具有三个完整转录单元的质粒和用于诱导HIV免疫反应的免疫原性组合物

摘要

本发明提供一种DNA质粒，其包含：(a)第一转录单元，其含有编码第一多肽且以可操作方式与含有第一启动子和第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(b)第二转录单元，其含有编码第二多肽且以可操作方式与含有第二启动子和第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(c)第三转录单元，其含有编码第三多肽且以可操作方式与含有第三启动子和第三聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；且其中所述第一、所述第二和所述第三启动子各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一、所述第二和所述第三聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元。本发明进一步涉及包含两个、三个或四个质粒的组合且用于诱导HIV免疫反应的免疫原性组合物，其中每一质粒表达指定抗原，所述抗原可为单一抗原或者两个或三个抗原的融合体。

说明书

技术领域

本发明涉及可改善预防性与治疗性抗原免疫反应的质粒、免疫原性组合物和方法。

背景技术

使用基于DNA质粒的免疫原性组合物进行免疫是一种有力手段，其可用于形成预防或治疗感染性疾病的方法或治疗进行中疾病过程。质粒DNA免疫已在动物模型中广泛测试，其中已发现其可有效诱导针对多种感染因子和肿瘤抗原的细胞和体液免疫反应。参见Donnelly JJ等人，Ann.Rev.Immunol.；15：617-48(1997)；Iwasaki A等人，J Immunol 158(10)：4591-601(1997)；Wayne，C.L.和Bennett M.，Crit.Rev.Immunol.，18：449-484(1998)。

质粒DNA免疫的重要优势是可以允许有关转录后修饰、表达水平、适宜细胞内运输和抗原呈递的方式对基因进行克隆、修饰并将其置于潜在质粒DNA表达载体中。可用于DNA免疫的质粒DNA载体类似于报告基因或治疗基因递送中所采用的载体。基于DNA质粒的免疫使用受试者的细胞机制来产生外源蛋白并刺激受试者的免疫系统以产生针对所述蛋白抗原的免疫反应。此等质粒DNA载体一般包含真核转录调节元件，所述元件是在广泛宿主细胞范围内指导基因高水平表达的强病毒启动子/增强子元件和确保经表达mRNA适当终止的聚腺苷酸化序列。尽管，病毒调节元件有利于在质粒DNA载体中使用，但使用未经修饰的病毒载体表达有关基因会带来使用质粒DNA不会遇到的安全性和技术性问题。

然而，目前的质粒DNA设计限制了单靶标细胞中多个基因自一个载体骨架的表达。因此，为转移和表达多个基因，需要用分开的质粒共转染靶标细胞。在必须用多个质粒共转染细胞时，很难达成所有编码基因的最优化表达，尤其在所述质粒于活体内使用时如此。克服这些局限性并表达两个或两个以上基因的先前尝试包括如下各物的使用：病毒载体、来自前病毒DNA的多个选择性剪接的转录物、基因融合体、含有来自病毒的IRES序列(内部核糖体进入位点)的双顺反子载体和双表达质粒。参见Conry R.M等人，Gene Therapy.3(1)：67-74，(1996)；Chen TT等人，Journal of Immunology.153(10)：4775-87，(1994)；AyyavooV等人，AIDS.14(1)：1-9，(2000)；Amara R.R等人，Vaccine.20(15)：1949-55，(2002)；Singh G等人，Vaccine 20：1400-1411(2002)。

现有的质粒设计尚无法解决在人类免疫原性组合物中提供适用于表达两个以上独立开放阅读框的DNA质粒的难题。在双顺反子载体的情形中，在许多实例中，仅有在IRES上游转录的第一个基因可由质粒或逆转录病毒载体强表达。参见Sugimoto Y.等人，Hum.Gen.Ther.6：905-915(1995)；Mizoguchi H等人，Mol.Ther.1：376-382(2000)。另一方面，双表达盒已有较佳表现。例如，发现用一具有两个独立表达盒的单一质粒共同递送B7-1和人类癌胚抗原(CEA)的cDNA与分开的质粒相比可产生远优于后者的免疫反应。参见ConryR.M等人，Gene Therapy.3(1)：67-74，(1996)。然而，在此情形中，两个独立表达盒都包括由同源HCMV启动子和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列构成。质粒内存在同源序列会使质粒不适合用于DNA免疫原性组合物，原因在于质粒骨架中存在同源序列会增加重复序列之间重组的可能性并导致载体不稳定。

人们在设计用于人类免疫原性组合物的质粒DNA载体时遇到的另一限制涉及质粒的大小和组织。在将多个转录单元加入质粒时，会出现转录单元之间的干扰，例如空间位阻形式的干扰。细胞RNA转录复合物须能够结合多转录单元质粒上的多个位点、解开DNA并有效转录基因。出于若干原因(包括质粒不稳定性、质粒制造中的困难且最重要的是投予考虑因素)，简单地使质粒变大不一定是最佳解决办法。为设计改良之质粒DNA多转录单元载体，人们须考虑基因的放置、开放阅读框的间隔和转录方向、表达水平、制造容易性、安全性和免疫受试者所必需的载体最终剂量。

因此，对于可用来自复合病原体(如HIV)表达多个蛋白的创新性质粒DNA非病毒载体设计尚存在需求，其中需要针对多种蛋白的广泛免疫反应。此外，对可指导多个HIV基因在单一细胞中高水平表达的基于多价DNA的免疫原性组合物存在需求。

发明内容

在一实施例中，本发明提供一种DNA质粒，其包含：(a)一第一转录单元，其含有编码一第一多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(b)一第二转录单元，其含有编码一第二多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(c)一第三转录单元，其含有编码一第三多肽且以可操作方式与含有一第三启动子和一第三聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一、所述第二和所述第三启动子各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一、所述第二和所述第三聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元。在本发明的另一实施例中，所述第一、第二和第三多肽在真核细胞中表达。

在另一实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导针对所选抗原的免疫反应的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有：(a)一DNA质粒，其包含(i)一第一转录单元，其含有编码一第一多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(ii)一第二转录单元，其含有编码一第二多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(iii)一第三转录单元，其含有编码一第三多肽且以可操作方式与含有一第三启动子和一第三聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三启动子各自来源于不同的转录单元；其中所述第一、第二和第三聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元；和(b)至少一种医药上可接受的稀释剂、佐剂、载剂或转染促进剂。在本发明的一特定实施例中，所述转染促进剂是布比卡因(bupivacaine)。在本发明的另一实施例中，所述第一、第二和第三多肽在真核细胞中表达。

在本发明的某些实施例中，使用活体内电穿孔将所述免疫原性组合物投予给一哺乳动物。在一特定实施例中，电穿孔涉及用一场强在约25V/cm至约800V/cm范围内的电流电刺激肌肉。

在又一实施例中，本发明提供一种使一脊椎动物宿主对于所选抗原免疫的方法，其包括向所述脊椎动物宿主投予一免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有：(a)一DNA质粒，其包含(i)一第一转录单元，其含有编码一第一多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(ii)一第二转录单元，其含有编码一第二多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(iii)一第三转录单元，其含有编码一第三多肽且以可操作方式与含有一第三启动子和一第三聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三启动子各自来源于不同的转录单元；其中所述第一、第二和第三聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元；和(b)至少一种医药上可接受的稀释剂、佐剂、载剂或转染促进剂。在本发明的另一实施例中，所述第一、第二和第三多肽在真核细胞中表达。

在本发明的另一实施例中，所选抗原来源于由细菌、病毒、过敏原和肿瘤组成的群组。在一特定实施例中，所选抗原是病毒抗原，其来源于选自由下列组成的群组的病毒：人类免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、流感病毒、单纯性疱疹病毒、人巨细胞病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒和冠状病毒(SARS)。

在本发明的又一实施例中，所选抗原是细菌抗原，其来源于选自由下列组成的群组的细菌：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(典型和非典型二者)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉衣原体(Chlamydiapsittaci)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、耳炎差异球菌(Alloiococcus otiditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、沙门氏鼠伤寒菌(Salmonella typhimurium)、霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏杆菌(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholrae)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、禽结核分枝杆菌-胞内结核分枝杆菌复合体(Mycobacteriumavium-Mycobacterium intracellulare complex)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变型杆菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、溶血性巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)和鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)。

在本发明的一实施例中，所述脊椎动物宿主选自由哺乳动物、鸟类和鱼类组成的群组。在本发明的某一实施例中，所述脊椎动物宿主是一选自由人类、牛、羊、猪、马、犬和猫类组成的群组的哺乳动物。

在本发明的一实施例中，所述第一、第二和第三启动子在真核细胞中有活性。在本发明的其它一些实施例中，所述第一、第二和第三启动子选自由下列组成的群组：人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子、猿巨细胞病毒(SCMV)启动子、鼠巨细胞病毒(MCMV)启动子、单纯性疱疹病毒(HSV)潜伏相关启动子-1(LAP1)、猿病毒40启动子、人延伸因子1α启动子和人肌细胞特异性结蛋白启动子。

在本发明的某些实施例中，所述第一、第二和第三聚腺苷酸化信号选自由下列组成的群组：兔β球蛋白poly(A)信号、合成polyA、HSV胸苷激酶polyA、人α球蛋白polyA、SV40 polyA、人β球蛋白polyA、多瘤病毒polyA和牛生长激素polyA。

在本发明的一特定实施例中，所述第一转录单元自HIV的gag和pol基因的融合体表达一gag-pol融合蛋白。在本发明的一实施例中，所述HIV的gag和pol基因融合体或gag-pol基因融合体来源于HIV的HXB2分离株。

在本发明的某一实施例中，所述第二转录单元自HIV的包膜基因表达一包膜蛋白。在本发明的一特定实施例中，所述包膜基因来源于HIV的初级分离株6101。

在本发明的一具体实施例中，所述第三转录单元自HIV的nef、tat和vif(ntv)基因的融合体表达一nef、tat和vif(NTV)融合蛋白。在本发明的一特定实施例中，所述HIV的nef、tat和vif基因融合体或ntv基因融合体来源于HIV的NL4-3分离株。

在本发明的一具体实施例中，在一三转录单元质粒中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相反方向。在本发明的另一实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第三转录单元的转录方向呈相反方向。

在本发明的某一实施例中，本发明提供一种三转录单元质粒，其进一步包含一编码一选择标记且以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列。在一实施例中，所述选择标记选自由下列组成的群组：卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。在另一实施例中，所述选择标记的位置选自由间隔区1、间隔区2和间隔区3组成的群组。在一具体实施例中，所述选择标记的位置是间隔区2。

在本发明的另一实施例中，本发明提供一种三转录单元质粒，其进一步包含一细菌复制起始点。在另一实施例中，所述复制起始点的位置选自由间隔区1、间隔区2和间隔区3组成的群组。在一具体实施例中，所述选择标记的位置是间隔区3。在一特定实施例中，所述复制起始点是pUC复制起始点。

在本发明的一实施例中，本发明提供一种三转录单元质粒，其中所述质粒总长度小于约15000个碱基对。在本发明的另一实施例中，间隔区1小于约400个碱基对，间隔区2小于约1100个碱基对且间隔区3小于约1100个碱基对。

在一实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫反应的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag-pol融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含(i)一第一转录单元，其含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(ii)一第二转录单元，其含有编码一HIV包膜多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一和第二启动子各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一和第二聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相反方向；或其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相同方向，且所述第一和第二转录单元由一含至少1000个碱基对的间隔区隔开；和(c)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在本发明的一特定实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。在一特定实施例中，所述第一质粒上的启动子是所述人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子，所述第一质粒上的聚腺苷酸化信号是所述牛生长激素poly A聚腺苷酸化信号且所述第一DNA质粒编码一HIV gag-pol融合多肽，其中所述HIV的gag和pol基因融合体或gag-pol基因融合体来源于HIV的HXB2分离株。在某一实施例中，所述第二质粒上的第一启动子是所述人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子，且所述第二质粒上的第一聚腺苷酸化信号是所述SV40 poly A聚腺苷酸化信号，且所述多肽是由来源于HIV的NI4-3分离株的nef、tat和vif(ntv)基因的融合体表达的nef、tat和vif(NTV)融合蛋白。在一特定实施例中，所述第二质粒上的第二启动子是猿巨细胞病毒(SCMV)启动子，所述第二质粒上的第二聚腺苷酸化信号是牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号，编码的包膜多肽来源于HIV的初级分离株6101。

在又一实施例中，本发明提供一种使一脊椎动物宿主对于所选抗原免疫的方法，其包括向所述脊椎动物宿主投予一免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag-pol融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含(i)一第一转录单元，其含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(ii)一第二转录单元，其含有编码一HIV包膜多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一和第二启动子各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一和第二聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相反方向；或其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相同方向，且所述第一和第二转录单元由一含至少1000个碱基对的间隔区隔开；和(c)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在本发明的一特定实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。在一特定实施例中，所述第一质粒上的启动子是所述人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子，所述第一质粒上的聚腺苷酸化信号是所述牛生长激素poly A聚腺苷酸化信号且所述第一DNA质粒编码一HIV gag-pol融合多肽，其中所述HIV的gag和pol基因融合体或gag-pol基因融合体来源于HIV的HXB2分离株。在某一实施例中，所述第二质粒上的第一启动子是所述人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子，且所述第二质粒上的第一聚腺苷酸化信号是所述SV40 poly A聚腺苷酸化信号，且所述多肽是由来源于HIV的NL4-3分离株的nef、tat和vif(ntv)基因的融合体表达的nef、tat和vif(NTV)融合蛋白。在一特定实施例中，所述第二质粒上的第二启动子是猿巨细胞病毒(SCMV)启动子，所述第二质粒上的第二聚腺苷酸化信号是牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号，编码的包膜多肽来源于HIV的初级分离株6101。在一实施例中，使用活体内电穿孔将所述免疫原性组合物投予给一哺乳动物。在一特定实施例中，所述电穿孔涉及用一场强在约25 V/cm至约800V/cm范围内的电流电刺激肌肉。在一实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。

在一实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫反应的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含一含有编码一HIV pol多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(c)一第三DNA质粒，其包含(i)一第一转录单元，其含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(ii)

一第二转录单元，其含有编码一HIV包膜多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一和第二启动子各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一和第二聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相反方向；或其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相同方向且所述第一和第二转录单元由一含至少1000个碱基对的间隔区隔开；和(d)一第四DNA质粒，其含有编码一佐剂多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；和(e)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。

在另一实施例中，本发明提供一种使一脊椎动物宿主对于所选抗原免疫的方法，其包括向所述脊椎动物宿主投予一免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含一含有编码一HIV pol多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(c)一第三DNA质粒，其包含(i)一第一转录单元，其含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽且以可操作方式与含有一第一启动子和一第一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；(ii)一第二转录单元，其含有编码一HIV包膜多肽且以可操作方式与含有一第二启动子和一第二聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列；其中所述第一和第二启动子各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一和第二聚腺苷酸化信号各自来源于不同的转录单元；且其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相反方向；或其中所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的转录方向呈相同方向且所述第一和第二转录单元由一含至少1000个碱基对的间隔区隔开；和(d)一第四DNA质粒，其含有编码一佐剂多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；和(e)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在一特定实施例中，所述电穿孔涉及用一场强在约25V/cm至约800V/cm范围内的电流电刺激肌肉。在一实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。

在一实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导HIV免疫反应的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV包膜多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag-pol融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(c)一第三DNA质粒，其包含一含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(d)一第四DNA质粒，其含有编码一佐剂多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；和(e)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在一特定实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。在另一实施例中，含有布比卡因的所述免疫原性组合物结合电穿孔法投予。在一具体实施例中，所述HIV包膜、gag-pol、nef-tat-vif和佐剂多肽在真核细胞中表达。在一实施例中，所述第一、第二、第三和第四质粒含有在真核细胞中有活性的启动子。

在一实施例中，本发明提供一种使一脊椎动物宿主对于所选抗原免疫的方法，其包括向所述脊椎动物宿主投予一免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV包膜多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag-pol融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(c)一第三DNA质粒，其包含一含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(d)一第四DNA质粒，其含有编码一佐剂多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；和(e)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在一特定实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。在另一实施例中，含有布比卡因的所述免疫原性组合物结合电穿孔法投予。在一具体实施例中，所述HIV包膜、gag-pol、nef-tat-vif和佐剂多肽在真核细胞中表达。在一实施例中，所述第一、第二、第三和第四质粒含有在真核细胞中有活性的启动子。

在本发明的某些实施例中，所述第一、第二、第三和第四质粒包含选自由下列组成的群组的启动子：人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子、猿巨细胞病毒(SCMV)启动子、鼠巨细胞病毒(MCMV)启动子、单纯性疱疹病毒(HSV)潜伏相关启动子-1(LAP1)、猿病毒40启动子、人延伸因子1α启动子和人肌细胞特异性结蛋白启动子。在本发明的某些实施例中，所述第一、第二、第三和第四质粒包含选自由下列组成的群组的聚腺苷酸化信号：兔β球蛋白poly(A)信号、合成polyA、HSV胸苷激酶polyA、人α球蛋白polyA、SV40 polyA、人β球蛋白polyA、多瘤病毒polyA和牛生长激素polyA。

在一特定实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导HIV免疫反应的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含如上所述的四个质粒，且其中每一质粒进一步包含一选自由卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因和氯霉素抗性基因组成的群组的选择标记。在另一实施例中，每一质粒进一步包含一细菌复制起始点。在又一实施例中，所述复制起始点是pUC复制起始点。

本发明亦提供一种免疫原性组合物，且其中第四DNA质粒包含一一级转录单元和一二级转录单元，其含有编码两个佐剂多肽且以可操作方式与调节元件上的两个核苷酸序列连接。在一实施例中，所述一级转录单元包含一编码一IL-12 p35多肽且以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列。在另一实施例中，所述二级转录单元包含一编码一IL-12 p40多肽且以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列。

在另一实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导HIV免疫反应的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV包膜多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(c)一第三DNA质粒，其包含一含有编码一HIV pol多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(d)一第四DNA质粒，其含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(e)一第五DNA质粒，其含有编码一佐剂多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；和(f)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在一具体实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。在另一实施例中，含有布比卡因的所述免疫原性组合物结合电穿孔法投予。在一实施例中，所述HIV包膜、gag、pol、nef-tat-vif和佐剂多肽在真核细胞中表达。

在另一实施例中，本发明提供一种使一脊椎动物宿主对于所选抗原免疫的方法，其包括向所述脊椎动物宿主投予一免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其包含一含有编码一HIV包膜多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(b)一第二DNA质粒，其包含一含有编码一HIV gag多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(c)一第三DNA质粒，其包含一含有编码一HIV pol多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(d)一第四DNA质粒，其含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元，其中所述单一转录单元以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；(e)一第五DNA质粒，其含有编码一佐剂多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接；和(f)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在一具体实施例中，所述转染促进剂是布比卡因。在另一实施例中，含有布比卡因的所述免疫原性组合物结合电穿孔法投予。

在本发明的一实施例中，所述第一、第二、第三、第四和第五质粒含有在真核细胞中有活性的启动子。在某些实施例中，所述第一、第二、第三、第四和第五质粒包含选自由下列组成的群组的启动子：人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子、猿巨细胞病毒(SCMV)启动子、鼠巨细胞病毒(MCMV)启动子和单纯性疱疹病毒(HSV)潜伏相关启动子-1(LAP1)、猿病毒40启动子、人延伸因子1α启动子和人肌细胞特异性结蛋白启动子。在本发明的其它一些实施例中，所述第一、第二、第三和第四质粒包含选自由下列组成的群组的聚腺苷酸化信号：兔β球蛋白poly(A)信号、合成poly A、HSV胸苷激酶poly A、人α球蛋白polyA、SV40 polyA、人β球蛋白polyA、多瘤病毒polyA和牛生长激素polyA。

在一特定实施例中，本发明提供一种用于在一脊椎动物宿主体内诱导HIV免疫反应的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含如上所述的五个质粒，且其中每一质粒进一步包含一选自由卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因和氯霉素抗性基因组成的群组的选择标记。在另一实施例中，每一质粒进一步包含一细菌复制起始点且其中所述复制起始点是pUC复制起始点。

本发明亦提供一种免疫原性组合物，且其中所述第五DNA质粒包含一一级转录单元和一二级转录单元，其包含编码两个佐剂多肽且以可操作方式与调节元件连接的两个核苷酸序列。在一实施例中，所述一级转录单元包含一编码一IL-12 p35多肽且以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列。在另一实施例中，所述二级转录单元包含一编码一IL-12 p40多肽且以可操作方式与含有一启动子和一聚腺苷酸化信号的调节元件连接的核苷酸序列。

本发明的其它方面和实施例揭示于下文具体实施方式中。

附图说明

图1显示经装配可在真核细胞中自三个分开的开放阅读框表达六个HIV基因或基因构造的说明性三联转录单元DNA质粒的环形示意图。图1显示同一质粒的线性但更详细的示意图。使用以下缩写：SCMV：猿巨细胞病毒启动子；HCMV：人巨细胞病毒启动子；BGHpolyA：牛生长激素聚腺苷酸化信号；kan：卡那霉素抗性标记基因；HSVlap 1：单纯性疱疹病毒潜伏相关启动子1；SV40 polyA：猿病毒40聚腺苷酸化信号；SV40sd/sa：猿病毒40剪接供体和受体；gag-pol：HIV gag-pol融合体；ntv：HIV nef-tat-vif融合体；env：HIV包膜。

图2显示HIV gag在293细胞中的表达。用2μg指定的质粒DNA表达载体转染293细胞。转染后48小时，通过西方(Western)印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

转染的质粒

102：HCMV-gag

201：HCMV-pol、SCMV-gag

203：HCMV-gag/pol/nef/tat/vif、SCMV-env

302：SCMV-gag/pol、HCMV-、Lap1-nef/tat/vif

204：HCMV-gag/pol、SCMV-env

303：SCMV-gag/pol、HCMV-env、Lap1-nef/tat/vif

001：没有插入序列的对照质粒

图3显示HIV pol在293细胞中的表达。用2μg指定的质粒DNA表达载体转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

转染的质粒

103：HCMV-pol

201：HCMV-pol、SCMV-gag

302：SCMV-gag/pol、HCMV-、Lap1-nef/tat/vif

203：HCMV-gag/pol/nef/tat/vif、SCMV-env

204：HCMV-gag/pol、SCMV-env

303：SCMV-gag/pol、HCMV-env、Lap1-nef/tat/vif

001：没有插入序列的对照质粒

图4显示HIVnef/tat/vif(ntv)在293细胞中的表达。用2μg指定的质粒DNA表达载体转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

转染的质粒

104：HCMV-ntv

105：Lap1-ntv

202：HCMV-ntv、SCMV-env

203：HCMV-gag/pol/nef/tat/vif、SCMV-env

302：SCMV-gag/pol、HCMV-、Lap1-nef/tat/vif

303：SCMV-gag/pol、HCMV-env、Lapl-nef/tat/vif

001：没有插入序列的对照质粒

图5显示HIV env在293细胞中的表达。用2μg指定的质粒DNA表达载体转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

转染的质粒

101：HCMV-env

202：HCMV-ntv、SCMV-env

203：HCMV-gag/pol/nef/tat/vif、SCMV-env

204：HCMV-gag/pol、SCMV-env

303：SCMV-gag/pol、HCMV-env、Lap1-nef/tat/vfi

001：没有插入序列的对照质粒

图6显示HIV gag在293细胞中的表达。用1μg指定的质粒DNA组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道  转染的质粒组合

1     301(gag/pol)+101(env)+104(ntv)

2     201(gag、pol)+202(env、ntv)

3     203(gag/pol/ntv、env)

4     303(gag/pol、env、ntv)

5     101(env)+102(gag)+103(pol)+104(ntv)

6     001(对照)

图7显示HIV env在293细胞中的表达。用1μg指定的质粒DNA组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道  转染的质粒组合

1     152(gag/pol)+101(env)+104(ntv)

2     201(gag、pol)+202(env，ntv)

3     203(gag/pol/ntv、env)

4     303(gag/pol、env、env)

5    101(env)+102(gag)+103(pol)+104(ntv)

6    001(对照)

图8显示HIV ntv在293细胞中的表达。用1μg指定的质粒DNA组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道  转染的质粒组合

1     152(gag/pol)+101(env)+104(ntv)

2     201(gag、pol)+202(env，ntv)

3     203(gag/po1/ntv、env)

4     303(gag/pol、env、env)

5     101(env)+102(gag)+103(pol)+104(ntv)

6     001(对照)

图9显示HIV pol在293细胞中的表达。用指定的质粒DNA浓度和组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道    转染的质粒组合              转染的质粒浓度(微克)

1    001(对照)                      2

2    201(gag、pol)+202(ntv、env)    1+1

3    204(gag/pol、env)+104(ntv)     1+1

4    203(gag/pol/ntv、env)          2

5    302(gag/pol、ntv)+101(env)     1+1

6    303(gag/pol、env、ntv)         2

图10显示HIV gag在293细胞中的表达。用指定的质粒DNA浓度和组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道 转染的质粒组合                 转染的质粒浓度(微克)

1    001(对照)                      2

2    201(gag、pol)+202(ntv、env)    1+1

3    204(gag/pol、env)+104(ntv)     1+1

4    203(gag/pol/ntv、env)          2

5    302(gag/pol、ntv)+101(env)     1+1

6    303(gag/pol、env、ntv)         2

图11显示HIV env在293细胞中的表达。用指定的质粒DNA浓度和组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道    转染的质粒组合    转染的质粒浓度(微克)

1    001(对照)                     2

2    201(gag、pol)+202(ntv、env)   1+1

3    204(gag/pol、env)+104(ntv)    1+1

4    203(gag/pol/ntv、env)         2

5    302(gag/pol、ntv)+101(env)    1+1

6    303(gag/pol、env、ntv)        2

图12显示HIV ntv在293细胞中的表达。用指定的质粒DNA浓度和组合转染293细胞。转染后48小时，通过西方印迹显现细胞结合型HIV蛋白。用于特定质粒的启动子和开放阅读框示于下方：

泳道    转染的质粒组合    转染的质粒浓度(微克)

1       001(对照)                     2

2       201(gag、pol)+202(ntv、env)   1+1

3       204(gag/pol、env)+104(ntv)    1+1

4       203(gag/pol/ntv、env)         2

5       302(gag/pol、ntv)+101(env)    1+1

6       303(gag/pol、env、ntv)        2

具体实施方式

基于DNA的免疫原性组合物为包括投予蛋白质抗原和佐剂的传统免疫原性组合物提供了一种替代物。取而代之，基于DNA的免疫原性组合物涉及向受试者组织内引入编码抗原的DNA或抗原，其中所述抗原由受试者的组织细胞表达。如本文所用，将所述免疫原性组合物称作“基于DNA的免疫原性组合物”或“基于核酸的免疫原性组合物”。存在的一个问题是，在需要多个基因产生保护性免疫反应时不得不使用多个质粒来逐个表达所述基因。此增加了制造和调节负担。本发明的实施例用能够在同一细胞中表达三个独立开放阅读框的质粒设计提供了解决此难题的方法。在本发明的某些实施例中，将基因融合以制备多聚蛋白，且以此方式可由一单一质粒表达许多更多的蛋白质。在一实施例中，由所述单一质粒表达六个蛋白质。

有多种因素可影响抗原基因的表达及/或基于DNA的免疫原性组合物的免疫原性。所述因素的实例包括质粒载体的构建、质粒载体的大小、用于驱动抗原基因表达的启动子的选择、质粒上转录单元的数目和大小、RNA转录物的稳定性、质粒中转录单元的取向、免疫的重现性和质粒中所插入基因的稳定性。本发明的实施例提供可最优化许多所述关键参数的质粒设计。

具有多个转录单元的质粒DNA载体的设计和最优化是关键所在。为改善经免疫受试者所接受的抗原的实际剂量，质粒大小须最小化，而蛋白质产物的数目和所产生的蛋白量应最大化。为平衡这些考虑因素，人们必须考虑基因的放置；转录单元的间隔；开放阅读框的转录方向；表达水平；启动子大小、取向和强度；增强子大小、放置、取向和强度；开放阅读框大小和组织；制造的容易性；质粒稳定性；安全性；和免疫受试者所必需的载体最终剂量。

利用DNA质粒进行免疫的重要考虑因素是质粒的制造。鉴于潜在的安全性考虑，制造方法和最终产物须经历高密度的仔细检查且受到多方面的质量控制。所述结果反映在用于所述程序的高成本上。因此，需要多个质粒的任何DNA免疫会成比例地更昂贵且有效性可能会更低。因此，在其中需控制制造成本的本发明某些实施例中，所提供的免疫原性组合物在每次应用中包含一适宜在实际上任何疾病过程中诱导免疫反应的单一质粒。

在一些情形中，尽管制造成本较高，使用各自含有一单一转录单元或两个转录单元的质粒组合会产生更有效的免疫原性组合物。在这些情形中，重要的是设计免疫原性组合物以使其具有最优化数目的编码诱导一有效免疫反应所必需的所有基因的质粒。代替各自含有一单一转录单元的多个质粒而改为使用含有表达所有必需基因的三转录单元的质粒时，须与特定抗原的免疫原性达成平衡。单一转录单元质粒组合方法的一优点是各个基因可各自由同一强启动子驱动。例如，可在每一质粒中使用HCMV启动子，而非每一质粒仅一次，通常情况是呈三转录单元质粒形式。与之相比，在使用三转录质粒时，HCMV启动子仅可使用一次以防止内部同源重组和质粒不稳定性的可能性。例如，在具有两个抗原表达质粒的组合物中，其中一个质粒具有一个转录单元且第二个具有两个转录单元。在此一组合物中，可使用HCMV启动子来驱动单一抗原或融合蛋白在具有一个转录单元的质粒中表达，且也可用其驱动多个蛋白或融合蛋白中之一在具有两个转录单元的质粒中表达。

在其中病原体是人免疫缺陷症病毒(HIV)的情形中，所述免疫原性组合物具有四个单一转录单元质粒，所述质粒包含分别编码一HIV包膜多肽、一HIVgag-pol融合多肽、一HIV nef-tat-vif融合多肽和一佐剂多肽的核苷酸序列。需要时，可使用包含分别编码一HIV gag多肽和一HIV pol融合多肽的核苷酸序列的两个单一转录单元质粒，以代替含有一编码一HIV gag-pol融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元质粒(从而在这个方面使用五个质粒)。

一般而言，根据其来源，启动子在组织特异性和起始mRNA合成的效率方面有所不同[Xiang等人，Virology，209：564-579(1994)；Chapman等人，Nude.Acids.Res.，19：3979-3986(1991)]。迄今为止，哺乳动物系统中大部分基于DNA的免疫原性组合物都依赖于来源于巨细胞病毒(CMV)的病毒启动子。CMV可来源于人类或猿。这些启动子在多种哺乳动物种类中于肌肉和皮肤免疫方面都具有良好功效。已知可影响由DNA免疫引发的免疫反应的另一因素是DNA递送方法；非经肠途径会产生低速率的基因转移并产生基因表达的明显变化性。参见Montgomery等人，DNA Cell Bio.，12：777-783(1993)。使用基因枪进行的高速率质粒接种增强了小鼠的免疫反应，可能的原因在于效率更高的DNA转染和树突细胞的更有效的抗原呈递。参见Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：11478-11482(1993B)；Eisenbraun等人，DNA Cell Biol.，12：791-797(1993)。也可通过其它业内已知方法(例如，转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(脂质体融合)或DNA载体转运体)将含有本发明的基于核酸的免疫原性组合物的载体引入期望宿主中。例如参见，Wu等人，J.Biol.Chem.267：963-967(1992)；Wu和Wu，J.Biol.Chem.263：14621-14624(1988)；Hartmut等人，1990年3月15日申请的加拿大专利申请案第2,012,311号。

因此，本发明涉及用于基因免疫脊椎动物(例如哺乳动物、鸟类和鱼类)的质粒、免疫原性组合物和方法。本发明的质粒、免疫原性组合物和方法可特别用于哺乳动物受试者，包括人类、牛、羊、猪、马、犬和猫类。所述质粒、免疫原性组合物和方法详细阐述于下文并参阅所引用的以引用方式并入本文的资料以提供所属领域的技术人员已知的细节。

A.DNA质粒、载体、构造、免疫原性组合物

术语质粒、构造和载体贯穿本说明书使用。本文所用术语“质粒”是指一环形、超螺旋DNA分子，其中装配入编码调节序列、开放阅读框、克隆位点、终止密码子、间隔区或就结构或功能区加以所选的其它序列的各种核酸分子并用作在一脊椎动物宿主体内表达基因的载体。此外，本文所用“质粒”能够在细菌菌株中复制。本文所用术语“构造”是指具有指定安排的基因和调节元件的特定载体或质粒。核酸序列可为“外源”序列(其意指所述核酸序列对于其中将引入载体的细胞而言是外源的)、“异源”序列(其意指所述核酸序列来自不同的遗传来源)或“同源”序列(其意指所述序列在结构上与细胞中的一序列有关但位于宿主细胞核酸内一般不会找到所述序列的位置)。所属领域的技术人员会清楚地了解如何构建载体或通过标准重组技术修饰本发明的质粒，所述技术阐述于(例如参见)Sambrook等人，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spnng Harbor Laboratory，New York，(1989)及其中在(例如)第3.18-3.26页和第16.17-16.27页所引用的参考文献和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，NewYork(1995)，二者以引用方式并入本文中。

术语“载体”用来指载体核酸分子，其中可插入编码一或多个抗原的指定核酸分子以将其导入其中可表达所述核酸分子的细胞中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。术语“表达载体”是指含有编码至少一部分能够被转录的基因产物的核酸序列的载体。在一些情形中，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情形中，这些序列未被翻译，例如，在产生经表达的干扰RNA(eiRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、反义分子或核糖体的情形中。表达载体可包含多种“控制序列”，所述“控制序列”是指以可操作方式连接的编码序列在特定宿主生物体体内转录且可能为翻译所必需的核酸序列。除支配转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可包括也行使其它功能且阐述于下文的核酸序列。

术语“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，其意指多种核苷酸(即包含与一磷酸根基和一可替换的碱基连接的糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子，所述碱基可为经取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或经取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。本文所用术语是指寡核苷酸以及寡脱氧核苷酸。所述术语也可包括多核苷(即减去磷酸根的多核苷酸)和任何其它含有聚合物的有机碱基。核酸分子可由现有的核酸来源(例如基因组或cDNA)获得，但可以合成方式制备(例如通过寡核苷酸合成制备)。

本文所用短语“各自来源于不同的转录单元”意指，每一具有类似功能的调节控制元件(例如启动子)全部具有不同来源且彼此不同源，达到此一程度以使在质粒中不会出现因重组造成的遗传不稳定性。参见Herrera等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.279：548-551(2000)。

本发明的免疫原性组合物包含一三联转录单元DNA质粒，所述质粒包含编码至少三个期望对其有免疫反应的所选抗原的DNA序列。在所述质粒中，所选抗原处于指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调节序列的控制下。本发明的免疫原性组合物也包含编码所选抗原的质粒的组合。所述组合可由编码额外所选抗原的两个、三个或四个质粒构成。在所述组合内的任何特定质粒上可存在一个、两个或三个转录单元。此外，可将编码佐剂多肽的额外质粒纳入本发明的免疫原性组合物中。

用于本发明的非病毒质粒载体包含经分离和经纯化的DNA序列，所述DNA序列包含编码所选免疫原和抗原的DNA序列。编码靶标抗原的DNA分子可来源于病毒或非病毒来源，例如已经设计可编码外源或异源核酸序列的细菌种类或肿瘤抗原。所述质粒或载体可包含来自病毒或噬菌体的序列。多种非病毒载体为业内已知且可包括(但不限于)质粒、细菌载体、噬菌体载体、“裸露”DNA、用阳离子脂质或聚合物浓缩的DNA以及用其它转染促进剂(例如局部麻醉剂(例如布比卡因))调配的DNA，如下文所述。

本发明质粒的组件可自现有载体获得。细菌载体的实例包括(但不限于)尤其来源于卡介苗(bacille Calmette Guérin，BCG)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏杆菌、大肠杆菌和李斯特菌(Listeria)的序列。用于获得组件的适宜质粒载体包括(例如)pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18和pBR328.

其它组件可自诱导型表达载体获得。适宜的诱导型大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，Gene，69：301-315(1988))、阿拉伯糖表达载体(例如，pBAD18，Guzman等人，J.Bacteriol.，177：4121-4130(1995))和pETIId(Studier等人，Methods in Enzymology，185：60-89(1990))。由pTrc载体表达靶标基因依赖于由杂合体trp-lac融合启动子控制的宿主RNA聚合酶转录。由pETIId载体表达靶标基因依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶T7gnI调节的T7 gn10-lac融合启动子控制的转录。所述病毒聚合酶由来自携带受lacUV5启动子转录控制的T7 gn1基因的固有原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)提供。所述pBAD系统依赖于由araC基因调节的诱导型阿拉伯糖启动子。可在阿拉伯糖存在下诱导所述启动子。

调节组件可自受外源提供的化合物调节的诱导型启动子获得，所述启动子包括锌诱导型羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、四环素诱导型系统(Gossen等人，Science 268：1766-1769(1995))和雷帕霉素诱导型系统(Magari等人，J din Invest，100：2865-2872(1997))。

真核细胞中的转录控制信号由启动子和增强子元件组成。本文所用“启动子”和“增强子”是指与参与转录的蛋白质发生特异性相互作用的DNA序列。参见Maniatis，T.等人，Science 236：1237(1987)。如上所述，可将5′-非翻译区与启动子和增强子组合以增强所选抗原的表达。驱动抗原在期望哺乳动物或脊椎动物受试者体内表达的启动子、增强子和其它调节序列可以类似方式选自已知可用于所述目的的启动子的广泛列表中。多种所述启动子在下文揭示。在下文所述的免疫原性DNA质粒组合物的一实施例中，有用启动子是人巨细胞病毒(HCMV)启动子/增强子(阐述于(例如)美国专利第5,158,062号和第5,385,839号中，二者以引用方式并入本文中)、人类疱疹病毒潜伏相关启动子1和2(HSVLap1和HSVLap2：有时称作“潜伏活性启动子1和2”)和猿巨细胞病毒(SCMV)启动子增强子。参见Goins W.F等人，J.Virology 68：2239-2252(1994)；Soares，K.J.等人，Virology70：5384-5394；Goins W.F等人，J.Virology 73：519-532(1999)。鼠巨细胞病毒(MCMV)启动子也适用。

其它有用转录控制元件包括转录后控制元件，例如组成型转运增强子(CTE)或CTE样元件，例如RNA转运元件(RTE)，其可帮助将未经剪接或部分剪接的RNA转运至细胞质。参见颁予Hammarskjold等人的美国专利第5,585,263号和Zolotukhin等人，J.Virol.68：944-7952(1994))。CTE或RTE是合意者，原因在于二者已显示可改善表达，而且许多基因都需要存在转录后控制元件。存在若干类型的CTE和CTE样元件，其可利用不同途径行使功能。参见Tabernero等人，J.Virol.71：95-101(1997)。也可参见国际申请案WO 99/61596，其阐述了一种能够代替CTE的新型转录后控制元件。

基因表达也可通过纳入在支持mRNA累积、增加mRNA稳定性水平上或通过促进核糖体进入来行使功能的多核苷酸序列来增强，所有所述机制都可产生更高的翻译水平。在本发明的某些特定实施例中，可将某些5′非翻译区和内含子与启动子和增强子组合已产生能够驱动更高基因表达水平的复合或嵌合启动子。

可用于增强基因表达的5′非翻译区的实例包括腺病毒三联先导序列(Adtp)，可将其插入启动子下游以通过增强翻译来增加基因或转基因的表达，同时不会改变所述启动子的特异性。参见W.Sheay等人，Biotechniques 15(5)：856-62(1993)。猩猩和小鼠延伸因子1α(EF-1a)mRNA的5′UTR包含已知可通过增加RNA转录及/或RNA稳定性来增强基因表达的内含子。参见S.Y.Kim等人，J Biotechnol.14；93(2)：183-7(1993)。编码真核细胞起始因子4g(eIF4g)的mRNA的5′-UTR特征为存在推定的内部核糖体进入位点(IRES)且展现出强启动子活性。参见B.Han B.和J.T.Zhang Mol Cell Biol 22(21)：7372-84(2002)。此外，人类热激蛋白70(Hsp70)mRNA的5′UTR包含一可使正常细胞培养条件下mRNA翻译效率提高一个数量级的元件。参见S.Vivinus等人，Eur J Biochem.268(7)：1908-17(2001)。NF-κB抑制因子的5′UTR可担当一有效IRES且还可在单顺反子mRNA范围内作为翻译增强子行使功能。参见A.Oumard等人，Mol Cell Biol.20(8)：2755-9(2000)。在CAP与起始密码子之间联合并加入时，SV40 5′UTR和人类T细胞白血病病毒(HTLV)1型长末端重复(SUR)序列的R区可能通过mRNA稳定作用来增加翻译效率。参见Y.Takebe等人，Mol Cell Biol.8(1)：466-472)(1988)。

在本发明的某些特定实施例中，可纳入本发明核酸分子、DNA质粒或载体中的调节序列包括(但不限于)启动子序列、增强子序列、5′非翻译区序列、内含子、CTE、RTE、聚腺苷酸化序列、剪接供体序列和剪接受体序列、分别位于待翻译基因的起始端和末端的转录起始和终止位点、用于在已转录区中进行翻译的核糖体结合位点、抗原决定部位标签、核定位序列、内部核糖体进入位点(iRES)元件、Goldberg-Hogness“TATA”元件、限制酶切位点、选择标记及诸如此类。增强子序列包括(例如)SV40 DNA的72 bp串联重复或逆转录病毒长末端重复序列或LTR等，且可用其来增加转录效率。参见Wasylyk等人，NucleicAcid Res.12：5589-5608(1984)。

用于DNA质粒的这些其它组件(包括(例如)复制起始点、聚腺苷酸化序列(例如，牛生长激素(BGH)polyA、猿病毒40(SV40)polyA)、药物抗性标记(例如，卡那霉素抗性)及诸如此类)也可选自广泛已知的序列，包括阐述于实例和下文明确指出的序列。

各个启动子和其它常见质粒元件的选择是习用方法且许多所述序列可获得，使用其可设计用于本发明的质粒。例如参见，Sambrook等人，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，(1989)及其中在(例如)第3.18-3.26页和第16.17-16.27页的所引用的参考文献和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1989)。可用于本发明的质粒的所有组件可容易地由所属领域的技术人员从业内已知材料中选择且可自制药业购得。

可表达抗原或多肽的适宜基因的实例在下文论述中加以鉴别。在本文的质粒和免疫原性组合物的一实施例中，所选抗原是HIV-1抗原，包括由gag、pol、env、nef vpr、vpu、vif和tat基因表达的抗原。在一实施例中，可通过(例如)适合预定宿主的密码子选择和去除任何抑制序列来最优化DNA质粒的编码和非编码序列与其它组件，也在下文有关抗原制备部分加以阐述。

根据本发明的实施例，组合物包含一表达至少三个所选抗原的质粒。或者，所述质粒组合物也包含一含有编码至少三个拷贝的相同感兴趣所选抗原或多肽的DNA序列的DNA质粒。在本发明的一实施例中，组合物可包含一自多个开放阅读框表达多个所选抗原的质粒。在另一实施例中，所述质粒组合物包含一含有编码多个拷贝的编码多个所选抗原的类似开放阅读框的DNA序列(例如来自不同进化枝的多个env基因)的DNA质粒。

在本发明的一特定实施例中，使用各自表达一单一抗原的组合质粒可产生更有效的免疫原性组合物。例如，在一实施例中，本发明提供一种免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含各自编码一HIV免疫原或一佐剂的四个质粒。一个所述特定免疫原性组合物包含下列四个质粒的组合：(a)一第一DNA质粒，其具有一含有编码一HIV包膜多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(b)一第二DNA质粒，其具有一含有编码一HIV gag-pol融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(c)一第三DNA质粒，其具有一含有编码一HIVnef-tat-vif融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(d)一第四DNA质粒，其具有一编码一佐剂多肽的核苷酸序列；和(e)至少一种医药上可接受的稀释剂、载剂或转染促进剂。在一具体实施例中，驱动每一所述HIV基因表达的启动子是HCMV启动子且用于每一所述HIV基因的poly A序列是牛生长激素poly A。

在本发明的一具体实施例中，其中使用各自表达一单一抗原的质粒组合是合乎需要的，其会有利于使用更多个含有更多编码单独多肽的单独基因和更少编码融合多肽的融合基因的质粒。例如，在一实施例中，本发明提供一种免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含各自编码一HIV免疫原或一佐剂的五个质粒。在本实施例中，所述免疫原性组合物包含：(a)一第一DNA质粒，其具有一含有编码一HIV包膜多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(b)一第二DNA质粒，其具有一含有编码一HIV gag多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(c)一第三DNA质粒，其具有一含有编码一HIV pol多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(d)一第四DNA质粒，其具有一含有编码一HIV nef-tat-vif融合多肽的核苷酸序列的单一转录单元；(e)一第五DNA质粒，其具有编码一佐剂多肽的核苷酸序列。在一具体实施例中，驱动每一所述HIV基因表达的启动子是HCMV启动子且用于每一所述HIV基因的poly A序列是牛生长激素poly A。

在又一实施例中，所述DNA质粒和免疫原性组合物可进一步包含作为单DNA质粒组件或作为包含抗原的DNA质粒一部分的编码一期望细胞因子、淋巴因子或其它基因佐剂的核苷酸序列。下文提供有关用于其的核酸序列可获得的适宜佐剂的说明。在例示于本发明的实施例中，用于同本发明的DNA质粒组合物一起投予的期望细胞因子是白介素-12。

所述DNA质粒组合物可存于医药上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂(例如下文所述者)中投予。尽管所述组合物可藉由任何所选投予途径投予，但在一实施例中，期望的投予方法是下文所述经肌内共同投予包含所述质粒分子与作为转染促进剂的布比卡因的组合物。

B.质粒中元件的物理排列

设计脊椎动物免疫原性组合物的现实考虑是在免疫受试者时可有效投予的DNA量。在考虑剂量时，限制质粒总长而同时使所述质粒中完整转录单元数目最大化可为形成质粒DNA设计提供一种策略。最小化质粒大小和最大化表达的基因数目的优点是每微克经注射DNA所递送的免疫原性蛋白的剂量得到提高。此外，已知随着载体大小的增加，载体不稳定的可能性会随之增加。参见Herrera等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.279：548-551(2000)。因此，为达成此目标，应就给定表达水平所需的启动子强度对各个调节控制元件(例如启动子)的大小加以考虑和平衡。类似地，开放阅读框的大小对质粒的整体大小起作用。如本文所用，在本文中将由不具有调节或所选抗原编码作用的DNA占据的转录单元之间的DNA区域称作“间隔区”。间隔区的大小在决定转录单元之间的转录干扰程度、位阻程度和质粒整体大小方面起重要作用。因此，须仔细对每一元件(不管是蛋白编码序列、调节控制序列还是间隔区)的大小加以考虑并将其限制在最小的有效碱基对数。

本发明的实施例提供DNA总长度小于或等于约18碱基对(kb)的三联转录单元DNA质粒。在一替代实施例中，本发明提供DNA总长度小于或等于约17kb的三联转录单元DNA质粒。本发明的另一实施例提供DNA总长度小于或等于约16kb的三联转录单元DNA质粒。本发明的某一实施例提供DNA总长度小于或等于约15kb的三联转录单元DNA质粒。本发明的又一实施例提供DNA总长度小于或等于约14kb的三联转录单元DNA质粒。本发明的一具体实施例提供DNA总长度小于或等于约13kb的三联转录单元DNA质粒。本发明的一特定实施例提供DNA总长度小于或等于约12kb的三联转录单元DNA质粒。本发明的另一实施例提供DNA总长度小于或等于约11kb的三联转录单元DNA质粒。

本文所用“约”或“近似”一般意指在给定数值或范围的20％以内。

如图1中所定义，三个转录单元之间的转录方向的取向是DNA质粒设计的另一考虑因素。分子生物学领域的技术人员会了解，在环形DNA质粒中仅存在两个转录方向。因此，在具有三个转录单元的质粒中，其中至少两个会取相同方向。在本发明的某一实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的表达方向呈相反方向。在本发明的另一实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的表达方向呈相反方向且所述第三转录单元的转录方向与所述第二转录单元呈相同方向。在本发明的又一实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的表达方向呈相反方向且所述第三转录单元的转录方向与所述第一转录单元呈相同方向。

所属领域的技术人员会了解，将所述转录单元编号为“第一”、“第二”和“第三”是仅为方便起见。可将所述三个转录单元以任何顺序安排在质粒中。

在具有两个转录单元的质粒中，对于两个转录单元的转录方向存在某些限制。如果两个转录单元的转录方向呈相反方向，则所述两个转录单元彼此间可由200bp一般小的间隔区隔开，另一选择为彼此间由300bp一般小的间隔区隔开，或者另一选择为彼此间由400bp一般小的间隔区隔开。

在具有两个转录单元的质粒中，如果两个转录单元的转录方向呈相同方向，则所述两个转录单元彼此间应由至少约500bp的间隔区隔开。在另一实施例中，所述两个转录单元彼此间应由至少约600bp的间隔区隔开。在又一实施例中，所述两个转录单元彼此间应由至少约700bp的间隔区隔开。在某一实施例中，所述两个转录单元彼此间应由至少约800bp的间隔区隔开。在另一实施例中，所述两个转录单元彼此间应由至少约900bp的间隔区隔开。在又一实施例中，所述两个转录单元彼此间应由至少约1000bp的间隔区隔开。

在本发明的另一实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的表达方向呈相同方向。在本发明的又一实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的表达方向呈相同方向且所述第三转录单元的转录方向与所述第二转录单元呈相同方向。在本发明的一特定实施例中，所述第一转录单元的转录方向与所述第二转录单元的表达方向呈相同方向且所述第三转录单元的转录方向与所述第一转录单元呈相反方向。

间隔区的大小是可加以操作以减轻转录单元之间的转录干扰、减少位阻和控制整体质粒大小的一个变量。在示于图1的实施例中，存在一隔开转录单元1和2的间隔区，其位于SCMV与HCMV启动子之间。本文所用隔开转录单元1和2的间隔区称作“间隔区1”。在示于图1的实施例中，存在一隔开转录单元2和3的间隔区，其位于SV 40 poly A与HSVLap1启动子之间。本文所用隔开转录单元2和3的间隔区称作“间隔区2”。在示于图1的实施例中，存在一隔开转录单元3和1的第三间隔区，其位于BGH poly A与兔β球蛋白polyA之间。本文所用隔开转录单元3和1的间隔区称作“间隔区3”。参见图1。

本发明的另一特征是，整体质粒大小可利用真核质粒的间隔区来最小化以满足质粒及/或佐剂功能的需要。例如，在示于图1的实施例中，间隔区3还包括细菌复制起始点。此外，在示于图1的实施例中，间隔区2包括用于细菌生长的卡那霉素基因。在其它实施例中，所述间隔区包括用于刺激免疫反应的CpG岛序列。在另一实施例中，所述间隔区包括用于增强抗原表达的CTE及/或RTE序列。在本发明的又一实施例中，所述间隔区可包括增强子序列。在本发明的另一实施例中，所述间隔区可包括已知用于增强表达的非翻译序列。

在本发明的一实施例中，间隔区1的大小小于约5kb，或者小于约4kb。在本发明的另一实施例中，间隔区1的大小小于约3kb，或者小于约2kb。在本发明的某一实施例中，间隔区1的大小小于约1kb。在本发明的一特定实施例中，间隔区1的大小在约800个碱基对(bp)至约1000bp之间。在本发明的一替代实施例中，间隔区1的大小在约600bp至约800bp之间。在本发明的某一实施例中，间隔区1的大小在约400bp至约600bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区1的大小在约300bp至约400bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区1的大小小于约400bp。在本发明的一具体实施例中，间隔区1的大小在约200bp至约300bp之间。在本发明的一特定实施例中，间隔区1的大小在约100bp至约200bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区1的大小在约10bp至约100bp之间。

在本发明的一实施例中，间隔区2的大小小于约5kb，或者小于约4kb。在本发明的另一实施例中，间隔区2的大小小于约3kb，或者小于约2kb。在本发明的某一实施例中，间隔区2的大小小于约1kb。在本发明的另一实施例中，间隔区2的大小小于约1100bp。在本发明的一特定实施例中，间隔区2的大小在约800个碱基对(bp)至约1000bp之间。在本发明的一替代实施例中，间隔区2的大小在约600bp至约800bp之间。在本发明的某一实施例中，间隔区2的大小在约400bp至约600bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区2的大小在约300bp至约400bp之间。在本发明的一具体实施例中，间隔区2的大小在约200bp至约300bp之间。在本发明的一特定实施例中，间隔区2的大小在约100bp至约200bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区2的大小在约10bp至约100bp之间。

在本发明的一实施例中，间隔区3的大小小于约5kb，或者小于约4kb。在本发明的另一实施例中，间隔区3的大小小于约3kb，或者小于约2kb。在本发明的某一实施例中，间隔区3的大小小于约1kb。在本发明的另一实施例中，间隔区3的大小小于约1100bp。在本发明的一特定实施例中，间隔区3的大小在约800bp至约1000bp之间。在本发明的一替代实施例中，间隔区3的大小在约600bp至约800bp之间。在本发明的某一实施例中，间隔区3的大小在约400bp至约600bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区3的大小在约300bp至约400bp之间。在本发明的一具体实施例中，间隔区3的大小在约200bp至约300bp之间。在本发明的一特定实施例中，间隔区3的大小在约100bp至约200bp之间。在本发明的另一实施例中，间隔区3的大小在约10bp至约100bp之间。

C.本发明的免疫原性组合物表达的抗原

本文所用“多肽”是指由本发明的质粒和免疫原性组合物编码的所选蛋白质、糖蛋白、肽或其它经修饰蛋白质抗原。本发明的实施例提供可在一脊椎动物宿主体内诱导针对“多肽”即针对所选抗原的免疫反应的质粒和免疫原性组合物。本文所用术语“所选抗原”是指这些多肽。在由质粒DNA表达时包含所述多肽的所选抗原可包括来源于病原体病毒、细菌、真菌、寄生虫、蛋白感染素或其组合的蛋白质、多聚蛋白、多肽、肽、其片段或融合体。或者，所选抗原可包括来源于癌细胞或肿瘤细胞的蛋白质、多聚蛋白、多肽、肽、其片段或融合体。在另一实施例中，所选抗原可包括来源于过敏原的蛋白质、多聚蛋白、多肽、肽、其片段或融合体以干扰IgE的产生进而缓和对过敏原的过敏反应。在又一实施例中，所选抗原可包括来源于是由宿主(自身分子)以不期望的方式、量或位置产生者(例如来自淀粉样前体蛋白的分子)的分子或其一部分的蛋白质、多聚蛋白、多肽、肽、其片段或融合体，以预防或治疗一脊椎动物宿主体内的特征为淀粉样蛋白沉积的疾病。在本发明的一实施例中，所选抗原可包括来源于HIV-1的蛋白质、多聚蛋白、多肽、肽或片段。

本发明的实施例也涉及包含一编码所选抗原的质粒的免疫原性组合物，所述抗原(1)选自病原体病毒、细菌、真菌或寄生虫以在一脊椎动物宿主体内引发免疫反应，或(2)选自来源于癌细胞或肿瘤细胞的癌症抗原或肿瘤相关抗原以在哺乳动物受试者体内引发治疗性或预防性抗癌作用，或(3)选自过敏原以干扰IgE的产生从而缓和对所述过敏原的过敏反应，或(4)选自由宿主(自身分子)以不期望的方式、量或位置产生者的分子或其一部分以降低这种不期望的作用。

在另一实施例中，期望的免疫原性组合物可利用本发明的三联转录单元质粒，其编码所选抗原以诱导旨在预防或治疗下列病毒性疾病之一的免疫反应：人类免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、1型至3型副流感病毒、流感病毒、单纯性疱疹病毒、人巨细胞病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、萼状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒、牛疫病毒、人类间质肺炎病毒、禽肺病毒(先前称作火鸡鼻气管炎病毒)、亨得拉病毒、尼帕病毒、冠状病毒、细小病毒、传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、鸟传染性法氏囊疾病病毒、鸡新城疫疾病病毒、马立克氏病(Marek′sdisease)病毒、猪呼吸系统和生殖系统综合症病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒、和冠状病毒(例如SARS病毒)。

在一特定实施例中，包含本发明三联转录单元质粒的免疫原性组合物包括那些编码来自引起新发疾病的病原体(例如严重急性呼吸道病毒(SARS)、人类疱疹病毒8(HHV-8)、汉坦病毒、霍乱弧菌0139、幽门螺旋杆菌和博氏疏螺旋体)的所选抗原的组合物。

在另一实施例中，包含本发明质粒的免疫原性组合物包括旨在预防及/或治疗由细菌引起的细菌疾病的组合物，所述细菌包括(但不限于)，流感嗜血杆菌(典型和非典型二者)、睡眠嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、粪链球菌、幽门螺旋杆菌、脑膜炎双球菌、奈瑟氏淋病双球菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉衣原体、百日咳杆菌、耳炎差异球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏鼠伤寒菌、霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏杆菌、霍乱弧菌、白喉杆菌、结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌-胞内结核分枝杆菌复合体、奇异变形杆菌、普通变型杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风杆菌、钩端螺旋体、博氏疏螺旋体、溶血性巴斯德氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、胸膜肺炎放线杆菌和鸡败血支原体。

本发明的实施例也涉及包含编码所选抗原来自下列各物的质粒的免疫原性组合物，所述抗原来自(但不限于)曲霉菌(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、念珠菌(Candida)、球孢子菌(Coccidiodes)、隐球菌(Cryptococcus)和组织浆菌(Histoplasma)。在某些实施例中，使用包含编码来自真菌的所选抗原的质粒的所述免疫原性组合物预防及/或治疗真菌性疾病。

在另一实施例中，本发明也涉及包含编码所选抗原来自下列各物的质粒的免疫原性组合物，所述抗原来自(但不限于)硕大利什曼原虫(Leishmania major)、蛔虫(Ascaris)、鞭虫(Trichuris)、贾第鞭毛虫(Giardia)、血吸虫(Schistosoma)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、毛滴虫(Trichomonas)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)。在特定实施例中，使用包含编码寄生虫的所选抗原的质粒的免疫原性组合物预防及/或治疗寄生虫性疾病。

在一特定实施例中，本发明提供用于在一脊椎动物宿主体内引发治疗性或预防性抗癌作用的免疫原性组合物，其包含编码所选抗原(例如癌症抗原或肿瘤相关抗原)的质粒，所述抗原包括(但不限于)前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。在一些实施例中，可将相同抗原或抗原变体置于多个转录单元中以增强转录和特定靶标抗原的最终剂量。

本发明的实施例也提供包含编码所选抗原的质粒的免疫原性组合物，所述抗原为用于缓和一脊椎动物宿主体内的过敏原反应的过敏原，包括那些含有过敏原或其片段者。所述过敏原的实例阐述于美国专利第5,830,877号和国际专利公开案第WO99/51259号，二者以引用方式并入本文中。所述过敏原包括(但不限于)花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物。本发明的免疫原性组合物可用于干扰IgE抗体的产生，IgE抗体是一种已知的引起过敏反应的原因。

本发明的实施例也涉及包含编码用于在一脊椎动物宿主体内缓和对自身分子的反应的所选抗原的质粒的免疫原性组合物。所选抗原包括那些含有自身分子或其片段的抗原。所述自身分子的实例包括与糖尿病有关的胰岛素β-链、与胃食管返流疾病有关的G17分子和可在如多发性硬化、狼疮和类风湿性关节炎等疾病中下调自身免疫反应的抗原。还包括3-淀粉样肽(也称作Ap肽)，其为淀粉样前体蛋白(APP)的内部39至43氨基酸片段且可通过由β和γ分泌酶处理APP来产生。Aβ1-42肽具有下列序列：Asp Ala Glu Phe Arg HisAsp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys GlyAla Ile He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO：1)。

同样合乎需要的是，选择和使用用于设计本发明的DNA质粒的编码所选抗原的序列以改变所选抗原编码基因序列的密码子使用以及已将其插入其中的DNA质粒，从而增加所述抗原的表达及/或去除其中的抑制序列。抑制序列的去除可通过使用美国专利第5,965,726号、第5,972,596号、第6,174,666号、第6,291,664号和第6,414,132号以及国际专利公开案第WO01/46408号中详细论述的技术来达成；所述专利以引用方式并入本文中。简言之，所述技术涉及较佳用多个点突变使所选基因中经鉴别的抑制/不稳定性序列突变。

作为下文所例示的一具体实施例，本发明的DNA质粒和免疫原性组合物期望采用一或多个对HIV-1基因(例如gag、pol、env nef tat和vif进行最优化的序列。

本发明的三联转录单元质粒还适用于在活体外转染、转化或感染宿主细胞以表达三个或三个以上的蛋白质或多肽。

D.用于转录单元的启动子

本发明的DNA质粒包含一个、两个或三个转录单元。每一转录单元包含至少一个启动子。因此，在本发明的某些实施例中，编码所选抗原的核酸处于启动子的转录控制下。“启动子”是指为起始基因的特异性转录所需要的细胞合成机制或引入的合成机制所识别的DNA序列。短语“处于转录控制下”意指，启动子相对于核酸处于正确的位置和取向以控制RNA聚合酶起始和基因转录。

本文用术语启动子指一组成簇围绕在RNA聚合酶起始位点周围的转录控制组件。有关如何组织启动子的诸多考虑来源于若干病毒启动子的分析，包括对HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元进行的分析。经最新工作扩充的这些研究已显示，启动子由不连续的功能组件构成，每一组件由大约7至20bp的DNA组成且包含一或多个用于转录活化剂或抑制剂蛋白的识别位点。

每一启动子中至少有一个组件起到定位RNA合成的起始位点的作用。所述组件中了解最清楚的实例是TATA盒，但在一些启动子中缺乏TATA盒，例如哺乳动物末端脱氧核糖核酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点的不连续元件自身可帮助固定起始位置。

适宜在任一转录单元中使用的启动子包括所有在真核细胞中有活性的启动子。适宜真核启动子的实例包括人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子(视情况具有HCMV增强子)(例如参见，Boshart等人，Cell，47：521-530(1985))、猿巨细胞病毒(SCMV)启动子、鼠巨细胞病毒(MCMV)启动子、单纯性疱疹病毒(HSV)LAP1启动子、猿病毒40(SV40)启动子、人延伸因子1α启动子、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、肌细胞特异性结蛋白启动子或在抗原呈递细胞中有活性的任何其它启动子。

此外，适宜真核启动子特征可为在组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和其它启动子中加以选择。在活性上具有非特异性且在编码所选抗原的DNA质粒采用的组成型启动子的实例包括(但不限于)逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、逆转录病毒LTR启动子(视情况具有RSV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子(Invitrogen)。可由外源提供的化合物调节的诱导型启动子包括(但不限于)阿拉伯糖启动子、锌诱导型羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)、蜕皮激素昆虫启动子(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996))、四环素抑制型系统(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(Gossen等人，Science，268：1766-1769，(1995)，也可参见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518，(1998))、RU486诱导型系统(Wang等人，Nat.Biotech.，15：239-243，(1997)和Wang等人，Gene Ther.，4：432-441，(1997))和雷帕霉素诱导型系统(Magari等人，J.Clin.Invest，100：2865-2872，(1997))。

可用于本发明DNA质粒的其它类型的诱导型启动子是那些由特定生理状态例如温度或急性期或仅在复制细胞中调节的启动子。有用的组织特异性启动子包括来自编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肌酸激酶以及活性高于天然存在的启动子的合成肌启动子的基因的启动子(参见Li等人，Nat.Biotech.，17：241-245，(1999))。尤其为人们所熟知的具有组织特异性的启动子实例是针对下述的启动子：肝脏(白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.，77：5124-32(1997)；B型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人，GeneTher.，3：1002-9，(1996)；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人，Hum.Gene Ther.，7：1503-14，(1996))、骨(骨钙蛋白，Stein等人，Mol.Biol.Rep.，24：185-96，(1997)；骨涎蛋白，Chen等人，J.BoneMiner.Res.，11：654-64，(1996))、淋巴细胞(CD2，Hansal等人，J.Immunol.，767：1063-8，(1988)；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)、神经元(神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，Andersen等人，Cell.Mot.Neurobiol.，73：503-15，(1993)；神经丝轻链基因，Piccioli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5611-5，(1991)；神经元特异性ngf基因，Piccioli等人，Neuron，75：373-84，(1995))。对于用于本范围的已知启动子的额外列表参见(例如)国际专利公开案第WO00/55335号。

E.用于转录单元的聚腺苷酸化信号

本发明的DNA质粒包含三个转录单元且每一转录单元包含至少一个聚腺苷酸化信号。本文所定义的“聚腺苷酸化信号”是指一可终止特定转录单元的转录并确保编码一多肽的核酸序列得到正确转录和翻译的终止序列(或终止位点)。所述终止位点可为合成位点或来自天然来源。终止位点的实例包括(但不限于)聚腺苷酸化信号和合成的双向转录终止位点。通常，所述聚腺苷酸化信号可停止DNA序列的转录。

可在任一转录单元中使用的适宜聚腺苷酸化信号包括在真核细胞中有活性的所有聚腺苷酸化信号。真核聚腺苷酸化信号的实例包括兔β球蛋白poly(A)信号，其是一已在文献中辨别为强的信号(Gil和Proudfoot，Cell 49：399-406(1987)；Gil和Proudfoot，Nature 312：473-474(1984))。其关键特征之一是其下游元件的结构，其中包含富含UG-和U-的结构域。其它polyA信号s包括合成polyA、HSV胸苷激酶polyA(参见Cole，C.N.和T.P.Stacy，Mol.Cell.Biol.5：2104-2113(1985))；人α球蛋白polyA SV40 poly A(参见Schek，N、Cooke，C和J.C.Alwine，Mol.Cell Biol.12：5386-5393(1992))；人β球蛋白poly A(参见Gil，A.和N.J.Proudfoot，Cell 49：399-406(1987))；多瘤病毒poly A(参见Batt，D.B和G.G.Carmichael Mol.Cell.Biol.15：4783-4790(1995)；牛生长激素polyA、(Gimmi，E。R.、Reff，M.E.和I.C.Deckman，Nucleic Acid Res.(1989))。许多其它聚腺苷酸化信号为业内已知，且同样可用于本发明的实施例。

SV40的早期和晚期聚腺苷酸化信号可用于本发明的各种实施例中。参见Schek等人，Mol.Cell Biol.12：5386-5393(1992)。这些序列编码于SV40基因组的2533位核苷酸处BamnHI位点与2770位核苷酸处Bcll位点之间的237个碱基对的片段内(Carswell和Alwine，Mol.Cell.Biol.9：4248；1989)。Carswell和Alwine做出结论，在两个SV40聚腺苷酸化信号中，晚期信号更为有效，最可能的原因为其包含可促进有效的裂解和聚腺苷酸化作用的下游序列元件和上游序列元件二者。

可使用业内已知方法鉴别和构建额外聚腺苷酸化位点。最小的聚腺苷酸化位点由AAUAAA和一第二识别序列(通常为富含G/U的序列，见于下游约30个核苷酸处)组成。本文所用序列呈DNA形式而非RNA形式，可简化并入表达载体的适宜DNA的制备。在呈DNA形式时，聚腺苷酸化位点由下游具有(例如)G/T富集区的AATAAA组成。两个序列都须存在以形成有效的聚腺苷酸化位点。这些位点的目的在于将特异性RNA结合蛋白募集至RNA处。AAUAAA可结合剪切聚腺苷酸化特异性因子(CPSF；Murthy K.G.和Manley J.L.(1995)，Gene Dev 9：2672-2683)，且第二位点(常常为G/U序列)可结合剪切刺激因子(CstF；Takagaki Y和Manley J.L.(1997)Mol Cell Biol 17：3907-3914)。CstF由若干蛋白质组成，但负责RNA结合的蛋白质是CstF-64，其是核糖核蛋白结构域蛋白家族的一个成员(Takagaki等人(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1403-1407)。

E.可用于本发明的免疫原性组合物的载剂、稀释剂、促进剂、佐剂和调配物

可用于本发明的DNA质粒和免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的稀释剂、赋形剂或医药上可接受的载剂。在一实施例中，所述医药上可接受的稀释剂是无菌水、无菌等渗盐水或生物缓冲液。也可以习用方式将所述抗原性组合物与稀释剂或载剂混合。本文所用语言“医药上可接受的载剂”意欲包括与向人类或其它脊椎动物宿主投予相容的任何与所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂及诸如此类。适宜载剂为所属技术领域的技术人员所明了且在很大程度上取决于投予途径。

可存在于本发明的免疫原性组合物中的另外一些额外赋形剂是佐剂、促进剂、保护剂、表面活性剂和化学稳定剂、悬浮剂或分散剂。通常，需对稳定剂、佐剂和保护剂最优化以确定对于在人类或兽医受试者中功效而言为最佳的调配物。

1.佐剂

佐剂是在与免疫原或抗原同时投予时可增强免疫反应的物质。多种细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节活性且从而可用作佐剂，其包括(但不限于)白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(例如参见美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(及其突变体形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(例如参见，美国专利第5,078,996号和ATCC登录号39900)；巨嗜细胞集落刺激因子(MCSF)；粒细胞集落刺激因子(GCSF)；和肿瘤坏死因子α和β(TNF)。可用于本发明的又一些佐剂包括趋化因子，其包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。粘附分子也可用作佐剂，例如选择蛋白，如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白。又一些有用佐剂包括(但不限于)粘蛋白样分子，例如，CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整合素家族成员，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员，例如PECAM，ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3；协同刺激分子，例如CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.1、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。又一佐剂分子包括卡斯蛋白酶(ICE)。也可参见国际专利公开案第WO98/17799号和第WO99/43839号，二者以引用方式并入本文中。

在一实施例中，期望佐剂是IL-12蛋白，其可自一质粒表达。例如参见，美国专利第5,457,038号、第5,648,467号、第5,723,127号和第6,168,923号，所述专利以引用方式并入本文中。在一实施例中，细胞因子可以蛋白质形式投予。在某一实施例中，IL-12由本发明DNA质粒的三个转录单元中的一或两个表达。或者，IL-12独立由一单独质粒表达。在另一实施例中，代替编码并表达II-12的质粒投予编码并表达IL-15的质粒。

用于增强免疫反应的适宜佐剂包括(但不限于)MPL^TM(3-O-脱酰基化单磷酰脂质A；Corixa，Hamilton，MT)，其阐述于美国专利第4,912,094号，所述专利以引用方式并入本文中。同样适合用作佐剂的是合成脂质A类似物或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其可自Corixa(Hamilton，MT)购得并阐述于美国专利第6,113,918号，所述专利以引用方式并入本文中。一种所述AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-去氧-4-O-磷酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其还称作529(以前称作RC529)。所述529佐剂可调配成水性形式或稳定乳液形式。

又一些佐剂包括矿物油和水乳液、铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝等)、爱菲金(Amphigen)、阿夫立定(Avridine)、L121/角鲨烯、D-交酯-聚交酯/糖苷、普卢兰尼克多元醇、胞壁酰二肽、灭活的博德特氏菌(Bordetella)、皂甙(例如Stimulon^TM QS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，阐述于以引用方式并入本文中的美国专利第5,057,540号)及尤其产生的颗粒(例如ISCOMS(免疫刺激复合物))、结核分枝杆菌、细菌脂多糖、合成的多核苷酸(例如含有CpG基元的寡核苷酸(美国专利第6,207,646号，其以引用方式并入本文中)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)，特别为LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；例如参见，国际专利公开案第WO 93/13302号和第WO 92/19265号，二者以引用方式并入本文中。

同样可用作佐剂的是霍乱毒素及其突变体，包括阐述于公开的国际专利申请案第WO00/18434号中者(其中29位氨基酸处的谷氨酸由另一氨基酸(除去天冬氨酸)取代，较佳为组氨酸)。类似CT毒素或突变体阐述于公开的国际专利申请案第WO 02/098368号(其中16位氨基酸处的异亮氨酸由另一氨基酸取代，此取代单独进行或连同进行68位氨基酸处丝氨酸被另一氨基酸的取代；及/或其中72位氨基酸处的缬氨酸由另一氨基酸取代)。其它CT毒素阐述于公开的国际专利申请案第WO 02/098369号中(其中25位氨基酸处的精氨酸由另一氨基酸取代；及/或将一氨基酸插入49位氨基酸处；及/或将两个氨基酸插入35和36位氨基酸处)。

在一些实施例中，可于免疫原性组合物中投予编码一佐剂的质粒DNA。在这些情形中，将其DNA插入用于纳入本发明免疫原性组合物中的质粒中的佐剂包括(但不限于)白介素-1(IL-1)、IL-5、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、TNF-β和BL-1(如公开的国际专利申请案WO 98/17799中所述)；B7.2(如公开的国际专利申请案WO 00/51432中所述)；IL-8、RANTES、G-CSF、IL-4、突变体IL-18、IL-7、TNF-R(如公开的国际专利申请案WO 99/43839中所述)；和突变体CD80(如公开的国际专利申请案WO 00/66162中所述)。本文所用术语“IL-12蛋白”欲指一或两个包含单链IL-12蛋白的人类IL-12亚单位，其中两个亚单位由一单编码序列编码并表达为一具有连接两个亚单位的连接子序列的单蛋白质。

在一特定实施例中，细胞因子以核酸组合物形式投予，所述组合物中包含编码所述细胞因子且处于指导其在哺乳动物细胞中表达的调节序列控制下的DNA序列。在又一实施例中，表达细胞因子的质粒与编码所选抗原的DNA质粒在一免疫原性组合物中一起投予。在又一实施例中，所述细胞因子在投予启动免疫原性组合物和加强免疫原性组合物之间投予。在再一实施例中，所述细胞因子与加强步骤一起投予。在又一实施例中，所述细胞因子与启动和加强组合物二者一起投予。

在本发明的某些实施例中，可将CpG DNA纳入质粒中以作为佐剂。本文所用CpGDNA是指含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸核酸分子的寡核苷酸，其包含一未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即“CpG DNA”)或含有一其后接有3′鸟嘌呤核苷并由磷酸键连接的5′胞嘧啶的DNA并可活化免疫系统。参见颁予Davis等人的美国专利第6,406,705号和颁予Krieg等人的美国专利第6,207,646号，二者以引用方式全部并入本文中。来自细菌DNA而非来自脊椎动物DNA的CpG DNA在活体外对外周血单核细胞(PBMC)具有直接的免疫刺激作用。此种淋巴细胞活化归因于未经甲基化的CpG二核苷酸，所述二核苷酸以期望的频率出现于细菌DNA中(1/16)，但在脊椎动物DNA中达不到如此高的频率(CpG抑制，1/50至1/60)且被甲基化。曾有人提出，对CpG DNA的反应的快速免疫活化会进化为可识别对微生物分子有特异性的结构模式的先天免疫防御机制的一个组份。参见颁予Davis等人的美国专利第6,406,705号和颁予Krieg等人的美国专利第6,207,646号，二者以引用方式全部并入本文中。

在某些实施例中，向受试者投予佐剂组合，其中所述佐剂组合包含至少一个含有至少一个未经甲基化的CpG DNA二核苷酸的寡核苷酸和至少一个非核酸佐剂(例如IL-12)。

2.促进剂或助剂

由多核苷酸分子组成的免疫原性组合物合意地包含可选赋形剂，例如多核苷酸转染促进剂或“助剂”，例如局部麻醉剂、肽、脂质(包括阳离子性脂质)、脂质体或脂质颗粒、多聚阳离子(例如多聚赖氨酸)、分支的三维多聚阳离子(例如树枝状聚合物)、碳水化合物、阳离子性两性分子、去污剂、苄铵表面活性剂或可促进多核苷酸转移至细胞的另一化合物。所述促进剂包括局部麻醉剂布比卡因或丁卡因(tetracaine)(参见美国专利第5,593,972号、第5,817,637号、第5,380,876号、第5,981,505和第6,383,512号及国际专利公开案第WO98/17799号，所述专利以引用方式并入本文中)。用于本发明的促进剂或助剂的其它非专有实例阐述于美国专利第5,703,055号、第5,739,118号、第5,837,533号、国际专利公开案第WO96/10038号(1996年4月4日公开)、及国际专利公开案第WO94/16737号(1994年8月8日公开)，所述专利案各自以引用方式并入本文中。

更佳地，所述转染促进剂以可与核酸分子形成一或多个复合物的量存在。在将所述转染促进剂与本发明的核酸分子或质粒混合时，其会形成多种小复合物或颗粒，所述小复合物或颗粒包裹DNA并是均质的。因此在本发明免疫原性组合物的一实施例中，可通过将转染促进剂与本发明的至少一个质粒混合来形成复合物。

在一特定实施例中，本发明的免疫原性组合物可由一类以上的质粒组成。或者，在本发明组合物的另一实施例中，转染促进剂可预先与每一质粒分开混合。如果欲将所有质粒以单大丸剂投予形式投予，则随后将分开的混合物组合成一单组合物以确保期望比例的质粒存在于单免疫原性组合物中。或者，可将转染促进剂和每一质粒分开混合且分开投予以获得期望比例。

在下文用术语“复合物”或“一或多个复合物”或“多个复合物”来定义免疫原性组合物的此实施例之处，应了解所述术语涵盖一或多个复合物。每一复合物包含一质粒。较佳地，所述复合物的直径在约50nm至约150nm之间。在所用促进剂是一局部麻醉剂(较佳为布比卡因)时，以多核苷酸组合物的总重计自约0.1重量％至约1.0重量％的量为较佳。也可参见国际专利公开案第WO99/21591号，其以引用方式并入本文中并教示苄铵表面活性剂作为助剂的掺入，较佳以约0.001重量％至0.03重量％之间的量投予。根据本发明，所存在的局部麻醉剂的量与所述核酸分子的比例为约1至10μg/ml核酸用约0.01％w/v至2.5％w/v局部麻醉剂。另一所述范围是约100μg/ml至1mg/ml核酸用约0.05％w/v至1.25％w/v局部麻醉剂。

3.免疫原性组合物中的其它添加剂

可将其它赋形剂纳入本发明的免疫原性组合物，所述添加剂包括保护剂、稳定成份、表面活性剂及诸如此类。

适宜的例示性保护剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸、乙香草醛、甘油、苯酚和对氯酚。

可使用的适宜稳定成份包括(例如)水解酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、焦磷酸钾、乳糖、乳白蛋白水解物和奶粉。

适宜表面活性物质包括(但不限于)Freund不完全佐剂、醌类似物、十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二(十八烷基)溴化铵、甲氧基十六烷基甘油和普卢兰尼克多元醇；多胺，例如，吡喃、硫酸葡聚糖、poly IC、卡波姆(carbopol)；肽，例如，胞壁酰肽和胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、特夫素(tuftsin)；油性乳液；和矿物凝胶(mineralgel)，例如，磷酸铝等；和免疫刺激复合物(iSCOMS)。也可将所述质粒掺入脂质体中以用作一免疫原性组合物。所述免疫原性组合物也可包含适和免疫原性组合物的所选投予模式的其它添加剂。所述免疫原性组合物本发明的也可包含冻干多核苷酸，其可与其它医药上可接受的赋形剂一起使用以形成粉末、液体或悬浮液剂型。例如参见，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第2卷，第19^th版(1995)，例如，Chapter 95 Aerosols；和国际专利公开案第WO99/45966号，其中的教示以引用方式并入本文中。

这些免疫原性组合物可包含适合经由任何习用投予途径投予的添加剂。在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物经制备可以(例如)液体、粉剂、气雾剂、片剂、胶囊、肠溶包膜片剂或胶囊或栓剂形式投予给人类受试者。因此，所述免疫原性组合物也可包括(但不限于)存于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液、乳液、膏剂和可植入的缓释或生物可降解调配物。在本发明的一实施例中，将所述免疫原性组合物制备成用于非经肠投予的调配物，活性成份以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供以在非经肠投予重新溶解的组合物之前用适宜媒剂(例如，无菌无致热源的水)重新溶解成所需浓度。其它有用的可非经肠投予的调配物包括那些包含呈微晶形式、脂质体制剂形式或作为生物可降解聚合物系统的组件的活性成份的调配物。用于缓释或植入的组合物可包含医药上可接受的聚合或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。

本发明的免疫原性组合物并不受到习用的生理上可接受的载剂、稀释剂和赋形剂(例如溶剂、缓冲剂、佐剂、促进剂或可用于上述类型医药制剂的其它成份)的选择的限制。具有适宜pH等渗性、稳定性和其它常规特性的来自上述组份的这些医药上可接受的组合物的制备为所属领域的技术人员已知。

F.用于免疫原性组合物的投予剂量和途径、电穿孔

一般而言，本发明免疫原性组合物各组份的适宜“有效量”或剂量的选择也将取决于所采用的免疫原性组合物中所选抗原的种类以及受试者的身体状况，特别尤其包括经免疫受试者的整体健康状况、年龄和体重。投予方法和途径与免疫原性组合物中额外组件的存在也会影响DNA质粒组合物的剂量和数量。有效剂量的选择和向上或向下的调整为所属领域的技术人员已知。在患者体内诱导免疫反应(较佳为保护性反应)或产生外源效应而无明显不良副作用所需要的质粒量会随这些因素而改变。所属领域的技术人员可容易地确定适宜剂量。

可通过多种途径将本发明的免疫原性组合物投予给人类或非人类脊椎动物，所述途径包括(但不限于)鼻内、经口、阴道、直肠、非经肠、皮内、经皮(例如参见，国际专利公开案第WO 98/20734号，其以引用方式并入本文中)、肌内、腹膜腔内、皮下、静脉内和动脉内。需由主治医师根据所用免疫原性组合物的性质和患者年龄、体重、性别和整体健康状况的评估以及免疫原性组合物中存在的抗原和类似因素对适宜途径加以选择。

可由主治医师或所属领域的技术人员根据宿主对方法应用的物理特性和精确反应来选择投予免疫原性组合物的顺序和各次投予间的时间长短。预计所述最优化为所属领域的技术人员所熟知。

在另一实施例中，提供一种于活体内在单一细胞中共表达不连续基因产物的一个、两个或三个开放阅读框的方法，其包括向哺乳动物的组织内导入约0.1μg至约100mg的多核苷酸。

可投予所述免疫原性组合物且所述质粒的吸收可在投予时借助电穿孔来增强。为实施电穿孔，将电极相隔约1mm至4mm放置，接近其中需注射多核苷酸的区域。电极的精确位置或设计会有所变化，只要允许电流通过经注射多核苷酸区域中与电极方向垂直的肌纤维即可。参见颁予G.A.Hofmann的美国专利第5,273,525号；颁予G.A.Hofmann的美国专利第5,869,326号；颁予S.B.Dev等人的美国专利第5,993,434号；颁予G.A.Hofmann等人的美国专利第6,014,584号；颁予G.A.Hofmann等人的美国专利第6,068,650号；颁予G.A.Hofmann的美国专利第6,096,020号；颁予G.A.Hofmann等人的美国专利第6,233,482号；颁予G.A.Hofmann的美国专利第6,241,701号；颁予G.A.Hofmann等人的美国专利第6,418,341号；颁予S.B.Dev等人的美国专利第6,451,002号；颁予G.A.Hofmann的美国专利第6,516,223号；颁予G.A.Hofmann的美国专利第6,763,264号；颁予I.Mathiesen等人的美国专利第6,110,161号；上述所有专利以引用方式全部并入本文中。

电极就位后，对肌肉实施电穿孔或电刺激。所述刺激以具有预设振幅和持续时间的脉冲形式递送。为最优化转染效率，脉冲持续时间、电压、电容、场强、数目、波型等参数会有所变化且比较转染效率。电脉冲是经由电穿孔施加的脉冲电场。所述脉冲可为单极、双极、指数或方形波形。电压处于约0至1000伏的范围内；脉冲持续时间在5微秒至5毫秒的范围内；脉冲数目在单脉冲至30,000个脉冲的范围内；且各串内的脉冲频率在0.5Hz至1000Hz的范围内。场强的可用范围在约25V/cm至约800V/cm范围内。所涵盖的用于实施本发明的电脉冲包括那些具有足以引起电穿孔的电压和持续时间的脉冲。参见Hofmann，G.A.Cell in electric fields.In E.Neumann，A.E.Sowers和C.A.Jordan(编辑)，Electroporation and electrofusion in cell biology(第389至407页).Plenum PublishingCorporation(1989)。

G.试剂盒组件

在又一实施例中，本发明提供一种可立即投予治疗任一上述疾病或病况的免疫原性、预防性或治疗性疗法(对于所述疾病或病况需要针对所选抗原的免疫反应)的医药试剂盒。所述试剂盒经设计可用于在哺乳动物或脊椎动物受试者体内诱导高水平抗原-特异性免疫反应的方法。所述试剂盒包含至少一种免疫原性组合物，其包含一含有编码一组所选抗原或肽的三个转录单元的DNA质粒。可在试剂盒中提供多个预先包装剂量的免疫原性组合物以用于多次投予。

在包含一DNA质粒的上述免疫原性组合物也不表达细胞因子或其它佐剂(例如IL-12)的情况下，所述试剂盒还可视情况包含一单独的细胞因子/佐剂组合物或多个预先包装剂量的细胞因子/佐剂组合物以用于多次投予。这些细胞因子组合物一般为核酸组合物，所述核酸组合物包含一编码所选细胞因子且在指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞内表达的调节序列控制下的DNA序列。其它佐剂可视情况在预先包装的小瓶中以溶液、液体或固体形式提供。

所述试剂盒还包括用于在启动/加强方法中使用所述免疫原性组合物的说明书。所述试剂盒也可包含用于实施某些分析、上述各种载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂及诸如此类以及投予所述组合物的装置(例如注射器、喷雾装置等)的使用说明。除组合物外其它组件可包括一次性手套、去污说明书、敷药棒或容器。

为更好地理解本发明，提出以下实例。所述实例仅出于举例说明的目的且不应将其理解为限制本发明的范围。下列实例中引用的所有文献、出版物和专利都以引用方式并入本文中。

实例

实例1.HIV基因的选择和修饰

所属领域的技术人员会了解，来自许多病毒和细菌的序列信息在业内可用。更特定而言，序列信息可用于克隆在本发明质粒中表达多肽所使用的基因。有关来自HIV和其它病原体的许多序列的信息可自美国洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos National Laboratory)的HIV序列数据库和美国国立医学图书馆(United States National Library of Medicine)的美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(8600 RockvillePike，Bethesda，MD 20894)获得。

在本发明的一实施例中，选择下列HIV基因将其纳入一表达大部分HIV基因组的例示性单DNA质粒中：来自HXB2分离株的gag基因和来自HXB2分离株的pol基因。完整的HXB2序列以登录号K03455列示于GenBank计算机数据库中。nef、tat和vif基因来源于NL4-3分离株。完整的NL4-3序列以登录号M19921列示于GenBank计算机数据库中。所述HIV包膜基因来源于自David Montefiore博士处获得的初级分离株6101。所述完整HIV包膜序列以登录号AY612855和bankit625244列示于GenBank计算机数据库中。

为在一单表达质粒中纳入大部分的HIV基因组，使用全长gag-pol基因和近乎全长的nef-tat-vif制备基因融合体。此外，去除gag基因与pol基因之间的蛋白酶切位点。本发明实施例中使用的所有HIV基因是针对高水平蛋白表达进行最优化(序列修饰)的RNA。参见美国专利第5,965,726号、第5,972,596号、第6,174,666号、第6,291,664号和第6,414,132号。

或者，可根据2004年6月4日提出申请的美国申请案第60/576,819号中提供的方法对所述HIV基因进行最优化。根据所述方法，通过用“代用”密码子替换某些野生型密码子来增强基因表达。通过选择适宜代用密码子来确定增强的多核苷酸序列。对代用密码子加以选则以改变天然存在(野生型)基因的A和T(或在RNA的情形中为A和U)含量。所述代用密码子是那些编码氨基酸丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的密码子。因此，经修饰的核酸序列在整个序列中都具有用于每一这些氨基酸的代用密码子。对于其余的11个氨基酸，未进行改造，从而在适当位置留下了相应的天然存在的密码子。

使用标准技术来修饰上述HIV基因以改善其安全性且最优化其表达。参见SambrookJ、Fritsch EF和Maniatis T.Molecular cloning：Alaboratory manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor NY.(1989)。例如，使用下列基因修饰来增强安全性(即，通过使病毒酶失活)并最大化纳入后续载体的HIV基因的宽度：

1)通过从各自基因中去除gag终止子和pol起始子来在一单开放阅读框中形成HIV-1gag-pol的融合多聚蛋白，并在野生型移码区中引入突变以排除形成两个单独蛋白质。在此融合构造实例中，野生型gagpol中的移码“不稳定”序列TTTTTT(SEQ ID NO：2)已变为cTTcTg(SEQ ID NO：3)。有关构建gag-pol融合基因的信息，参见Megede，J.Z等人，J.Virology 77：6197-6207(2003)，其中的揭示内容以引用方式全部并入本文中。野生型gag-pol融合蛋白包含一56个氨基酸的开放阅读框的没有功能的多肽，其将gag基因和pol基因隔开。为最小化本发明构造的整体大小，对具有最终四个残基(Lys-Gly-Arg-Pro)(SEQ IDNO：4)的gag多聚蛋白进行修饰以在其后加有一简化的十氨基酸基因间区(Asp-Arg-Gln-Gly-Thr-Val-Ser-Phe-Asn-Phe)(SEQ ID NO：5)。pol多聚蛋白的前四个残基保留(Pro-Gln-Ile-Thr)(SEQ ID NO：6)。在三联转录单元质粒内未偏离gag基因和pol基因的野生型编码区来促进表达。

2)通过删除编码三个活性位点氨基酸(Asp-Thr-Gly，25至27位)的核苷酸来使HIV-1蛋白酶的所有蛋白水解活性失活。参见Loeb等人Nature，340：397(1989)；Wu等人J Virol，70：3378(1996)。

3)通过删除编码下列四个氨基酸：即Tyr 183、Met 184、Asp 185、Asp 186的核苷酸来使逆转录酶(RT)失活。参见Larder等人，Nature，327：716-717(1987)；Larder等人PNAS，86：4803-4807(1989)。

4)通过删除编码一单氨基酸：即glu 478的核苷酸来消除RNAse活性。参见Davies等人，Science，252：88-95(1991)；Schatz等人1989，FEBS lett.257：311-314(1989)。

5)通过删除编码下列三个氨基酸：即Asp 626、Asp 678和Glu 714的核苷酸来消除整合酶功能。参见Wiskerchen等人，J.Virol，69：376-386(1995)；Leavitt等人，J.Biol.Chem.，268：2113-2119(1993)。

6)通过将下列编码区融合在框内(nef氨基酸残基4至206；tat氨基酸残基2至80；vif氨基酸残基2至192)以编码一单多聚蛋白来形成一HIV-1 nef、tat和vif基因的单开放阅读框。将此多聚蛋白称作nef-tat-vif或ntv。

7)作为安全性预防措施，通过去除nef的十四烷基化信号(残基1至3，MGG)和删除tat的两个半胱氨酸(C30和C34)来使tat蛋白失活。

实例2.单一、二联和三联转录单元质粒的构建

这些实例中详述的质粒列示于表1和表2中。

借助多种组件在环形双链DNA质粒中构建三联转录单元表达盒。参见图1。第一组件是一用于在真核细胞中表达多肽的第一转录单元，其由所述猿巨细胞病毒(SCMV)启动子、一克隆位点和牛生长激素(BGH)poly-A信号组成。第二组件是一用于在真核细胞中表达多肽的第二转录单元，其由人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子、一克隆位点和SV40聚腺苷酸化(poly A)信号组成。隔开所述第一和第二转录单元的是间隔区1。第三组件是一用于在真核细胞中表达多肽的第三转录单元且由单纯性疱疹病毒Lap1启动子、SV40剪接供体/受体、一克隆位点和一兔β球蛋白poly-A信号组成。参见Goins W.F等人，J.Virology 68：2239-2252(1994)；Soares，K.J.等人，Virology 70：5384-5394；Goins W.F等人，J.Virology 73：519-532(1999)。隔开所述第二和第三转录单元的是间隔区2。间隔区2中还包括一嵌合细菌卡那霉素抗性(km^r)基因，1α型腺苷酰基4′-核苷酸基转移酶。参见ShawKJ等人，Microbiol.Reviews 57：138-163(1993)和Sadale，Y等人，J.Bacteriol.141：1178-1182(1980)。已对此基因加以设计可赋予对少数氨基糖苷类的抗性，同时此能够选出含有所述质粒的细菌。隔开所述第三和第一转录单元的是间隔区3。间隔区3包括一在细菌中增殖所述质粒所需要的pUC细菌复制起始点。

实例3.含有六个HIV基因的三联转录单元质粒

作为使用三转录单元质粒DNA载体的说明，形成能够共表达三个真核开放阅读框质粒的载体。通过将编码HIV-1抗原的下列所选基因插入实例2中所述的三联转录单元表达盒来形成所述三转录单元质粒DNA载体。所有克隆技术都按照习用技术实施(Sambrook等人，1989)。

首先，将一HIV-1 gag-pol融合基因插入所述第一转录单元的SCMV点与BGH poly-A位点之间的Pmel-Xhol克隆位点。所述gag基因来源于HXB2分离株，且类似地，所述pol基因也来源于HXB2分离株。完整的HXB2序列以登录号K03455列示于GenBank计算机数据库中。所属领域的技术人员会了解，能够以类似方式插入来自其它进化枝或其它病毒或细菌基因的其它HIV-1 gag和pol基因。有关HIV和其它病原体的序列信息可从美国洛斯阿拉莫斯国家实验室的HIV序列数据库和美国国立医学图书馆的美国国家生物技术信息中心(8600 Rockville Pike，Bethesda，MD 20894)获得。

接下来，将来源于HIV-1的初级分离株(6101)的全长包膜基因(gp160)插入所述第二真核转录单元的HCMV位点与SV40 poly-A位点之间的MluI克隆位点。所述6101包膜序列可在GenBank计算机数据库中以登录号AY612855和bankit625244获得。

最后，将编码一HIV nef-tat-vif(NTV)融合蛋白的基因构造(其包括与tat残基2至80融合和与vif残基2至192融合的nef残基4至206)插入HSVLapl启动子与兔β球蛋白poly-A信号之间的Kpnl-EcoRV克隆位点。nef、tat和vif基因都来源于HIV的NL4-3分离株-1。完整HIV-1 NL4-3序列以登录号M19921列示于GenBank计算机数据库中。

因此，在构建时，在所述第一转录单元中将gag-pol开放阅读框置于SCMV启动子和BGH poly-A位点控制下；在所述第二真核转录单元中将包膜开放阅读框置于HCMV启动子和SV40 poly-A信号的控制下；且在所述第三真核转录单元中将nef-tat-vif融合开放阅读框置于HSV Lap1/SV40内含子和兔β球蛋白poly-A信号的控制下。

实例4.HIV基因自单一、二联、三联转录单元质粒的表达

材料和方法：细胞和转染

在活体外评估实例3中所述的表达六个HIV基因的质粒表达经编码蛋白的能力。用于所有活体外表达研究的细胞是293细胞和RD细胞，所述细胞自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。用于在这些细胞中表达HIV蛋白的程序如下：转染前24小时以每个35mm直径孔中有2×10⁵个细胞的密度将细胞铺板并用经纯化的质粒DNA转染。对于转染，将2μg质粒与Fugene转染剂(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)混合并分层置于细胞上，总体积100μl。接下来，将细胞与含有10％FBS的2ml DMEM培养基(BRL)一起培育48小时。最后，收集细胞溶解产物供进一步分析使用。

经表达蛋白质的检测

HIV蛋白的特异性检测使用西方印迹分析来达成。例如，通过使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分开蛋白混合物来实施gag、pol、包膜和vif蛋白中每一个的西方印迹分析。接下来，然后将已分开的蛋白转移至PVDF膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。分别用预染的分子量标准和重组HIV-1 p24(gag)、p66(pol)、gp160(env)及vif蛋白(Invitrogen)作为大小标准和阳性对照。gag、pol、env和vif表达的检测通过免疫染色来达成。将具有已结合且已分开的蛋白的PVDF膜与对各蛋白有特异性的抗体一起培育。使用与碱性磷酸酶(Invitrogen)结合的二级抗体并通过使用显色检测试剂盒(chromogenic detection kit，Invitrogen)来实施显色。

HIV基因自单一、二联和三联转录单元质粒的表达

对HIV基因自三联转录单元质粒的表达进行评估并与相同基因自单一转录单元质粒和二联转录单元质粒中之一的表达加以比较。所述单一转录单元质粒具有一纳入HCMV启动子和BGH poly-A信号作为表达调节元件的单真核转录单元。所述单一转录单元质粒由101编号至105，外加110和111，如表1所示。例如，质粒101在所述单一转录单元中纳入HIV env基因作为开放阅读框。类似地，质粒102在所述单一转录单元中纳入HIV gag基因作为开放阅读框。此外，质粒103在所述单一转录单元中纳入HIV pol基因作为开放阅读框且质粒104在所述单一转录单元中纳入HIV nef-tat-vif(ntv)基因融合体作为开放阅读框。质粒101也在所述单一转录单元中纳入HIV nef-tat-vif(ntv)基因融合体作为开放阅读框，不同之处在于其由Lap1启动子而非质粒104中的HCMV驱动。最后，质粒110在所述单一转录单元中纳入HIV gag-pol-nef-tat-vif基因融合作为开放阅读框且质粒111在所述单一转录单元中纳入HIV gag-pol基因融合作为开放阅读框。

所述二联转录单元质粒具有两个完整的真核转录单元。所述二联转录单元质粒由201编号至204且包含212，如表1所示。用于所述二联转录单元质粒的表达调节元件在所述第一转录单元中由一CMV启动子连同一SV40 polyA组成，且在所述第二转录单元中由一SCMV启动子连同一BGH poly-A信号组成。在此实施例中，质粒201在所述第一转录单元中纳入HIV pol基因且在所述第二转录单元中纳入HIV gag基因。质粒202在所述第一转录单元中纳入HIV nef-tat-vif基因融合基因且在所述第二转录单元中纳入HIV env基因。质粒203在所述第一转录单元中纳入一HIV gag-pol-nef-tat-vif基因融合基因且在所述第二转录单元中纳入HIV env基因。质粒204在所述第一转录单元中纳入HIV gag-pol基因融合基因且在所述第二转录单元中纳入HIV env基因。

在一些实施例中，通过自一质粒对其进行表达来提供佐剂。在这些情形中，所述质粒须包含适宜数量的转录单元。为说明清楚起见且为区分于抗原质粒，将使用一级、二级和三级术语指代具有一个或两个或三个转录单元的佐剂质粒。例如，IL-12是一由两个多肽构成的佐剂。适宜质粒是质粒212，其在所述一级转录单元中纳入在HCMV立即早期启动子和SV40聚腺苷酸化信号控制下表达的IL-12 p35亚单位，且在所述二级转录单元中IL-12p40亚单位是在猿CMV启动子(SCMV)和BGH聚腺苷酸化信号控制下表达。

所述三联转录单元质粒具有三个完整的真核转录单元并编号为301、302和303。参见表2。三个质粒间的差异在于插入的HIV开放阅读框的数目不同。所述三联转录单元质粒的表达调节元件在第一转录单元中由一SCMV启动子连同一BGH poly-A信号组成，在第二转录单元中由一HCMV启动子连同一SV40 poly A组成且在第三转录单元中由一HSVLapl启动子连同一兔β球蛋白poly-A信号组成。如表2中所示，301号质粒是一三联转录单元质粒，但其中仅一个转录单元具有一插入的开放阅读框。具体而言，质粒301在所述第一转录单元中纳入gag-pol融合基因开放阅读框。302号质粒是具有两个转录单元的三联转录单元质粒，其中插入如下开放阅读框：在所述第一转录单元中插入gag-pol且在所述第三转录单元中插入一HIV nef-tat-vif融合基因开放阅读框(在所述第二转录单元中没有插入基因)。最后，303号质粒是具有所有三个转录单元的三联转录单元质粒，其中插入如下开放阅读框：在所述第一转录单元中插入gag-pol基因融合体开放阅读框，在所述第二转录单元中插入env基因开放阅读框且在所述第三转录单元中插入nef-tat-vif融合基因开放阅读框。

表1.单一和二联转录单元质粒^*

  质粒编号HIV构造类型  001空载体对照对照/无TU  101HCMV-env-BGH poly A单一  102HCMV-gag-BGH poly A单一  103HCMV-pol-BGH poly A单一  104HCMV-ntv-BGH poly A单一  105Lap1-ntv-兔β球蛋白poly A单一  110HCMV-gag-pol-ntv-BGH poly A单一/融合体  111HCMV-gag-pol-BGH poly A单一/融合体  201HCMV-pol-SV40 poly A、SCMV-gag-BGH poly A二联

  202HCMV-ntv-SV40 poly A、SCMV-env-BGH poly A二联  203HCMV-gag-pol-ntv-SV40 poly A、SCMV-env-BGH poly A二联  204HCMV-gag-pol-SV40 poly A、SCMV-env-BGH poly A二联  212^**HCMV-mIL-12 p35-SV 40 poly A、SCMV-mIL-12 p40-BGH polyA佐剂

^*使用下列缩写：SCMV：猿巨细胞病毒启动子；HCMV：人巨细胞病毒启动子；HSVlap1：单纯性疱疹病毒潜伏相关启动子1；gag-pol：HIV gag-pol融合体；ntv：HIV nef-tat-vif融合体；env：HIV包膜，mIL-12：鼠类白介素-12。

表2.三联转录单元质粒^*

  质粒编号                               HIV构造ORF个数  301SCMV-gag-pol-BGH poly A、HCMV-[无]，Lap1-[无]一个  302SCMV-gag-pol-BGH poly A、HCMV-[无]，Lap1：ntv-兔β球蛋白poly A两个  303SCMV：gag-pol-BGH poly A、HCMV-env-SV40 poly A、Lap1：ntv-兔β球蛋白polyA三个

^*使用下列缩写：SCMV：猿巨细胞病毒启动子；HCMV：人巨细胞病毒启动子；HSVlap1：单纯性疱疹病毒潜伏相关启动子1；gag-pol：HIV gag-pol融合体；ntv：HIV nef-tat-vif融合体；env：HIV包膜；HCMV-[无]、Lap1-[无]表示转录单元不含开放阅读框(参见质粒301)；^**IL-12可来源于鼠类或恒河猴或人类。

如上所述，构建多个单一和二联转录单元质粒用以与所述三联转录单元质粒的表达进行比较。参见表1和2。通过用所述单一、二联、三联转录单元质粒瞬时转染293及/或RD细胞并通过西方印迹使用适宜抗体分析细胞溶解产物来评估这些含有gag、pol、env、nef-tat-vif、gag-pol和gag-pol-nef-tat-vif的构造的表达模式。

实施细胞溶解产物中gag自各种构造的活体外表达且使用西方印迹检测结果。参见图2和表1。分别用小鼠抗gag单克隆和人类多克隆血清检测gag和pol蛋白。将分子量标记和HIV p24加入前两个泳道作为标准。所述表达gag的单一转录单元质粒102在第一样品泳道进行电泳。具有两个转录单元且两个转录单元具有插入开放阅读框的质粒是质粒201、203和204，所有都产生大量的gag或含有gag的多聚蛋白，例如gag-pol-nef-tat-vif或gag-pol。在gag-pol融合构造中，使gag与pol之间的移码序列突变以允许gag和pol自同一阅读框表达。二转录单元质粒201、203和204所产生的gag少于单一转录单元质粒102。编码gag-pol融合体的二联或三联转录单元质粒表达等量的gag-pol多聚蛋白，其迁移为约180kd的预期大小。还在经转染细胞的细胞溶解产物中检测gag自编码一大gag-pol-ntv多聚蛋白的质粒203的表达且所述蛋白迁移为约220kD的预期大小。然而，自此大融合体(质粒203)的表达低于编码gag-pol的质粒302和303的表达。三转录单元质粒303也产生了大量呈gag-pol多聚蛋白形式的gag，但gag少于所述单一转录单元质粒且约等于由二联转录单元质粒产生的水平。插入有两个开放阅读框且一个转录单元没有开放阅读框的三转录单元质粒302所产生的gag与二转录单元质粒的水平近似相同。参见图2。

实施细胞溶解产物中pol自各种构造的活体外表达谱分析且使用西方印迹检测到的结果与在gag情形中观察到的模式相类似。参见图3和表1。在此情形中，用人类多克隆血清检测pol蛋白。将分子量标记和HIV逆转录酶加入前两个泳道作为标准。表达pol的单一转录单元质粒103在第一样品泳道中进行电泳。接下来，具有两个转录单元且两个转录单元具有插入的开放阅读框的质粒201、203和204都产生了大量的pol或含有pol的多聚蛋白，例如gag-pol-nef-tat-vif或gag-pol。与gag的情形相反，二转录单元质粒201、203和204与单一转录单元质粒103产生约相同水平的pol。pol和gag-pol融合体表达的pol多聚蛋白迁移为如下预期大小：pol为约110kd，gag-pol为约180kd且gag-pol-nef-tat-vif为约250kd。三转录单元质粒303也产生了呈gag-pol多聚蛋白形式的pol但pol少于所述单一和二联转录单元质粒。另一方面，插入有两个开放阅读框且一个转录单元没有开放阅读框的三转录单元质粒302表达的呈gag-pol多聚蛋白形式的pol与二转录单元质粒201和203的水平近似相同。参见图3。在本实例中，质粒204表达的pol的水平大于其它二转录单元质粒201和203。参见图3。

对称作nef-tat-vif或NTV的HIV调节蛋白的融合体在细胞溶解产物中的活体外表达实施类似分析。参见图4和表1。用小鼠抗-vif单克隆抗体检测NTV蛋白。将分子量标记和重组HIV vif p23分别加入前两个泳道作为标准。分别受HCMV或Lap 1启动子控制表达NTV的二单一转录单元质粒104和105在前两个样品泳道中电泳。参见图4。两个质粒所谓nef-tat-vif表达水平近似相同。接下来，具有两个其中插入开放阅读框的完整转录单元的两个质粒(质粒202和203)都产生了大量的nef-tat-vif多聚蛋白。质粒203的nef-tat-vif蛋白表达水平似乎较低，但预计其原因在于所表达的多聚蛋白很大(gag-pol-nef-tat-vif，约220kD)。插入有两个开放阅读框且一个转录单元没有开放阅读框的三转录单元质粒302产生的nef-tat-vif水平与单一转录单元质粒近似相同。参见图4。插入有三个开放阅读框的三转录单元质粒303也产生了大量nef-tat-vif多聚蛋白。具体而言，三转录单元质粒303产生的nef-tat-vif少于单一转录单元质粒(104和105)且约等于或好于由二联转录单元质粒(202和203)产生的nef-tat-vif多聚蛋白的水平。参见图4。

评定各个单一、二联和三联转录单元质粒在细胞溶解产物中表达HIV-包膜基因的能力。参见图5和表1。用小鼠抗-env单克隆抗体检测包膜蛋白。将分子量标记和重组HIVgp120分别加入前两个泳道作为对照。第一样品泳道包含自受HCMV启动子控制的表达env的单一转录单元质粒101表达的蛋白质。参见图5。表达了大量包膜糖蛋白。接下来，三个具有两个完整转录单元(有两个插入的开放阅读框)的质粒(质粒202、203和204)产生了大量包膜糖蛋白。在每一情形中，包膜基因都受到SCMV启动子的控制。三转录单元质粒303也产生了大量env糖蛋白，但与单一和二联转录单元质粒(101、202、203和204)比较时表达水平降低2至3倍。参见图5。

结论

根据半定量活体外表达分析，数据表明，所有的插入的HIV基因(包括gag-pol、env和ntv)都以显著水平自携带三个独立转录单元的三联启动子质粒表达。

实例5：在每一质粒中DNA浓度恒定情况下经由多个质粒或单个质粒的多基因表达

接下来，将自编码多个基因的单个三联转录单元质粒的表达与多个质粒(每一个自相同基因阵列表达单个基因)加以比较，其中使每一质粒中的DNA恒定在1μg。在每一情形中，还通过补充不含开放阅读框插入序列的DNA质粒使DNA的总量恒定在4μg。使用培养细胞(用1μg每一质粒瞬时转染)评估HIV gag表达，且通过西方印迹分析细胞溶解产物。如图6中所示，在泳道2(两个质粒)、泳道3(一个质粒)、泳道4(一个质粒)和泳道5(四个质粒)中容易检测到HIV gag表达。泳道1(三个质粒)中的HIV gag表达低。三转录单元质粒303也产生了大量gag蛋白，但少于含有更多质粒的组合。

评估HIV env自单个或多个质粒的表达且结果示于图7中。另一方面，将1μg的每一质粒瞬时经转入培养细胞并通过西方印迹分析细胞溶解产物。结果显示，在泳道1(3质粒)，泳道2(两个质粒)、泳道3(一个质粒)、泳道4(一个质粒)和泳道5(四个质粒)中容易检测到HIV env表达。在每一情形中，通过补充不含开放阅读框插入序列的质粒DNA使DNA总量等于4μg来将DNA的总量恒定在4μg。三转录单元质粒303也产生了大量env糖蛋白。参见图7。在此情形中，所述单个三转录单元质粒303产生的env糖蛋白量与泳道5(其中使用4个质粒)中产生的糖蛋白量相当。

如图8中所示，使用1μg每一质粒(瞬时转染入培养细胞)评估HIV nef-tat-vif自单个或多个质粒的表达且通过西方印迹分析细胞溶解产物。参见图8。结果显示，在泳道1(3个质粒)、泳道2(2个质粒)、泳道3(1个质粒)、泳道4(一个三转录单元质粒)和泳道5(4个质粒)中检测到HIV nef-tat-vif表达。参见图8。使DNA的总量恒定在4μg。三转录单元质粒303产生可大量nef-tat-vif蛋白，但少于含有两个质粒的组合。

结论

如图6、7和8所示，使用三转录单元质粒(303)时，编码gag-pol、env和ntv蛋白的所有三个开放阅读框都同时以类似水平表达，从而确定了所述质粒的功能。

实例6：在总DNA浓度恒定情况下经由多个质粒或单个质粒的多基因表达

在浓度为2μg的三联转录单元质粒与的每一含1μgDNA的两个质粒组合之间比较HIV基因gag、pol、env和nef-tat-vif的表达。使总DNA浓度恒定在2μg，如图9、10、11和12所示。

图9显示，自两质粒组合或自三联转录单元质粒的pol蛋白表达是类似的。泳道2显示自质粒201和202的组合的pol蛋白表达的西方印迹，两个二联转录单元质粒经构建可表达HIV基因gag、pol、nef-tat-vif和env的完整阵列。接下来，使用pol蛋白的西方印迹评估pol蛋白自二联转录单元质粒与单一转录单元质粒的两个的组合的表达，所述组合正以各种形态表达gag、pol、env和nef-tat-vif。参见图9，泳道3(质粒204和104)和泳道5(质粒302和101)。在每一情形中都存在可检测的pol表达。泳道4包含自质粒203表达的pol蛋白的西方印迹，所述质粒203是一正表达HIV基因gag-pol-nef-tat-vif和env的整个阵列的二联转录单元质粒。参见图9。泳道6包含自质粒303表达的pol蛋白的西方印迹，所述质粒303是表达HIV基因gag-pol env和nef-tat-vif的整个阵列的三联转录单元质粒的实例，如实例2和3中所述。参见图9。

图10和图11对gag和包膜蛋白自二质粒组合的表达与自三联转录单元质粒的蛋白表达加以比较。泳道2显示gag和env蛋白自质粒201和202的组合的表达的西方印迹，所述质粒是经构建可表达HIV基因gag、polnef-tat-vif和env的整个阵列的两个二联转录单元质粒。接下来，使用西方印迹评估gag和env蛋白自二联转录单元质粒和单一转录单元质粒的组合的表达。参见图10和图11：泳道3(质粒204和104)和泳道5(质粒302和101)。质粒302是一作为二转录单元质粒发挥作用的三转录单元质粒，原因在于其仅具有两个插入的开放阅读框。参见表2。在每一情形中都存在可检测的gag和env表达。参见图10。泳道4例示自质粒203表达的gag和env蛋白的西方印迹，所述质粒是表达HIV基因gag-pol-nef-tat-vif和env的整个阵列的二联转录单元质粒。参见图10和11。泳道6包含自实例2和3中所述的三联转录单元质粒303表达的gag和env蛋白的西方印迹。参见图10和11。gag和env蛋白自所述三联转录单元质粒303的表达与质粒组合的表达相当。

图12使用西方印迹检测对nef-tat-vif多聚蛋白自各种质粒组合的表达与自三联转录单元质粒的蛋白表达加以比较。泳道2显示nef-tat-vif多聚蛋白自质粒201和202的组合的表达的西方印迹，两个二联转录单元质粒经设计可表达HIV基因gag、pol、nef-tat-vif和env。泳道3和5显示用西方印迹检测的nef-tat-vif多聚蛋白自二联转录单元质粒和单一转录单元质粒的两个不同组合的表达。参见图12：泳道3(质粒204和104)和泳道5(质粒302和101)。如上所述，质粒302是一作为二转录单元质粒发挥作用的三转录单元质粒，原因在于其仅具有两个插入的开放阅读框。参见表2。在此情形中，泳道5中所见的nef-tat-vif蛋白自质粒302的表达水平低于自质粒201和202(泳道2)或204和104(泳道3)的组合的表达水平。参见图12。泳道4绘示nef-tat-vif多聚蛋白自质粒203的表达，所述质粒是表达HIV蛋白gag-pol-nef-tat-vif和env的整个阵列的二联转录单元质粒。参见图12。泳道6绘示nef-tat-vif多聚蛋白自三联转录单元质粒303的表达。参见图12。nef-tat-vif自303的表达明显高于自质粒302的表达。令人注意的是，自二转录单元质粒(203)(受一个启动子控制表达大gag-pol-nef-tat-vif多聚蛋白而受另一启动子控制表达env蛋白)的表达明显低于编码来自三个独立转录单元的相同基因的质粒303的表达。

总之，使用所述三联转录单元质粒时，三个开放阅读框能够以近似相等的水平同时表达且整体水平与编码所述基因的单一和二元启动子构造都相当。活体外基因表达数据表明，在多个HIV基因自三联转录单元质粒表达时不存在明显的启动子干扰。因此，可以适当方式将各个转录单元置于所述载体中。

实例7：在总DNA浓度不保持恒定情况下经由多个质粒或由单个质粒的多基因表达

将自编码多个基因的单个三联转录单元质粒的表达与表达相同基因阵列的多个质粒加比较，其中使每一质粒的DNA使恒定在1μg。与实例5相反，DNA的总量没有用不含开放阅读框插入序列的质粒DNA加以补充来补偿DNA的总量。未显示数据，但归纳如下。

在本实例中，使用用1μg每一质粒瞬时转染的培养的293细胞评估HIV gag、pol、env和ntv表达并通过西方印迹分析细胞溶解产物。用组合：三个质粒(101、104、301)、两个质粒(201和202)、一个质粒(203)、一个质粒(303)和四个质粒(101、102、103、104)转染，由此检测HIV gag表达。三转录单元质粒303产生大量gag蛋白，相比之下组合需要更多质粒。具体而言，三转录单元质粒303产生的gag多聚蛋白多于具有所有六个HIV基因的二转录单元质粒203且明显低于具有所有六个HIV基因的二转录单元质粒201和202的组合。gag自三个质粒(101、104、301)的组合的表达较弱，其中gag作为SCMV启动子驱动的gag-pol融合体表达。

还评估了HIV env自单个或多个质粒的表达。结果证明，易于自三个质粒(301、101和104)、两个质粒(201和202)，一个质粒(203)，一个质粒(303)和四个质粒(101、102、103和104)的组合检测到HIV env表达。DNA总量取决于使用的质粒数，其中每个质粒含有1μg经转染DNA。在此情形中，所述三转录单元质粒303与其它质粒或质粒组合相比产生更多的env糖蛋白。

使用瞬时转染入培养细胞之1μg每一质粒评估HIV nef-tat-vif自单个或多个质粒的表达并通过西方印迹分析细胞溶解产物。自三个质粒(301、101和104)，两个质粒(201和202)、一个质粒(203)、一个质粒(303)和四个质粒(101、102、103和104)的组合检测到HIV nef-tat-vif表达。三转录单元质粒303产生大量nef-tat-vif蛋白。

结论

设计并构建编码以不依赖于Rev的方式表达高水平特异性蛋白的多个HIV基因的三联转录单元质粒，其确认单个质粒构造可独立有效地表达三个转录物。在本实例中，对HIV基因自所述三联转录单元质粒的表达与相同基因自单或二联转录单元构造的表达加以比较。数据表明，自三联转录单元质粒的基因表达在与由单或双表达盒表达者比较时水平较低。然而，在上述实例中发现HCMV启动子驱动之基因表达高于SCMV启动子，HSV-lap1启动子更低。在所述质粒中定位表达具有较高至较低免疫原性的抗原的基因时，应考虑所述三联转录单元构造中启动子强度的差异。

实例8.包含一个、两个或三个完整转录单元的质粒载体的鼠类免疫研究

实施鼠类研究来确定并比较自六个HIV-1基因(包括gag、pol、env，nef、 tat及vif)表达蛋白的三转录单元质粒载体的免疫原性功能。具体而言，对各种基于单一、二联和三联质粒DNA的免疫原性组合物在Balb/c小鼠体内引发多抗原特异性细胞调节的免疫反应的相对能力加以比较。

如表3中所概述用总共100μg剂量的DNA经肌内免疫Balb/c小鼠。在所有情形中，用0.25％布比卡因调配免疫原性组合物并以100μl体积将其注射入四头肌中。第二次免疫后10天，宰杀动物并分离出血清和脾脏用于免疫分析。分析经免疫小鼠血清中的抗-gag及抗-env特异性抗体滴定度。脾脏用于使用如下文所述的ELISPOT分析测量抗原特异性IFN-γ分泌细胞。

动物

对于这些研究，使用4至6周龄雌性Balb/c小鼠。根据实验室动物照管和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，National Research Council，NationalAcademic Press，Washington，DC，1996)养护小鼠。此外，使用和照管小鼠的程序由WyethResearch′s Institutional Animals Care and Use Committee批准。

免疫原性组合物和免疫

使用编码HIVenv gp160、gag p55、pol或a nef-tat-vif融合蛋白的各种质粒DNA表达载体作为实验免疫原性组合物，且使用空表达载体骨架作为对照免疫原性组合物载体。有关研究设计参见下文表3。在瞬时转染人类横纹肌肉瘤(RD)细胞后通过西方印迹确认各种表达载体的HIV基因表达。参见实例4至7。

用于这些研究的佐剂也可经由DNA质粒递送。在本实例中，所有动物都共同注射有25μg表达11-12的212号质粒。这种佐剂质粒是编码鼠类IL-12 p35和p40基因的二转录单元表达质粒(表1中212号质粒)。参见表1。IL-12 p35亚单位在HCMV立即早期启动子和SV40聚腺苷酸化信号的控制下表达，而IL-12 p40亚单位在猿CMV启动子(SCMV)和BGH聚腺苷酸化信号的控制下表达。在瞬时转染RD细胞后通过用抗-小鼠IL-12 p70捕获ELISA(Endogen，Woburn，MA)筛选细胞上清液来确认鼠类IL-12的产生(数据未显示)。

表3.小鼠研究设计-两次免疫

组编号质粒编号 质粒说明总DNA(μg)小鼠编号免疫时间表(周)1303 HCMV-env；SCMV-gag/pol；lap-ntv10090-31a203 HCMV-gag/pol；SCMV-env；10090-32b101+110 HCMV-env HCMV-gag-pol-ntv505090-32c104+204 HCMV-ntv HCMV-gag-pol，SCMV-env505090-32d111+202 HCMV-gag-pol HCMV-ntv，SCMV-env505090-32e201+202 HCMV-pol，SCMV-gag HCMV-ntv， SCMV-env505090-33a111101 HCMV-gag/pol HCMV-env333390-3

104 HCMV-ntv333b101104201 HCMV-env HCMV-ntv HCMV-pol，SCMV-gag33333390-33c102103202 HCMV-gag HCMV-pol HCMV-ntv，SCMV-env33333390-34001载体对照10060-3

用于免疫的表达质粒由Puresyn公司(Malvern，PA)生产。质粒在大肠杆菌中繁殖，通过碱性溶解由细胞中分离，通过柱层析纯化并逐个以2.5mg/mL的浓度在含有0.25％作为促进剂的布比卡因的等渗柠檬酸缓冲液(29.3mM柠檬酸钠，0.67mM柠檬酸，150mMNaCl，0.34mM EDTA，pH＝6.4-6.7)中加以调配，以形成DNA：布比卡因复合物。对于所有各组，将佐剂质粒与抗原表达质粒混合作为所述免疫原性组合物的一部分。最终质粒制备物显示由＞90％的超螺旋质粒DNA组成且残余的内毒素显示为＜30EU/mg的DNA(数据未显示)。恰在免疫前，通过混合适宜质粒表达载体调配物来制备免疫原性组合物。使用18号针和0.3mL注射器通过肌内注射将所得免疫原性组合物投予至两侧四头肌(0.1cc总注射体积，其中每个部位0.05cc)。

鼠类IFN-γELISPOT分析

最初作为检测分泌抗体B-细胞的方法开发了ELISPOT(或ElisaSpot，酶联免疫斑点分析(Enzyme-linked ImmunoSpot Assay)的缩写)。所述方法现已适合确定针对特异性抗原的T-细胞反应，通常表示为每一百万中活化的细胞数。在本实例中，用干扰素γ(IFN-γ)产生作为单一细胞活化的读数。

在本分析中，ELISPOT用于确定由表达特异性HIV抗原的免疫原性组合物引发的细胞毒性T-细胞活性。对于IFN-γELISPOT反应的确定来说，使用小鼠IFN-γELISPOT试剂盒(材料号551083，BD Biosciences，San Diego CA)。在每孔中具有一膜底的96孔微量滴定板中实施ELISPOT分析。具体而言，用浓度为10mcg/mL的纯化的抗-小鼠γ-干扰素(mIFN-γ)单克隆抗体(材料号51-2525KC，BD-Biosciences，San Diego CA)过夜涂覆96孔平底ELISPOT板(ImmunoSpot，Cell Technology Limited，Cleveland Ohio)，此后各板用无菌1×磷酸盐缓冲盐水(1×PBS)洗涤3次且随后用R10完全培养基(含有10％热灭活的(HI)胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100mcg/mL硫酸链霉素、1mM丙酮酸钠、1mM HEPES、100mcM非必需氨基酸的RPMI-1640)封阻2小时。首先通过在两个无菌显微镜载玻片的磨砂端之间研磨脾脏来处理小鼠脾脏。将所得匀浆液重悬于10毫升完全R05培养基(补充有5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100mcg/mL硫酸链霉素、1mM丙酮酸钠、1mM HEPES、100mcM非必需氨基酸的RPMI 1640培养基)中，且随后通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心作用分离脾细胞并重悬于含有2mcg/mL Con-A(Sigma)、覆盖HIV gag p55、HIV-1 6101 env gp160、pol、nef、tat、vif的肽池(11个氨基酸重叠的15个单体单元；每一最终肽浓度为2.5mcM)的完全R10培养基或单独培养基中。输入细胞数是4×10⁵个脾细胞/孔(4×10⁶个脾细胞/mL)并在两个重复孔中分析。将脾细胞在37℃下培育22小时至24小时且随后通过首先用去离子水洗涤3次并在冰上培育10分钟至20分钟将其从ELISPOT板上移除。然后各板用含有0.1％Tween-20的1×PBS洗涤6次。随后，各板用经R10稀释的抗-小鼠IFN-γ生物素化检测抗体(5.0mcg/ml，材料号51-1818KZ，BD-Biosciences，San Diego CA)处理并在4℃下培育过夜。然后各ELISPOT板用含有0.1％Tween-20的1×PBS洗涤10次并用经R10按1∶100稀释的100mcL/孔的抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶共轭物(目录号51-9000209，BD-Biosciences，San Diego CA)处理并在室温又培育1小时。通过将板用含有0.1％Tween-20的1×PBS漂洗6次并用1×PBS漂洗3次来去除未结合的抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶共轭物。接下来，通过将20mcL/mL的AEC色原体(Chromogen)在AEC底物溶液(目录号551951，BD-Biosciences，San Diego CA)中加以稀释来制备过氧化物酶底物。通过加入100mcL/孔的底物溶液持续3分钟至5分钟来起始显色。最后，各板用水漂洗并在空气中干燥。使用可摄取ELISPOT板中单个孔的图像的ELISPOT分析仪或成像装置测定结果且随后数斑点。在此情形中，使用Immunospot读数器(CTL公司，Cleveland，OH)计数所得斑点。如果反应(减去培养基背景)较培养基反应高≥3倍且每10⁶个脾细胞中≥50个斑点形成细胞分泌干扰素γ(#SFC/10⁶个脾细胞)，则认为肽特异性IFN-γELISPOT反应呈阳性。

如表4所示，用由表3所示质粒构成的免疫原性组合物免疫两次后测量多质粒DNA免疫后小鼠体内各个HIV-1抗原和总HIV特异性IFN-γELISPOT反应。

表4.两次免疫后的鼠类免疫反应

    组ID   gag特异性   反应^*  pol特异性  反应   env特异性   反应ntv#物异性反应总HIV特异性反应    对照   2  0   305    1a   46  43   2384331    2e   29  138   18112360    2c   102  118   20344467    1   20  39   4682529    3b   16  109   40420548    2d   188  185   2518632    2b   43  65   5486662    3a   139  105   802181064    3c   174  378   616111179

^*将抗原特异性IFN-γELISPOT反应报告为每10⁶个脾细胞中分泌干扰素γ的斑点形成细胞(#SFC/10⁶个脾细胞)。

#ntv：nef-tat-vif融合蛋白。

在所有情形中，nef-tat-vif特异性反应相对较低。其在1组小鼠中最低，其中nef-tat-vifwas在lap1启动子的控制下。然而，在上述实例4至7中发现HCMV启动子驱动的基因表达高于SCMV启动子，且SCMV-启动子驱动的基因表达高于HSV-lap1启动子。三联启动子构造中所使用的启动子强度的差异可能是造成此构造用于免疫原性组合物时所观察到的诱导的免疫反应较低的原因。

对于融合蛋白的使用，比较HIVpol在3a和3c中的ELISPOT反应，使用融合多肽而非单多肽时似乎存在免疫原性某种程度的降低。

另一考虑是所检查的蛋白质的相对免疫原性。例如，通过检查3b与3c(其中HCMV启动子驱动的基因表达可驱动含有一单一转录单元的单一质粒上的基因env、gag、pol和nef-tat-vif中的每一个)，仍存在免疫原性的分级，其近似为env＞pol＞gag＞nef-tat-vif。如上所述，在设计用于免疫原性组合物的各个质粒和组合质粒时，应同时考虑启动子强度和相对免疫原性。

接下来，实施另一研究来评估在使用一、二和三质粒免疫原性组合物进行三次免疫时对免疫反应的影响。参见表5。如上所述对各组的6只小鼠进行免疫，但所述小鼠被免疫三次(每次间隔三周)而非免疫两次(每次间隔三周)。参见表5。1组、2e组和3a组使用与表3中相同的免疫原性组合物。此外，在使用三次免疫的研究中，构建一个新质粒(指定为301)以直接对HCMV启动子驱动的gag/pol融合蛋白的基因表达与SCMV启动子驱动的gag/pol融合蛋白的基因表达加以比较。比较表5与表6中的3a组与4b组。此质粒也允许比较自三联转录单元质粒表达的gag-pol融合体与自由类似启动子驱动的三个单一转录单元质粒表达的gag-pol融合体和env基因的免疫原性潜能。比较表5与表6中的1组和4b组。在最后一次加强免疫后17天收获脾组织并分析针对各个HIV蛋白的抗原特异性ELISPOT反应。

表5.鼠类研究设计-三次免疫

¹组编号质粒编号 质粒说明总DNA(μg)小鼠编号 免疫时间表 (周)1303 HCMV-env；SCMV-gag/pol；lap-ntv1009 0-3-62e201+202 HCMV-pol，SCMV-gag HCMV-ntv，SCMV-env50509 0-3-63a111101104 HCMV-gag/pol HCMV-env HCMV-ntv3333339 0-3-6

¹组编号质粒编号 质粒说明总DNA(μg)小鼠编号 免疫时间表 (周)4b101104301 HCMV-env HCMV-ntv SCMV-gag/pol，HCMV-[无]，Lap 1-[无]3333339 0-3-6对照001载体对照1006 0-3-6

¹1组、2e组和3a组使用与表3中相同的免疫原性组合物，但实施三次免疫。

由三转录单元质粒诱导的总细胞免疫反应近似相同或高于含有单一和二联转录单元质粒的免疫原性组合物诱导的细胞免疫反应。参见表6。

表6.鼠类细胞免疫反应-三次免疫

组IDgag特异性反应^*pol特异性反应env特异性反应ntv#-特异性反应总HIV-特异性反应13458986110772e32363431698953a1741627138211314b473572279883对照00325

^*将抗原特异性IFN-γELISPOT反应报告为#SFC/10⁶个脾细胞。

#ntv：nef-tat-vif融合蛋白。

免疫原性组合物的下列三次免疫的ELISPOT结果表明，用基于三转录单元质粒的免疫原性组合物三次免疫后的HIV细胞免疫反应在所述第三免疫后增加100％。然而，反应平衡仍会随所涉及的启动子强度和抗原的相对免疫原性而变化。清楚的是，对于其中制造优势是必需的某些情形而言，三联转录单元质粒在免疫原性组合物会成为投予三个或三个以上基因的良好载体。

已发现，迄今在免疫原性组合物中测试的所有质粒设计都可正确表达抗原且具有免疫原性，从而可在三次免疫后活化细胞免疫反应。然而，在三联启动子构造中置于HSV Lap1启动子控制下时，无法检测到nef、tat和vif特异性反应。

在某些情况下，可针对一定范围抗原诱发广泛且平衡的细胞免疫反应的免疫原性组合物会较佳。在此情形中，如表3和表4所示的二和三pDNA免疫原性组合物设计(2d、3a和3c)似乎能够引发有效(＞600 SFC/10⁶个细胞)、平衡的HIV特异性ELISPOT反应且对于非人类灵长类动物中的进一步测试选则所述设计。参见实例9。

实例9.用包含一个或两个完整转录单元的质粒载体进行的恒河猴免疫研究

在实例8的表3和4表中，三pDNA免疫原性组合物(特定而言为2d组、3a组和3c组中所用的免疫原性组合物)似乎能够针对所有六个HIV蛋白引发有效(＞600 SFC/10⁶细胞)、平衡的HIV特异性ELISPOT反应且选则所述组合物用于非人类灵长类动物中进一步测试。

实验设计

对于本研究，总共使用30只来源于印度的Mamu-A^*01阴性、人工繁殖的雌性恒河猴(Macaca mulatta)。使恒河猴居住在New Iberia研究中心(New Iberia，LA)并根据实验室动物照管和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，National ResearchCouncil，National Academic Press，Washington，DC，1996)养护。此外，使用和照管恒河猴的程序由Wyeth Research′s Institutional Animals Care and Use Committee批准。

免疫：

用于免疫的表达质粒由Puresyn公司(Malvem，PA)生产。在大肠杆菌中繁殖质粒，通过碱性溶解从细胞中分离，并通过柱层析纯化。然后以2.5mg/mL的浓度在含有0.25％布比卡因的等渗柠檬酸缓冲液(29.3mM柠檬酸钠、0.67mM柠檬酸、150mM NaCl、0.34mM EDTA，pH＝6.4-6.7)中逐个调配质粒以形成DNA：布比卡因复合物。最终质粒制备物显示由＞90％的超螺旋质粒DNA组成且残余的内毒素显示为＜30EU/mg的DNA(数据未显示)。

用于恒河猴研究的佐剂是作为免疫原性组合物一部分递送的DNA质粒。此佐剂质粒是编码恒河猴IL-12 p35和p40基因的二转录单元表达质粒(表1中的212号质粒)。参见表7。所述IL-12 p35亚单位是在HCMV立即早期启动子和SV40聚腺苷酸化信号的控制下表达，而IL-12 p40亚单位是在the猿CMV启动子(SCMV)和BGH聚腺苷酸化信号的控制下表达。通过分析来自经瞬时转染的RD细胞的上清液在静止恒河猴外周血淋巴细胞中(PBL；数据未显示)诱发IFN-γ分泌的能力来确认质粒表达的恒河猴IL-12的生物活性。

表7.恒河猴研究设计

组编号质粒编号¹质粒说明总DNA(μg)动物数2d111+HCMV-gag-pol4.256202HCMV-ntv，SCMV-env4.25212HCMV-IL-12 p35，SCMV-IL-12 p401.53a111HCMV-gag/pol2.86101HCMV-env2.8104HCMV-ntv2.8212HCMV-IL-12 p35，SCMV-IL-12 p401.53c102HCMV-gag2.86

组编号质粒编号 ¹质粒说明总DNA(μg)动物数103 HCMV-pol2.8202 HCMV-ntv，SCMV-env2.8212 HCMV-IL-12 p35，SCMV-IL-12 p401.53cE²102 HCMV-gag0.566103 HCMV-pol0.56202 HCMV-ntv，SCMV-env0.56212HCMV-IL-12 p35，SCMV-IL-12 p400.304a³102 HCMV-gag2.16101 HCMV-env2.1103 HCMV-pol2.1104 HCMV-ntv2.1212 HCMV-IL-12 p35，SCMV-IL-12 p401.54--001 载体对照8.56对照212 HCMV-1L-12p35，SCMV-IL-12 p401.5

¹所有组都接受1.5mg编码作为佐剂的恒河猴IL-12(rIL-12)的212号质粒(HCMV-IL-12p35，SCMV-IL-12 p40)。

²纳入第二个3c组，其中在投予方案中加入电穿孔。

³稍晚些时间在所述恒河猴研究中加入额外组(4a)以确定指定的4载体疫苗设计的免疫原性。

所有恒河猴都按0、4和8周的时间表免疫。恰在免疫前，混合适宜质粒表达载体调配物以形成免疫原性组合物并通过使用18号针和3mL注射器肌内注射(2d组、3a组、3c组和对照)入两侧三角肌两侧四头肌(1ml注射体积，每个部位2.5mgDNA)投予。

通过使用具有21号针的标准1ml_注射器(Braun)肌内注射入两侧三角肌和两侧四头肌(隔开8.0mm)且随后立即进行电刺激(即，电穿孔)来用pDNA免疫3cE组恒河猴。注射体积为0.2ml，每次注射在每个部位提供0.5mg质粒DNA，总共达2mg总DNA。因此，电穿孔组(3cE)接受投予给其它组的总DNA的1/5。

在本实例中，电穿孔条件如下：六个20ms单极脉冲，250mA且约100V/cm。在每一脉冲之间有250ms的停顿。

不存在电穿孔时，表8所示结果表明，与基于含有至少一个具有一个以上转录单元的质粒的质粒组合的免疫原性组合物相比，基于具有一单一转录单元的质粒组合的免疫原性组合物(3a组)在10或16周后产生最高的总细胞免疫反应。比较3a与2d和3c。

表8.多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

总HIV特异性IFN-γELISPOT反应

                                     总HIV特异性IFN-γELISpot反应^*  组ID  基线  第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周  2d  43.8  ±10.5  286.5  ±234.9    278.7    ±104.5    403.1    ±89.9    348.3    ±108.8    769.9    ±340.4    407.5    ±82.2  3a  29.5  ±12.8  61.5  ±23.2    204.8    ±26.4    635.0    ±230.5    365.8    ±47.1    1652.5    ±563.3    1015.3    ±584.8  3c  35.5  ±9.0  56.5  ±12.3    138.3    ±32.5    892.5    ±277.5    300.0    ±95.9    786.7    ±213.1    816.3    ±330.6  3cE  41.5  ±13.6  1405.0  ±422.0    346.3    ±72.7    1287.9    ±365.6    3349.6    ±1575.9    3637.8    ±863.7    8140.8    ±1819.0  4a  18.8  ±8.2  52.1  ±13.3    43.3    ±16.6    272.9    ±60.0    230.0    ±40.5    190.6    ±38.9    nd¹  对照  32.0  ±12.5  10.2  ±2.7    33.2    ±12.0    24.2    ±9.3    16.7    ±4.0    12.1    ±4.1    47.1    ±13.7

^*将总HIV特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶PBL±标准误差。

¹nd，未进行

令人惊讶的结果是，电穿孔使总细胞免疫反应在第10周时增强450％以上且在第16周时增强990％以上。比较3cE与3c。表8所示结果表明，与基于具有一单一转录单元的质粒组合的免疫原性组合物相比，基于含有至少一个具有一个以上转录单元的质粒的质粒组合的免疫原性组合物在与电穿孔组合时在10或16周后产生最高的总细胞免疫反应。比较3c组和3a组。

在恒河猴研究中，当不使用电穿孔时，3a组产生最高的10或16周总HIV抗原特异性ELISPOT反应(1,652和1015 SFC/10⁶个细胞)。此反应与2d组(770 SFC/10⁶细胞)或3c组(787 SFC/10⁶细胞)无显著差异。参见表8。然而，藉助电穿孔能获得最高的ELISPOT反应。参见表8中的3cE组。

有趣的是，其中使用电穿孔的加强免疫后的峰值免疫反应较非电穿孔组晚些出现。例如，3a组动物的总HIV特异性IFN-γELIspot反应在第4周免疫或加强免疫后于第6周出现峰值。参见表8。相比之下，对于电穿孔组，峰值在接近第10周时出现。参见表8。

作为针对六个HIV蛋白的IFN-γELISPOT反应进一步分析细胞免疫反应。表9显示针对HIV env、gag、pol和nef-tat-vif蛋白融合蛋白的IFN-γELISPOT反应。在恒河猴研究中，当再一次不使用电穿孔时，3a组产生最高的针对env和nef-tat-vif的第10周HIV抗原特异性ELISPOT反应。参见表9。3c组动物产生最高的针对gag的ELISPOT反应且2d组产生最高的针对pol蛋白的ELISPOT反应。在表9中比较3a与2d和3c。迄今最高的ELISPOT反应是借助电穿孔获得的。参见表9中的3cE组。

表9.第10周时多质粒DNA疫苗接种后的各个HIV抗原特异性IFN-γELISPOT反应

                        抗原特异性IFN-γELISPOT反应^*    组ID    Env    Gag    Pol    ntv    总计    2d    360.4    ±111.8    107.9    ±45.2    204.0    ±182.6    97.6    ±67.6    769.9    ±340.4    3a    1170.4¹    ±427.0    43.8    ±17.5    173.8    ±97.7    264.6³    ±113.8    1652.5    ±563.3    3c    412.1    ±131.7    246.3²    ±59.7    106.7    ±60.5    21.7    ±8.9    786.7    ±213.1    3cE    861.1    ±292.5    1147.9    ±356.9    1023.1    ±384.0    605.7    ±159.3    3637.8    ±863.7    4a    132.9    ±33.9    29.4    ±6.5    9.1    ±5.4    19.2    ±7.9    190.6    ±38.9    对照    7.1    ±3.4    1.7    ±0.8    2.5    ±1.1    0.8    ±0.5    12.1    ±4.1

^*将各个HIV抗原特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBI±标准误差。

¹相对于2d组的统计学上更高的env特异性ELISPOT反应(p＜0.05)。

²相对于3a组的统计学上更高的gag特异性ELISPOT反应(p＜0.05)。

³相对于3c组的统计学上更高的ntv特异性ELISPOT反应(p＜0.05)。

表10显示最后一次免疫后第16周、第8周时针对HIV env、gag、pol和nef-tat-vif蛋白融合蛋白的IFN-γELISPOT反应。当不使用电穿孔时，3a组产生最高的针对env和nef-tat-vif的16周HIV抗原特异性ELISPOT反应，而3c组产生最高的针对gag和pol的10周HIV抗原特异性ELISPOT反应。借助电穿孔能获得最高的ELISPOT反应。参见表10中的3cE组。

表9和表10显示，所述免疫原性组合物中抗原表达质粒由3增加至4，针对所有HIV蛋白的免疫反应均降低。参见表9和表10。

表9和表10也显示，2d组中所述免疫原性组合物中具有两个抗原表达质粒(其中一个质粒具有两个转录单元)的质粒诱导出最广和最平衡的针对所有HIV蛋白的免疫反应。参见表9和表10。

表10：多质粒DNA疫苗接种后第16周的

各个HIV抗原特异性IFN-γELISpot反应

                        抗原特异性IFN-γELISpot反应^*    组ID    Env    Gag    Pol    ntv    总计    2d    217.5    ±33.3    76.3    ±25.8    81.3    ±32.2    32.5    ±14.3    407.5    ±82.2

    3a    831.0    ±457.8    39.7    ±35.6    80.2    ±68.7    64.3    ±25.6    1015.3    ±584.8    3c    437.5    ±187.9    250.0    ±88.2    96.3    ±68.0    32.5    ±10.7    816.3    ±330.6    3cE    1984.7    ±698.1    1975.3    ±567.2    2305.6    ±786.2    1875.3    ±624.4    8140.8    ±1819.0    4a    nd¹    nd    nd    nd    nd    对照    22.5    ±7.2    5.0    ±2.3    9.2    ±3.6    10.4    ±4.4    47.1    ±13.7

^*将各个HIV抗原特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表11显示最后一次免疫后第30周、第22周的针对HIV env、gag、pol和nef-tat-vif蛋白融合蛋白的IFN-γELISPOT反应。在恒河猴研究中，当再一次不使用电穿孔时，3a组产生最高的针对env、pol和nef-tat-vifHIV的抗原特异性ELISPOT反应。参见表11。3c组动物产生最高的针对gag的ELISPOT反应。在表11中比较3a与2d和3c。借助电穿孔能获得最高的ELISPOT反应。参见表11中的3cE组。

在小鼠和恒河猴研究中，抗原特异性ELISPOT反应一般在接受自身在HCMV启动子控制下的各个单独基因的各组中最高。在恒河猴研究中，电穿孔在产生免疫反应中是较所述免疫原性组合物是否包含具有一个抑或两个完整转录单元的质粒或是否使用融合蛋白更重要的因素。

表11：多质粒DNA疫苗接种后第30周的

各个HIV抗原特异性IFN-γELISpot反应

                     抗原特异性IFN-γ ELISpot反应^*    组ID    Env    Gag    Pol    ntv    总计    2d    44.2    ±11.6    6.7    ±3.1    8.8    ±6.3    4.6    ±3.6    64.2    ±16.0    3a    184.0    ±105.4    5.6    ±3.7    14.0    ±6.9    10.2    ±4.7    213.9    ±119.1    3c    52.5    ±11.7    25.4    ±6.6    2.9    ±2.0    0.8    ±0.8    81.7    ±19.6    3cE    831.3    ±339.1    768.9    ±216.7    907.4    ±476.5    886.4    ±371.8    3,393.9    ±920.4    4a¹    nd    nd    nd    nd    nd    对照    9.6    ±4.8    0.0    ±0.0    1.6    ±1.2    0.0    ±0.0    11.3    ±5.8

^*将各个HIV抗原特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹未进行

随时间变化的针对各个HIV蛋白的细胞免疫反应

用表7中所述质粒免疫后在第2周、4周、6周、8周、10周和16周量测针对各个HIV蛋白env、gag、pol、nef、tat和vif的IFN-γELISPOT反应。结果示于表12至表17中。

表12：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

HIV env特异性IFN-γELISpot反应

                                  HIVenv特异性IFN-γELISpot反应^*    组ID  基线    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d  17.7  ±4.5    204.0    ±162.8    182.3    ±64.8    295.1    ±60.9    209.6    ±66.1    360.4    ±111.8    217.5    ±33.3    3a  5.3  ±2.2    43.8    ±19.6    165.3    ±20.6    577.9    ±224.5    308.8    ±38.6    1170.4    ±427.0    831.0    ±457.8    3c  21.0  ±8.4    26.3    ±7.1    84.8    ±20.2    538.3    ±174.2    192.1    ±71.1    412.1    ±131.7    437.5    ±187.9    3cE  23.2  ±9.5    598.3    ±203.9    144.2    ±30.9    382.9    ±87.2    1165.8    ±647.7    861.1    ±292.5    1984.7    ±698.1    4a  14.6  ±8.7    24.2    ±10.1    22.1    ±9.6    254.2    ±57.5    169.2    ±33.5    132.9    ±33.9    nd¹    对照  13.7  ±5.4    3.0    ±1.6    17.2    ±9.0    17.1    ±6.0    9.2    ±2.6    7.1    ±3.4    22.5    ±7.2

^*将HIV env特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/106个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表13：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

HIV gag特异性IFN-γELISpot反应

                                HIVgag特异性IFN-γELISpot反应^*  组ID  基线    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周  2d  6.8  ±1.5    23.5    ±16.7    36.0    ±18.3    28.1    ±5.7    59.6    ±31.2    107.9    ±45.2    76.3    ±25.8  3a  2.2  ±1.0    9.0    ±3.4    21.5    ±4.9    17.5    ±11.5    10.0    ±2.7    43.8    ±17.5    39.7    ±35.6  3c  4.5  ±2.1    19.0    ±6.7    51.7    ±15.6    229.6    ±67.0    86.7    ±1.8    246.3    ±59.7    250.0    ±88.2  3cE  4.8    709.6    161.3    381.7    1169.6    1147.9    1975.3

±2.9    ±244.1    ±38.3    ±78.5    ±551.6    ±356.9    ±567.2  4a2.1±8.7    12.4    ±3.7    5.4    ±2.4    10.0    ±4.0    27.5    ±6.2    29.4    ±6.5    nd¹  对照3.2±2.2    1.0    ±0.6    7.7    ±4.5    1.7    ±0.8    2.1    ±1.2    1.7    ±0.8    5.0    ±2.3

^*将HIV gag特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表14：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

HIV pol特异性IFN-γELISpot反应.

                                 HIVpol特异性IFN-γELISpot反应^*    组ID  基线  第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d  12.2  ±4.3    33.8    ±31.3    27.7    ±7.6    53.3    ±32.3    41.7    ±25.1    204.0    ±182.6    81.3    ±32.2    3a  7.3  ±4.1    1.8    ±0.9    7.3    ±2.9    17.5    ±7.9    15.0    ±4.5    173.8    ±97.7    80.2    ±68.7    3c  6.5  ±3.4    3.5    ±2.1    1.8    ±1.3    102.1    ±42.3    17.1    ±6.8    106.7    ±60.5    96.3    ±68.0    3cE  3.7  ±2.4    54.6    ±30.5    22.1    ±9.1    316.3    ±215.8    497.9    ±179.7    1023.1    ±384.0    2305.6    ±786.2    4a  1.7  ±1.1    9.3    ±6.8    2.5    ±1.3    5.4    ±2.0    13.8    ±4.8    9.1    ±5.4    nd¹    对照  10.7  ±4.4    3.2    ±2.8    4.7    ±3.0    2.1    ±1.6    4.2    ±2.7    2.5    ±1.1    9.2    ±3.6

^*将HIV pol特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表15：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

HIV nef特异性IFN-γELISpot反应

                                 HIVnef特异性IFN-γELISpot反应^*    组ID  基线    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d  4.8  ±3.2    16.3    ±16.3    22.5    ±16.7    12.4    ±6.0    32.9    ±14.4    43.7    ±27.6    24.6    ±12.3    3a  20.1  ±9.8    2.5    ±2.0    7.9    ±3.6    13.8    ±5.2    22.5    ±9.8    192.1    ±76.7    54.8    ±25.4    3c  4.2  ±4.2    0.4    ±0.4    0.0    ±0.0    10.4    ±7.5    3.3    ±2.5    10.0    ±8.1    18.3    ±9.6

  3cE  5.1  ±3.4    11.9    ±7.2    11.7    ±7.7    67.1    ±56.6    281.7    ±207.0  403.2  ±158.3  1276.2  ±516.3  4a  0.4  ±0.4    1.7    ±1.4    5.4    ±3.1    2.1    ±2.1    10.4    ±5.0  8.3  ±4.4  nd¹  对照  3.6  ±2.8    0.8    ±0.8    0.8    ±0.8    0.0    ±0.0    0.0    ±0.0  0.0  ±0.0  2.9  ±1.5

^*将HIV nef特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表16：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

HIVtat特异性IFN-γELISpot反应

                                  HIVtat特异性IFN-γELISpot反应^*    组ID    基线    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d    7.1    ±3.3    0.8    ±0.5    7.1    ±4.2    8.5    ±3.3    2.9    ±2.1    4.6    ±2.1    3.8    ±1.4    3a    10.0    ±5.3    3.8    ±2.3    2.9    ±1.2    4.2    ±2.0    8.8    ±7.3    14.6    ±8.2    1.7    ±1.2    3c    6.2    ±4.5    6.3    ±2.9    0.4    ±0.4    8.3    ±3.5    0.4    ±0.4    1.3    ±1.3    2.9    ±1.2    3cE    7.6    ±5.2    22.4    ±13.8    2.1    ±1.0    25.0    ±17.8    75.0    ±42.4    29.3    ±19.9    190.0    ±88.4    4a    0.0    ±0.0    1.8    ±1.5    5.8    ±2.9    1.3    ±1.3    5.8    ±3.7    10.3    ±6.1    nd¹    对照    5.1    ±4.5    0.8    ±0.5    2.1    ±1.6    3.3    ±1.5    0.0    ±0.0    0.0    ±0.0    2.1    ±1.2

^*将HIV tat特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表17：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的

HIV vif特异性IFN-γELISpot反应

                                 HIVvif特异性IFN-γELISpot反应^*    组ID  基线    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d  9.4  ±3.9    7.9    ±7.9    3.3    ±2.9    5.8    ±2.7    1.7    ±1.2    8.7    ±8.1    4.2    ±1.9    3a  12.9  ±8.5    0.4    ±0.4    0.4    ±0.4    4.2    ±2.3    0.8    ±0.8    12.1    ±12.1    7.8    ±2.7    3c  6.4    0.8    0.0    3.8    0.4    2.5    11.3

  ±4.8    ±0.5    ±0.0    ±2.0    ±0.4    ±2.5    ±3.3  3cE  8.9  ±5.9    8.2    ±5.1    5.0    ±2.6    115.0    ±51.6    159.6    ±64.8    173.2    ±103.6    409.1    ±129.9  4a  0.0  ±0.0    2.8    ±1.8    2.1    ±0.8    0.0    ±0.0    3.3    ±1.1    0.6    ±0.2    nd¹  对照  6.8  ±2.2    1.2  ±0.8    0.8    ±0.8    0.0    ±0.0    1.3    ±1.3    0.0   ±0.0    5.4    ±3.1

^*将HIV vif特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个PBL±标准误差。

¹nd，未进行

显示随时间变化的针对各个蛋白的免疫反应的表12至表17表明，在指定的DNA投予浓度下所述免疫原性组合物中抗原表达质粒由3增加至4导致针对所有HIV蛋白的免疫反应降低。参见表12至表17。

实例10：HIV特异性CTL和辅助细胞的百分比的估测

通过在第10周和16周首先消耗未经分级的CD4+或CD8+细胞的外周血淋巴细胞(PBL)然后测量总HIV特异性IFN-γELISpot反应来估测HIV特异性CTL和辅助细胞的相对量。

磁珠消耗的PBL的制备

使用涂有抗-人类CD4-或CD8特异性小鼠单克隆抗体的聚苯乙烯磁珠按照制造商说明书(Dynal Biotech，Oslo，Norway)自未经分级的PBL消耗CD4+或CD8+细胞。简言之，洗涤新分离的恒河猴PBL并悬浮至存于含有2％FBS的冰冷1×PBS中，终浓度2×10⁶个细胞/mL。用含有2％FCS的1×PBS将涂有抗-人类CD4-或抗-CD8特异性小鼠单克隆抗体的Dynal微珠洗涤三次，随后以5∶1的磁珠：细胞比将其加入未经分级的PBL中，并在4℃下于旋转/倾斜装置上培育1小时。培育后，将磁珠/细胞悬浮液置于磁选柱上，且收集含有CD4+或CD8+细胞消耗的PBL的液流。用补充有5％FBS的完全培养基将所述细胞洗涤一次，并用补充有5％FBS的完全培养基悬浮至初始体积。等体积的未经分级和磁珠消耗的PBL直接用于ELISpot分析。

随后通过流式细胞术定量CD4+和CD8+细胞亚组消耗的效率和加至ELISpot板中的CD4+和CD8+细胞的精确数目。简言之，用含有2％FBS的1×PBS将磁珠消耗的PBL洗涤一次并在室温用下列单克隆抗体染色15分钟：抗-恒河CD3-异硫氰酸荧光素(FITC，克隆SP34；BD Pharmingen，San Jose，CA)；抗-人类CD4-藻红蛋白(PE，克隆M-T477；BD Pharmingen，San Jose，CA)；抗-人类CD8-甲藻素叶绿素蛋白(PerCP；克隆SK1；BDPharmingen，San Jose，CA)；和抗-人类CD20-别藻蓝蛋白(APC，克隆L27；BD Pharmingen，San Jose，CA)。然后用含有2％FBS、0.02％叠氮化合物的1×PBS将细胞洗涤一次并重悬于含有1％多聚甲醛的1×PBS中。FACS分析在FACSCalibur流式细胞分析仪(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)上实施并使用CellQuest软件加以分析。常规情况下％CD4+或CD8+细胞消耗＞95％(数据未显示)。

表18：第10周和16周未经分级和CD4+或CD8+细胞消耗的

PBL中的总HIV特异性IFN-γELISpot反应

    第10周    第16周    组ID    未经分级    CD4消耗   CD8消耗    未经分级    CD4消耗   CD8消耗    2d    1,501    ±632    1,494    ±801   364   ±77    902    ±173    758    ±141   431   ±93    3a    2,524    ±789    1,239    ±662   997   ±222    1,821    ±906    1,059    ±689   539   ±175    3c    1,484    ±359    908    ±268   536   ±147    1,532    ±556    856    ±308   607   ±203    3cE    6,651    ±1,326    10,563    ±3,388   1,921   ±274    13,361    ±2,770    21,051    ±7,067   2,754   ±543    4a    1,591    ±281    688    ±119   954   ±248    nd¹    nd   nd  对照    6    ±2    31    ±10   34   ±15    187    ±12    107    ±31   118   ±24

^*将总HIV特异性IFN-γELISpot反应报告为平均#SFC/10⁶个未经分级、经CD4±或CD8+消耗的PBL±标准误差。

¹nd，未进行

表18所示结果提供参与特定诱导的免疫反应的HIV特异性CTL细胞对辅助细胞的相对百分比的估测。可由所述数据中得出少数一般性观察结果。首先，2d组、3a组和3c组可引发类似大小的针对HIV的细胞免疫反应。3a组似乎可诱发较高水平的免疫反应，但此组的分析变差量也较高。在免疫同时使用电穿孔的情形中，针对3c组中质粒的免疫反应的大小增加约5倍至约10倍。参见表18，比较3cE和3c。同样值得注意的是，作为免疫同时使用电穿孔的结果，更多的细胞参与了免疫反应。

实例11：多质粒免疫诱导的HIV特异性抗体滴定度

包含质粒DNA的免疫原性组合物(IC)可提供优于目前使用的其它类型免疫原性组合物技术的若干优点。例如，与习用的基于蛋白质的亚单位IC相比，基于DNA的IC允许由主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原加工途径对经编码抗原进行有效加工和呈递。I类抗原加工在诱导CD8+T细胞调节的免疫反应方面起重要作用。然而，习用的基于蛋白质的亚单位IC通常在其引发抗原特异性抗体反应方面优于基于DNA的IC。

对于HIV病毒溶解产物特异性抗体滴定度的测定，在4℃下用20ng/孔经去污剂断裂的HIV-1_MN(Advanced Biotechnologies，Columbia，MD)涂覆ELISA板18小时。将经去污剂断裂的HIV-1_MN稀释于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(15mM Na₂CO₃，35mM NaHCO₃，pH9.6)中。对于HIV env特异性抗体滴定度的测定，稀释于1×PBS的纯化的HIV-16101 gp120(由Larry Liao，Duke University友情提供，20ng/孔)涂覆ELISA板。与HIV蛋白一起培育18小时后，用含有0.1％Tween 20的1×PBS将ELISA板洗涤五次并在室温用含有0.1％Tween 20和3％BSA的1×PBS封阻2小时。将来自经免疫和对照动物的血清样品用含有1％BSA和0.1％Tween-20的1×PBS稀释，并将其加入ELISA板中，开始按1∶100稀释且进一步在整个板中稀释3倍。经稀释的血清样品在4℃下与涂有蛋白的各板培育过夜。通过将对灵长类动物IgG有特异性的生物素偶联的抗体在室温培育2小时来达成抗原特异性免疫球蛋白的检测。用补充有0.1％Tween-20、1％BSA(Accurate Scientific，Westbury，NY)的1×PBS按1∶30,000稀释此抗体。接下来，洗去一级抗体且随后与抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶偶联的抗生物素二级抗体(500单位/ml储液，用补充有0.1％Tween-20、1％BSA的1×PBS按1∶10,000稀释，Roche immunochemical，Indianapolis，IN)在室温一起培育1小时。最后，通过加入100mcL/孔的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，Sigma)来显色。将抗原特异性抗体滴定度定义为得到大于相同动物的初始血清(即第0周)的O.D.₄₅₀的最后一个血清稀释的倒数+3个标准偏差。

测定多质粒DNA免疫前16周内某些时间点的HIV包膜滴定度并示于表19。将HIV-16101 env gp120 ELISA滴定度计算为得到大于相同动物的初始血清(即第0周)的O.D.₄₅₀的最后一个血清稀释的倒数+3个标准偏差。表19(以及下文表20)中的数据是以平均log₁₀滴定度±平均值标准误差显示。在此情形中，HIV-1 env滴定度＜2.00表示小于1∶100的终点滴定度且处于检测限以下。

表19：多质粒DNA免疫后随时间变化的

HIV-16101 env gp120特异性ELISA抗体滴定度

                                       HIV-1envELISA滴定度^*    组¹ID    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d    2.00    ±0.00    2.00    ±0.00    2.08    ±.035    2.43    ±0.21    2.73    ±0.27    2.59    ±0.20    3a    2.00    ±0.00    2.00    ±0.00    2.16    ±0.10    2.64    ±0.32    2.95    ±0.28    2.56    ±0.29    3c    2.00    ±0.00    2.00    ±0.00    2.16    ±0.16    2.48    ±0.21    2.80    ±0.32    2.95    ±0.37    3cE    2.16    ±0.16    2.72    ±0.16    4.39    ±0.49    3.67    ±0.44    5.18    ±0.20    4.78    ±0.23    4a    nd¹    nd    nd    nd    nd    nd    对照    2.00    ±0.00    2.08    ±0.08    2.00    ±0.00    2.16    ±0.10    2.16    ±0.16    2.32    ±0.16

^*将数据报告为平均log₁₀滴定度±平均值的标准误差。HIV-1 env滴定度≤2.00表示小于1∶100的终点滴定度且处于检测限以下。

¹nd表示未进行

如表19所示，用基于含有至少一个具有一个以上转录单元的质粒的质粒组合的免疫原性组合物免疫的3c组动物在第16周时获得最高的非电穿孔滴定度。然而，2d组和3a组的结果有些类似，但其中3a组动物在第8周和10周显示出最高的滴定度。参见表19，比较3a与2d和3c。基于含有至少一个具有一个以上转录单元的质粒的质粒组合且在免疫同时接受电穿孔-电刺激的免疫原性组合物迄今产生了最高的针对HIV包膜蛋白的滴定度。参见表19，比较3c与3cE。

多质粒DNA免疫的第2周、4周、6周、8周、10周和16周测定的整个病毒溶解产物的总HIV滴定度示于表20中。将HTV-1_MN病毒溶解产物特异性ELISA滴定度确定为得到大于相同恒河猴初始血清(即免疫前)的O.D.₄₅₀的最后一个血清稀释的倒数+3个标准差。在此表中，将数据报告为平均log₁₀滴定度±平均值的标准误差。需注意，抗体滴定度≤1.70表示小于1∶50的终点滴定度且位于检测限以下。表20中第16周的结果类似于表19中所示结果。

表20：多质粒DNA疫苗接种后随时间变化的总HIV-1特异性ELISA抗体滴定度

                                              总HIV-1ELISA滴定度^*    组ID    第2周    第4周    第6周    第8周    第10周    第16周    2d    1.70    ±0.00    1.70    ±0.00    1.75    ±0.05    1.75    ±0.05    2.04    ±0.28    1.70    ±0.00    3a    1.75    ±0.05    1.75    ±0.05    1.70    ±0.00    1.70    ±0.00    1.70    ±0.00    1.70    ±0.00    3c    2.06    ±0.19    2.11    ±0.18    1.75    ±0.05    1.88    ±0.13    1.85    ±0.07    1.90    ±0.06    3cE    1.88    ±0.13    1.88    ±0.13    3.46    ±0.53    2.38    ±0.34    4.36    ±0.16    3.75    ±0.29    4a    nd¹    nd    nd    nd    nd    nd    对照    1.70    ±0.00    1.75    ±0.05    1.70    ±0.00    1.70    ±0.00    1.91    ±0.21    1.91    ±0.21

^*将数据报告为平均log₁₀滴定度±平均值的标准误差。抗体滴定度≤1.70表示小于1∶50的终点滴定度且位于检测限以下。

¹nd表示未进行

实例12：多质粒免疫对恒河猴的各种血清学参数和体重的影响

通过完整血液计数分析在不同时间测定用于所述研究的恒河猴外周血白细胞计数(WBC)并报告为平均WBC(×1000/ml)±标准误差。参见表21。

表21：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔情况下的总WBC计数(×1000)

    周数    组ID    -2    0    2    4    6    8    10    16    2d    10.3    ±1.1    8.8    ±1.4    8.1    ±1.0    7.2    ±0.7    7.1    ±1.0    8.6    ±0.7    6.9    ±0.9    6.6    ±0.4    3a    8.6    ±1.4    5.5    ±0.8    7.9    ±1.3    6.0    ±0.9    6.3    ±1.0    7.3    ±1.1    7.8    ±1.1    8.0    ±1.6    3c    9.4    ±1.4    6.3    ±0.6    8.0    ±0.8    7.0    ±0.8    7.3    ±0.9    9.9    ±0.9    8.4    ±1.4    7.8    ±1.2    3cE    11.0    ±1.7    12.1    ±1.5    8.2    ±1.1    18.4    ±2.0    11.0    ±1.3    13.1    ±1.3    9.3    ±0.9    7.9    ±0.5    4a    11.6    ±0.8    10.3    ±1.4    8.9    ±0.8    8.0    ±0.8    8.2    ±0.5    7.9    ±0.5    8.3    ±0.7    nd¹    对照    7.6    ±0.9    5.6    ±0.7    7.1    ±0.9    5.7    ±0.6    5.9    ±0.7    7.6    ±1.3    5.6    ±0.5    6.6    ±0.7

^*将由完整血液计数分析测定的外周血白细胞计数(WBC)报告为平均WBC(×1000/ml)±标准误差。

¹nd，未进行

通过完整血液计数分析在不同时间测定用于所述研究的动物的外周血红细胞计数(RBC)并报告为平均RBC(×10⁶/ml)±标准误差。参见表22。

通过完整血液计数分析随时间变化测定  所述研究中使用的动物的外周血血红蛋白水平(g/dL)并报告为平均血红蛋白水平±标准误差。参见表23。

用表7中所述质粒和免疫原性组合物进行的多质粒免疫并未对所述研究使用的动物的WBC、RBC和血红蛋白水平产生任何不良影响。参见表21至表23。在使用电穿孔时(其中使用免疫原性组合物免疫3cE组)检测到一种明显的积极作用。在此组中，整个研究过程中WBC数显著提高。参见表21。

表22：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总RBC计数(×10⁶)

  周数    组ID  -2  0    2  4  6  8  10  16    2d  5.60  ±0.12  5.64  ±0.03  5.62  ±0.08  5.69  ±0.09  5.70  ±0.11  5.67  ±0.11  5.74  ±0.06  5.91  ±0.08    3a  5.61  ±0.19  5.36  ±0.17  5.39  ±0.17  5.40  ±0.13  5.39  ±0.15  5.53  ±0.18  5.32  ±0.14  5.70  ±0.16    3c  5.39  5.32  5.43  5.46  5.38  5.45  5.52  5.69

  ±0.13  ±0.14  ±0.09  ±0.13  ±0.14  ±0.10  ±0.13  ±0.09    3cE  5.63  ±0.15  5.91  ±0.09  5.80  ±0.07  5.60  ±0.21  5.87  ±0.10  5.57  ±0.13  5.70  ±0.07  5.75  ±0.11    4a  5.99  ±0.11  5.68  ±0.09  5.97  ±0.08  5.77  ±0.11  5.84  ±0.07  5.79  ±0.12  5.54  ±0.10  nd¹    对照  5.69  ±0.18  5.49  ±0.13  5.57  ±0.09  5.63  ±0.09  5.61  ±0.08  5.66  ±0.09  5.73  ±0.12  5.94  ±0.13

^*通过完整血液计数分析测定外周血红细胞计数(RBC)并报告为平均RBC(×10⁶/ml)±标准误差。

表23：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总血红蛋白水平

    周数    组ID  -2  0  2    4    6    8    10    16    2d  12.5  ±0.3  12.7  ±0.2  12.5  ±0.2    12.6    ±0.2    12.5    ±0.1    12.6    ±0.2    12.9    ±0.2    13.1    ±0.2    3a  13.1  ±0.3  12.6  ±0.3  12.6  ±0.3    12.5    ±0.3    12.6    ±0.3    13.0    ±0.3    12.8    ±0.4    13.4    ±0.2    3c  12.7  ±0.3  12.6  ±0.2  12.7  ±0.2    12.7    ±0.2    12.6    ±0.4    13.0    ±0.3    13.2    ±0.3    13.5    ±0.3    3cE  12.8  ±0.3  13.4  ±0.2  13.0  ±0.2    13.1    ±0.3    13.4    ±0.2    12.9    ±0.2    13.0    ±0.1    13.3    ±0.2    4a  13.5  ±0.3  13.1  ±0.2  13.5  ±0.2    13.1    ±0.2    13.2    ±0.2    13.1    ±0.2    12.5    ±0.2    nd¹    对照  13.3  ±0.3  12.8  ±0.3  13.0  ±0.2    12.9    ±0.2    13.0    ±0.2    13.2    ±0.1    13.6    ±0.3    13.9    ±0.3

^*将通过完整血液技术分析测定的外周血血红蛋白水平(g/dL)报告为平均血红蛋白水平±标准误差。

¹nd，未进行

通过完整血液计数分析随时间变化测定如在所述研究中使用的动物中测定的外周血小板水平并报告为平均血小板水平(×1000)±标准误差。参见表24。

通过完整血液计数分析随时间变化测定所述研究中使用的动物的百分比血细胞比容水平并报告为平均百分比血细胞比容水平±标准误差。参见表25。

通过完整血液计数分析随时间变化测定如在所述研究中使用的动物中测定的外周血总淋巴细胞数并报告为平均总淋巴细胞数±标准误差。参见表26。

通过完整血液计数分析随时间变化测定所述研究中使用的动物的外周血总CD3⁺T-淋巴细胞数并报告为平均总CD3⁺T-淋巴细胞数±标准误差。参见表27。

通过完整血液计数分析随时间变化测定所述研究中使用的动物的外周血总CD3⁺CD4⁺Th-淋巴细胞数并报告为平均总CD3⁺CD4⁺Th-淋巴细胞数±标准误差。参见表28。

通过完整血液计数分析随时间变化测定所述研究中使用的动物的外周血总CD3⁺CD8⁺T-淋巴细胞数并报告为平均总CD3⁺CD8⁺T-淋巴细胞数±标准误差。参见表29。

通过完整血液计数分析随时间变化测定所述研究中使用的动物的外周血总CD20⁺淋巴细胞数并报告为平均总CD20⁺淋巴细胞数±标准误差。参见表30。

表24：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和没有

电穿孔的情况下的总血小板计数(×1000)

  周数    组ID  -2  0  2  4  6  8  10  16    2d  404  ±42  433  ±19  399  ±21  411  ±16  392  ±30  420  ±13  448  ±17  394  ±21    3a  419  ±41  418  ±31  399  ±28  441  ±25  402  ±30  411  ±20  450  ±35  380  ±17    3c  454  ±19  404  ±13  418  ±21  405  ±19  391  ±13  423  ±41  381  ±23  381  ±27    3cE  384  ±29  389  ±30  414  ±31  389  ±33  431  ±33  315  ±33  400  ±24  347  ±24    4a  364  ±21  373  ±9  339  ±16  368  ±15  355  ±16  357  ±16  360  ±19  nd¹    对照  458  ±39  412  ±33  386  ±47  383  ±14  386  ±43  414  ±35  409  ±27  378  ±34

^*将通过完整血液计数分析测定的外周血小板水平报告为平均血小板水平(×1000)±标准误差。

¹nd，未进行

表25：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的百分比血细胞比容

  周数    组ID  -2  0  2  4  6  8  10  16    2d  38.3  ±0.9  38.5  ±0.5  37.8  ±0.6  38.6  ±0.4  38.4  ±0.4  38.6  ±0.5  38.9  ±0.4  40.2  ±0.5    3a  39.9  ±1.0  37.7  ±0.8  38.4  ±1.1  38.3  ±0.9  38.0  ±0.8  39.7  ±1.1  38.3  ±1.1  40.7  ±0.7    3c  38.9  37.8  38.7  38.8  38.4  39.3  39.7  40.6

  ±0.8  ±0.8  ±0.5  ±1.1  ±1.1  ±0.9  ±0.9  ±0.8    3cE  39.1  ±0.9  40.6  ±0.5  39.7  ±0.6  39.6  ±0.9  40.9  ±0.5  39.0  ±0.6  40.0  ±0.3  39.9  ±0.5    4a  41.3  ±0.8  38.8  ±0.6  40.8  ±0.5  39.6  ±0.4  40.1  ±0.6  39.8  ±0.6  37.9  ±0.5  nd¹    对照  40.3  ±1.0  38.5  ±0.6  39.3  ±0.4  39.4  ±0.4  39.6  ±0.5  40.3  ±0.5  40.8  ±0.7  41.8  ±0.7

^*将通过完整血液计数分析测定的百分比血细胞比容水平报告为平均百分比血细胞比容水平±标准误差。

¹nd，未进行

表26：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总淋巴细胞数

  周数    组ID  -2  0  2  4  6  8  10  16    2d  3444  ±554  4399  ±521  3952  ±578  4038  ±462  3646  ±677  4631  ±574  3600  ±581  3018  ±422    3a  2955  ±613  2901  ±452  2706  ±405  2910  ±434  2804  ±459  3631  ±714  3186  ±775  3814  ±736    3c  3213  ±448  3097  ±369  3192  ±407  3343  ±559  3417  ±699  4268  ±667  3098  ±678  3925  ±805    3cE  3157  ±331  3737  ±718  4441  ±608  2737  ±383  4835  ±822  5286  ±987  4927  ±575  4385  ±612    4a  4850  ±348  3763  ±381  4268  ±339  3471  ±149  4544  ±363  3494  ±248  3408  ±248  nd¹    对照  2638  ±230  3685  ±784  3280  ±349  3037  ±334  3828  ±456  4392  ±465  3451  ±358  3470  ±220

^*将通过完整血液计数分析测定的外周血总淋巴细胞数报告为平均总淋巴细胞数±标准误差。

¹nd，未进行

表27：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总CD3⁺T-淋巴细胞数

  周数    组ID  -2  0  2  4  6  8  10  16    2d  1778  ±356  2469  ±265  2167  ±306  2299  ±257  2051  ±356  2917  ±313  2261  ±318  1852  ±218

    3a    1697    ±291    1796    ±269    1681    ±255    1910    ±327    1822    ±322    2536    ±450    2344    ±619    2772    ±523    3c    1862    ±215    1815    ±175    1862    ±187    1949    ±279    2080    ±341    2679    ±313    2019    ±385    2458    ±426    3cE    1716    ±223    1926    ±421    2718    ±427    1417    ±241    3139    ±560    3437    ±680    3229    ±360    2928    ±457    4a    2848    ±240    2141    ±263    2481    ±265    1881    ±95    2851    ±328    2153    ±212    2141    ±224    nd¹    对照    1455    ±85    2188    ±484    1883    ±218    1749    ±258    2334    ±382    2789    ±334    2352    ±341    2291    ±197

^*外周血

表28：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总CD3⁺CD4⁺Th-淋巴细胞数

  周数    组ID  -2  0  2  4  6  8  10  16    2d  1117  ±226  1463  ±197  1348  ±219  1371  ±190  1317  ±225  1770  ±208  1435  ±225  1457  ±266    3a  934  ±143  1007  ±158  986  ±156  1084  ±191  1078  ±198  1425  ±242  1291  ±322  1535  ±287    3c  1132  ±167  1108  ±130  1178  ±129  1195  ±176  1283  ±209  1598  ±208  1229  ±224  1480  ±256    3cE  1034  ±155  1115  ±194  1622  ±267  827  ±124  1752  ±271  1917  ±347  1673  ±165  1628  ±165    4a  1774  ±220  1362  ±202  1528  ±202  1171  ±91  1743  ±247  1363  ±163  1360  ±174  nd¹    对照  877  ±79  1292  ±259  1162  ±117  1109  ±155  1430  ±239  1659  ±226  1437  ±178  1353  ±139

^*将通过完整血液计数分析测定的外周血总CD3⁺CD4⁺Th-淋巴细胞数报告为平均总CD3⁺CD4⁺Th-淋巴细胞数±标准误差。

¹nd，未进行

表29：用质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总CD3⁺CD8⁺T-淋巴细胞数

    周数    组ID    -2    0    2    4    6    8    10    16    2d    627    1008    807    908    729    1137    811    678

    ±141    ±105    ±96    ±87    ±147    ±131    ±103    ±92    3a    729    ±159    778    ±118    691    ±94    823    ±139    729    ±120    1111    ±224    1041    ±285    1254    ±251    3c    663    ±61    661    ±69    635    ±61    709    ±102    744    ±122    1023    ±111    712    ±151    884    ±149    3cE    626    ±78    774    ±229    1067    ±169    542    ±114    1409    ±334    1431    ±348    1528    ±206    1270    ±294    4a    1005    ±47    721    ±70    901    ±74    628    ±53    994    ±95    699    ±64    718    ±58    nd¹    对照    540    ±92    876    ±252    695    ±151    625    ±141    870    ±172    1104    ±184    872    ±215    880    ±131

^*将通过完整血液计数分析测定的外周血总CD3⁺CD8⁺T-淋巴细胞数报告为平均总CD3⁺CD8⁺T-淋巴细胞数±标准误差。

¹nd，未进行

表30：用多质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的总CD20⁺淋巴细胞数

  周数    组ID    -2    0    2    4  6    8    10    16    2d    1468    ±309    1287    ±347    1369    ±403    1131    ±328    1337    ±391    1300    ±331    993    ±301    918    ±275    3a    1071    ±296    857    ±204    859    ±218    767    ±175    782    ±195    799    ±229    575    ±115    746    ±189    3c    1143    ±269    994    ±205    1155    ±264    1089    ±283    1083    ±340    1322    ±380    902    ±295    1175    ±356    3cE    1081    ±140    968    ±139    1221    ±156    923    ±125    1147    ±201    1080    ±173    1006    ±138    966    ±118    4a    1332    ±186    1127    ±162    1247    ±113    1255    ±148    1051    ±104    938    ±100    987    ±91    nd¹    对照    984    ±161    1134    ±296    1171    ±169    1027    ±183    1206    ±221    1223    ±204    912    ±144    945    ±164

^*将通过完整血液计数分析测定的外周血总CD20⁺淋巴细胞数报告为平均总CD20⁺淋巴细胞数±标准误差。

¹nd，未进行

用表7所述质粒和免疫原性组合物进行的多质粒免疫对所述研究使用的动物的血小板计数(表24)、百分比血细胞比容(表25)、总淋巴细胞数(表26)、总CD3+T-淋巴细胞数(表27)、总CD3+CD4+Th淋巴细胞数(表28)总CD3+CD8+T-淋巴细胞数s(表29)和总GD20+T-淋巴细胞数(表30)也未产生任何不良影响。当使用布比卡因调配的免疫原性组合物同时使用电穿孔来免疫3cE组时，在这些分析中也检测到对总淋巴细胞数(表26)、总CD3+T-淋巴细胞数(表27)、总CD3+CD4+Th-淋巴细胞数(表28)、总CD3+CD8+T-淋巴细胞数(表29)的积极作用。在此组中，每一这些类别中的淋巴细胞数在研究过程中的各时间点都显著提高。

每周监测一次用于所述研究的动物的体重。将体重(kg)报告为平均体重±标准误差。参见表31。

表31：多质粒DNA疫苗免疫的恒河猴在有和

没有电穿孔的情况下的体重(kg)

  周数    组ID    -2  0  2  4  6  8  10  16    2d    3.74+0.27  3.63  ±0.27  3.84  ±0.29  3.93  ±0.28  3.98  ±0.29  4.16  ±0.29  4.00  ±0.28  4.05  ±0.28    3a    3.63    ±0.19  3.56  ±0.19  3.74  ±0.22  3.75  ±0.22  3.83  ±0.25  3.98  ±0.23  3.85  ±0.25  3.96  ±0.25    3c    3.70    ±0.23  3.65  ±0.20  3.87  ±0.24  3.97  ±0.25  4.16  ±0.25  4.26  ±0.29  4.14  ±0.26  4.28  ±0.30    3cE    3.67    ±0.23  3.91  ±0.23  4.03  ±0.28  3.99  ±0.26  4.04  ±0.28  4.12  ±0.25  4.06  ±0.27  4.14  ±0.30    4a    3.67    ±0.19  3.72  ±0.21  3.83  ±0.22  3.77  ±0.19  3.85  ±0.18  3.71  ±0.18  3.72  ±0.14  nd¹    对照    3.61    ±0.23  3.66  ±0.20  3.91  ±0.18  4.03  ±0.19  4.15  ±0.18  4.24  ±0.19  4.21  ±0.20  4.29  ±0.21

^*将体重(kg)报告为平均体重±标准误差。

¹nd，未进行

最后，此分析表明，用表7所述质粒和免疫原性组合物进行的多质粒免疫对所述研究中使用的动物的体重也未产生任何不良影响(表31)。

实例13.使用包含各具有一单一转录单元的四个质粒的免疫原性组合物进行的鼠类免疫研究

前述实例表明，在其中总免疫反应必须最大化的情形中，那么使用基于每个质粒中具有表达单一抗原的单一转录单元的质粒组合的免疫原性组合物可能是有利的。在本实例中，实施鼠类免疫研究以比较基于四个质粒的免疫原性组合物与基于三个质粒的免疫原性组合物的免疫原功能性。更特定而言，对基于指导六个HIV-1基因(包括gag、pol、env、和仅一个nef-tat-vif基因融合体)的表达的四个单独质粒的免疫原性组合物的免疫原功能性与基于指导六个HIV-1基因(包括env、gag-pol基因融合体和第二个nef-tat-vif基因融合体)的表达的三个单独质粒的免疫原性组合物的免疫原功能性加以比较。以各个基于三个和四个DNA质粒的免疫原性组合物在Balb/c小鼠中引发多抗原特异性细胞调节的免疫反应的相对能力来评估免疫原功能性。HIV基因和序列阐述于实例1中。来自3a组和3c组的三质粒免疫原性组合物与实例8和实例9中所述者相同。参见表1和表32。

免疫原性组合物和免疫

使用编码HIVenv gp160、gag p55、pol(或gag-pol融合体)或nef-tat-vif融合蛋白的质粒DNA表达载体作为实验免疫原性组合物，且使用空表达载体骨架作为对照免疫原性组合物载体。有关研究设计参见下文表32。在瞬时转染人类横纹肌肉瘤(RD)细胞后通过西方印迹确认各种表达载体的HIV基因表达。参见实例4至7。

3a组具有各具有一单一转录单元质粒的三个质粒，但其中两个抗原是融合蛋白(gag-pol和nef-tat-vif)。3c组也具有三个质粒，但其中两个质粒具有一单一转录单元且第三质粒具有两个完整转录单元。参见表32。仅一个抗原被表达为融合蛋白(nef-tat-vif)。组4a具有各具有一单一转录单元质粒的四个质粒，但其中仅一个抗原是融合蛋白(nef-tat-vif)。

用于这些研究的佐剂也可经由DNA质粒递送。在本实例中，用25μg编码鼠类IL-12p35和p40基因并表达鼠类IL-12的212号质粒共同注射所有动物。参见表1。

如表32中所概述用总剂量100μg的DNA经肌内免疫Balb/c小鼠。在所有情形中，将免疫原性组合物与0.25％布比卡因调配在一起并将其以100μl体积注射入四头肌。第二次免疫后10天，宰杀动物并分离出血清和脾脏用于免疫分析。脾脏用于使用如下文所述的ELISPOT分析测量抗原特异性IFN-γ分泌细胞。

动物

对于这些研究，使用4至6周龄雌性Balb/c小鼠。根据实验室动物照管和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，National Research Council，NationalAcademic Press，Washington，DC，1996)养护小鼠。此外，使用和照管小鼠的程序由WyethResearch′s Institutional Animals Care and Use Committee批准。

表32.鼠类研究设计-两次免疫

¹组编号质粒编号质粒说明总DNA(μg)小鼠编号免疫时间表(周)3a111104101 HCMV-gag/pol HCMV-ntv HCMV-env33333380-33c102103202 HCMV-gag HCMV-pol HCMV-ntv，SCMV-env33333380-3

4a101102103104 HCMV-env HCMV-gag HCMV-pol HCMV-ntv2525252580-35001载体对照10040-3

¹3a组和3c组使用与表3中相同的免疫原性组合物。

表33所示数据表明，所述免疫原性组合物中抗原表达质粒数由3增加至4并未使针对HIV蛋白的免疫反应产生任何明显增加。参见表33。

表33.两次免疫后的鼠类免疫反应

组IDgag特异性反应^*pol特异性反应env特异性反应ntv#特异性反应总HIV特异性反应对照3091133a163247156411620903c43611556718323454a29466211501232229

^*将抗原特异性IFN-γELISPOT反应报告为每10⁶个脾细胞中分泌干扰素γ的斑点形成细胞(#SFC/10⁶个脾细胞)

#ntv，nef-tat-vif融合蛋白

本文引用的所有资料都以引用方式并入本文中。相信此项技术中的技术人员会了解对所述方法和组件进行的各种修改和较小改动。

序列表

<110>惠氏公司

<120>具有三个完整转录单元的质粒和用于诱导HIV免疫反应的免疫

     原性组合物

<130>AM101565

<160>6

<170>PatentIn version3.2

<210>1

<211>42

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1               5                   10                  15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

            20                  25                  30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

        35                  40

<210>2

<211>6

<212>DNA

<213>1型人类免疫缺陷病毒

<400>2

tttttt                                                                  6

<210>3

<211>6

<212>DNA

<213>1型人类免疫缺陷病毒

<220>

<221>misc_difference

<222>(1)..(1)

<223>允许通读的突变

<220>

<221>misc_difference

<222>(4)..(4)

<223>允许通读的突变

<220>

<221>misc_difference

<222>(6)..(6)

<223>允许通读的突变

<400>3

cttctg    AM101565 Sequence Listing to AGENT′s 5.25.05                  6

<210>4

<211>4

<212>PRT

<213>1型人类免疫缺陷病毒

<400>4

Lys Gly Arg Pro

1

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>1型人类免疫缺陷病毒

<400>5

Asp Arg Gln Gly Thr Val Ser Phe Asn Phe

1               5                   10

<210>6

<211>4

<212>PRT

<213>1型人类免疫缺陷病毒

<400>6

Pro Gln Ile Thr

1