用于作为具有完整细胞壁的悬浮单细胞的植物细胞系的诱导和维持的体外方法及其转化

摘要

本发明提供了将悬浮细胞聚集体破碎成具有完整初生细胞壁的单细胞的简单且一致的方法。本发明部分地涉及含有果胶降解酶或微管蛋白解聚化合物(包括秋水仙素)的培养基中所培养的悬浮细胞聚集体的细胞分离。本发明还涉及化合物用于此类目的的新用途。本发明的另一方面涉及目的物(即分离的细胞)的转化。此类过程将基于单细胞的转化和选择过程简化并整合入转基因和转质体事件产生的工作过程。本发明还消除了技术约束，并以高通量方式产生无标志物的且均一表达的转基因系，以支持动物保健、生物制药、及性状和作物保护平台的各种需要。

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2006年12月29日提交的临时申请流水号60/878,028的权益。

发明领域

本发明部分地属于植物细胞系增殖的领域，包括增殖作为单细胞的、在悬浮液中的植物细胞的方法。

发明背景

在过去的20年里，快速出现了与用于有用次级代谢产物生产的大规模植物细胞培养过程的开发中的重大改善相联系的植物遗传工程技术。自1995年起(Moffat，1995；Ma等，2003)，此类植物细胞悬浮培养物日益作为有价值的宿主细胞系统用于重组蛋白表达。

生长素诱导的胼胝体(callus)组织或悬浮液(尽管它们有单一的组织起源)通常含有具有多种表型的细胞。如此，自此类细胞类型开发的转基因系通常是高度异质的，具有不一致的表达水平。因此，已经自单一原生质体获得了产生许多有用次级代谢产物的克隆，即自紫草(Lithospermumerythrorhizon)原生质体制备的高紫草宁生成细胞克隆(Maeda等，1983)。

迄今为止，必须形成原生质体以解开细胞，这不仅为了细胞选择，而且也为了培养的植物细胞的电穿孔/PEG介导的转化。从植物组织分离单细胞克隆需要制备原生质体。然而，原生质体通常难以再生其正常的壁，因为分离的原生质体通常是停滞的，而且难以分裂(Hahne和Hoffmann，1984)。在许多对培养的原生质体的研究中，产生的第一和主要的多糖是胼胝质(callose)，其由1-、3-、8-吡喃葡萄糖构成(Klein等，1981)。

受伤的或受亚的植物通常将大量的这种葡聚糖分泌入壁膜间隙中(Currier，1957)。在壁再生的早期期间，纤维素和木葡聚糖之间的结合不如它在完整植株中时强烈(Hayashi等，1986)。因为木葡聚糖和纤维素在初生细胞壁中的大分子组织表现出负责强度和延伸性(Hayashi和Maclachlan，1984)，原生质体周围的木葡聚糖以及纤维素沉积表现出对于它们的分裂和生长潜力是至关重要的。这种先决条件使原生质体的分裂延迟，如此增加再生成具有亲本系的细胞特征的正常细胞的时间。

因此，植物细胞培养领域中正在进行的技术挑战是分离能从培养中的植物组织克隆的活的单细胞(Bourgin，1983；Tabata等，1976)。在悬浮培养中，总是形成非均一的细胞聚集体，而且每个此类聚集体含有近百个细胞。关于这些聚集的细胞之间的接合一无所知，而且尚未有报告鉴定出能解散细胞聚集体并将它们作为具有完整细胞壁的单细胞在体外维持的单酶。

在数份报告中提示了果胶在细胞粘附特性中的作用，但是这样的联系相对更近一些才确立的(Bouton等，2002)。另外，报告了细胞粘附特性的强烈下降(Sterling等，2006)。

qua1-1突变体显示了脱离的单根细胞(Bouton等，2002)。通过使用针对特定果胶表位而制备的抗体进行的免疫荧光实验，进一步确证了果胶含量的降低。这些观察结果提示所编码的酶可能牵涉果胶多糖的合成，并清楚地指明果胶牵涉植物细胞的粘附特性。

如此，破坏果胶合成以消除细胞粘附特性能促进细胞分离。已经有报告，用一次果胶降解酶处理进行的单细胞分离(Naill，2005)帮助紫杉(Taxus)细胞悬浮培养物中单细胞的分离。使用此类紫杉单细胞来筛选具有更高紫杉醇(Taxol)生成水平的良种(elite)克隆系。然而，此方法在培养基中连续存在酶的情况中在悬浮单细胞维持中是没用的。还有，用酶或酶组合的此类短脉冲处理的最高单细胞产率仅是17.1％-34.4％(Naill，2005)。稻悬浮液中的连续果胶酶处理仅导致了0.005％浓度的细微悬浮聚集体，但是对作为单细胞的悬浮液的维持没有帮助(Lee等，2004)。酶组合(即果胶酶和纤维素酶)超过8小时的延长处理导致了细胞溶解(Naill，2005)。

已经有报告，大豆细胞悬浮培养物中细胞分离的增强在存在秋水仙素的情况中得到增强(Umetsu等，1975)。为了分离细胞，以比用于产生染色体多倍性的浓度(5-20mM)低的浓度(0.1-1.0mM)将生物碱添加至培养基。不过，秋水仙素抑制植物和动物细胞中的有丝分裂(Lewin，1980)。秋水仙素结合微管蛋白，并阻止微管的装配。因此，为了获得细胞分离，秋水仙素浓度和处理时间应当尽可能的低。

秋水仙素生物碱已经被用于使培养的动物细胞中的生长同步化，其中通常以0.5mM添加生物碱，并且应当在有丝分裂之前的几小时内使细胞停滞。虽然形态发生效应与动物细胞中的相当类似，但是植物细胞能在存在0.1mM秋水仙素的情况中的生长过程中分裂(Umetsu等，1975)。大豆悬浮细胞在1mM秋水仙素中培养4天后，细胞生存力下降。另外，仅44.8％的细胞在这些处理中是能生存的，但是将它们保持分裂是有可能的，这不像在动物细胞中那样。

已经调查了微管蛋白解聚抑制剂或寡糖素在植物体外培养物中维持单细胞悬浮液中的用途。早在1975年，文献便有一些关于使用秋水仙素来进行细胞分离的信息；参见下文参考文献部分。还已经调查了作为除草剂的微管蛋白抑制剂。

良种转基因事件产生和发现严重依赖于使能技术(enabling technology)的开发。适于转化悬浮细胞聚集体的当前方法是土壤杆菌(Agrobacterium)和晶须介导的方法。土壤杆菌法显示了高达67-90％的主链整合率，使其成为非常低效的过程，而WHISKERS^TM介导的转化不会充当高通量过程(HTP)。表明PEG介导的方法总是与原生质体一起使用，并且烟草的原生质体虽然易于转化，但是由于细胞壁再生问题，其不易于进行HTP转化过程。

关于供基于单细胞悬浮培养的转化用的方案，本领域似乎是没有记载的。有数份关于基于原生质体的方案的报告，但是它们是缺乏细胞壁的，不像下文所讨论的植物细胞的单细胞悬浮液那样。

发明概述

本发明提供了将悬浮细胞聚集体破碎成具有完整初生细胞壁的单细胞的简单且一致的方法。以下的公开内容讨论含有果胶降解酶或微管蛋白解聚化合物(包括秋水仙素)的培养基中所培养的悬浮细胞聚集体的细胞分离。

本发明还涉及化合物用于此类目的的新用途。

本发明的一方面涉及目的物(即分离的细胞)的转化。此类过程将基于单细胞的转化和选择过程简化并整合入转基因和转质体(transplastomic)事件产生的工作过程。本发明还消除了技术约束，并以高通量方式产生无标志物的且均一表达的转基因系，用以支持动物保健、生物制药(biopharma)、及性状和作物保护平台的各种需要。

附图简述

图1：在培养基中传代培养7天，在连续果胶裂合酶(Pectolyase)处理中具有完整细胞壁的JTNT1悬浮细胞的单细胞分离。

A：正常的BY2悬浮液；B：与A相同，但经I2KI染色的细胞，以显示细胞的聚集；C和D：连续酶处理6天后所分离的细胞；E和F：在有和没有I2KI染色的情况中所分离的单细胞。注意正常细胞分裂(F)。

图2：连续果胶裂合酶处理(用FDA和PI来处理细胞)后6天的BY2细胞生存力及单细胞产率。

A：BY2细胞聚集体；B：1ml接种物中的BY2在果胶裂合酶中在培养基中达5天；C：6ml接种物与酶一起在培养基中5天；D、E和F：C的显微镜视野快相；G：BAP和12％蔗糖中形成的具有BY2细胞变体的对照团块；H和I：来自G的、来自5天连续酶处理的单细胞。FDA和PI中染色的细胞。注意经PI染红的死亡细胞。

图3：在来自BY2和Xanthi烟草悬浮液的细胞聚集体悬浮液的培养基中，自7天秋水仙素处理诱导单细胞悬浮液。

A：正常的BY2悬浮聚集体(经Calcafluor染色的)；B：在1mM秋水仙素中达7天的单细胞BY2悬浮液；C：与B相同，但扩大的，以显示具有完整壁的单细胞；D：Xanthi的悬浮聚集体；E：在0.5mM秋水仙素中处理7天的Xanthi悬浮聚集体。注意0.5mM中单细胞的部分释放；和F：1mM秋水仙素中所分离的Xanthi单细胞。

图4：在秋水仙素处理中自BY2和Xanthi烟草悬浮聚集体释放具有完整细胞壁的单细胞。

A：正常的BY2悬浮聚集体；B：在1mM秋水仙素中达7天的单细胞BY2悬浮液；C和D：除去秋水仙素后细胞恢复成聚集体(以1个秋水仙素处理培养周期进行传代培养后4天)；E：Xanthi的悬浮聚集体；F：在1mM秋水仙素中处理7天的Xanthi悬浮聚集体。注意BY2和Xanthi培养物中所释放的单细胞和完整细胞壁的存在，如在存在荧光增白剂Calcafluor的情况中所看到的。(用0.1％Calcafluor处理所有样品，并在Leica荧光显微镜下检查)。

图5：在秋水仙素处理中自BY2变体烟草(在EP 12％蔗糖培养基中适应的)和曼陀罗悬浮聚集体释放具有完整细胞壁的活的单细胞。

A：正常的BY2-V悬浮聚集体；B：未处理聚集体的更近视图；C、D和E：单细胞BY2悬浮液在1mM秋水仙素中诱导7天(10X、20X和40X放大率下的细胞)；F：在1mM秋水仙素处理中达7天，曼陀罗悬浮液中的单细胞诱导。用FDA和PI处理所有样品，并在Leica荧光显微镜下检查。注意这里在FDA染色剂中看到的细胞的高生存力且在PI中具有非常少的染红细胞。

图6：DAS-PMTI-1(Dow AgroSciences(DAS)专卖的甲基吲哚衍生物和有力的微管抑制剂除草剂)对NT1烟草细胞生长的影响。在不存在或存在25nM或50nM的DAS-PMTI-1的情况中在含有3％甘油作为唯一碳源的NT1B培养基中培养细胞。所有鲜重值表示来自重复样品的均值±0.18。

图7：来自DAS GAD1762-034悬浮系的单细胞和集落生成。

图8A、8B和8C：来自DAS GAD1762-034单细胞的集落的2-6周生长。

图9：在7天和13天收集样品达超过4轮传代培养周期，并实施表达分析。将所获得的表达数据绘图。

图10：使用DAS-PMTI-1来分离的BY2细胞的单细胞。使用20-50nM浓度来在传代培养5天后产生单细胞。注意细胞是单细胞(一对具有交叠的边缘)，并在附接有共焦成像系统的微差干涉相差显微镜(Differential InterferenceContrast Scope)下拍摄照片。

图11：PEG处理72小时后的YFP表达(Ubi10-YFP质粒)。焦平面中小的子(分裂)细胞之一显示GFP表达，指明表达可以是稳定的。

图12：左，由100mg/L卡那霉素抑制的未处理对照组织；右，选择培养基上生长的单细胞衍生的推定转质体分离群。

图13：自胡萝卜单细胞悬浮液产生克隆系。用未处理的悬浮聚集体铺板的M培养基上的胞苔生长(lawn growth)(小图A)。用单细胞铺板的培养基上的离散集落生长(小图B)。

图14：液体培养基中的0.5-1mM秋水仙素处理和启动传代培养后第14天(第2轮传代培养周期结束时)所分析的培养物。A：自簇释放单细胞；B：用FDA活体染色剂染色的紧密挤压的细胞聚集体；C和D：过滤悬浮液(使用具有100um孔径的滤器)后，经FDA染色的分别在1mM和0.5mM处理中释放的单细胞；E和F：来自D的单细胞的更近视图。

图15：JTNT1单细胞响应MTI的生长曲线。

发明详述

分离和培养单细胞的能力具有许多可能的应用。例如，本文所述方法可用于改善与用于动物保健应用的植物细胞培养物的生产力有关的过程。

如此，本发明的方法对于增强基于植物细胞的动物保健和生物制药产物的过程功效是有用的。本发明的实施方案能有助于筛选转基因细胞系良种克隆，诸如在迷你悬浮细胞培养启动中，使批次间变化(batch to batch variation)最小化，用以为基于单细胞的转化系统开发标准操作方案(SOP)，以使聚集体中的非转基因细胞最小化或将其消除。总之，本发明的各方面在动物保健HTP(高通量过程)筛选和宿主细胞系改善程序中是有用的。

本发明还例示并容许基于单细胞的测定法和细胞分选过程的进一步开发，以根据与细胞猝灭荧光探针有联系的RNA表达来鉴定稳定表达的细胞。

此类单细胞在定点同源重组瞬时筛选中也是有用的，代替当前基于原生质体的瞬时系统。例如，黑墨西哥甜(Black Mexican Sweet，BMS)玉米悬浮液和芸苔(canola)悬浮液可为此类应用提供单一系统。如此，例如，靶向同源重组可在本发明的实施方案中使用。这种类型的技术是例如WO 03/080809 A2和相应公布的美国申请(USPA 20030232410)的主题，所述申请涉及锌指用于靶向重组的用途。重组酶(例如cre-lox和flp-frt)的用途在本领域中也是已知的。

可使用体外植物表达系统来生成有用的药用和动物保健重组蛋白。此类植物表达系统的关键优势在于它们本质上是真核的——拥有与哺乳动物细胞的内膜系统和分泌途径类似的内膜系统和分泌途径。因此，复杂蛋白质一般有效地折叠并进行装配，具有合适的翻译后修饰。

植物生产系统的另一个益处是放大(scale-up)的潜力。筛选良种表达克隆和放大(bulk up)此类同质表达细胞系之后，实质上无限量的重组蛋白可以或是在所包含的绿色组织中培养或是使用发酵或生物反应器系统在工业设备中放大。

本文中例示了用于产生单细胞的两种策略。两者都成功地起作用来分离活的单细胞。然而，在至少在两种悬浮细胞类型中获得大体积的具有完整细胞壁的单细胞悬浮液方面，秋水仙素方法相对于酶降解方法是更优选的。酶方法不仅显示对细胞生长的抑制，而且显示更高程度的死亡率。还有，在不除去或漂洗所使用的培养基的情况中将活细胞铺板于凝胶培养基上时，细胞死亡，而且没有观察到集落生长。推荐的是，可使用经由酶降解方法所产生的此类单细胞悬浮液的应用，但是会需要进一步的优化。

相反地，此研究中所测试的微管蛋白抑制剂(如秋水仙素)的添加表现出对于分离植物细胞和选择单细胞是非常有用的。此方法是简单的，因为其仅牵涉在传代培养阶段期间将合适体积的秋水仙素添加至液体培养基。这会是枢要的工具，其对于过程(诸如用作为起始细胞的高度存活细胞的均一接种物来启动迷你悬浮培养)中的给定悬浮液会具有重大意义。该技术能提高电穿孔、Whiskers^TM、和土壤杆菌介导的转化的效率。还可使用此类单细胞制备物来从转基因悬浮聚集体中分离重组蛋白生成系的良种克隆。

虽然原生质体方法已经用于单细胞分离，该主题秋水仙素方法是更容易和更有力的。因为存在壁，通过秋水仙素方法所获得的单细胞比原生质体更稳定，而且不需要细胞壁的再生。细胞具有壁，该壁具有正常的木葡聚糖/纤维素网络组成(Hayashi和Maclachlan，1984)。它们在细胞扩展和分离过程中不产生胼胝质，如在如下观察中所看到的，其中在存在秋水仙素的情况中伸长的松幼苗细胞没有异常的壁增厚，但是放射状扩大(Itoh，1976)。在无秋水仙素的培养基中传代培养后，细胞的生长是正常的，而大多数原生质体是停滞的，并且难以分裂(4)。秋水仙素培养的细胞可具有一定程度的多倍性，然而，此研究中所使用的秋水仙素浓度(0.1-1.0mM)比诱导多倍性所需要的浓度(5-20mM)低10-100倍。用秋水仙素方法回收单细胞比用原生质体回收单细胞好得多(Hyashi和Yoshida，1988)。可使用流式细胞术来进一步测试主题细胞以评估多倍性水平和基因组稳定性。另外，倍性水平提高可经由转化细胞的拷贝数目增加而提供重组蛋白水平增强的额外益处。

聚半乳糖醛酸(galacturonan)活性在大豆悬浮细胞中显示了分离细胞的生物学功能，并且报道为寡糖素，因为其对细胞分离显示了生物学功能(Albersheim和Darvill，1985)。因此，半乳糖醛酸也在这些悬浮细胞中进行测试以实现细胞分离而没有任何倍性变化，以防存在有这里报道的单细胞悬浮液中观察到的任何秋水仙素诱导的倍性变化。因此，正在进一步评估聚半乳糖醛酸和其它类似寡糖素的直接应用以比较在通过破坏细胞粘附特性来分离细胞中的功效。如此，本发明提供了经过数轮悬浮细胞传代周期而细胞同时维持基因组稳定性的可再现且一致的简单方法。

本文中所例示的一种优选的化合物是DAS-PMTI-1。此化合物表现为非常有效力的(在影响培养物生长方面是秋水仙素的约100-1000倍)。处理7天后，在0.5mM浓度中有相当多的细胞死亡，但是在这些培养物在没有DAS-PMTI-1的情况中进行传代培养时，在2周后PH悬浮细胞以低频率作为单细胞回收。根据对单细胞分离的优选应用(诸如细胞类型等)，可实施进一步优化以确定此化合物的优选浓度。具有类似功能的其它MTI抑制剂可通过破坏果胶合成而在主题细胞分离中使用。根据本公开内容，可测试别的MTI抑制剂及其类似物，并筛选其在产生和维持单细胞中的功效。

DAS-PMTI-1(也称为4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯)的化学结构如下：

供依照本发明使用的化合物的优选类属是DAS-PMTI-1型化合物。此类化合物可符合上文所提供的通用结构，而且包括其功能性(供依照本发明使用)衍生物和类似物。

下面是供依照本发明使用的一些已知微管蛋白抑制剂的类属化学式。虽然DAS-PMTI-1是一个优选的实施方案，但是实际上任何微管蛋白抑制剂均可依照本发明使用。在一些优选的实施方案中，与秋水仙素组合地使用如下二芳基吡唑类属的一个或多个成员：

其中

X＝CO₂R、CH₂CO₂R、CH₂CH₂CO₂R、(CH₂)₃CO₂R、OCH₂CO₂R、OCH(CH₃)CO₂R、OC(CH₃)₂CO₂R、CH₂OCH₂CO₂R、CH₂CH(CO₂CH₂CH₃)CO₂R、或OCH(CO₂CH₂CH₃)CO₂R，

Y＝CN、Cl、Br、F、或NO₂，

Ar₁＝未取代的苯基、未取代的吡啶、1-3取代的苯基、1-3取代的吡啶、或用卤素或CN取代，

Ar₂＝未取代的苯基、未取代的吡啶、1-3取代的苯基、1-3取代的吡啶或用卤素或CN取代，且

R＝H或1-5个碳的直链或支链酯。

如此，已经使用微管抑制剂来产生单细胞植物悬浮培养物，并且它们可在培养中维持至少2轮传代培养周期。这些单细胞悬浮液的独特之处在于它们具有完整的细胞壁，但是它们仍彼此分离地存在。

“转基因的”植物、植物细胞等是(除非另有说明)自如下经转化植物细胞(或原生质体等)衍生的整个植株、植物细胞、植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、单子叶植物细胞培养物、双子叶植物细胞培养物或其后代，所述经转化的植物细胞(或原生质体等)含有由实验室技术导入的、最初不存在于相同物种的天然非转基因植物细胞中的外来DNA。术语“转基因植物”和“经转化的植物”在本领域中有时已经作为同义术语使用，定义其DNA包含外源DNA分子的植物。转基因植物可被稳定地转化以含有在植物的基因组DNA内发挥功能并整合入植物基因组DNA中的外来DNA，或者是已经被基于病毒的载体转化并瞬时表达外来DNA的转基因植物。

“分离的”和“纯化的”暗示“人为的”(“hand of man”)，并可应用于多核苷酸和蛋白质。例如，克隆的多核苷酸是分离的多核苷酸。

转化方法。已经使用用于核转化的土壤杆菌和聚乙二醇(PEG)和用于质体转化的生物射弹轰击来对这些单细胞测试核转化和质体转化。在核转化尝试中，已经证明了质粒DNA的投递和黄色荧光蛋白瞬时表达。已经在质体转化中回收细胞，并经由PCR分析显示了稳定转化。放大(bulk)转质体胼胝体分离群，并正在经由ELISA分析选择标志nptII基因表达。

本文所述转化方法可应用于动物保健过程。然而，在用于重组蛋白生产的细胞类型的宿主之外，经由新的投递方法(包括纳米微粒投递)的基于单细胞的转化还可为转化作物植物提供独特的办法。

经由PEG和/或电穿孔方法的主题单细胞转化的开发使具有完整壁的单细胞像细菌/哺乳动物细胞系统一样顺从(amenable)，并且在用于那些细胞类型的高通量转化系统中也是有用的。

转化单细胞的能力具有许多可能的应用。例如，本文所述方法可用于改善与用于动物保健应用的植物细胞培养物的生产力有关的过程。再则，主题过程对于增强基于植物细胞的动物保健和生物制药产物的过程功效是有用的。主题方法还可帮助筛选转基因细胞系的良种克隆。此类应用可用于迷你悬浮细胞培养启动，使批次间表达变化最小化，并用以开发SOP，以使聚集体中的非转基因细胞或多种事件的存在最小化或将其消除。

如发明背景部分中所讨论的，土壤杆菌法是非常低效的，而WHISKERS^TM介导的转化不会充当高通量过程。PEG介导的方法与原生质体一起使用。虽然烟草原生质体易于转化，但是由于细胞壁再生问题，它们不易于进行HTP转化过程。

相比之下，本发明提供了完整的细胞壁。PEG介导的过程是具有完整细胞壁的单细胞的第一份报告。本方法还是高度有效的。还有，通过使用片段纯化的质粒来进行转染，此过程消除了主链整合。经由诸如荧光激活细胞分拣(FACS)等过程的、牵涉植物单细胞的快速转化方案对于过程的小型化和自动化会是理想的，以便以降低的费用、资源和预定时间限度(timeline)来筛选合适的事件。这可如下彻底改善当前的胼胝体或悬浮聚集体选择过程，即经由细胞分选仪来筛选经转化的细胞，并经由工业研究或生产流水线为进一步的推进确定同质表达的良种事件。

如此，例如，主题过程为新的生物加工研究和开发，为HTP筛选动物保健需要和宿主细胞系改善提供了基本的基础。

本发明容许进一步开发基于单细胞的测定法和细胞分选过程，用以根据与细胞猝灭荧光探针有联系的RNA表达来鉴定稳定表达的细胞。

此类单细胞在对感兴趣基因(GOI)瞬时和/或稳定筛选性状和作物保护平台中也是有用的。

除非明确指明或暗示，术语“一个”、“一种”和“所述”在用于本文时表示“至少一个”、“至少一种”。

通过提及而完整收录本文中所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物，其程度为它们不与本说明书的明确教导相矛盾。

实施例

实施例1——材料和方法

BY2悬浮培养的细胞自日本烟草获得，并以7天周期在LSBY2培养基中维持。曼陀罗悬浮液和Pettite哈瓦那烟草悬浮液自在DAS启动的胼胝体启动，而Xanthi悬浮液作为来自UIUC(IL)的Jack Widholm教授的样品获得。JT-NT1悬浮细胞(自华盛顿大学获得，以7天周期在NT1B培养基中维持)仅用于果胶降解酶研究以将细胞分离成单细胞。将细胞在摇瓶中在黑暗中于25-28℃在定轨摇床上以150rpm培养。秋水仙素自Fluka获得，DAS-PMTI-1(Martin等，2001；Smith等，2001)自DAS CRS获得，而果胶降解酶(果胶裂合酶Y和果胶酶)来自Sigma。在此调查中所使用的两种微管蛋白聚合抑制剂的储存浓缩液溶解于DMSO中以制备0.5M储液。果胶酶和果胶裂合酶的测试浓度在0.0005％-0.005％范围中。例如，烟草悬浮细胞系NT-1和BY-2适于实施本发明。例如，BY-2细胞是商品化的，并可依照Nagata等获得(Nagata，T.，Nemoto，Y.，和Hasezawa，S.[1992]，烟草BY-2细胞系作为高等植物的细胞生物学中的“HeLa”细胞。Int.Rev.Cytol.132：1-30)。NT-1细胞最初自烟草栽培变种嫩黄2(Nicotiana tabacum L.cv.bright yellow 2)开发。NT-1细胞系被广泛使用，并易于获得；虽然，任何烟草悬浮细胞系符合本发明的实施。值得注意的是，NT-1细胞系的起源是不清楚的。此外，该细胞系表现出可变异，并倾向于随培养条件而变化。适于在下文实施例中使用的NT-1细胞可以以编号ATCC No.74840自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。还可参见美国专利No.6,140,075。

实施例2——显微观察

通过光学显微镜检术(以Nomarski和暗视野光学)来观察细胞扩展和分离。通过使用血细胞计数器来对球状细胞和单细胞计数以分别测定细胞扩展和分离的程度。通过用5％(wt/vol)三氧化铬处理16小时并对细胞计数来测定聚集体中的细胞数目(Henshaw等，1966)。使用荧光显微镜(ZeissPhotomicroscope)通过用荧光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙锭(PI)对细胞染色(Yokoyama等，1997)来测定细胞生存力。为了测定此单细胞培养物中细胞壁的存在，使用荧光增白剂。在此研究中使用自Sigma获得的Calcafluor(其是对纤维素特异性的荧光染料)，并通过荧光显微镜检术(Zeiss Photomicroscope)来观察纤维素-Calcafluor络合。将Calcafluor(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)制备成PBS缓冲液中的0.1％(wt/vol)溶液，并在黑暗中于室温贮存(Kwok等，2003)。使用前，将Calcafluor染色剂以15,000g离心2分钟以除去沉淀物。将1滴或2滴Calcafluor溶液添加至分离的细胞。于室温2或3分钟后，用水漂洗细胞悬浮液，并用TBS(pH 7.2)中0.1％Evan氏蓝(Sigma；E-2129)于室温复染色1分钟，并在紫外显微镜下以395-415nm波长(455nm的观察光)观察。细胞壁表现为浅蓝色-白色或蓝绿色的椭圆形晕。

实施例3——培养基中连续果胶酶和果胶裂合酶处理的结果

使用Petite哈瓦那、BY2和NT1烟草悬浮液来调查不同浓度的果胶降解酶(即果胶酶和果胶裂合酶)的效果。JT-NT1悬浮液确实更好地响应果胶酶处理，而BY2悬浮液比其它酶对应物更好地响应果胶裂合酶处理。然而，存在有细胞死亡率，如通过各细胞类型的活体染色剂和抑制性生长所显现的。增加传代培养阶段的细胞接种物体积，多至12倍，以具有合理的单细胞产率。可以将PH和BY2细胞在含果胶裂合酶的培养中培养至少7天。这些细胞在低浓度果胶裂合酶(3个活性单位)中的连续培养表现为有害的。培养第6天的细胞在接种物体积是6ml(处于稳定期的起始接种物体积)并与酶一起在50ml新鲜培养基中培养时产生高的单细胞。这些细胞在培养6天后用FDA和PI测试时显示了更高程度的活单细胞(图1和2)。悬浮培养物的生长在酶处理中受到彻底地影响，并且将细胞在含有相同酶的培养基中传代培养表现为有害的。推荐的是，可以将细胞在培养中新鲜处理长至最大限度7天的持续时间，然后应当将这些细胞转移至不含酶的培养基以恢复生长。此方法充其量可用于筛选异质聚集体中的良种转基因克隆或用以用一致的细胞体积开始高通量悬浮培养。

图1：在培养基中传代培养7天，在连续果胶裂合酶处理中具有完整细胞壁的JTNT1悬浮细胞的单细胞分离。

A：正常的BY2悬浮液；B：与A相同，但经I2KI染色的细胞，以显示细胞的聚集；C和D：连续酶处理6天后所分离的细胞；E和F：在有和没有I2KI染色的情况中所分离的单细胞。注意正常细胞分裂(F)。

图2：连续果胶裂合酶处理(用FDA和PI来处理细胞)后6天的BY2细胞生存力及单细胞产率。

A：BY2细胞聚集体；B：1ml接种物中的BY2在果胶裂合酶中在培养基中达5天；C：6ml接种物与酶一起在培养基中5天；D、E和F：C的显微镜视野快相；G：BAP和12％蔗糖中形成的具有BY2细胞变体的对照团块；H和I：来自G的、来自5天连续酶处理的单细胞。FDA和PI中染色的细胞。注意经PI染红的死亡细胞。

实施例4——秋水仙素对BY2、NT1、Petite哈瓦那(PH)和Xanthi(Xan)及曼陀罗(JM)悬浮细胞生长的影响

培养7天后，在0.5mM和1mM秋水仙素浓度，BY2、Xan、和JM细胞的细胞数目有响应(图3、4、和5)。然而，在1mM BY2悬浮细胞和JM细胞中看到高程度的悬浮单细胞。有意义的是，注意到JM细胞生长即使在0.5mM秋水仙素中也受到彻底地影响，并且生长即使在相同培养基中再生长一周后也不能恢复。这指明JM细胞中细胞分裂受到秋水仙素抑制，并且需要进一步测试更低的浓度以优化细胞分离而不降低培养物密度或生长。有趣的是，BY2悬浮细胞没有观察到这样的生长抑制，BY2悬浮细胞能在存在1mM秋水仙素的情况中连续培养至少14天。在第3天首次观察到细胞膨胀，并且随着培养在BY2悬浮细胞中继续，细胞形成球形。因为球状细胞逐渐从聚集体中释放，推测细胞分离伴有细胞扩展。7天后在含有1mM秋水仙素的培养基中有与对照培养物中大约相等数量的BY2细胞。在将1mM秋水仙素中培养7天的细胞传代培养至无秋水仙素的培养基时，以聚集体生长的能力没有完全恢复，代替地，看到约90％的悬浮细胞为完整单细胞。细胞扩展和分离也部分地在含有0.5mM秋水仙素的培养基中所测试的所有其它细胞悬浮液的细胞悬浮聚集体中发生。存在有JT-NT1和JM悬浮细胞中观察到的抑制性细胞生长应答。NT1悬浮细胞在1mM秋水仙素中记录到几乎50％的生长下降。

在这些细胞中观察到大的分离细胞，这与qua1-1果胶突变体中报道的分离的表皮根细胞中的那些类似(Bouton，2002)。用DAS-PMTI-1测试的所有细胞悬浮类型中观察到具有一般球形的细胞的类似部分分离。然而，在经0.5mM浓度DAS-PMTI-1处理的悬浮液中细胞生长受到非常显著地影响。可实施进一步的实验以优化用此化合物进行细胞分离的条件，及以使细胞抑制性生长最小化。如FDA和PI染色测试所证明的，所测试的BY2和JM细胞悬浮液中有高程度的细胞生存力。细胞是高度圆形的，并且在许多细胞中显示喙样的凸出物，指明活性细胞的细胞壁延伸，这可能在细胞分裂之前。分离的细胞是大的、扩展的，并具有原生质体典型的球形。使用Calcafluor染色剂来测定完整细胞壁的存在或缺失。图4.显示了环绕这些球形细胞的细胞壁的清晰存在。在显微镜的暗场聚光器下对这些细胞的观察显示了环绕细胞的厚细胞壁(图3：小图C)。这些单细胞在振荡培养物中是能复原的，因为没有由于果胶的缺乏和大细胞的存在而死亡的细胞，如在活体染色测试中所看到的(图5)。看到非常高百分比的活的健康细胞，如在此小图中所看到的。因此，有可能在振荡培养物中或微孔板中使用这些细胞作为具有精确细胞数目的接种物。

图3：在来自BY2和Xanthi烟草悬浮液的细胞聚集体悬浮液的培养基中，自7天秋水仙素处理诱导单细胞悬浮液。

A：正常的BY2悬浮聚集体(经Calcafluor染色的)；B：在1mM秋水仙素中达7天的单细胞BY2悬浮液；C：与B相同，但扩大的，以显示具有完整壁的单细胞；D：Xanthi的悬浮聚集体；E：在0.5mM秋水仙素中处理7天的Xanthi悬浮聚集体。注意0.5mM中单细胞的部分释放；和F：1mM秋水仙素中所分离的Xanthi单细胞。

图4：在秋水仙素处理中自BY2和Xanthi烟草悬浮聚集体释放具有完整细胞壁的单细胞。

A：正常的BY2悬浮聚集体；B：在1mM秋水仙素中达7天的单细胞BY2悬浮液；C和D：除去秋水仙素后细胞恢复成聚集体(以1个秋水仙素处理培养周期进行传代培养后4天)；E：Xanthi的悬浮聚集体；F：在1mM秋水仙素中处理7天的Xanthi悬浮聚集体。注意BY2和Xanthi培养物中所释放的单细胞和完整细胞壁的存在，如在存在荧光增白剂Calcafluor的情况中所看到的。(用0.1％Calcafluor处理所有样品，并在Leica荧光显微镜下检查)。

图5：在秋水仙素处理中自BY2变体烟草(在EP 12％蔗糖培养基中适应的)和曼陀罗悬浮聚集体释放具有完整细胞壁的活的单细胞。

A：正常的BY2-V悬浮聚集体；B：未处理聚集体的更近视图；C、D和E：单细胞BY2悬浮液在1mM秋水仙素中诱导7天(10X、20X和40X放大率下的细胞)；F：在1mM秋水仙素处理中达7天，曼陀罗悬浮液中的单细胞诱导。用FDA和PI处理所有样品，并在Leica荧光显微镜下检查。注意这里在FDA染色剂中看到的细胞的高生存力且在PI中具有非常少的染红细胞。

实施例5——含有甘油作为唯一碳源的培养基中单细胞的产生和DAS-PMTI-1的影响

本实施例提供了关于新的甘油生长培养基和DAS-PMTI-1低浓度效应及生长特征的另一个讨论。本结果是非常有意义的，因为文献中有如下在先报道，即甘油减轻秋水仙素在破坏大豆微管中的影响；如此，本领域教导反对在用于本应用的培养基中使用甘油。参见例如Hayashi和Yoshida，85PNAS2618-22(1988)。另外，本甘油数据对于植物细胞是新的，而且此类结果先前尚未有报道。使用3％甘油作为唯一碳源，3种不同基因型的烟草快速培养物已经成功生长数月。

此实施例还提供了描绘两种不同DAS-PMTI-1浓度中的培养行为的生长曲线图，并将其与空处理进行比较。

破坏微管的数种类型的化合物产生单细胞。所述化合物包括微管破坏剂或抑制剂(α和β微管蛋白结合化合物)，其分类到以下各项之下：(i)二硝基苯胺类，秋水仙素、黄草消(Oryzalin)、氟乐灵(Trifluaralin，Trifluralin)、Chloralin；(ii)N-苯基氨基甲酸酯类，诸如苯甲酰胺、拿草特(pronamide)、磷酰胺(phosphoric amide)、甲基胺草磷(amiprophosmethyl)(Morejohn和Foskett，1986；Akashi等，1988)，以及抗真菌剂，苯甲酰胺氯菌胺(zarilamide)(Young，1991)；(iii)抗癌药，帕利他塞(paclitaxel)(Morejohn和Foskett，1986)、长春新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)；和(iv)破坏微管和/或壁特性二者的其它化合物诸如纤维素合成抑制剂和细胞骨架抑制剂，诸如铝和香豆素，还对它们测试它们产生没有微核形成或具有低微核形成的单细胞的能力。皮层微管和有丝分裂微管具有不同敏感性，并且来自上文所列不同类型或来自所述类型之一的化合物的组合选择性破坏小管，其程度不影响细胞分裂，但是细胞粘附特性会受到有效的破坏，以达到和维持处于单细胞阶段中的细胞，其具有低基因组不稳定性或没有基因组不稳定性。

检查微管抑制剂(MTI)对悬浮培养中的烟草细胞生长的影响。将第7天稳定期细胞(1ml)转移至250ml摇瓶中含有不同浓度(25-1000nM)MTI的培养基(50ml)(Bokros等，1993)，并在黑暗中于25℃在培养物中培养7天。对照和含MTI的烧瓶两者都含有终浓度0.5-0.1％(v/v)的DMSO。在EP12培养基中对BY2细胞评估与这些化学品一起的生长，而在NT1B培养基中对BTI-NT1细胞评估与这些化学品一起的生长，其中用3％甘油替换碳源。将这些细胞的响应与对相同培养基组成但以3％蔗糖作为碳源的响应进行比较。使用甘油培养基，因为已知甘油是微管稳定剂，而且3％甘油中适应的烟草细胞在压力下未显示酚类。

在1天的间隔，通过在配衡的离心管中短暂离心来沉降一式三份细胞样品(0.5ml)，并测定鲜重。图6中所示结果显示了2天滞后期之后，对照细胞快速地生长4天，并在第6天进入稳定期。与25nM DAS-PMTI-1一起培养的烟草细胞显示了与对照培养物中的那些类似的生长动力学。然而，稳定期期间，这些培养物的鲜重比对照的鲜重略微大些，这提示用50nM DAS-PMTI-1促进生长。在荧光显微镜下检查经FDA和碘化丙锭处理的细胞时，与0.5-1.0mMDAS-PMTI-1一起培养的细胞在培养启动3天之内表现出完全的抑制和细胞死亡。数据表明烟草细胞生长在50nM阈值附近时受到抑制，但是超过100nM浓度引起对有丝分裂的抑制和细胞死亡。

不像秋水仙素(秋水仙素是用于产生单细胞的低效力的二硝基苯胺，其中0.25-0.5mM浓度是有效的)，DAS-PMTI-1即使在存在甘油作为NT1和BY2细胞两者的总碳源的情况中在低至5-25nM的浓度也是非常有效的。25nM浓度范围不仅有效释放单细胞，而且在10天时间段里在不降低细胞生长率方面也是非常有效的(图6)。事实上，在生长的稳定期有生物量的略微增强，这是由于这些单细胞经历扩展的实情。然而，显微镜观察未显示这些单细胞中存在微核。

图6：DAS-PMTI-1对NT1烟草细胞生长的影响。在不存在或存在25nM或50nM的DAS-PMTI-1的情况中在含有3％甘油作为唯一碳源的NT1B培养基中培养细胞。所有鲜重值表示来自重复样品的均值±0.18。

在共焦显微镜下分析经由DAS-PMTI-1产生的细胞的单细胞状态，并且清楚地证实它们是单细胞，因为未发现细胞是附着的。

实施例6——转基因悬浮系和克隆系生成的去褶合(deconvolution)

烟草悬浮液通常含有聚集体或小簇中的细胞，而且它们是高度异质的。培养中的细胞可能在遗传方面是相同的(同质群体)或可能显示一些遗传变异(异质群体)。自单一亲本细胞衍生的细胞的同质群体称为克隆。因此，克隆群体内的所有细胞在遗传方面是相同的，而且在细胞特征方面是高度同质的。BY2和NT1烟草细胞悬浮液在许多实验室中常规用作模式系统。

除去细胞壁后，这些细胞容易被转化(Mathur和Koncz，1998)，这直接经由微粒轰击或与根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养来实现(An，1985；Klein等，1988；Rempel和Nelson，1995)。虽然根癌土壤杆菌介导的BY-2转化在许多实验室中常规地进行，我们发现获得转基因胼胝体的效率在各实验间有所变化，并且主要取决于BY-2细胞培养物的品质。同步化。处于M期和G1早期的BY-2细胞比驻留于G2的细胞对稳定根癌土壤杆菌介导的转化易感10倍。另外，组成型表达virG基因的土壤杆菌菌株LBA4404(van der Fits等，2000)在产生转基因胼胝体方面有效2-5倍。通常，自4mL与此土壤杆菌菌株共培养的BY-2细胞可获得约500个转基因胼胝体，容许进行表型筛选程序。然而，经转化悬浮系的簇或聚集体表现出具有异质的多种转基因事件。因此，在各批次培养之间有不一致的表达水平。采用单细胞方法来使簇中细胞的嵌合混合物去褶合，并将它们分离为单独的细胞以鉴定克隆事件。自用PAT选择标志基因转化的嵌合转基因悬浮NT1烟草系(GAD1762-034)产生单细胞(图7和8)。

图7：来自DAS GAD1762-034悬浮系的单细胞和集落生成。图8A、8B和8C：来自DAS GAD1762-034单细胞的集落的2-6周生长。

随机挑选约20个离散的集落，并在新鲜的选择培养基上进一步扩大。从这些集落产生悬浮系，并各经过6轮7天的传代培养周期而获得快速生长系。这些集落的生物量产量在这些系和供进一步蛋白质分析用的19种高级系之间是相当一致的。

在7天和13天收集样品达超过4轮传代培养周期，并实施表达分析。将所获得的表达数据绘图(图9)。

自数据分析清楚的是，在与对照悬浮聚集体系#34进行比较时可获得在数轮传代培养周期里有紧密表达的数种克隆系。另外，亚系17在表达水平上胜过对照系，指明此过程会挑选出群体中的克隆良种系，并且进一步的改良去褶合可有助于获得均一表达的良种系。

实施例7——单细胞悬浮培养物的转化

材料和方法

植物细胞材料的制备：转化前3-4天，通过将2ml NT1或BY2培养物转移入250mL烧瓶中的40ml NT1B或LSBY2培养基中来将1周龄悬浮培养物传代培养至新鲜的培养基。如上文所述的那样使用微管抑制剂(MTI)的浓度以产生单细胞。MTI处理后4天或7天收集单细胞。

图10：使用DAS-PMTI-1(DAS专卖的甲基吲哚衍生物和有效力的微管抑制剂除草剂)来分离的BY2细胞的单细胞。使用20-50nM浓度来在传代培养5天后产生单细胞。注意细胞是单细胞(一对具有交叠的边缘)，并在附接有共焦成像系统的微差干涉相差显微镜下拍摄照片。

在经由Beckman流式细胞仪处理BY2单细胞时，有658250个活细胞/ml培养基，活细胞具有10.43um的直径均值和593.8um³的体积。

土壤杆菌制备：在-80℃在50％甘油中贮存含有YFP基因(pDAB4613)构建体的根癌土壤杆菌菌株LBA4404。使用20-500μl等分试样的含有表达载体的储用培养物来启动液体培养基，其直接通过将20-500μl添加至30ml YEP液体培养基来实现，所述YEP液体培养基含有10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl、10g/L蔗糖和50mg/L壮观霉素。在黑暗中于28℃和以150-200rpm温育18-20小时后，直至培养物达到OD600约为1.5的密度。

为了核转化的单细胞共培养：转化时，将1.0ml土壤杆菌悬浮液添加至装有40ml 4或7天龄烟草单细胞悬浮液(在培养基中预先清洗以除去任何MTI)的烧瓶，并通过使用10ml宽口移液器上下吹吸5次来混合。然后以250μl等分试样将均一的悬浮液转移入24孔板中，包裹在石蜡膜中，并在黑暗中于25℃在不进行摇动的情况中培养3天。如下测试约50μl悬浮液的等分试样，即将其放置在显微镜载玻片上，并寻找黄色荧光蛋白(YFP)瞬时表达。

为了核转化的单细胞PEG/DNA处理：在启动传代培养时用1mM终浓度的在NT1B培养基中的秋水仙素(Fluka)处理JT-NT1细胞聚集体悬浮液，并在定轨摇床上以125rpm培养7天。于25℃培养悬浮液。第7天结束时，从烧瓶中收集1ml(0.6OD₆₀₀)单细胞，并分配至14ml无菌管中。添加10ml MaMg培养基(关于组分，参见下表1)，并以约1000rpm旋转5分钟。

倒掉液体，将细胞重悬于300μl MaMg中，并添加约50μg质粒DNA。向此单细胞和DNA混合物缓慢添加300μl PEG 3350(40％PEG 3350w/v、0.4M甘露醇、0.1M Ca(NO₃)₂，最终pH 5-6)，并将其温和地混合。将单细胞、DNA和PEG混合物于室温温育20分钟，然而添加10ml W5(清洗培养基)，并以约1000rpm旋转5分钟。倒掉液体，添加2ml基础液体培养基(NT1B)，并将细胞悬浮液转移到多孔板中。如此可将数个重复转移入24孔板的孔中。在20-24小时时如下测定YFP瞬时表达，即将50μl体积的细胞悬浮液移至显微镜载玻片上，然后在具有合适滤光器(激发500/20nm，二铬(diachrome)，发射535/30nm)的荧光显微镜下检查它们。

为了质体转化的单细胞生物射弹轰击：在EP 12％培养基中的20-50nMDAS-PMTI-1中处理BY2细胞以增加质体数目，并且其中或是没有2，4-D或是添加BAP以增加质体的大小，其进行7天。在第7天结束时，收集单细胞，并将2ml悬浮液转移至滤纸。将细胞保持在LS BY2凝胶培养基上达2小时以进行干燥。射击来自2，4-D缺陷型单细胞系和经BAP处理的细胞系的各5块平板。用50nM DAS-PMTI-1处理这些细胞达2周，而在第3周，它们处于20nmDAS-PMTI-1中。细胞是良好的，而且相对健康。

使用生物射弹枪(biolistic gun，BioRad)，遵循标准方案用0.6μm金颗粒上的pDAB3969轰击细胞。在不含选择剂的培养基上恢复2天后，将它们转移至LS-BY212％蔗糖+100mg/L卡那霉素选择。

结果和讨论

核转化成果：对PEG(图11)和Agro转化(图3)的尝试清楚地显示了彼此类似的表达频率。在所分析的50μl细胞等分试样中，有2-3个YFP表达细胞。如此，一批约每10970个单细胞中才有一个经转化的细胞，指明所述过程可能不是非常有效的。有可能的是，细胞没有除去残余的秋水仙素，并且在平行实验中，细胞以较高的集落频率更快且更健康地恢复成集落。这指明在优化实验中清洗步骤增加转化频率。若仅会自单细胞挑出一个事件，则在这两种转化方法中在微孔板中每ml单细胞会有至少50-60个经转化的细胞。然而，可进一步优化转化条件，并且可分离额外的、稳定转化的集落。

图11：PEG处理72小时后的YFP表达(Ubi10-YFP质粒)。焦平面中小的子(分裂)细胞之一显示GFP表达，指明表达可以是稳定的。

质体转化：培养6周后，在选择培养基上鉴定出5个活跃生长的集落。然而，在100mg/L卡那霉素选择中杀死了对照未处理的细胞(图12)。对活跃生长的集落进行取样，并通过PCR进行分析以测定质粒的整合。5个集落中的2个显示了清楚的PCR产物，指明质体中整合了转基因。

图12：左，由100mg/L卡那霉素抑制的未处理对照组织；右，选择培养基上生长的单细胞衍生的推定转质体分离群。

正在实施进一步的实验以进一步开发高通量核和质体转化方案。

正在实施进一步的转化实验来优化方案，以便为新的生物加工研究和开发进一步开发HTP和无主链(使用片段纯化的质粒)转化方案。

实施例8——悬浮培养物在甘油培养基中的适应

材料和方法

为了同步化的培养物条件化。为了改善同步化，将所有的培养物继续2周而不进行传代培养，接着在50ml新鲜培养基中稀释1ml旧培养物。该传代培养后2天对未分化的且分裂中的细胞进行计数(观察到高至40％的无丝分裂指数)，而在培养后10天观察到分化的非分裂细胞。对整个制片规程使用0.5ml悬浮液样品。

细胞培养物

长期嫩黄-2(BY-2)培养于LSGS-BY2培养基(附录1)中，而NT1细胞和短期Petite哈瓦那(PHL)烟草悬浮细胞培养于LSG-BY-2培养基(附录II)或G-NT1培养基(附录III)中。在生长培养基中，所有的培养基都具有甘油，作为替代蔗糖的碳源，例外是在常规BY2培养物的情况中，其中培养基在甘油之外还具有1％蔗糖。在250ml Erlenmeyer瓶中以一周间隔稀释悬浮培养物(50ml新鲜培养基中的1ml旧培养物)。在旋转式摇床上以100rpm搅动细胞悬浮液，并于25℃和在黑暗中维持。Vos等，“Microtubules become more dynamicbut not shorter during preprophase band formation：a possible‘Search-and-Capture’mechanism for Microtubule translocation，”Cell MotilCytoskeleton 57：246-258，2004。

甘油培养基中培养的细胞培养物的特征

所有培养物的总体生长在与糖培养的对照培养物相比时是下降的。然而，在培养接种物的起始水平提高时，获得正常的生长速率。细胞是健康的，而且有可能在没有糖对照培养物中观察到的典型细胞褐变的情况中将它们在培养物中继续培养长至2周。甘油培养物中培养的细胞在与其糖培养的对应物进行比较时在悬浮单元中具有更高的细胞聚集。在实验中使用这些细胞以测试MTI化合物破坏聚集的亚单元的细胞粘附特性，因为甘油减轻膜的稳定性。

附录I

LSGS-BY2培养基组成如下：Murashige和Skoog大量和微量盐类(macroand micro-salts)(Murashige和Skoog 1962)，补充有30ml甘油(v/v)和10g蔗糖(w/v)、100mg/l肌肉肌醇、200mg/l KH₂PO₄、1mg/l硫胺素和0.2μg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。将培养基调节至pH 5.8，之后高压灭菌。

附录II

LSG-BY2培养基组成如下：Murashige和Skoog大量和微量盐类(Murashige和Skoog 1962)，补充有30ml甘油(v/v)、100mg/l肌肉肌醇、200mg/lKH₂PO₄、1mg/l硫胺素和0.2μg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。将培养基调节至pH 5.8，之后高压灭菌。

附录III

G-NT1培养基组成如下：Murashige和Skoog大量和微量盐类(Murashige和Skoog 1962)，补充有30ml甘油(v/v)、100mg/l肌肉肌醇、180mg/l KH₂PO₄、1mg/l硫胺素和2mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。将培养基调节至pH 5.8，之后高压灭菌。

实施例9——自双子叶植物(烟草(BY2、NT1、Petite哈瓦那、Xanthi))，胡萝卜(Daucus carota L.ssp.sativus cv Sativa)的悬浮培养物产生单细胞

胡萝卜悬浮培养物

已经自体外维持的胡萝卜(Daucus carota L.ssp.sativus cv Sativa)植株启动胡萝卜胼胝体培养物。在半固体培养基上培养分离的叶柄外植体(Mashayekhi-Nezamabadi，2000)。通过将50mg易碎的胼胝体转移到24微孔板中的1.5ml LSBY2培养基(附录I)中来从胼胝体启动悬浮培养物。然后将生长最快的悬浮液的1ml悬浮液转移至烧瓶中的35ml LSBY2液体培养基。在7天传代培养周期中在漫射光中维持培养物。这些培养物是可再生的，并且悬浮单元是成块的，具有紧密排列的细胞。在传代培养的悬浮液启动阶段用0.5mM-1mM秋水仙素或用25nM-0.5mM DAS-PMTI-1(4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯)处理时，来自所述单元的细胞在培养启动的第3天内分离，并释放入培养基中。细胞培养物在秋水仙素处理中显示单细胞的同质产生，而在DAS-PMTI-1中显示单细胞产生，但具有各种各样的细胞形状而不是球形的。细胞具有完整的细胞壁，如在荧光显微镜下通过Calcafluor染色剂所分析的。

胡萝卜单细胞悬浮液的克隆系产生

使用LSBY2新鲜培养基将处于生长稳定期(0.5M秋水仙素处理中培养启动后7天)的单细胞悬浮液稀释至0.6OD₆₆₀。将1.5ml经稀释的单细胞培养物铺板于15X100Petri板中的M培养基(附录II)上，并使用接种环来展开。未处理的胡萝卜悬浮聚集体也稀释至相同的密度，并类似地铺板以比较这些培养物之间的生长应答。在黑暗中生长4周后，具有单细胞的平板产生数个离散的集落，指明自这些细胞能获得克隆系。然而，未处理的悬浮液显示了平板表面上胼胝体的胞苔生长(图13)。如此，可能显示了，分离的胡萝卜细胞能产生自单个细胞衍生的集落以产生克隆系。

图13：自胡萝卜单细胞悬浮液产生克隆系。用未处理的悬浮聚集体铺板的M培养基上的胞苔生长(小图A)。用单细胞铺板的培养基上的离散集落生长(小图B)。

实施例10——自单子叶植物(玉米、稻(T309)、野茅(Orchard grass)、小麦(Anza))的悬浮培养物产生单细胞

全能的含叶绿素的玉米细胞培养物

启动玉米光合自养培养物，并以7天培养周期维持(Jayakumar等2005)。传代培养时用25nM-0.5mM DAS-PMTI-1(4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯)或10nM-0.5mM氟乐灵处理培养物以自聚集体分离单细胞。秋水仙素仅在0.5mM以上至1mM的范围的浓度是有活性的并释放单细胞(图14)。玉米悬浮单元在与所分析的双子叶植物细胞进行比较时紧密挤压成坚实的细胞聚集体。然而，绿色玉米细胞悬浮液具有最坚实的悬浮单元，并且处理显示了7天中高至50％的活的单细胞释放，其可通过以100rpm的短暂旋转或流经具有直径范围75-100um的孔的筛子过滤来分离。

图14：启动传代培养后第14天(第2轮传代培养周期结束时)所分析的培养物和液体培养基中的0.5-1mM秋水仙素处理。A：自簇释放单细胞；B：用FDA活体染色剂染色的紧密挤压的细胞聚集体；C和D：过滤悬浮液(使用具有100um孔径的滤器)后，经FDA染色的分别在1mM和0.5mM处理中释放的单细胞；E和F：来自D的单细胞的更近视图。

野茅和稻(T309)悬浮培养

在半固体培养基上自成熟的种子(DAS种子保藏中心)启动野茅和T309胼胝体。使用Fauquet等，1996所述方案，自此种子衍生的胼胝体启动悬浮培养物。以7天传代培养周期在黑暗中在摇瓶中以150rpm维持悬浮细胞培养物。以类似的浓度范围使用与那些针对玉米(上文)所述的类似的MTI化合物。启动培养后3-5天释放野茅和稻单细胞。

小麦(Anza栽培变种)悬浮培养

在半固体MS2-D小麦培养基(附录III)上自小盾片(scultellum)组织启动Anza小麦胼胝体。自经过灭菌和浸泡的组织分离小盾片组织，并将自不同组织诱导的胼胝体转移至液体MS-2D小麦培养基(附录III)。分离到一种快速生长的细胞悬浮系，并以7天传代培养周期在MS2D液体培养基上进一步传代培养7年，并长期(7年)维持。为了产生单细胞，首先在NB麦草畏(dicamba)液体培养基(附录IV)中培养物使适应。可将Anza小麦培养物进行条件化以在此培养基中产生具有一致大小的细胞聚集体单元的精细悬浮液。在传代培养启动阶段将秋水仙素、氟乐灵或DAS-PMTI-1添加至接种物，以25nM-1mM浓度范围加入培养基中。从启动培养后3天起，悬浮液释放单细胞入培养基中。单细胞是小且均一的。

附录I

LSBY2培养基组成如下：Murashige和Skoog大量和微量盐类(Murashige和Skoog 1962)，补充有30g蔗糖(w/v)、100mg/l肌肉肌醇、200mg/l KH₂PO₄、1mg/l硫胺素和0.2μg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸。将培养基调节至pH 5.8，之后于120℃高压灭菌。使用培养第7天(处于稳定期)的悬浮体积来启动培养物。将1ml体积的胡萝卜悬浮接种物转移入50ml LSBY2培养基中，然后在黑暗中在28℃以150rpm将培养物放置在摇床上。在培养启动周期将所使用的MTI化合物连同新鲜培养基一起添加。

附录II

M培养基组成如下：LS基础盐类和B5维生素、30g葡萄糖、各1uM 2，4-D和细胞分裂素(Kinetin)，并将培养基调节至pH 5.8，之后将8gm/L Noble琼脂添加至培养基。然后将培养基进行高温灭菌，并倒入15X100 Petri板中。

附录III

MS2D培养基组成如下：MS盐类(Murashige和Skoog 1962)和Eriksson氏维生素，补充有2mg 2，4-D、0.5mg硫胺素、30g蔗糖、400mg肌肉肌醇、400mg酪蛋白水解物(ECH)。将培养基pH调节至5.8之后，将培养基进行高温灭菌。以7天间隔例行地对悬浮培养物进行传代培养(54ml新鲜培养基中6ml所使用悬浮液的起始接种物)，并在以150rpm摇动的情况中在黑暗中于28℃培养。在这些条件下，细胞群体在接种后2天和6天之间总是处于指数生长。对于从成熟的种子小盾片诱导胼胝体的凝胶培养基，MS2D培养基含有额外成分2.5g/L Gelrite，其在调节pH之后添加。

附录IV.

NB麦草畏培养基组成如下：NB基础盐类、蔗糖30g/L、肌肉-肌醇100mg/L、ECH酪蛋白水解物(ECH)300mg/L、L-脯氨酸(2.5M)1.7ml/L、L-谷氨酰胺500mg/L和6.6mg/L麦草畏。将培养基调节至pH5.8，之后过滤灭菌。

实施例11——胡萝卜单细胞产生和Si-C晶须介导的胡萝卜单细胞悬浮培养物的遗传转化

胡萝卜单细胞悬浮液的启动

将可再生的胡萝卜冷冻保存系(D2-40-018)融化，并在Linsmeier-Skoog(LS)培养基(Nagata，T.，Nemoto，Y.和Hasezawa，S.(1992)Int.Rev.Cyto 132，1-30)中培养。培养基盐购自PhytoTechnology Laboratories，产品目录编号L689。在一周内建立活跃生长的悬浮系，并通过将2ml PCV转移至58ml LSBY2悬浮培养基来在28℃在定轨摇床(Innova-3300)上以125rpm在漫射光下以7天培养周期对维持系进行传代培养。为了单细胞产生，将1ml PCV的处于稳定期的胡萝卜悬浮液添加入30ml具有1mM秋水仙素(Sigma，产品目录编号C3915)的LS悬浮培养基中，并培养7天。自3-7天培养物产生单细胞，并为转化实验做好了准备。可如下将胡萝卜的单细胞维持在稳定期长至28天，即通过添加60ml新鲜的LS BY2液体培养基来在14天时稀释培养物。

WHISKERS^TM介导的胡萝卜单细胞的遗传转化

启动培养后4天和11天时观察到具有1mM秋水仙素的LSBY2培养基中所产生的单细胞。单细胞是非常有活性的而且是活的，如通过荧光素二乙酸酯染色剂所测定的。在草铵膦(glufosinate ammonium)平板上选择后10天和25天，自单细胞衍生的集落观察到表达黄色荧光蛋白的胼胝体事件。

遗传转化胡萝卜单细胞

在转化实验中使用改良的WHISKERS^TM转化方案[Petolino，Welter和Cai(2003)Molecular Methods of Plant Analysis，卷23，147-158，章9，GeneticTransformation of Plants，ISBN 3540002928]。如下启动实验，即单细胞处理和培养启动后第4天和第11天将25ml单细胞胡萝卜悬浮液转移入无菌的250ml IEC-离心瓶(Fisher Scientific产品目录编号05-433B)中。通过添加8.1ml新鲜制备的5％晶须悬浮液(Silar SC-9，Advanced Composit Materilas Corp，Greer，SC)和170ug pDAB3831来实施转化，其中pDAB3831含有驱动PAT基因的AtUbi10启动子和驱动YFP基因的CSVMS启动子。每次转化由一个瓶子组成，所述瓶子放置在改良的涂料混合器(Red Devil Equipment Co，Minneapolis，MN)中，并在高处搅动10秒，之后将细胞返回至500ml回收烧瓶，并添加100ml新鲜的LSBY2液体培养基。容许细胞在旋转式摇床上以125rpm和于28℃恢复1小时。

恢复之后，将3ml细胞悬浮液的等分试样均匀地分配至搁在布氏漏斗上的无菌55mm 4号滤纸片(Whatman International Ltd.)上，并吸去液体培养基。然后将具有细胞的滤纸放置在装有含15mg/l草铵膦和作为胶凝剂的0.8％TC琼脂的半固体LSBY2-B15培养基的60 x 20mm培养皿上。将平板在黑暗中于28℃温育。10天后，取出滤纸上表达GFP的事件，并放置在单独的LSBY2-B15半固体平板上。将剩余的滤纸和细胞转移至新鲜的半固体LSBY2-B15培养基，并在黑暗中于28℃温育。

单细胞集落事件的分析

使用“EnviroLogixPAT/pat平板试剂盒”，经由灵敏ELISA测定法来对推定的转基因事件分析功能性PAT选择标志蛋白，所述推定的转基因事件为在启动转化实验后25天在Leica倒置荧光显微镜下均匀地发荧光。EnviroLogixPAT/pat平板试剂盒是“三明治式”酶联免疫吸附测定法(ELISA)。将胼胝体组织放置在微量离心管中，并添加250ul提取缓冲液。提取缓冲液是PBS(Fisher产品目录编号BP665-1)和0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich产品目录编号P1379)。在微量离心管中用小的手提式研杵来研磨所述组织。以11,000rcf离心样品提取物达1分钟，并以下列稀释度在ELISA中使用上清液：1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64。如Envirologix试剂盒产品编号AP014中所述的那样遵循ELISA方法。在此测试中，将样品提取物添加至经针对来自pat基因的PAT制备的抗体包被的测试孔。样品提取物中所存在的任何剩余物结合抗体，然后通过添加经酶(辣根过氧化物酶)标记的PAT/pat抗体来检测。简单的清洗步骤后，用显色步骤来显现测定法的结果；显色与样品提取物中的PAT/pat浓度成正比。

结果显示样品比率143mg/250ul提取缓冲液的阴性对照组织在PATELISA中不产生数值。样品比率63mg/250ul的事件001B确实产生83ng/ml的ELISA数值，其等于每mg胼胝体有330pg PAT，如此指明明亮地发荧光的事件确实被在预期范围中发荧光的两种PhiYFP并还被PAT选择标志基因转化了。

实施例12——微管抑制剂的化学类别和植物单细胞产生

微管和微原纤维(microfibril)之间的平行进化代表对未知极化原理的相关应答而非因果关系(Emons等，1992)。这由数个例子所支持，其中受到水压力(water-stressed)的玉米(玉蜀黍(Zea mays))根成熟区中的大多数细胞具有右手螺旋的微管排列，但左手螺旋的微原纤维(Baskin等，1999)。类似地，拟南芥属(Arabidopsis)(拟南芥(Arabidopsis thaliana))突变体即微管组构1(morl)具有异常的微管排列，但具有明显未改变的微原纤维排列(Himmelspach等，2003；Sugimoto等，2003)。我们的实验中的单细胞悬浮液显示了与对照的生长应答类似的生长应答，其中干重在细胞传代培养周期里增加，指明细胞在较低浓度的微管蛋白抑制剂(MTI)中进行分裂，尽管有如下实情，即它们具有显示各向同性生长且放射状扩展的细胞。另外，通过改变培养基组成，有可能在此类具有拍摄到的各向同性生长的单细胞中看到细胞板，这进一步支持如下实情，即这些细胞确实在低水平的MTI浓度中进行分裂。如此，用低浓度的微管抑制剂处理并在培养基中在最佳水平中维持的植物细胞能使皮层微管的实质性群体保持不改变。这会容许单细胞继续正常的细胞壁建造过程(包括成膜体建造)，其对于细胞分裂是重要的先决条件。

为了部分抑制微管功能并选择在低水平中选择性破坏它们的化合物，筛选不同类别的化合物。MTI与植物微管蛋白的相互作用已经受到充分表征(Hugdahl和Morejohn，1993)。然而，用任何抑制剂，都有非特异性效应(Vaughn和Lehnen，1991)。因此，在此实施例中，评估具有不同化学性质的微管抑制剂类别的比较以鉴定能维持单细胞生长而没有非特异性效应的化合物。存在有如下化合物诸如氯苯胺灵(clorpropham)，已知它们以低于刺激放射状扩展所需的浓度抑制延伸，因为它们对有丝分裂微管的影响比对皮层微管的影响更活跃(Hoffman和Vaughn，1994)。如此，此工作的目的是选择如下化合物，其在低的最佳浓度中会保留足够的皮层微管，以实施正常的细胞功能同时维持各向同性生长，但同时具有低的非特异性抑制效应或没有非特异性抑制效应。

秋水仙素是草酚酮(tropolone)衍生物，其立体化学结构和作用模式是完善建立的(Keats和Mason，1981；Margolis和Wilson，1977；Raugh和Wilson，1980；Murgulis，1974)，并且其阻止从微管蛋白二聚体形成微管。拿草特(Propyzamide)及其它苯甲酰胺作用于植物细胞中的核纺锤体(Akashi等，1988；Bartels PG和Hilton JL.，1973；Carlson等，1975)，并被开发为萌前除草剂，其对一年生禾本科植物和阔叶草是有效的(Aya等，1975)。磷酰胺的用途与二硝基苯胺除草剂(包括黄草消(Surflan)和氟乐灵(Treflan))的那些用途类似(Ashton和Crafts，1981)。氟乐灵是二硝基苯胺除草剂家族的众所周知的代表之一；其破坏植物微管，但在动物细胞中是无效的(Hess和Bayer，1974；Hess和Bayer，1977)。吡啶具有苯环，其中碳之一被氮替换。有数种作为除草剂使用的经取代的吡啶。在此组中有氟硫草定(dithiopyr，)和噻氟啶草(thiazopyr，)。氟硫草定是选择性的萌前和萌后材料，其仅在草皮上使用以控制极其多种禾本科杂草。它常常与其它除草剂一起配制，并在肥料上配制。噻氟啶草是选择性的萌前化合物，其良好地针对实际上所有的禾本科杂草起作用，而且对极其多种作物(包括柑桔、棉、玉米、花生、大豆和马铃薯)起作用。如此，吡啶表现为功能上的微管装配抑制剂。

材料和方法

JTNT1烟草悬浮培养物。通过将1ml充实细胞体积(PCV)传代培养入20ml烟草培养基(MS盐类、肌肉-肌醇、盐酸硫胺素(1mg/ml)、磷酸氢二钾(无水的)、MES、2，4-D(10mg/ml)和3％甘油(NT1B培养基)中来维持JTNT1烟草细胞悬浮培养物。每7天对细胞系进行传代培养，并根据测试需要而放大。1M蔗糖抑制紫杉醇诱导的植物微管蛋白聚合的速率和程度两者(Bokros等，1993)。存在1M蔗糖的情况中植物微管蛋白聚合的调查(APM(甲基胺草磷)和黄草消两者)产生植物微管长度的浓度依赖性缩短(Morejohn和Fosket，1984；Morejohn等，1987)。此外，蔗糖使预成型微管稳定，使MTI对预成型微管的效应的检查不能实行。另外，蔗糖实质性增加溶液粘度，而且至少部分地通过减缓二聚体和多聚体扩散速率来改变微管蛋白聚合。如此，产生单细胞的培养基中具有低的蔗糖或没有蔗糖是重要的。如此，为此研究开发甘油中适应的新JTNT1系。

对于处理，用1ml在20ml培养基中的PCV制备悬浮系，同时频繁地漩涡以容许良好的细胞分布(因为悬浮聚集体趋于沉降)，然后转移入24孔微量滴定板的孔中。24孔中的每孔装有1ml JTNT1悬浮液。将24孔板保持在Innova4900多环境摇床(Multi Environmental Shaker)上，其具有专用夹具和挽具以容许堆积平板高至6块平板。以130rpm的速度和于25℃在黑暗中旋转平板。

单细胞产生。将每种化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中以提供0.5摩尔储液。将1ml JTNT1悬浮液(1ml PCV/20ml烟草培养基)添加至24孔板的每孔。向每孔添加单独的化学品以达到想要的浓度(1μM、3μM和10μM)。容许培养物在Innova摇床上生长7天。使用SpectraMax M2^e通过分子装置(设置在600吸光度，每孔取得5次读数)对每孔取得每天浊度测量。在第7天，使用Leica 5000倒置共焦显微镜来对细胞观察单细胞形成和细胞生存力。

甲基胺草磷(amiprophosmethyl)(APM)

氟硫草定(dithiopyr)

(±)-4S，5R-4-硝基-5-(2，3，4-三甲氧苯基)环己烯(三甲氧苯基环己烯)

经由LSBY2甘油培养基中的BY2单细胞的克隆胼胝体事件产生。经由Shaul等，1996所述改良的方案由pDAB1590转化烟草BY-2细胞(Nagata等，1992)，并在共培养4天后在LSBY15上进行选择。回收表达绿色荧光蛋白的胼胝体事件，并将胼胝体维持在LSBY2B15培养基上。一个月内，胼胝体事件生长至数厘米直径，并将小的但明亮地发荧光的块(约2-5mm²团块)转移至新鲜的固体培养基，以便保持给细胞提供新鲜选择剂中的营养物，并选择同质表达GFR的胼胝体。将500mg胼胝体块转移至250ml摇瓶中的50mlLSBY2-Gly-B15(具有作为碳源的3％甘油和1％蔗糖的改良LSBY2液体培养基)(130rpm，25℃，在黑暗中)。每周使用0.5ml充实细胞体积(PCV)的细胞来开始悬浮培养。如此，分别以每月周期和7天周期维持表达绿色荧光蛋白(GFP)的胼胝体和悬浮聚集体。

表达GFP的单细胞的产生。如下产生单细胞，即在启动7天培养周期期间在LSBY2-Gly-B15培养基中添加1uM浓度的化合物DDP(二苯基吡唑)，连同添加0.5ml充实细胞体积(PCV)的处于稳定期的表达GFP的悬浮聚集体。或者，如下将25ml悬浮聚集体转移至25ml新鲜的LSBY2-Gly-B15悬浮培养基，即添加50ul 1M二苯基吡唑储液(在DMSO中溶解)以在悬浮液中提供1uM终浓度。如此，可在仅3.5天的短得多的周期中产生单细胞。LSBY215培养基始终含有供选择用的15mg/l草铵膦。

整个3.5或7天培养周期，GFP在单细胞中作为嵌合蛋白表达，并驻留在亚细胞位置中，因为使用Leica显微镜并还使用Zeiss Axiovision共焦激光扫描显微镜使用常规的表面荧光(epifluorescence)在活细胞中观察到嵌合构建体的GFP表达。在许多亚细胞区室(包括细胞核和胞质丝)中看到表达。

结果和讨论

细胞在含有甘油的烟草培养基中是非常健康的，而且细胞簇是非常明显的。细胞在7天期间里显示良好的生物量增加，虽然与含糖的对照相比有约50％的生物量减少。对照培养物也具有0.1％DMSO，以便确保没有DMSO诱导的效应。1uM 4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯(二苯基吡唑)向蔗糖或甘油培养基的添加没有自相应的对照显著减少细胞生物量，指明在存在二苯基吡唑的情况中有与对照类似的单细胞活跃生长。通过2个子周期或3.5天，取出培养物时生长曲率是类似的。与对照相比，甘油培养物中的单细胞产生也显示非常高的活细胞。

已经对数种其它化合物(包括氟乐灵、黄草消和微管蛋白稳定剂类化合物，诸如紫杉醇)研究了它们从具有作为唯一碳源的3％甘油的NT1B培养基中培养的烟草JTNT1悬浮培养物产生单细胞的效率。这些是秋水仙素、N-(1，1-二甲基丙炔基)3-氯苯甲酰胺、拿草特和氟乐灵。在这些研究中，所述化合物在其单细胞产生效率及在剂量-响应曲线的陡度方面有差异。黄草消(像所测试的其它化合物一样)增加单细胞直径至少4倍，而且具有约10倍阈值的饱和浓度。秋水仙素增加直径5倍，而且具有较陡的剂量-响应曲线，这表明这两种化合物可能优选在高剂量工作。

产生单细胞所必需的浓度，对秋水仙素而言为介于50uM和2mM之间的范围内，而对于拿草特，N-(1，1-二甲基丙炔基)3-氯苯甲酰胺而言为介于10nM和100uM之间。然而，黄草消和氟乐灵用于最佳单细胞产生的浓度在100nM-1mM的范围。然而，在高浓度中的这些化合物增加所处理细胞中发生的蛋白质合成、质体和线粒体分裂，导致形成大至300uM直径且具有核多倍性的巨大细胞，如培养21天的胡萝卜细胞中所看到的。这些结果提示有丝分裂抑制是这些化合物在所研究高浓度时的基本效应。如此，似乎重要的是，不仅保持MTI的最佳浓度，而且保持该化合物的化学性质(其对细管会具有非常选择性的功能而没有与细胞分裂功能类似的非选择性功能)。和目标一致，下文描述了其它化合物，除较早所述二苯基吡唑之外。

观察到BY2悬浮聚集体：在LSBY2糖培养基中；1uM二苯基吡唑中产生的正在分裂的BY2单细胞在改良的LSBY2培养基中显示细胞板；去褶合的BY2GFP转基因细胞和LSBY2-15凝胶培养基上的单克隆集落事件。

LSBY2甘油培养基中的烟草BY2单细胞产生的汇总。在1uM二苯基吡唑中自聚集体悬浮液产生的单细胞在培养3.5天时在90％的细胞中显示具有一个或两个核仁的单个细胞核。可将这些细胞铺板于具有0.8％TC琼脂和15mg/l作为选择剂的草铵膦的LSBY2凝胶平板上，因为转化聚集体悬浮液所使用的pDAB 1590质粒具有作为选择标志的PAT。以1∶4稀释在液体培养基中稀释细胞，铺板于凝胶培养基上，并在铺板后21天中选择克隆事件。

关于甲基胺草磷(APM)，在添加至JTNT1悬浮液后，在1-10μM浓度中形成单细胞；在更高的浓度有显著的生长减少和细胞分裂抑制。与仅具有DMSO的对照相比，可在1μM和3μM APM的照片中看到球形的分开的细胞。在存在1μM和3μMAPM的情况中，JTNT1烟草细胞是健康的黄色，并且良好地生长。细胞生存力(如通过荧光素二乙酸酯和碘化丙锭染色剂所测量的)显示了高至70％的生存力。

再次观察到甘油培养基中APM诱导的JTNT1烟草细胞的单细胞产生。在具有甘油和0.1％DMSO的培养基中观察到JTNT1对照悬浮聚集体；在具有1、3和10uM APM的NT1B甘油培养基中观察到JTNT1单细胞。

氟硫草定属于破坏微管的经取代吡啶除草剂的类别。在以1μM、3μM和10μM的浓度添加至JTNT1悬浮物时，使用1μM和3μM浓度(照片E和F)时形成了单细胞，但是10μM浓度具有单细胞(并且细胞浓度是低的)。在所测试的所有浓度使用氟硫草定时，烟草细胞是健康的，正在生长，且是黄色的。用1μM和3μM氟硫草定处理后的细胞生存力在70-80％之间，指明较高的生存力。

在JTNT1烟草培养物中对秋水仙素模拟物(Evans等，2003)(±)-4S，5R-4-硝基-5-(2，3，4-三甲氧苯基)环己烯(三甲氧苯基环己烯)测试其单细胞产生效率。虽然细胞(它们是略微暗黄色的)中有轻微的脱色，但是细胞在平板上非常良好地生长。在1μM、3μM和10μM时，此化学品促进单细胞的形成。细胞是球形的，而且所有水平间的细胞生存力在80-90％的范围。细胞生长抑制在所测试的浓度间是相当类似的，并且细胞是健康的，具有高的生存力和较小的细胞毒性。

如此，在用10uM浓度的三甲氧苯基环己烯诱导时在甘油培养基中观察到JTNT1烟草细胞的诱导的单细胞产生。

超级单细胞(super single cell)。可将胡萝卜悬浮聚集体培养在60ml含1mM秋水仙素的LSBY2液体培养基中，并维持在相同的培养基中达长至28天。第2轮传代培养后的生长在14天后下降，但细胞保持生长以形成超级单细胞，其是活的而且是健康的(但是显示广泛的叶状细胞核，指明核多倍性的发生)。在具有LSBY2培养基中连续1mM秋水仙碱的21日龄细胞中观察到具有数个细胞核的胡萝卜超级单细胞。

结论

通过目视观察、干重(仅在第7天取得的)和浊度读数来观察这些测试水平中的细胞生长。图15描绘了7天期间内取得的浊度读数。浊度读数关于仅含有培养基(具有3％甘油)和1μM、3μM和10μM浓度的微管抑制剂的平板。虽然对照具有最好的生长模式(如预期的)，但是在1μM和3μM的比率，没有一种所测试的化学品引起细胞系死亡。在所有的处理中的细胞大约在相同时间点(第3天)经历生长速率增加，而细胞体积在第7天时仍然增加。这显示经化学方法处理的细胞保持能存活的达至少7天。

实施例12参考文献：

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实施例13——对MTI产生的单细胞亚细胞结构、细胞发生和分子基因组不稳定性评估的比较调查

已经在数种植物物种中在细胞发生水平研究了组织培养衍生的植株中的总基因组稳定性(Shoyama等1995；Zoriniants等2003)。关于embling衍生的植株的稳定性，细胞发生研究已经揭示了对比观察。Odake等(1993)报道了分别在自Gellan Gum固化培养基和液体培养基获得的石刁柏(Asparagusofficinalis L.)的66.7％和100％embling中的染色体加倍(自二倍体至四倍体)。相比之下，Mamiya等(2001)报道了石刁柏中体细胞胚发生期间没有倍性变化。已经有报道，培养基中所使用的合成生长素(诸如2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和NAA(萘乙酸)与体细胞克隆变异有联系(Karp 1989；Phillips等1994)。确实，在已经使用了2，4-D的胡萝卜(Ronchi等1992)和杨树(Rugh等1993)体细胞胚发生系统两者中报道了倍性降低。微管蛋白抑制剂(MTI)也增加植物细胞中的倍性。然而，浓度和MTI化合物类别决定倍性的性质或倍性的缺乏。例如，黄草消诱导TBY2细胞中的核多倍性，但类似浓度的戊炔草胺(propazamide)则不然(Ehsan等，1999)。类似地，在较高浓度的秋水仙素中，胡萝卜悬浮细胞的长期暴露诱导核多倍性。胡萝卜悬浮细胞在来自14-21天连续处理的1mM秋水仙素培养的单细胞中显示核多倍性。然而，此类倍性水平的频率在长至14天的培养物中是小得多的，并小于1％，这与对生长素培养的对照悬浮液报道的对照类似(Karp 1989；Phillips等1994)。然而，在此研究中所测试的化合物中，4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯和4S，5R-4-硝基-5-(2，3，4-三甲氧苯基)环己烯在14天连续处理中显示具有低核倍性百分比或没有核倍性百分比的有效单细胞产生。

在任何情况中，使用此类低细胞毒性MTI自细胞聚集体诱导单细胞的过程仍可改变具有不同基因表达序型的单细胞的现有基因表达样式。公知的是，DNA甲基化触发不想要的后果，导致体外体细胞克隆变异。另外，MTI诱导可导致分子变异或不稳定性的变化。在弯叶画眉草(Eragrostis curvula)的四倍体中在秋水仙素诱导的染色体加倍中报道了1.09％的多态性百分比(Mecchia等2007)。处理弯叶画眉草种子所使用的秋水仙素浓度水平是0.05％。本研究的目的是评估1uM 4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧基)-乙酸乙酯中产生的JTNT1单细胞中的基因组稳定性。

已经尝试了多种分子方法(诸如AFLP、RAPD(快速扩增多态DNA)、RFLP(限制性片段长度多态性))来鉴定和测量组织培养衍生的植株中的体细胞克隆变异水平(Devarumath等2002；Martins等2004；Sanchez-Teyer等2003；Hale和Miller 2005)。然而，不管所使用的方法，仅可测定非常小的百分比(比1％小得多)的基因组，无论技术如何丰富(就取样的基因座数目而言)。可获得的多种技术之中，AFLP是最高度多重的，通常每个引物对测定50-100个基因座。认为这些基因座在整个基因组中或多或少随机分散，如此AFLP为检测组织培养诱导的变化提供最好的机会。此外，AFLP还是供栽培变种鉴定和变异性分析用的较有力分子技术之一(Hale和Miller 2005)。如此，选择此评估方法以在此研究中使用。

材料和方法

JTNT1烟草单细胞启动和样品收集

在3.5天培养周期中在两种不同培养基即具有3％蔗糖的NT1B(NT1B-Suc)和具有3％甘油的NT1B(NT1B-Gly)中启动JTNT1烟草单细胞。通过添加12.5ml维持在相应培养基中的处于稳定期培养的悬浮聚集体来开始培养，并转移至125ml摇瓶中12.5ml含有1uM 4-氯-1，5-二苯基-1H-吡唑-3-基氧)-乙酸乙酯(二苯基吡唑)的新鲜培养基。用泡沫塞子封闭烧瓶，并在定轨摇床上以130rpm在黑暗中于25-28℃培养。每3.5天对培养物进行传代培养长至14天的时间段。通过以3000rpm旋转悬浮液达5分钟来每3.5天收获4份培养物样品(Suc/Gly培养的细胞和具有0.2％DMSO的Suc/Gly培养基中的对照培养物)。立即冻干样品以防止任何细胞氧化，以便使对收获后所引入的对样品的任何有害效应最小化。用Hoechst核染色剂对单细胞进行染色达1小时，并在显微镜下观察任何核异常达长至两个培养周期。

单细胞的细胞学表征

细胞生存力和细胞壁。使用建立的JTNT1单细胞来用FUN1(F-7030，Molecular Probes，Invitrogen Inc)细胞染色剂进行染色，所述FUN1细胞染色剂用于酵母中的生存力测试，而且这含有两种颜色荧光探针。使用第3种荧光探针Calcafluor白色M2R(其对细胞壁进行染色)来对细胞进行染色。对于JTNT1单细胞，添加20μm FUN1染色剂，并于室温温育培养物达20分钟。添加1mL新鲜的培养基以清洗过量的染色剂，并以3000rpm离心；倒去上清液。在Zeiss ApoTome显微镜上检查细胞并成像。

质膜。将JTNT1细胞与5μM FM4-64(苯乙烯基染料)一起温育达5分钟，并用新鲜的培养基清洗。以3000rpm离心培养物，并添加新鲜的培养基。在Zeiss ApoTome显微镜上显现细胞。

细胞核。用Hoechst核染色剂对单细胞进行染色达1小时，并在Zeiss ApoTome上观察任何核异常达长至两个培养周期。也使用结晶紫染色剂作为活体核染色剂以观察核结构，用于倍性表征。

细胞骨架。毒蕈肽结合肌动蛋白丝。使用Alex Fluor 488鬼笔环肽(A12379，Invtrogen Inc)来对单细胞染色。将6.6uMAlex Fluor添加至单细胞，温育30分钟，并在显微镜上成像。

对基因组不稳定性的分子评估

DNA提取。自3.5、7、10.5和14天收获来自代表性样品的基因组DNA。使用CTAB方案(参见附录-实施例12)来提取连同对照一起的Suc和Gly培养物(10份样品)。使用来自Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oregon)的染料来对DNA进行定量。微量滴定板的每孔含有与10μl 40x稀释的DNA样品或λDNA标准品(0、2.5、5和10ng/μl)组合的90μl 200倍PicoGreen。使用标准的摇板仪来短暂地摇动平板，并使用来自Molecular Devices(Sunnyvale，California)的Spectra Max GeminiXS荧光计来读取荧光(激发约480nm，发射约520nm)。一式三份对每个样品进行定量，并使用3次结果的平均数来进行随后的稀释。用无菌水将DNA样品浓度稀释至91ng/μl的工作浓度。

AFLP分析。使用Vos等(1995)的方案的改良来进行扩增片段长度多态性(AFLP)测定法，如Bryan等(2002)中所述的。联用切割6-bp的限制酶EcoRI和切割4-bp的限制酶MseI。自Applied Biosystems(Foster City，CA)定购EcoR1经荧光标记的和MseI未标记的AFLP引物。经由具有一处改良的选择性扩增反应，使用Applied Biosystems的AFLP植物作图方案来实施AFLP分析。所述改良是消化/连接反应于37℃温育过夜。在经过灭菌的去离子水中将选择性扩增产物稀释2倍。将0.5ul稀释的产物与5ul加载缓冲液(与500ul ABI HiDi甲酰胺混合的5ulGeneScan 500bp LIZ大小标准品)组合。在具有G5-RCT谱矩阵的AB3730XL DNA分析仪上使用标准条件来分析样品。然后将数据输入4.0版(Applied Biosystems，2005)中。依照PCR片段大小，给等位基因指定数值。

结果和讨论.

单细胞的细胞学及其它亚细胞评估

细胞壁和细胞分裂。细胞培养过程中，发生生长和分化，并且细胞的形状和结构依赖于细胞壁。单细胞显示具有3-10倍大小增加的各向同性生长，显示典型的圆形细胞。为了理解细胞壁结构，使用Calcafluor(具有对纤维素的结合亲和力的增白剂)。在单细胞中，观察到独特的圆形壁。细胞壁是动态的结构，其在决定细胞形状中发挥重要的作用，并与环境因素相互作用。虽然所观察的大多数单细胞显示了球形细胞，有可能看到具有细胞板的正在分裂的细胞。干重的增加是另一个指征，即这些单细胞中正在发生细胞分裂。在MTI中培养14天后，若将单细胞转移至无MTI的培养基，则细胞重新组成聚集体悬浮液，显示各向异性生长的可逆性。

质膜。质膜是重要的细胞成分之一，其围住所有的细胞内容物。它展示细胞壁的轮廓，并在细胞内部和环境之间提供最终的过滤器。两亲性FM苯乙烯基染料对于研究活的真核细胞中的细胞器组构和小泡运输是有用的(Bolte等，2004)。最初，FM染料定位于质膜(PM)，然后胞吞入液泡和小泡中，然后至内体中。FM4-64(膜选择性荧光染料)对质膜进行染色，然后内在化至细胞中的其它细胞器(Ueda等，2001)。染色5分钟后，在质膜上观察到单细胞荧光，并且没有结构缺陷。在使用100nM Isoxeben来除去纤维素网络的单一样品中，FM4-64显示了表面上广泛的小泡。膜在5分钟内显示活跃的胞吞。

细胞核。据报道经MTI处理的植物细胞中的核组构是复杂的，而且显示核多倍性在较高的浓度中是普遍的。在1uM浓度的二苯基吡唑和三甲氧苯基环己烯中对样品检查长至7天。通过使用多种染色剂(Hoechst3325)来分析核胞器结构。在JTNT1中，单细胞在1uM浓度的二苯基吡唑和三甲氧苯基环己烯中在3.5天培养物中含有具有一个细胞核或两个核仁的单一细胞核。然而，高浓度的这些化合物导致形成大至150-300uM直径且具有核多倍性的巨大细胞，如培养21天的胡萝卜细胞中所看到的。这些结果提示有丝分裂抑制是这些化合物在所研究高浓度的基本效应。如此，重要的是，不仅保持MTI的最佳浓度，而且保持该化合物的化学性质，所述化合物对细管会具有非常选择性的功能而没有与细胞分裂功能类似的非选择性功能。

细胞骨架。细胞骨架由细胞结构的结构完整性中所牵涉的数种结构蛋白(诸如F-肌动蛋白和微管蛋白)组成。使用绿色荧光Alexa Flour 488肌动蛋白偶联物(A12373)(其是较亮的，而且pH依赖性较小)来研究细胞骨架体内动力学。微管和肌动蛋白丝对为了其生长和分化及植物细胞生存而维持植物细胞中的细胞骨架结构是必需的结构(Kost等，2002)。用鬼笔环肽染色的单细胞显示了肌动蛋白丝细胞骨架，并且所述丝没有有缺陷的定位，因为细胞结构是正常的。

分子分析。基于EcoRI(对甲基化不敏感的限制酶)的应用，AFLP分析牵涉10对引物组合。引物对中的两对没能扩增(p6和p10)，而引物对中的两对没有显示任何片段上的差异(3p和8p)。引物对1p、2p、3p、4p、5p、7p、8p、9p的明显分离片段的数目分别是47、39、31、42、47、32、7和46。在用对甲基化不敏感的(即EcoRI-MseI)引物组合处理的所有样品中都没有检测到AFLP多态性，14天甘油培养的JTNT1样品(第4轮传代培养周期)除外。相比之下，对于甘油培养的样品，在所有的其它样品中没有鉴定出多态性片段。经蔗糖处理的样品对所测试的任何引物组合都没有显示任何片段的多态性。如预期的，单细胞样品中至少3轮传代培养周期没有差异。然而，在由缺乏蔗糖而强加的压力(其似乎已经触发了不稳定性)之外，甘油培养物中的第4轮传代培养周期多态性可能是由于化合物的连续存在。未显示多态性的JTNT1单细胞培养物的差异提示简单碳源甘油(虽然已知稳定微管)可能不能支持许多细胞功能，尤其在微管蛋白抑制剂(MTI)延长存在的情况中。在任何情况中，可在用二苯基吡唑测试的浓度范围内成功地准备单细胞处理达至少4轮传代培养周期而没有基因组不稳定性问题。

拍摄针对引物5p的2多态性的快照。传代培养4具有130bp片段插入和131bp片段删除。

测定AFLP序型，其牵涉对甲基化不敏感的酶EcoRI和MseI及引物对组合的应用。第4轮传代培养周期的所有样品是单态的，而第4轮传代培养周期的甘油序型在多个基因座是多态的。

表2：提供了所使用的AFLP引物组合的详情和观察到的条带的相应数目。Suc-X，NT1B-蔗糖培养基中的单细胞；Gly-X，NT1B-甘油培养基中的单细胞；Cont-Suc，蔗糖中的对照JTNT1悬浮聚集体；Cont-Gly，甘油中的对照JTNT1悬浮聚集体

对一致性的分子遗传评估。在此研究中看到AFLP多态性(对于所使用的10个引物组合中的9个引物组合，第4轮传代培养周期的甘油培养单细胞悬浮液之中)。所有观察到的变异性属于使用EcoRI/MseI所产生的片段。与豌豆的叶(Smulders等1995)和组织培养再生物相比，先前已经对番茄胼胝体报道了组织培养过程中甲基化状态的提高(Cecchini等1992)。如此，为了进一步评估基于甲基化的变异，可进行用对甲基化敏感的PstI/MseI组合进行的进一步评估。

附录——实施例13

自烟草细胞悬浮液/胼胝体组织的CTAB DNA提取

1.称出约25mg冻干的组织至2ml Eppendorf管中。

2.将不锈钢珠子放入具有组织的管中，并在Geno-研磨机或涂料摇床(paintshaker)上摇动约1分钟。(Geno-研磨机设置在500击/分钟)。除去珠子，并温和地轻拍管以减少组织聚块。

3.添加1ml提取缓冲液，温和地轻拍管以减少组织聚块，并使得组织进入缓冲液中，于65℃温育同时温和地在其侧面混合达2小时。冷却至室温(约10分钟)。

提取缓冲液(250ml)

Tris-HCl    25ml

NaCl        29.2g

Na EDTA     12.5ml

CTAB        6.25g

PVP         3.75g

水          (添加直至终体积250ml)

4.将0.75ml 25∶24∶1酚/氯仿/异戊醇pH 8添加至提取缓冲液，并用手温和地摇晃5分钟。以10,000rpm离心5分钟以分离各相。小心地将水相转移入新管中。

5.使用24∶1氯仿/辛醇代替酚/氯仿/异戊醇混合物来重复步骤4。

6.以等体积将异丙醇添加至上清液，并于室温放置1小时。

7.以10,000rpm对管进行离心达10分钟，并倒掉上清液，同时小心地将沉淀物保持在管底中。

8.添加0.5ml 70％乙醇和RNA酶混合物以清洗DNA沉淀物，并以10,000rpm离心1分钟(1∶1000RNA酶/乙醇)。

9.小心地倒掉上清液，并仅用70％乙醇重复清洗。通过于室温放置3小时或对样品进行旋转蒸发达约5分钟来使沉淀物完全干燥。

10.一旦没有酒精液滴存在，则将沉淀物溶解于0.2ml已经预加温至65℃的1X Tris EDTA缓冲液中。于室温将样品放置过夜以充分重悬。

11.第二天早晨温和地摇动管以进行混合。在琼脂糖凝胶上运行样品以检查RNA的降解和存在，并进行定量。

实施例13参考文献：

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实施例14——烟草BY2单细胞的质体转化

为质体转化作准备的单细胞的启动

将4ml烟草BY2悬浮液(以7天周期维持的处于稳定期生长的)添加至由具有泡沫塞子的125mL摇瓶中所包含的26mL新鲜的培养基，所述培养基由培养基A[LS盐类(PhytoTechnology Laboratories，L689)、120g/L蔗糖、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、10mg/L盐酸硫胺素和20nM二苯基吡唑(DPP)]或培养基B[LS盐类、120g/L蔗糖、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、10mg/L盐酸硫胺素、2.5mg/L苄氨基嘌呤(BAP)和20nM DPP]构成。以125rpm的速度在黑暗中于28℃将烧瓶放置在旋转式摇床上达7天。

转化实验

通过用新鲜的培养基稀释BY2悬浮培养物(如上文所述的那样培养的)至OD₆₅₀为1.0来启动转化实验。对于每个转化靶物，将1.5ml经稀释的悬浮液移液至无菌滤纸上，所述无菌滤纸已经放置在真空过滤装置的顶部。将悬浮细胞均匀地穿过滤纸表面而沉积。将滤纸和细胞转移至轰击培养基[MS基础盐类、B5维生素、18.2g/l甘露醇、18.2g/L山梨醇、30g/L蔗糖、1mg/L BAP、0.1mg/L 1-萘乙酸(NAA)、8g/L TC琼脂(PhytoTechnology Laboratories，A175)]。

供单细胞质体转化用的质粒构建体

在此实施例中所使用的DNA构建体称为pDAB3969。构建体元件侧翼有来自烟草叶绿体基因组的16S trnI和trnA序列。两种基因aphA-6和nptII分别作为由Prrn加T7基因10和PpsbA启动子驱动的选择标志使用。T7基因10还驱动感兴趣的基因TurboGFP。

BY2单细胞的生物射弹轰击

轰击之前将细胞保持在轰击培养基上达4小时。使用Bio-RadPDS-1000/He投递系统来轰击制备好的靶物。制备金颗粒(0.4μm，Inbio GoldMelbourne，Australia)，并使用标准方法来将DNA沉淀在其表面上。

以1100psi对靶平板进行轰击，连同28英寸汞真空，和离阻止网(stoppingscreen)9cm的距离。然后将平板搁置(set aside)达单日回收期。然后将滤纸加组织转移至培养基C[LS盐类、120g/L蔗糖、170mg/L无水磷酸二氢钾，0.6mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L 2，4-D、8g/L TC琼脂和100mg/L卡那霉素]，并留在最初的选择平板上，直至出现抗性集落。在抗性集落生长成4-5mm直径时，将它们分离至含有凝胶培养基C的单独平板上，并进行扩大，直至它们大到足以进行取样以进行PCR分析。

结果和讨论

将BY2悬浮系培养于培养基A和培养基B中达7天。自培养基A中培养的细胞制备5块靶平板，并自培养基B中培养的细胞制备5块别的平板。设计这两种培养基以通过提高蔗糖含量、除去生长素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和在培养基B中通过添加细胞分裂素BAP来产生扩大的造粉体(1，2)。扩大的造粉体充当供生物射弹转化用的较大靶物。两种含有20nM DPP的培养基产生单细胞。经轰击的平板产生3个来自经培养基A处理的细胞的卡那霉素抗性集落和2个来自经培养基B处理的细胞的抗性集落。

对来自每个集落的样品取样以进行分子分析。使用DNasey方案来提取DNA，并通过使用下列引物组的PCR来分析等分试样。

  引物名称  引物序列  MAS394  TATGCTGCGTTCGGGAAGGATGAA 第2组  MAS395  GATTAAAAGAATAAACATCCGATG  MAS396  TTGCCTAAGAGAGGATGCATCGGA 第3组  MAS397  TTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGC  MAS398  TGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGG 第4组  MAS399  TTGGTGTAGCCGCCGTTGTTGATG  MAS400  TGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGC 第5组  MAS401  GGCTATGCCATCCTAAGGTGCTGC

经引物扩增的转化构建体区段。引物MAS401位于天然烟草质体DNA中trnA侧翼的末端之外83bp处，并证明进入质体基因组中的整合。

引物组2、3、4和5的PCR反应对所有的5种样品产生阳性反应。来自野生型(非转化的)BY2悬浮细胞或烟草植株对照的DNA没有产生任何条带。如此，PCR结果指明所有3种转基因的存在和进入质体基因组中的整合。