL大小的灭菌水滴中，注意稍用力将病组织压入水滴中，静置5分钟左右；观察有无雾状菌浓从病样组织中喷出，如有继续下一步试验；如无，说明该病样品不是由茄科青枯菌侵染引起的；

(3)从病样组织喷出的雾状菌浓中取1μL液体于PCR管中，配制聚合酶链式反应(PCR)混合物，包括1单位Taq酶、4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)200μmol/L、上游引物和下游引物各0.5μmol/L、2.5μL 10倍反应缓冲液及双蒸水至25μL；将PCR管放入PCR仪中，于PCR仪中进行PCR反应。设置反应参数：94℃预变性4min，94℃变性1min、52℃退火45s、72℃延伸50s，30个循环，最终延伸10min；

(4)取反应产物在质量体积百分比为(w/v)1％琼脂糖凝胶上电泳，70V恒压电泳60min；在凝胶成像系统中观察，并拍照；根据电泳结果做出判定。

检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的工艺流程图见图2。

三、实验结果与分析：

如图3及图4所示，应用本发明的方法，茄科青枯菌引起的茄子和番茄病样茎基部维管束组织在载玻片水滴中均出现喷雾现象(图3仅显示其中一个茄子病样品的喷雾，其它病样品与其相同)，而且以雾状液为模板可成功扩增到预期大小为517bp的特异目的片段(见图4)，而作为对照的健康茄子样品并未出现以上喷雾现象及特异扩增条带，说明该检测方法是准确可靠的。

实施例2：对未知病样品的检测鉴定试验

一、实验材料：对采自多个地区田间的10种不同植物青枯病样品或无症状健康样品进行检测。

二、实验方法：

对来自广东多个地区采集到的10种不同植物样品进行取样，共取得17个样品并进行编号，各号样品所对应的植物种类、采集地点以及症状表现等信息如表1所示。检测鉴定所采用的方法同实施例1所用方法相同，并用传统的植物病原细菌分离鉴定方法加以比较验证。

传统的植物病原细菌分离鉴定方法具体步骤包括：①用75％酒精对待检病样组织表面消毒；②用灭菌的解剖刀切取病样维管束组织并进行稀释分离；③在含TTC琼脂平板上划线及28～30℃条件下培养48～36小时；④纯化单菌落获得菌株；⑤菌落与菌体形态特征观察；⑥菌株生理生化特性测定，即测定对乳糖、麦芽糖、D(+)-纤维二糖、葡萄糖和蔗糖、甘露醇、山梨醇、卫茅醇等碳水化合物的利用和分解；⑦菌株16S rDNA基因克隆与序列分析；⑧在温室中(25～35℃)进行人工接种试验，测定分离菌株对原寄主植物的致病性；⑨接种植株症状观察；⑩从显症病株中再分离到与接种菌株相同的病原菌。

三、实验步骤：

(1)用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部，从待检样品的茎基部取大小约为1.5～2mm×2.5～3mm的维管束组织，从不同的待检样品(茄子、番茄、马铃薯、花生、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、菊花、桑树)中共取17份样品组织；

(2)用无菌的移液器吸取约100μL的灭菌水，滴在干净的载玻片上，用灭菌的镊子将组织放入干净的载玻片约100μL灭菌水滴中，注意稍用力将病样组织压入水滴中，静置5分钟左右；观察有无雾状菌浓从病组织中喷出，如有继续下一步试验；如无，说明该病样品不是由茄科青枯菌侵染引起；

(3)从雾状菌浓中取1μL液体于PCR管中，配制聚合酶链式反应(PCR)混合物，包括1单位Taq酶、4种脱氧核糖核苷酸dNTP 200μmol/L、上游引物和下游引物各0.5μmol/L、2.5μL 10倍反应缓冲液及双蒸水至25μL；将PCR管放入PCR仪中，于PCR仪中进行PCR反应。设置反应参数：94℃预变性4min，94℃变性1min、52℃退火45s、72℃延伸50s，30个循环，最终延伸10min；

(4)取反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，70V电泳60分钟；在凝胶成像系统中观察，并拍照；根据电泳结果做出判定。

四、实验结果与分析：

如图5、图6及表1结果显示：待检的17个样品中2、3、4、5、7、9、10、12、13、14、16、17和18号样品均为阳性，即病样中含有茄科青枯菌，是由茄科青枯菌侵染引起的，与其症状表现相符合；6、8、11和15号样品为阴性，即样品中不含茄科青枯菌，不是由茄科青枯菌侵染引起不正常或是健康植株，与其表征也相一致，而且本发明方法检测结果与传统植物病原细菌分离鉴定的结果完全一致，从而进一步验证了该检测鉴定方法的可靠性。

表1应用本发明方法及传统方法检测鉴定不同来源待检样品的结果比较

  样品编号  寄主植物  症状表现  采集地  本发明方法  传统方法  2  茄子  萎蔫  东莞  +  +  3  茄子  萎蔫枯死  连州  +  +  4  番茄  萎蔫  佛山  +  +  5  番茄  轻微萎蔫  广州  +  +  6^*  番茄  健康无病症  广州  -  -  7  马铃薯  萎蔫  惠州  +  +  8^*  马铃薯  健康无病症  惠州  -  -  9  花生  萎蔫  广州  +  +  10  辣椒  萎蔫  高要  +  +  11*  辣椒  健康无病症  广州  -  -

  12  烟草  黄化、萎蔫  南雄  +  +  13  烟草  1-2片叶黄化  南雄  +  +  14  空心菜  萎蔫  广州  +  +  15*  沙姜  健康无病症  阳春  -  -  16  沙姜  萎蔫枯死  阳春  +  +  17  菊花  萎蔫  广州  +  +  18  桑树  萎蔫枯死  阳春  +  +

注：+表示为阳性，-表示为阴性

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>广东省农业科学院植物保护研究所

<120>一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病方法

<130>66

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>上游引物

<400>1

atgattctgc ggcctacgcg gcat                            24

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>下游引物

<400>2

agtcgggtct ggcgtcgacc atcaa                           25