作为诊断、预后和治疗肝细胞癌(HCC)的目标的颗粒体蛋白－内皮素前体(GEP)超表达

摘要

本发明进一步提供了测定试剂是否导致细胞中颗粒体蛋白－内皮素前体(GEP)蛋白活性降低的方法。本发明还提供了降低细胞中颗粒体蛋白－内皮素前体(GEP)蛋白表达的方法。本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法。本发明进一步提供了治疗受肝细胞癌(HCC)折磨的个体的方法，包括将治疗有效量的特异性干扰个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白－内皮素前体(GEP)蛋白表达的试剂给药于个体。

说明书

贯穿该申请，参考了特定的出版物。这些出版物的全部引用，以及另外的参考文献，就在权利要求之前可以找到。为了更全面地描述在此所述和所要求的本发明申请时为止的技术状况，在此将这些出版物的公开内容引入该申请中作为参考。

发明背景

肝细胞癌(HCC)是世界上第五大最常见的癌症，每年约有五十万新病例和几乎同样多的死亡^1-3。更好地理解发病因素和疾病的分子基础是疾病预防和控制的关键。流行病学研究已经表明乙肝和丙肝病毒感染，乙醇诱导的肝损伤和食用黄曲霉毒素与HCC密切相关。然而，关于肝癌产生和进展的分子基础知道得很少。认为p53肿瘤抑制基因作为“细胞看门人”起着主要作用，而β-连锁蛋白致癌基因反常最近已经证明了肿瘤转变潜能^2-4。然而，肝致癌作用中的主要生长因子基本上是未知的。

最近已经鉴定了HCC和邻接HCC肝组织之间不同表达的基因⁵。颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)是HCC中高度表达基因之一，具有17q21.32的基因座。GEP蛋白是能够刺激细胞增殖的分泌蛋白⁶，且其降低的表达与致瘤潜能的抑制相关^7，8。在30-60％的肝癌中检测到17q的染色体增大^9.10，强烈表明该染色体臂上生长因子/原-致癌基因的存在。没有研究报道过HCC中的GEP表达模式及其生物作用。该研究中，测定了HCC，邻接HCC的肝组织，和正常肝组织中的RNA水平和蛋白质中的GEP定位。

发明概述

本发明提供了测定试剂是否导致细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白表达降低的方法，包括步骤(a)在试剂不存时容许GEP蛋白表达的条件下，将细胞接触试剂；(b)合适的时间段后，测定细胞中GEP蛋白的表达量；和(c)将步骤(b)中测定的表达量和试剂不存在下产生的表达量相比较，借此试剂存在下降低的表达量表明试剂导致GEP蛋白表达的降低。

本发明进一步提供了测定试剂是否导致细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)活性降低的方法，包括步骤(a)在试剂不存时容许GEP蛋白活性的条件下，将细胞接触试剂；(b)测定细胞中GEP蛋白的活性量；和(c)将步骤(b)中测定的活性量和试剂不存在下产生的活性量相比较，借此试剂存在下降低的活性量表明试剂导致GEP蛋白活性的降低。

本发明还提供了降低细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)表达的方法，包括将特异性干扰细胞中GEP蛋白表达的试剂引入细胞中。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括步骤(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白的表达水平；(b)测定个体正常肝细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白的表达水平；和(c)将步骤(a)中测定的表达水平和步骤(b)中测定的表达水平相比较，其中步骤(a)中较高的表达水平表明个体受到HCC的折磨。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括步骤(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白的表达水平；和(b)将步骤(a)中测定的表达水平与健康者正常肝细胞中的GEP蛋白表达水平相比较，其中步骤(a)中较高的表达水平表明个体受到HCC的折磨。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括以下步骤：(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)编码mRNA的量；(b)测定个体正常肝细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)编码mRNA的量；和(c)将步骤(a)中测定的mRNA量和步骤(b)中测定的mRNA量相比较，其中步骤(a)中较高的量表明个体受到HCC的折磨。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)的折磨，包括步骤(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)编码mRNA的量；和(b)将步骤(a)中测定的mRNA量和健康者正常肝细胞中发现的GEP编码mRNA的量，其中步骤(a)中较大的mRNA量表明个体受到HCC的折磨。

本发明进一步提供了治疗受肝细胞癌(HCC)折磨的个体的方法，包括将治疗有效量的特异性干扰个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白表达的试剂给药于个体。

附图简述

图1A-D

人肝脏样品中的GEP表达。(A)通过实时RT-PCR的RNA定量。框顶部和底部的水平线各自表示第25个和第75个百分位。框内的线表示中值。顶部和底部水平条表示内四分位数范围1.5倍内的数据。(B-D)GEP的免疫组织化学染色。具有蛋白质信号值3的HCC(B)，具有蛋白质分值0的邻接于HCC的肝脏(C)，和具有蛋白质分值0的正常肝组织(D)。

图2A-D

HCC中GEP和p53蛋白质的定位。(A)GEP蛋白染色。由箭头表示(×40放大倍数)具有强烈GEP表达的肿瘤部位。(B)p53蛋白染色。由箭头来表示具有p53核表达的肿瘤部位(×40)。(C)框内部分扩大放大倍数的GEP蛋白染色(×200)。(D)框内部分扩大放大倍数的p53蛋白染色(×200)。将蛋白信号染成棕色，用苏木精将剖面反染色。

图3A-C

降低的GEP水平降低了细胞增殖速率和细胞活性。在含有血清或血清限制的条件下检测Hep3B和Huh7细胞的转染子：△载体对照(V)，π反义(AS)，■全长(FL)，□正义对照(S)，和◆亲本细胞系。(A)GEP蛋白水平。(B)细胞生长曲线。(C)通过MTT测试的细胞活性。

图4A-C

降低的GEP水平降低了肿瘤的入侵能力，集落形成能力和致瘤潜力。(A)通过Matrigel入侵室来测定细胞的入侵能力。(B)软琼脂上的集落形成能力。(C)在无胸腺裸鼠中的致瘤潜力。

发明详述

定义

如本申请中所用的，除了在此另外明确地规定，以下每个术语具有以下所示的意思。

如在此所用的，可以使用本领域那些技术人员已知的各种方法和传送系统中的任一种来实现或进行“给药”试剂。例如可以静脉内，通过脑脊髓液，口服，通过鼻，通过植入，经粘膜，经皮，肌内和皮下来进行给药。

如在此所用的，“试剂”意思是任何化学物质，包括而无限制，蛋白质，抗体，核酸，小分子及其任意的混合物。

如在此所用的，“抗体”包括，例如，天然产生的和非天然产生的抗体。特别地，该术语包括多克隆和单克隆抗体，及其抗原结合片段。此外，该术语包括嵌合抗体(例如人化抗体)和完全合成的抗体，及其抗原结合片段。

如在此所用的，“反义分子”意思是任何核酸，将该核酸引入细胞时(直接或通过另一直接引入细胞的核酸的表达)，特异性地与细胞中编码表达受到抑制的蛋白质(即目标蛋白)的mRNA的至少一部分杂交，因此抑制目标蛋白的表达。

如在此所用的，“DNA酶(DNAzyme)”意思是其是DNA或其催化部分是DNA的催化核酸，其特异性地识别并分裂特殊的目标核酸序列，其可以是DNA或RNA。每个DNA酶具有催化部分(也称为“催化结构域”)和由两个结合结构域构成的目标序列结合部分，催化结构域的每个侧面上一个。

如在此所用的，“药物学上可接受的载体”意思是本领域那些技术人员已知的各种载体中的任一种。

以下的传送系统，其使用各种常用的药物载体，只是预想的用于给药本发明组合物的许多实施方案的表示。

可注射的药物传送系统包括溶液，悬浮液，凝胶，微球体和聚合的可注射物，并可以包括赋形剂，如改变溶解度的试剂(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚辛基丙酮和PLGA’s)。可植入系统包括棒和盘，并可以含有赋形剂，如PLGA和聚辛基丙酮。

口服传送系统包括片剂和胶囊。这些可以含有赋形剂，如粘合剂(例如，羟丙基甲基纤维素，聚丙烯吡咯烷酮，其他纤维素物质和淀粉)，稀释剂(例如，乳糖和其他糖，淀粉，磷酸氢钙和纤维素物质)，崩解剂(例如，淀粉聚合物和纤维素物质)和润滑剂(例如硬脂酸盐和滑石)。

经粘膜的传送系统包括药膏，片剂，栓剂，阴道栓，凝胶和霜剂，并可以含有赋形剂，如增溶剂和促进剂(例如，聚丙二醇，胆汁盐和氨基酸)，和其他载体(例如，聚乙二醇，脂肪酸酯和衍生物，以及亲水性聚合物，如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。

皮肤传送系统包括，例如，水和非水凝胶，霜剂，多重乳浊液，微乳浊液，脂质体，膏剂，水和非水溶液，洗剂，气溶胶，烃基和粉末，并可以含有赋形剂，如稳定剂，渗透增强剂(例如，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和氨基酸)，和亲水性聚合物(例如聚卡波糖和聚乙烯吡咯烷酮)。一实施方案中，药物学上可接受的载体是脂质体或透皮增强剂。

用于重建传送系统的溶液，悬浮液和粉末包括载体，如悬浮剂(例如，树胶，zanthan，纤维素和糖)，湿润剂(例如，山梨糖醇)，稳定剂(例如，乙醇，水，PEG和聚丙二醇)，表面活性剂(例如，十二烷基磺酸钠，司盘，吐温和十六烷基吡啶)，防腐剂和抗氧化剂(例如，对羟基苯甲酸酯，维生素E和C，以及抗坏血酸)，抗结块剂，涂层剂和螯合剂(例如，EDTA)。

如在此所用的，“核酸”意思是任何核酸分子，包括但不限于，DNA，RNA及其杂交体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A，C，G，T和U，及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域公知的并在PCRSystems，Reagents and Consumables(PCR系统，反应物和消耗品)(Perkin Elmer Catalogue 1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc，Branchburg，New Jersey，USA)中有举例说明。

如在此所用的，“核酶(ribozyme)”意思是其是RNA或其催化部分是RNA的催化核酸分子，其特异性地识别和分裂特殊的目标核酸序列，其可以是DNA或RNA。每个核酶具有催化部分(也称为“催化结构域”)和由两个结合结构域构成的目标序列结合部分，催化结构域的每个侧面上一个。

如在此所用的，“小的干扰RNA”(也称为siRNA或RNAi)包括但无限制，与目标基因(或其片段)相同或同源的多核苷酸序列，该目标基因(或其片段)直接或间接地连接与目标基因(或其片段)序列互补的多核苷酸序列。siRNA任意地包括足够长度的多核苷酸连接物序列以允许两个多核苷酸序列折叠并相互杂交。设计连接物序列来分隔siRNA的反义和正义链，足以限制位阻的影响并允许dsRNA分子的形成，不与dsRNA分子杂交部分内的序列杂交。例如，在U.S.专利No.6,544,783中论述了siRNA。

如在此所用的，“个体”意思是任何动物，如人，非人灵长类，小鼠，大鼠，豚鼠或兔子。

如在此所用的，“合适的时间段”意思是对于本方法，足以允许试剂效果的时间量。

如在此所用的，“治疗有效量”意思是足以治疗受肝细胞癌(HCC)折磨个体的量。

如在此所用的，“治疗”肝细胞癌(HCC)意思是减缓，停止或逆转疾病的进程。

发明的实施方案

本发明提供了测定试剂是否导致细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白表达降低的方法，包括步骤(a)在试剂不存时容许GEP蛋白表达的条件下，将细胞接触试剂；(b)合适的时间段后，测定细胞中GEP蛋白的表达量；和(c)将步骤(b)中测定的表达量和试剂不存在下产生的表达量相比较，借此试剂存在下降低的表达量表明试剂导致GEP蛋白表达的降低。一实施方案中，细胞存在于细胞培养物中。另一实施方案中，细胞是肿瘤细胞。

再一实施方案中，通过测定细胞中GEP蛋白编码mRNA的量来进行表达量的测定。另一实施方案中，通过测定细胞中的GEP蛋白量来测定表达量。使用GEP蛋白特异性抗体来进行细胞中GEP蛋白量的测定。

本发明进一步提供了测定试剂是否导致细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白活性降低的方法，包括步骤(a)在试剂不存时容许GEP蛋白活性的条件下，将细胞接触试剂；(b)测定细胞中GEP蛋白的活性量；和(c)将步骤(b)中测定的活性量与试剂不存在下产生的活性量相比较，借此试剂存在下降低的活性量表明该试剂导致GEP蛋白的活性降低。一实施方案中，细胞存在于细胞培养物中。另一实施方案中，细胞是肿瘤细胞。

本发明还提供了降低细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白表达的方法，包括将特异性干预细胞中GEP蛋白表达的试剂引入细胞中。一实施方案中，细胞存在于细胞培养物中或是肿瘤细胞。另一实施方案中，试剂是核酸。核酸可以是，但不限于，小的干扰RNA，核酶，DNA酶或反义分子。反义分子可以包括如SEQ ID NO：5中

所示的核酸序列

                                            GAAGGGGCAG

CAACTGGAAG TCCCTGAGAC GGTAAAGATG CAGGAGTGGC CGGCAGAGCA

GTGGGCATCA ACCTGGCAGG GGCCACCCAG ATGCCTGCTC AGTGTTGTGG

GCCATTTGTC CAGAAGGGGA CGGCAGCAGC TGTAGCTGGC TCCTCCGGGG

TCCAGGCAGC AGGCCACAGG GCAGAACTGA CCATCTGGGC ACCGCGTTCC

AGCCACCAGC CCTGCTGTTA AGGCCACCCA GCTCACCAGG GTCCACATGG

TCTGCCTGCG TCCGACTCCG CGGTCCTTG。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括步骤(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白的表达水平；(b)测定个体正常肝细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白的表达水平；和(c)将步骤(a)中测定的表达水平与步骤(b)中测定的表达水平相比较，其中步骤(a)中较高的表达水平表明个体受到HCC的折磨。一实施方案中，通过免疫组织化学来测定GEP蛋白的表达水平。另一实施方案中，通过蛋白质印迹分析来测定GEP蛋白的表达水平。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括步骤(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白的表达水平；和(b)将步骤(a)中测定的表达水平与健康者正常肝细胞中GEP蛋白的表达水平相比较，其中步骤(a)中的较高表达水平表明个体受到HCC的折磨。一实施方案中，通过免疫组织化学来测定GEP蛋白的表达水平。另一实施方案中，通过蛋白质印迹分析来测定GEP蛋白的表达水平。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括以下步骤：(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)编码mRNA的量；(b)测定个体正常肝细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)编码mRNA的量；(c)将步骤(a)中测定的mRNA量和步骤(b)中测定的mRNA量相比较，其中步骤(a)中较高的mRNA量表明个体受到HCC的折磨。一实施方案中，使用正向引物，反向引物和探针通过定量实时聚合酶链式反应来测定mRNA的量。正向引物包括，但不限于，SEQ ID NO：2中所示的核酸序列5’-CAAATG GCC CAC AAC ACT GA-3’。反向引物包括，但不限于，SEQ IDNO：3中所示的核酸序列5’-CCC TGA GAC GGT AAA GAT GCA-3’。探针包括，但不限于，SEQ ID NO：4中所示的序列5’-6FAMCCACTG CTC TGC CGG CCA CTCMGBNFQ-3’。

本发明还提供了测定个体是否受到肝细胞癌(HCC)折磨的方法，包括步骤(a)测定个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)编码mRNA的量；(b)将步骤(a)中测定的mRNA量与健康者正常肝细胞中发现的GEP编码mRNA的量相比较，其中(a)中较高的mRNA量表明个体受到HCC的折磨。一实施方案中，使用正向引物，反向引物和探针通过定量实时聚合酶链式反应来测定mRNA的量。正向引物包括，但不限于，SEQ ID NO：2中所示的核酸序列5’-CAA ATG GCC CAC AAC ACT GA-3’。反向引物包括，但不限于，SEQ ID NO：3中所示的核酸序列5’-CCC TGA GAC GGT AAA GATGCA-3’。探针包括，但不限于，SEQ ID NO：4中所示的序列5’-6FAMCCA CTG CTC TGC CGG CCA CTCMGBNFQ-3’。

本发明进一步提供了治疗受肝细胞癌(HCC)折磨的个体的方法，包括将治疗有效量的特异性干预个体肿瘤细胞中颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)蛋白表达的试剂给药于个体。一实施方案中，试剂是核酸。核酸可以是，但不限于，小的干预RNA，核酶，DNA酶或反义分子。反义分子可以包括SEQ ID NO：5所示的核酸序列

GAAGGGGCAG CAACTGGAAG TCCCTGAGAC GGTAAAGATG CAGGAGTGGC

CGGCAGAGCA GTGGGCATCA ACCTGGCAGG GGCCACCCAG ATGCCTGCTC

AGTGTTGTGG GCCATTTGTC CAGAAGGGGA CGGCAGCAGC TGTAGCTGGC

TCCTCCGGGG TCCAGGCAGC AGGCCACAGG GCAGAACTGA CCATCTGGGC

ACCGCGTTCC AGCCACCAGC CCTGCTGTTA AGGCCACCCA GCTCACCAGG

GTCCACATGG TCTGCCTGCG TCCGACTCCG CGGTCCTTG。

优选的实施方案中，个体是人。

以下的实验详述部分具体说明了本发明。提出该部分是为了帮助理解本发明但不是用来，也不应当解释为以任何方式来限制此后权利要求中所示的本发明。

实验详述

与HCC个体正常肝组织周围以及健康个体的正常肝组织相比较，颗粒体蛋白-内皮素前体(GEP)在肝细胞癌(HCC)中大量而普遍地表达。两个不同的HCC细胞系(Hep3B和Huh7)中的功能研究证明了GEP下调导致降低的增殖，肿瘤入侵性，和集落形成能力。使用Balb/c无胸腺小鼠的体内实验证明GEP下调导致降低的增殖，和降低的致瘤性。

110对HCC和邻近正常肝组织的检测表明HCC中的RNA水平显著高于邻近正常肝中的(图1A)。使用完全正常的肝组织用于标准化，还表明了致瘤组织中GEP RNA的高水平是GEP超表达的结果(图1A)。

HCC组织中的GEP RNA的高水平与通过定量实时PCR和显象密度计扫描的半定量蛋白质印迹所显示的GEP蛋白表达水平正相关(图1)。大多数HCC组织显示出强至中等的GEP蛋白表达水平，而大部分邻近的肝组织和完全正常的肝组织显示出弱至零的GEP蛋白表达水平。

表1.人肝脏样品中的GEP蛋白表达

 GEP蛋白表达分值          HCC个体  正常  n＝22  HCC  n＝110  邻近HCC的肝脏  n＝110 0(负信号) 1(弱信号) 2(中等信号) 3(强信号)  25(22.7％)  17(15.5％)  22(20.0％)  46(41.8％)  72(65.5％)  37(33.6％)  1(0.9％)  0  22(100％)  0  0  0

缩写：GEP，颗粒体蛋白-内皮素前体；HCC，肝细胞癌

根据临床病理学显著性来进一步分析HCC中的GEP超表达。通过免疫组织化学来评价GEP蛋白的表达水平，并分成“弱表达(分值≤中值)”和“强表达(分值＞中值)”的类别。本发明者证明强GEP蛋白表达与大的肿瘤(＞5cm)，静脉渗透以及头一年的肝内复发显著相关(表2)。相反，GEP表达水平与血清α-胎蛋白(AEP)水平，肿瘤被膜，肿瘤结节的数量，微卫星结节，性别，个体年龄，HBV相关性(通过血清HBsAg来测定)，或pTNM阶段没有显著相关性。

表2.关于GEP表达的HCC临床病理学特征

  临床病理学参数    GEP表达  P  0-2  3  肿瘤大小  小(≤5cm)  大(＞5cm)  静脉渗透  不存在  存在  头一年的肝内复发  是  否  血清AFP水平  低(≤20ng/ml)  高(＞20ng/ml)  肿瘤被膜  不存在  存在  肿瘤结节  单个  多个  微卫星结节  不存在  存在  性别  男性  女性  年龄  青年(≤中值，52)  老年(＞中值，52)  HBV相关性  HBsAg阳性  HBsAg阴性  pTNM阶段  早期(I-II)  晚期(III-IV)  30  34   37  27   14  50   26  38   42  20   49  15   31  31   55  9   34  30   6  58   28  33  13  33   13  33   18  28   12  34   38  7   35  11   20  26   34  12   27  19   4  42   14  32  0.048^*    0.002^*    0.049^*    0.114    0.050    0.954    0.502    0.113    0.300    1.000    0.105 

缩写：HCC，肝细胞癌；GEP，颗粒体蛋白-内皮素前体；AFP，α-胎蛋白；HBsAg：乙肝表面抗原。

GEP互补的反义寡核苷酸的效果

使用亲本Hep3B和Huh7 HCC细胞系作为体外模型，通过定量RT-PCR来显示GEP表达的高水平。用不同构建体来转染细胞系用于测定GEP表达抑制。证明了通过转染的反义片段降低了GEP表达和蛋白质水平(图3)。此外，还检测了含血清和血清限制条件下的细胞增殖率。反义转染子显示出细胞增殖的显著降低。

表3.HCC转染子中GEP水平^*和细胞增殖^#的相关性

                Hep3B                   Huh7    10％血清      0％血清     10％血清      2％血清  GEP    细胞倍  增时间  (hr)  GEP    细胞倍  增时间  (hr)  GEP    细胞倍  增时间  (hr)  GEP    细胞倍  增时间  (hr)  反义  全长  正义  对照  载体  对照  0.3  2.5  0.9   0.9   40.3  22.8  25.3   23.2   0.2  1.2  1.1   1.1   62.6  39.7  34.3   40.4   0.4  N.D.  1.1   1.1   42.5  N.D.  29.1   32.8   0.3  N.D.  1.0   1.0   49.5  N.D.  31.3   31.0 

GEP，颗粒体蛋白-内皮素前体；HCC，肝细胞癌

^*涉及亲本细胞相对倍数差异的转染子GEP水平

^*在第3至第5天中测定的细胞倍增时间，因为该阶段是细胞增殖的对数期。

将通过测量线粒体活性的MTT测试用于测定细胞活性。反义转染子证明了在含血清和血清限制条件下细胞活性的显著降低，而全长转染子证明了两种条件下与各自亲本细胞系相似的细胞活性。

在两种HCC细胞系中使用Matrigel细胞入侵室来研究细胞入侵能力。进行48小时的孵育时间段，使50,000个细胞迁移并从无血清培养基侵入由BD Matrigel基底膜基质(BD Biosciences)隔开的含血清培养基中。在Hep3B中，反义转染子表明与空载体对照相比较，细胞迁移降低5.2倍。相似地，反义Huh7转染子表明与空载体对照相比较(图4A)，细胞迁移降低2.2倍。这些发现清楚地证明了GEP表达的抑制将导致细胞迁移降低，并随后导致HCC细胞入侵性的降低。

在非贴壁依赖性条件下测定转染子的集落形成能力，其中使50,000个转染的细胞在4周内克隆。使用显微镜，计数至少三个重复两次进行的独立实验中所形成集落中的细胞数。与空载体对照相比较。Hep3B和Huh7反义转染子集落的总细胞量各自显著降低2.2和1.3倍(图4B)。该发现清楚地证明了GEP对于肿瘤集落形成的功能效果。

在4周龄的Balb/c无胸腺小鼠中测定转染子的致瘤潜力。进行动物背部躯干部分5百万个细胞的皮下接种。每周进行肿瘤大小和体重的两项测量来观察肿瘤的发展。Hep3B反义转染子在所检测5只小鼠中的3只中产生了肿瘤，而空载体转染子在全部5只小鼠中产生了较大的肿瘤。所有实验动物在第60天终止，外科手术取出肿瘤用于净重测定。与载体对照组相比较。反义组的肿瘤重显著降低7.7倍。

这些研究证明GEP正向调节了细胞增殖速率，细胞活性，细胞入侵，集落形成，以及致瘤潜力。功能数据进一步证实了强GEP表达通常与大的HCC大小和静脉渗透的存在相关的临床研究。因此证明了GEP在致肝癌中起主要作用，引起不同的肿瘤阶段，从增殖至随后的入侵和转移。

个体和样品收集

在手术过程中获得肝肿瘤，邻近肿瘤的非肿瘤肝组织，非癌个体的肝硬化肝脏和正常肝脏的组织样品。表1中列出了pTNM阶段的分布和其他临床病理学参数。在移植手术中收集正常的肝样本。器官捐献者没有基础的肝病且对于乙肝血清学是阴性的。将每个组织样本，0.5-1cm³，分成3等份。将一部分福尔马林固定和石蜡包埋，用于组织学或免疫组织化学研究。将两个部分在液氮中急冻并存储在-70℃直至使用。

从肿瘤样品中提取RNA

根据制造商的实验方案使用TRIZOL试剂(Invitrogen，USA)来提取总RNA。简而言之，将冷冻组织样品放入10mlTRIZOL试剂中并立即均质。将均质过的样品通过注射器来剪切基因组DNA并使其在室温放置5分钟。然后，将匀浆在4000rpm 4℃离心30分钟。将澄清的匀浆溶液转移至干净的管子中并加入2ml氯仿。充分混合后，将混合物在4500rpm 4℃离心30分钟来分离含有RNA的水相。将水相转移至干净的管子中并加入5ml异丙醇从样品中沉淀出RNA。通过离心来收集沉淀的RNA并用75％乙醇洗涤两次。在程序结束时，将RNA溶解于DEPC-水中用于随后的实验。

第一链cDNA合成

根据制造商的说明使用高容量cDNA获得(High Capacity cDNAAchive)试剂盒(Applied Biosystems，USA)从0.5μg的样品总RNA来合成第一链cDNA。首先用1单位的DNA酶I在室温将总RNA样品处理15分钟。然后通过加入EDTA溶液并在70℃加热10分钟来停止反应。将DNA酶I处理过的总RNA样品加入含有1×RT缓冲液，4mM dNTP混合物，1×随机引物，125单位MultiScribe RT的逆转录反应混合物中。将混合物在25℃孵育10分钟，并在37℃孵育2小时来合成第一链cDNA。

免疫组织化学染色

按照制造商的说明使用Dako Envision Plus系统(Dako，Carpinteria，CA)并进行改进来进行免疫组织化学。简而言之，用浸在柠檬酸盐缓冲液中的部分通过微波来进行抗原恢复。内源过氧化物酶阻断后，使用第一抗体。通过辣根过氧化物酶缀合的第二抗体来检测信号并使用二氨基联苯胺作为色原来产生颜色。然后用苏木精将组织部分反染色。对于GEP，使用2μg/ml的多克隆抗体GEP(AGI，Sunnyvale，CA)。对于α-胎蛋白(AFP)，使用1∶50稀释度的多克隆抗体(Dako)。对于p53检测，使用1∶50稀释度的单克隆抗体DO-7(Dako)。

蛋白质印迹分析

在10％的SDS-PAGE凝胶中分离30μg的总蛋白并转移至聚乙二烯二氟化物膜上(Millipore，Bedford，MA)。用10％无脂奶粉阻断斑点，探测对抗多克隆GEP抗体，接着缀合辣根过氧化物酶的抗兔IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。根据制造商的说明使用增强的化学荧光蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)来观察条带，并暴露于Hyperfilm^TM(AmershamBiosciences)。通过所暴露膜的密度扫描来定量蛋白质的相对水平，使用凝胶成像系统和UVP GelWorks ID Intermediate版本3.01(UltraViolet Products Ltd.，Cambridge，UK)。

定量实时PCR

使用ABI PRISM 7700测序系统(Applied Biosystems，USA)来进行实时定量多重RT-PCR。GEP基因表达的测试中使用五微升1∶60倍稀释的第一联cDNA。来自Pre-Developed TaqMan Assay Reagents的18s rRNA的引物和探针用作所有PCR中所有样品的内源对照。每25μlPCR反应中，含有1×PCR缓冲液II，5.5mM MgCl₂，0.2mMdATP，dCTP，dGTP，0.4mM dUTP，0.625单位AmpliTaq Gold。目标基因的最佳引物和探针浓度和基因表达测试的最佳18s rRNA对照稀释度如下：

SEQ ID NO：1

1      GTAGTCTGAG CGCTACCCGG TTGCTGCTGC CCAAGGACCG CGGAGTCGGA CGCAGGCAGA

61     CCATGTGGAC CCTGGTGAGC TGGGTGGCCT TAACAGCAGG GCTGGTGGCT GGAACGCGGT

121    GCCCAGATGG TCAGTTCTGC CCTGTGGCCT GCTGCCTGGA CCCCGGAGGA GCCAGCTACA

181    GCTGCTGCCG TCCCCTTGTG GACAAATGGC CCACAACACT GAGCAGGGAT CTGGGTGGCC

241    CCTGCCAGGT TGATGCCCAC TGCTCTGCCG GCCACTCCTG CATCTTTACC GTCTGAGGGA

301    CTTCGAGTTG CTGCCCCTTC CCAGAGGCCG TGGCATGCGG GGATGGCCAT CACTGCTGCC

361    CACGGGGGTT CCACTGCAGT GCAGACGGGC GATCCTGCTT CCAAAGATCA GGTAAGAACT

421     CCGTGGGTGC CATCCAGTGC CCTGATAGTC AGTTCGAATG CCCGGACTTC TCCACGTGCT

481     GTGTTATGGT CGATGGCTCC TGGGGGTGCT GCCCCATGCC CCAGGCTTCC TGCTGTGAAG

541     ACAGGGTGCA CTGCTGTCCG CACGGTGCCT TCTGCGACCT GGTTCACACC CGCTGCATCA

601     CACCCACGGG CACCCACCCC CTGGVAAAGA AGCTCCCTGC CCAGAGGACT AACAGGGCAG

661     TGGCCTTGTC CAGCTCGGTC ATGTGTCCGG ACGCACGGTC CCGGTGCCCT GATGGTTCTA

721     CCTGCTGTGA GCTGCCCAGT GGGAAGTATG GCTGCTGCCC AATGCCCAAC GCCACCTGCT

781     GCTCCGATCA CCTGCACTGC TGCCCCCAAG ACACTGTGTG TGACCTGATC CAGAGTAAGT

841     GCCTCTCCAA GGAGAACGCT ACCACGGACC TCCTCACTAA GCTGCCTGCG CACACAGTGG

901     GGGATGTGAA ATGTGACATG GAGGTGAGCT GCCCAGATGG CTATACCTGC TGCCGTCTAC

961     AGTCGGGGGC CTGGGGCTGC TGCCCTTTTA CCCAGGCTGT GTGCTGTGAG GACCACATAC

1021    ACTGCTGTCC CGTGGGGTTT ACGTGTGACA CGCAGAAGGG TACCTGTGAA CAGGGGCCCC

1081    ACCAGGTGCC CTGGATGGAG AAGGCCCCAG CTCACCTCAG CCTGCCAGAC CCACAAGCCT

1141    TGAAGAGAGA TGTCCCCTGT GATAATGTGA GCAGCTGTCC CTCCTCCGAT ACCTGCTGCC

1201    AACTCACGTC TGGGGAGTGG GGCTGCTGTC CAATCCCAGA GGCTGTCTGC TGCTCGGACC

1261    ACCAGCACTG CTGCCCCCAG GGCTACACGT GTGTAGCTGA GGGGCAGTGT CAGCGAGGAA

1321    GCGAGATCGT GGCTGGACTG GAGAAGATGC CTGCCCGCCG GGCTTCCTTA TCCCACCCCA

1381    GAGACATCGG CTGTGACCAG CACACCAGCT GCCCGGTGGG GCAGACCTGC TGCCCGAGCC

1441    TGGGTGGGAG CTGGGCGTGC TGCCAGTTGC CCCATGCTGT GTGCTGCGAG GATCGCCAGC

1501    ACTGCTGCCC GGCTGGCTAC ACCTGCAACG TGAAGGCTCG ATCCTGCGAG AACGAAGTGG

1561    TCTCTGCCCA GCCTGCCACC TTCCTGGCCC GTAGCCCTCA CGTGGGTGTG AAGGACGTGG

1621    AGTGTGGGGA AGGACACTTC TGCCATGTTA ACCAGACCTG CTGCCGAGAC AACCGACAGG

1681    GCTGGGCCTG CTGTCCCTAC CGCCAGGGCG TCTGTTGTGC TGATCGGCGC CACTGCTGTC

1741    CTGCTGGCTT CCGCTGCGCA GCCAGGGGTA CCAAGTGTTT GCGCAGGGAG GCCCCGCGCT

1801    GGGACGCCCC TTTGAGGGAC CCAGCCTTGA GACAGCTGCT GTGAGGGACA GTACTGAAGA

1861    CTCTGCAGCC CTCGGGACCC CACTCGGAGG GTGCCCTCTG CTCAGGCCTC CCTAGCACCT

1921    CCCCCTAACC AAATTCTCCC TGGACCCCAT TCTGAGCTCC CCATCACCAT GGGAGGTGGG

1981    GCCTCAATCT AAGGCCTTCC CTGTCAGAAG GGGGTTGTGG CAAAAGCCAC ATTACAAGCT

2041    GCCATCCCCT CCCCGTTTCA GTGGACCCTG TGGCCAGGTG CTTTTCCCTA TCCACAGGGG

2101    TGTTTGTGTG TGTGCGCGTG TGCGTTTCAA TAAGTTTGT ACACACTTTC

SEQ ID NO：1的备注

446的多态性：T或C

1922的多态性：T或C

SEQ ID NO：2

5′-CAA ATG GCC CAC AAC ACT GA-3′(0.2μM)

SEQ ID NO：3

5′-CCC TGA GAC GGTAAA GAT GCA-3′(0.2μM)

SEQ ID NO：4

5′-6FAMCCA CTG CTC TGC CGG CCA CTCMGBNFQ-3′(0.2μM)

18s对照：1×

定量实时PCR的条件如下：95℃10分钟，95℃15秒和60℃1分钟的40个循环。将通过软件[Applied Biosystems]产生的PCR反应的扩增曲线用于测定极限循环(C_T)。C_T值表示在其可以首先检测到报告荧光超过基础信号增加的PCR循环。

细胞培养和反义GEP cDNA的转染

将pCMV6-XL5(OriGene Technolgis Inc.，Rockville，MD)中克隆的全长GEP cDNA用作模板，用于将不同的GEP构建体装配至pcDNA3.1(+)中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用Not1和XbalI限制位点来亚克隆全长GEP。通过聚合酶链式反应来产生N-端片段(290bp大小，对应于位置-31至258bp)^7，8，在反义和正义方向亚克隆来产生各自的构建体。使用两种人HCC细胞系，Hep3B(AmericanTissue Culture Collection，Rockville，MD)和Huh7(Health ScienceResearch Resources Bank，Osaka，Japan)。Hep3B是p53-缺陷的，而Huh7含有p53蛋白超表达的突变p53。将这两种细胞系用于测试是否GEP功能是p53依赖性的。使用含血清的DMEM(补充10％FBS，50U/ml青霉素G和50μg/ml链霉素)在标准培养条件下培养细胞。根据制造商的说明用LipofectAMINE(Invitrogen)来转染细胞：1，反义片段用于降低GEP水平；2，全长用于GEP的超表达；3，正义片段作为反义实验的对照，4，空载体作为所有转染实验的对照。通过G418来选择稳定的克隆。在含血清(10％)，血清限制(对于Hep3B，0％血清，对于Huh7，2％血清，因为0％血清中的细胞增殖是可忽略的)条件下测定GEP蛋白水平和增殖。

SEQ ID NO：5

GAAGGGGCAG CAACTGGAAG TCCCTGAGAC GGTAAAGATG CAGGAGTGGC CGGCAGAGCA

GTGGGCATCA ACCTGGCAGG GGCCACCCAG ATGCCTGCTC AGTGTTGTGG GCCATTTGTC

CAGAAGGGGA CGGCAGCAGC TGTAGCTGGC TCCTCCGGGG TCCAGGCAGC AGGCCACAGG

GCAGAACTGA CCATCTGGGC ACCGCGTTCC AGCCACCAGC CCTGCTGTTA AGGCCACCCA

GCTCACCAGG GTCCACATGG TCTGCCTGCG TCCGACTCCG CGGTCCTTG

GEP转染的HCC细胞的体外功能分析

通过将五万个细胞接种于6-孔平板中来测定细胞增殖。连续5天每天收集细胞，并通过锥虫蓝排除来计数存活的细胞。通过MTT测试进行的线粒体脱氢酶活性来测量细胞活性^18，19，其中将五千个细胞接种于96-孔平板中，并连续5天测试。使用BioCoat Matrigel入侵室(BD Biosciences，Bedford，MA)来测定细胞入侵能力，其中室膜滤器(8μm孔径)涂覆BD MatrigelTM基底膜基质(BDBiosciences)。上部室装载2ml无血清培养基中的五万个细胞，而下部室装满2ml含血清的培养基。标准孵育48小时后，用棉签除去膜上表面上的非入侵细胞。将膜下表面的入侵细胞洗入PBS中，固定于Carnoy’s溶液中，并用苏木精和曙红染色。在显微镜下计数每个膜滤器10个随机选择区域的入侵细胞(×100放大倍数)。通过软琼脂上的集落形成能力来测定非贴壁依赖性生长²⁰。通过混合等量的1.6％低熔点琼脂(USB)和补充20％FBS的2×DMEM来形成6-孔平板中的1.5ml琼脂基。将五千个细胞悬浮于1.5ml软琼脂中(含有补充20％FBS的2×DMEM，和0.8％低熔点琼脂的混合物)并覆盖于琼脂基上。4周后，在显微镜下计数每孔10个区域中超过15个细胞的集落。体外实验的每个数据点表示至少三个重复两次进行的独立实验的结果。

GEP-转染的HCC细胞的体内功能分析

将4周大的Balb/c无胸腺裸鼠用于测试转染子的体内致瘤潜力²¹。研究实验方案得到香港大学教学和研究活动物使用协会的批准。在每只动物的背部躯干部分接种五百万个细胞。每周两次测量肿瘤大小和体重。在第60天终止小鼠，收集肿瘤用于进一步的测定。每个实验组包括5只小鼠。

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