一种重组新疆家蚕抗菌肽制备方法及其获得的新疆家蚕抗菌肽与应用

摘要

本发明公开一种重组新疆家蚕抗菌肽的纯化制备方法、重组新疆家蚕抗菌肽及其在抑菌、抗肿瘤方面的应用。重组新疆家蚕抗菌肽是从新疆家蚕中克隆得到的，并在真核表达系统中进行了表达。其制备方法为，将发酵液离心去除沉淀，冷冻干燥后经离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤层析而分离纯化得到。重组新疆家蚕抗菌肽对细菌和肿瘤细胞具有强烈的抑杀作用，而且还具有无溶血活性和对正常组织细胞没有毒性作用，在制备治疗病原微生物感染性疾病和肿瘤的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，涉及到一种重组新疆家蚕抗菌肽的纯化制备方法、重组新疆家蚕抗菌肽及其在抑菌、抗肿瘤方面的应用。

背景技术

青霉素的发现，使人们摆脱了对病原微生物所致疾病的恐惧，由此导致了大量的抗菌素的出现，为保护人类的健康奠定了坚实的基础。但是传统抗菌素的滥用和耐药菌株的不断产生，严重影响了感染性疾病的临床治疗效果。因此，新一代抗菌素的研制成为21世纪新药研发的重点。近20多年来，不同来源的抗菌肽显示出了广谱抗菌活性的特点，而且具有传统抗菌素不可比拟的优点，即不会引起耐药菌株的产生，从而有望成为新一代的抗菌制剂。

家蚕在中医药中常作为辅料用于疾病的治疗。天然的抗菌肽也可用作药物原料。1996年将柞蚕抗菌肽用于治疗肾炎、肝炎的新药“肾肝宁”。1997年，柞蚕素胶囊以西药二类治疗乙型肝炎进入了临床观察。但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高未能工业化生产。

新疆有着悠久的养蚕历史。在长期的养殖中，培育出大量有较强抗病能力的品种。张富春等从新疆阿克苏地区蚕种场所培育的新蚕三号的3龄幼虫中克隆到家蚕抗菌肽的cDNA分子，所编码的蛋白质氨基酸序列与已报道的家蚕天蚕素B序列的同源性达98％。而且新疆家蚕抗菌肽已在原核表达系统和真核表达系统中得到了表达，为新疆家蚕抗菌肽的大量制备提供了坚实的平台。

重组昆虫抗菌肽是利用生物工程技术，将抗菌肽基因克隆到基因工程菌中，从而产生的杀菌多肽。重组新疆家蚕抗菌肽的制备主要采用高效液相色谱技术(HPLC)或者采用原核表达系统表达融合的抗菌肽，酶切后，用离子交换层析技术分离得到所需的抗菌肽，这种方法产生的抗菌肽产量低，成本高。重组新疆家蚕抗菌肽是将从新疆阿克苏家蚕克隆得到的抗菌肽基因，转化到抗菌肽基因工程菌中，通过发酵而获得。发酵所得的重组抗菌肽的纯度达不到生物医学的需要，限制了其应用。这就需要进行深度的纯化。目前，重组抗菌肽的纯化方法较为单一，多为应用一种或二种层析方法，但纯度不理想。或者是将标签与抗菌肽结合，应用亲和层析技术进行纯化。这种方法纯化后需进一步处理，将标签去除，而且成本相对较高。因此，重组抗菌肽下游技术的优化成为其广泛应用的瓶颈。

发明内容

针对目前重组抗菌肽的纯化方法较为单一，纯度不高，而且纯化成本相对较高的现状。本发明提供了一种重组新疆家蚕抗菌肽的制备方法，并且提供抗菌肽在制备抗感染和抗肿瘤药物中的应用。

同时，本发明还提供一种高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽。

本发明提供了一种重组新疆家蚕抗菌肽具体的制备方法及获得高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽。本发明将发酵液离心去除沉淀，100℃水浴20-40min，离心去除沉淀，经过冷冻干燥后，通过离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤层析进行分离纯化而获得。

具体的离子交换层析为，将所收集的发酵干粉溶于10-100mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液后上样到同样缓冲液平衡了的阴离子交换柱，交换柱长10-160mm，直径5-20mm，用含1.0-2.0M的NaCl的10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰。

具体的疏水作用层析为，离子交换层析得到的活性峰II、III上样于经用含1.5-2.5M NH₄(SO₄)₂的10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH6.0-9.0缓冲液平衡的疏水层析柱，柱长10-100mm，直径5-20mm，用10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰。

具体的凝胶过滤层析为，疏水作用层析所获得的活性峰II、III上样于Sephadex G-75凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长1000mm，直径20mm，用重蒸水进行洗脱，收集第III峰，为抗菌肽峰。

本发明还具体提供了一种高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽，将其编码所述抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后，将发酵液离心去除沉淀，经过冷冻干燥后，通过离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤层析进行分离纯化而获得。

具体的，获得的重组新疆家蚕抗菌肽属于杀菌力最强的天蚕素B类(cecropin B)，其所编码的抗菌肽有63个氨基酸，其中成熟肽为37个氨基酸，前导肽为26个氨基酸，不含半胱氨酸、不具二硫桥；第8位的是苯丙氨酸，又有别于其它的抗菌肽，产生有别于其它抗菌肽的特性，甚至有更高的活性。

其DNA碱基序列：

ATG AAT TTC GCA AAG ATC CTA TTT TTC GTC TTC GCT CTG

GTG CTG GCT TTG AGC ATG ACC AGC GCT GCT CCC GAG CCC

AAG TGG AAG ATC TTC AAG AAA ATT GAA AAA ATG GGC AGG

AAC ATT CGT GAC GGC ATC GTC AAA GCG GGC CCG GCG ATC

GAG GTC CTT GGT TCG GCT AAA GCT ATA GGA AAA TGA

其氨基酸序列：

MNFAKILFFV FALVLALSMT SAAPEPKWKI FKKIEKMGRN

IRDGIVKAGP AIEVLGSAKA IGK

本发明也提供了上述纯化工艺所获得的重组新疆家蚕抗菌肽相关的生物学特性。具体为，抗菌肽是一小分子肽，具有热稳定性，可以100℃水浴10min到10h，而重组新疆家蚕抗菌肽在加热煮沸8h后，抗菌活性仍未变化，表明重组新疆家蚕抗菌肽表现较强的抗菌活性和热稳定性；耐酸、碱特性：在pH在3-11的范围内，重组新疆家蚕抗菌肽的抗菌能力保持不变；同时，重组新疆家蚕抗菌肽在浓度为0-5M的NaCl中仍具有较强的抗菌活性。

同时，本发明还具体提供了抗菌肽在抗感染和抗肿瘤中的应用，具体的将所获得的重组新疆家蚕抗菌肽在制备治疗病原微生物感染性疾病和肿瘤的药物中的应用。

本发明获得的重组新疆家蚕抗菌肽能显著抑制其它微生物的生长，所有微生物菌包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、普通变形杆菌、化脓放线菌、链球菌、布氏杆菌等，表明重组新疆家蚕抗菌肽具有广谱抗菌的功能。

同时，本发明获得的重组新疆家蚕抗菌肽能显著抑制肿瘤细胞的生长。对Hela、SiHa、MGC、MFC等细胞的生长有显著的抑制作用。与细胞未经处理的对照组相比，不生成肿瘤或生成的肿瘤明显小于对照组。进一步证实重组新疆家蚕抗菌肽能体内抑制肿瘤的生长。

目前临床上所应用的多数抗菌素没有抑杀肿瘤的功能，本发明所述的新疆家蚕抗菌肽在体外具有显著的抑杀肿瘤的作用，能显著抑制肿瘤细胞的生长，与文献所报道的其它来源的具有抑制肿瘤活性的抗菌肽相比，重组家蚕抗菌肽的肿瘤抑制活性高50倍。同时，本发明所述的新疆家蚕抗菌肽能显著抑制小鼠体内肿瘤的生长。

另外，从重度宫颈糜烂和宫颈癌患者取样，分离得到4种微生物。16s rRNA及形态和生化培养特性，初步鉴定为粪肠球菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等细菌；应用PCR分析，从这4种细菌中扩增出HPV16特异性片段。进一步，本发明所得的重组新疆抗菌肽能够优选抑制该4种微生物的生长，其MIC分别为0.023μg/ml、0.014μg/ml、0.008μg/ml、0.030μg/ml。

通过实施本发明具体的技术方案，实现本发明内容，可以实现所获得的重组新疆家蚕抗菌肽病原微生物和肿瘤细胞的体外作用结果，具体说明本发明实现的药效和潜在的效果：

1、重组新疆家蚕抗菌肽的抑菌谱：重组新疆家蚕抗菌肽具有广谱抗菌的功能，对微生物具有显著的抑制作用，所有微生物包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、普通变形杆菌、化脓放线菌、链球菌、布氏杆菌、粪肠球菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等。

2、重组新疆家蚕抗菌肽的最小杀菌浓度(MBC)：重组新疆抗菌肽对微生物的最小杀菌浓度明显低于氨苄青霉素，显示较强的抗菌能力。重组新疆家蚕抗菌肽对微生物的最小杀菌浓度包括大肠杆菌0.030μg/ml、金黄色葡萄球菌0.007-0.011μg/ml、巨大芽孢杆菌0.010-0.014μg/ml、谷氨酸棒杆菌0.018-0.021μg/ml、苏云金杆菌0.012-0.016μg/ml、普通变形杆菌0.013-0.017μg/ml、化脓放线菌0.028-0.033μg/ml、链球菌0.009-0.011μg/ml、布氏杆菌0.005-0.006μg/ml、粪肠球菌0.020-0.025μg/ml、葡萄球菌0.013-0.015μg/ml、杆状菌0.005-0.010μg/ml、棒状杆菌0.028-0.032μg/ml等。

3、重组新疆家蚕抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用：重组新疆家蚕抗菌肽能显著抑制肿瘤细胞Hela、SiHa、MGC、MFC等细胞的生长。对肿瘤细胞的完全抑制剂量分别为，Hela：0.054-0.084μg/ml；SiHa：0.058-0.079μg/ml；MGC：0.055-0.081μg/ml；MFC：0.062-0.078μg/ml。重组新疆家蚕抗菌肽具有较强的肿瘤抑制作用。

4、本发明所需试剂均为分析纯，制备方法为常规的蛋白质纯化技术，操作简便，所需时间短，成本较低，可直接进行放大生产。

附图说明：

图1为重组新疆家蚕抗菌肽的离子交换柱层析图；

图2为重组新疆家蚕抗菌肽的疏水作用层析图；

图3为重组新疆家蚕抗菌肽Sephadex G-75凝胶过滤层析图。

具体实施方式：

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。

实施例1：重组新疆家蚕抗菌肽的制备方法一

发酵液12000rpm，5min离心去除沉淀，100℃水浴30min，12000rpm，10min离心去除沉淀，冷冻干燥后-20℃保存备用。

第一步，离子交换层析：将上述所收集发酵干粉40mg溶于10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0缓冲液，12000rpm，4℃离心10min，取上清，再用0.45μm的滤膜进行过滤。上样于10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH7.0缓冲液平衡了的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，交换柱长10mm，直径5mm，经2.5个柱体积相同的缓冲液洗至穿流峰完全洗脱。用含2.0M的NaCl的10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0缓冲液梯度洗脱，收集II、III峰。

第二步，疏水作用层析：离子交换层析得到的活性峰II、III上样于经用含1.5M NH₄(SO₄)₂的10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0缓冲液充分平衡了的Phehyl Sepharose HP疏水层析柱，柱长10mm，直径5mm，经3个柱体积相同的缓冲液洗至穿流峰完全洗脱。用10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰；

第三步，凝胶过滤层析：用2个柱体积的重蒸水平衡Sepadex G-75凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长1000mm，直径20mm。将疏水作用层析所获得的活性峰II、III上样于已平衡好了的Sephadex G-75凝胶过滤柱，用重蒸水进行洗脱，收集第III峰，即为抗菌肽峰，即可获得高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽。

实施例2：重组新疆家蚕抗菌肽的制备方法二

发酵液12000rpm，5min离心去除沉淀，100℃水浴30min，12000rpm，10min离心去除沉淀，冷冻干燥后-20℃保存备用。

第一步，离子交换层析：将上述所收集发酵干粉40mg溶于100mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH9.0缓冲液，12000rpm，4℃离心10min，取上清，再用0.45μm的滤膜进行过滤。上样于10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH7.0缓冲液平衡了的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，交换柱长160mm，直径20mm，经2.5个柱体积相同的缓冲液洗至穿流峰完全洗脱。用含2.0M的NaCl的100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH9.0缓冲液梯度洗脱，收集II、III峰。

第二步，疏水作用层析：离子交换层析得到的活性峰II、III上样于经用含2.5M NH₄(SO₄)₂的100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH9.0缓冲液充分平衡了的Phehyl Sepharose HP疏水层析柱，柱长100mm，直径20mm，经3个柱体积相同的缓冲液洗至穿流峰完全洗脱。用100mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH9.0缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰；

第三步，凝胶过滤层析：如上述技术步骤，将收集第III峰，即为抗菌肽峰，即可获得同样高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽。

实施例3：重组新疆家蚕抗菌肽的制备方法三

如上述实施例原料的准备。

第一步，离子交换层析：将上述所收集发酵干粉40mg溶于50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH8.0缓冲液，12000rpm，4℃离心10min，取上清，再用0.45μm的滤膜进行过滤。上样于10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH7.0缓冲液平衡了的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，交换柱长100mm，直径10mm，经2.5个柱体积相同的缓冲液洗至穿流峰完全洗脱。用含1.5M的NaCl的50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH8.5缓冲液梯度洗脱，收集II、III峰。

第二步，疏水作用层析：离子交换层析得到的活性峰II、III上样于经用含2.0M NH₄(SO₄)₂的10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH8.5缓冲液充分平衡了的Phehyl Sepharose HP疏水层析柱，柱长50mm，直径15mm，经3个柱体积相同的缓冲液洗至穿流峰完全洗脱。用80mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.5缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰；

第三步，凝胶过滤层析：如上述技术步骤，将收集第III峰，即为抗菌肽峰，即可获得同样高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽。

实施例4：重组新疆家蚕抗菌肽的制备方法四

如上述实施例原料的准备。

第一步，离子交换层析：如上述所述具体实验步骤，将收集发酵干粉溶于10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液，12000rpm，经离心，取上清，再用滤膜进行过滤。缓冲液后上样到同样缓冲液平衡了的阴离子交换柱，交换柱长10-160mm，直径5-20mm，用含1.0-2.0M的NaCl的10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰。

第二步，疏水作用层析：如上述所述具体实验步骤，离子交换层析得到的活性峰II、III上样于经用含1.5-2.5M NH₄(SO₄)₂的10-100mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液平衡的疏水层析柱，柱长10-100mm，直径5-20mm，用10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0-9.0缓冲液梯度洗脱，收集第II、III峰。

第三步，凝胶过滤层析：如上述技术步骤，将收集第III峰，即为抗菌肽峰，即可获得同样高纯度的重组新疆家蚕抗菌肽。

实施例5：重组新疆家蚕抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用

用无菌重蒸水将所纯化的重组新疆家蚕抗菌肽按10倍进行倍比稀释，共有8个滴度，每个滴度设置3个重复，每孔加样量100μl，同时设立正常肝细胞HL-7702为对照组。将5×10⁴/ml的MGC细胞或正常肝脏细胞200μl加到96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO₂培养箱内培养。24h后，去除旧DMEM培养基，每孔重新加入新的DMEM培养基100μl，同时将上述不同滴度的样品以每孔100μl加样量加入，轻轻混匀后，重新置入CO₂培养箱中培养24h。吸去上清，PBS轻轻洗涤，去除上清。每孔加入80μl新鲜的DMEM培养基，再加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)，轻轻振荡，继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内的培养基，每孔加入100μl的二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡，37℃培养30min，在酶联免疫检测仪的490nm处测定各孔的吸光值。EC₅₀是杀伤50％细胞时的药物浓度。结果见表1。

表1：重组新疆家蚕抗菌肽在体外抑杀肿瘤生长的作用

  样品浓度(μg/ml)                               A490  MGC  HL-7702  2.74  2.74×10-1  2.74×10-2  2.74×10-3  2.74×10-4  2.74×10-5  2.74×10-6  2.74×10-7  0.095  0.284  0.296  0.429  0.592  0.763  0.915  1.057  0.083  0.085  0.088  0.082  0.085  0.083  0.081  0.086

目前临床上所应用的多数抗菌素没有抑杀肿瘤的功能，从上述表中可以看出，新疆家蚕抗菌肽在体外具有显著的抑杀肿瘤的作用。

实施例6：重组新疆家蚕抗菌肽对病原微生物和肿瘤细胞的体外作用

1、重组新疆家蚕抗菌肽的抑菌谱：将重组家蚕抗菌肽配成27.4μg/ml的供试样本。用下述所列的病原菌于LB固体培养基中制成平板，用直径3mm的打孔器打孔，每孔加样量为20μl，相当于0.548μg/ml。每种病原菌重复3次。37℃培养18-24h，测量抑菌直径，结果见表2：

表2：重组新疆家蚕抗菌肽的抑菌谱

  供试菌株  抑菌圈直径(mm)  大肠杆菌  金黄色葡萄球菌  巨大芽孢杆菌  谷氨酸棒杆菌  苏云金杆菌  普通变形杆菌  化脓放线菌  链球菌  布氏杆菌  粪肠球菌  葡萄球菌  杆状菌  棒状杆菌  5  18  13  10  15  13  5  16  20  7  15  19  5

2、重组新疆家蚕抗菌肽的最小杀菌浓度(MBC)

本发明的重组新疆家蚕抗菌肽的最小杀菌浓度采用常用药物氨苄青霉素为阳性对照，无菌蒸馏水为阴性对照。各试验用无菌试管3支，并标明药物浓度和作用时间，参见表3。

表3：重组新疆家蚕抗菌肽与氨苄青霉素的最小杀菌浓度的比较

  供试菌株                         最小杀菌浓度  抗菌肽(μg/ml)  氨苄青霉素(μg/ml)  大肠杆菌  金黄色葡萄球菌  巨大芽孢杆菌  谷氨酸棒杆菌  苏云金杆菌  普通变形杆菌  化脓放线菌  链球菌  布氏杆菌  粪肠球菌  葡萄球菌  杆状菌  棒状杆菌  0.030  0.008  0.012  0.020  0.014  0.015  0.030  0.010  0.006  0.023  0.014  0.008  0.030  0.8  5.0  3.3  0.5  11.0  0.2  13.9  9.6  16.7  10.0  11.3  17.4  12.6

3、重组新疆家蚕抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用

应用无菌重蒸水将所纯化获得的重组新疆家蚕抗菌肽进行10倍倍比稀释，共有8个滴度，每个滴度设置3个重复，每孔加样量100μl，同时设立正常肝细胞HL-7702为对照组。将5×104/ml的MGC细胞或正常肝脏细胞200μl加到96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO₂培养箱内培养。24h后用MTT法测定样品对细胞的杀伤作用。EC50是杀伤50％细胞时的药物浓度。结果见表4。

表4：重组新疆家蚕抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用

 供试样品                                 EC50(μg/ml)  MGC  HL-7702 发酵液 重组新疆家蚕抗菌肽(批号1) 重组新疆家蚕抗菌肽(批号2) 重组新疆家蚕抗菌肽(批号3)  8000  35.2  1.38  0.072  -  -  437.5  285.2

目前临床上所应用的多数抗菌素没有抑杀肿瘤的功能，从上述表中可以看出，新疆家蚕抗菌肽在体外具有显著的抑杀肿瘤的作用。

重组新疆家蚕抗菌肽能显著抑制微生物的生长，所有微生物菌包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、普通变形杆菌、化脓放线菌、链球菌、布氏杆菌、粪肠球菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等。结果表明重组新疆家蚕抗菌肽具有广谱抗菌的功能。另外，重组新疆家蚕抗菌肽能显著抑制肿瘤细胞的生长，重组新疆家蚕抗菌肽对MGC细胞的抑制剂量为0.072μg/ml，与文献所报道的其它来源的具有抑制肿瘤活性的抗菌肽相比，重组家蚕抗菌肽的肿瘤抑制活性高50倍。