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在细胞中诱导骨形态发生蛋白(BMPs)和转化生长因子－β蛋白(TGF－βs)表达的方法

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摘要

描述了一种在细胞中诱导一种或多种骨形态发生蛋白(BMPs)和/或转化生长因子－β(TGF－βs)蛋白表达的方法。该方法包括用包含操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸转染细胞。所述一种或多种骨形态发生蛋白可以是BMP－2、BMP－4、BMP－6、BMP－7或它们的组合。所述转化生长因子－β蛋白可以是转化生长因子－β1蛋白(TGF－β1)。转染可通过直接注射病毒或裸DNA，或通过非病毒载体如质粒，离体或在体内完成。该方法可用来在骨细胞中诱导骨形成，或在能够产生蛋白聚糖和/或胶原蛋白的细胞中，刺激蛋白聚糖和/或胶原蛋白的生成。

著录项

公开/公告号CN1777680A

专利类型发明专利
公开/公告日2006-05-24

原文格式PDF
申请/专利权人麦德托尼克索发摩尔丹耐克公司;
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申请/专利号CN200480010171.7
发明设计人 W·麦克凯;S·伯登;S·永恩;
展开▼

申请日2004-03-07
分类号C12P21/06(20060101);C12N15/70(20060101);C12N5/00(20060101);C12N15/63(20060101);A01N63/00(20060101);A01N43/04(20060101);
代理机构31100 上海专利商标事务所有限公司;
代理人陶家蓉
地址美国田纳西州
入库时间 2023-12-17 17:20:52

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2014-04-30

未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P21/06 授权公告日:20080625 终止日期:20130307 申请日:20040307

专利权的终止
2008-06-25

授权

授权
2006-07-19

实质审查的生效

实质审查的生效
2006-05-24

公开

公开

说明书

发明领域

本发明的领域总的涉及用遗传物质转染细胞的方法。更具体说，本发明的领域涉及用编码LIM矿化蛋白(LIM)的核酸转染细胞，诱导一种或多种骨形态发生蛋白(BMPs)和/或转化生长因子-β蛋白(TGF-βs)的表达。

背景技术

成骨细胞被认为是从多能间充质干细胞分化而来。成骨细胞的成熟导致分泌可以矿化和形成骨的细胞外基质。这个复杂过程的调节并不完全了解，但认为，它涉及一组称为骨形态发生蛋白(BMPs)的信号转导糖蛋白质。这些蛋白已经显示出与胚胎背腹模式的形成、肢体芽发生和成年动物的骨折修复相关(B.L.Hogen，Genes &Develop.，10，1580，(1996))。该组转化生长因子-β超家族分泌蛋白在分化不同阶段的各种细胞类型中具有广谱活性；而这些紧密相关的分子之间生理活性的差异还不清楚(D.M.Kingsley，Trends Genet.，10，16(1994))。

已经有人研究了BMP-6、BMP-2和BMP-4对诱导大鼠颅骨成骨细胞分化的作用(Boden等，Tndocrinology，137，3401(1996))。在需要BMP或糖皮质激素以启动分化的胎鼠颅骨培养物中，糖皮质激素提供BMP-6的mRNA和蛋白表达诱导能力增加十倍，它们促进了成骨细胞的分化(Boden等，Endocrinology，138，2920(1997))。

已经在体内研究了TTPs的骨形成刺激作用。尽管用BTPs和其他细胞外信号传递分子获得了早期的成功，然而它们的使用存在缺陷。例如，需要较大剂量纯化的BTPs以增加新生骨的生成，因此增加了这种治疗方法的费用。另外，诸如BMP细胞外蛋白当引入宿主动物中后易受降解。

细胞内信号传递或调节分子可能在诱导骨形成通路中起作用。一类细胞内调节分子是LIM蛋白，它有一个特征性的结构基序，称为LIM结构域。LIM结构域是富含半胱氨酸的结构基序，由双-氨基酸间隔臂连接的两个特殊锌指组成。一些蛋白只有LIM结构域，而其他蛋白包含各种其它功能结构域。LIM蛋白形成多种分子的组别，包括转录因子和细胞骨架蛋白。LIM结构域的主要作用看来是通过与相同或不同的LIM结构域形成二聚物，或通过结合不同的蛋白，来介导蛋白的相互作用。

在LIM同源结构域蛋白(同时具有LIM结构域和同源结构域序列的蛋白)中，LIM结构域用作负调节元件。LIM同源结构域蛋白参与细胞谱系的决定和分化调节的控制，虽然仅仅LIM蛋白可能具有相似的作用。仅仅LIM蛋白也涉及细胞增值的控制，因为编码这类蛋白的几个基因与致癌性染色体的易位相关。

人和其他哺乳动物种类易患需要骨修复和/或再生过程的疾病或损伤。例如，骨折的治疗将为新的治疗方案所改进，这种治疗方案可以刺激自然的骨修复机制，从而减少骨折痊愈所需的时间。患系统性骨质疾病，如骨质疏松症的个体，可得益于能产生系统性新骨组织形成的治疗方案。这类治疗方案可以降低因骨质损失所致骨折的发生率，这正是该疾病的特征。

利用细胞内信号传递分子诱导新骨形成的治疗方案是理想的。基因治疗技术使得在成骨前体细胞(参与骨形成的细胞)或外周血白细胞内，引入编码介导骨形成的细胞内信号传递分子的核苷酸片段成为可能。基因治疗提供了很多潜在优点：(1)降低了与产生靶治疗蛋白相关的成本；(2)与细胞外治疗方案相比疗效更高，因为它能够使细胞内信号更长时间表达；(3)对靶细胞的影响不因可用于与治疗蛋白相互作用的受体数量有限而受到限制；(4)可将转染的成骨祖细胞直接输送至需要局部性骨形成的部位；和(5)该疗法可以全身性应用，诱导系统性骨形成并提供对骨质疏松症和其他代谢性骨疾病的治疗方式。

人和其他哺乳动物都会患椎间盘退变，伴有下背疼痛、椎间盘突出和脊柱狭窄。椎间盘退变伴有进行性蛋白聚糖基质损失，这可引起椎间盘更易受生物性机械伤害和退变。因此，需要有一种刺激合适细胞合成蛋白聚糖和/或胶原蛋白的方法，合适的细胞如髓核细胞、纤维环细胞和椎间盘细胞。

发明概要

本发明一方面提供了一种在细胞中诱导一种或多种骨形态发生蛋白或转化生长因子-β蛋白(TGF-βs)表达的方法。该方法包括用含有操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸转染细胞上。可根据根据本发明的方法诱导一种或多种选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1或它们组合的蛋白质表达。本发明此方面所述的分离核酸可以是能在标准条件下与序列表中第25号序列全长的互补核酸分子杂交的核酸；和/或可在高度严谨条件下与序列表中第26号序列全长的互补核酸分子杂交的核酸分子。所述细胞可以是任何体细胞，包括但不限于，暗黄层(buffy coat)细胞、干细胞和椎间盘细胞。

本发明第二方面提供了一种能够过度表达一种或多种骨形态发生蛋白或转化生长因子-β(TGF-βs)蛋白的细胞。该细胞可以是能过度表达一种或多种选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1或它们组合的蛋白质的细胞。该细胞可以是暗黄层细胞、椎间盘细胞、间充质干细胞或多能干细胞。也提供了一种包含上述细胞和运载体材料的植入物。本发明也提供在哺乳动物中引入上述细胞或植入物，诱导哺乳动物骨形成的方法；和在哺乳动物的椎间盘中引入上述细胞，治疗哺乳动物椎间盘疾病的方法。

本发明的其他优点和新颖特征将在下面的描述中作部分说明，本领域技术人员通过查视下面内容或者通过实施本发明而学习，将更加明白本发明的优点和新颖特征。

附图简要说明

图1说明在转染了所示感染复数(MOIs)的大鼠椎间盘细胞中，HLMP-1表达后硫酸化葡糖胺多糖(sGAG)的产生；

图2显示感染了不同MOI的AdHLMP-1后6天，大鼠椎间盘细胞的剂量反应；

图3显示转染250个MOI病毒颗粒/细胞6天后，AdHLMP-1转染的大鼠椎间盘细胞表达的聚集蛋白聚糖和BMP-2的mRNA；

图4A显示感染不同MOIs的Ad-hLMP-1后12小时，HLMP-1的mRNA表达；

图4B显示感染后3至6天，培养基中sGAG的产量；

图5显示sGAG的产生随时间的变化；

图6A显示在大鼠纤维环细胞中聚集蛋白聚糖基因表达对LMP-1过度表达的反应；

图6B显示在大鼠纤维环细胞中BMP-2基因表达对LMP-1过度表达的反应；

图7显示在以25个AdLMP-1MOI感染后的大鼠纤维环细胞中HLMP-1的mRNA水平与时间的关系；

图8显示对于HLMP-1过度表达，BMPs和聚集蛋白聚糖的mRNA水平变化；

图9显示对于HLMP-1过度表达的反应中，sGAG的产生增加与时间的关系；

图10显示在LMP-1介导sGAG产生的增加受到成头蛋白(noggin)的阻断；

图11显示单层培养6天后，LMP-1对培养基中sGAG的影响；

图12A-12D是A549细胞中，免疫组化染色LMP-1蛋白的显微照片；

图13A-13F是A549细胞感染AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)48小时后，免疫组化染色的显微照片；

图14A-14D是A549细胞感染AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)48小时后，免疫组化染色的显微照片；

图15A-15D是免疫组化染色人暗黄层细胞中的白细胞表面标记CD45的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部，3天(图15A和15C)或5天(图15B和15D)后切下用于此测定。

图16A-16D是免疫组化染色人暗黄层细胞中BMP-4的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部，3天(图16A和16C)或5天(图16B和16D)后切下用于此测定。

图17A-17D是免疫组化染色人暗黄层细胞中BMP-7的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部，3天(图17A和17C)或5天(图17B和17D)后切下用于此测定。

图18是免疫组化染色人暗黄层细胞中BMP-7的高倍放大的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1，先与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部，14天后切下用于此测定。

图19A-19D是人暗黄层细胞的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部，1天(图19A和19C)或3天(图19B和19D)后切下用于此测定。

图20A和20B是人暗黄层细胞的高倍放大的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1或Adβgal，先与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部，1天后切下用于此测定。

图21A-21J是人暗黄层细胞的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1(上排-图21A-21E)或Adβgal(下排-图21F-21J)，与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部后，在不同时间点切下用于此测定。

图22A-22C是人暗黄层细胞的高倍放大的显微照片，该细胞感染了AdLMP-1，与胶原基质皮下植入到无胸腺大鼠胸部后，在不同时间点切下用于此测定。

优选实施例详述

LMP-1是一种新颖的LIM结构域蛋白，与早期成骨细胞分化相关。LMP-1转录物首先在软骨原基中心出现成骨细胞之前、胚胎长骨发育时邻近肥大软骨细胞的间充质细胞中检测到(参见Boden等，“LIM-1，一种LIM结构域蛋白，介导BMP-6对骨形成的作用”，Endocrinology，139，5125-5134(1998))。LMP-1蛋白是LIM结构域蛋白异质性家族的一员，该家族许多成员与各种细胞类型的生长分化相关。然而，LIM结构域蛋白作用的精确机制鲜为人知。参见Kong等，“肌肉LIM蛋白通过提高MyoD的活性促进肌生成”，Mol.Cell.Biol.，17，4750-4760(1997)；Sadler等，“斑联蛋白和双重LIM结构域富含半胱氨酸蛋白质(CCRP)：两种相互作用的、与细胞骨架相关的LIM结构域蛋白”，J.Cell Biol.，119，1573-1587(1992)；Salgia等，“人桩蛋白，即一种被P210(BCCR/ABL)磷酸化的粘着斑蛋白的分子克隆”，J.Biol.Chem.，270，5039-5047(1995)；和Way等，“Mec-3，一种含有同源框的基因，在线虫中调节触觉感受器神经元分化”，细胞，54，5-16(1988)。

虽然LMP-1是一种LIM结构域蛋白，但是最近有研究显示，对于成骨细胞分化，LIM结构域自身并不是必需的(参见Liu等，“过度表达的LIM矿化蛋白并不需要LIM结构域来诱导骨形成”，骨矿化研究杂志，17，406-414(2002))。LMP-1被认为是一种有效的细胞内信号传递分子，能以极低剂量诱导体外成骨细胞分化和体内从头骨形成(Boden等，Endocrinology，139，5125-5134(1998))。

两个独立实验系统的结果表明，LMP-1能诱导几种BMP的表达。早至体外插入LMP-1cDNA 48小时后、或体内72小时后，就可以检测到BMP-4和BMP-7。体内研究显示，大部分植入的表达LMP-1的暗黄层细胞在体内存活小于一周，但证据显示，流出的宿主细胞可分化为成骨细胞。结果也表明LMP-1诱导的膜状骨形成没有清晰的软骨界面，是许多BMP常见的。

发明人也证明了用AdLMP-1处理的细胞在体外产生LMP-1、BMP-2和较少量的BMP-6和TGF-β1蛋白。BMP-4和BMP-7是受LMP-1诱导的其它分泌性成骨诱导因子。发明人进行的反义寡核苷酸实验表明BMP-4和BMP-7是LMP-1对其他细胞发挥其成骨诱导作用所必需的。

下述A549实验显示腺病毒本身不诱导BMPs，未处理的细胞也不表达BMPs。这些实验也显示LMP-1并不诱导两种与成骨细胞分化不相关的蛋白质(如II型胶原蛋白和MyoD)。

选择A549肺癌细胞是因为A549细胞不像成骨细胞，它没有BMP的基础表达。

采用普通静脉血的暗黄层细胞作离体基因治疗的用法是相当新的方法。参见Viggeswarapu等，“腺病毒输送LIM矿化蛋白-1在体内和体外诱导新骨形成”，J.Bone Joint Surg.Am.，83-A，364-376(2001)。为确定转染了LMP-1cDNA的暗黄层细胞能存活多长时间和增加BMPs的合成、分泌和活性，使用CD-45抗原(参见Kurtin等，“白细胞常见抗原-在石蜡切片中用单克隆抗体诊断性鉴别造血性和非造血性肿瘤：免疫研究和超微结构定位的相关性”，Hum.Pathol.，16，353-365(1985)；和Pulido等，“对四种不同CD45抗原特异性的比较性生化和组织分布研究”，J.Immunol.，140，3851-3857(1988))。能与抗CD-45一抗特异性反应的细胞数量进行性减少，至植入后10天达到最少。抗CD-45染色的消失、7天后植入物中心的细胞消失和骨形成的向心模式都提示，包括那些表达LMP-1细胞在内的植入细胞并不能长时间存活，提示LMP表达细胞可能通过诱导分泌因子间接参与骨形成过程，这些分泌因子会吸引宿主祖细胞并调节其分化成为成熟的成骨细胞。有证据显示，LMP-1启动了一组级联反应，包括几种成骨诱导蛋白(BMPs)的分泌。因此LMP-1是一种理想的治疗性候选物，因为LMP-1可以产生显著作用，而不会在体内很多细胞中长时间持续表达。

发明人已证明通过离体基因转移将LMP-1cDNA转移给易位植入的外周血暗黄层细胞可进行骨诱导。因此，本发明涉及用编码LIM矿化蛋白的核酸转染非骨细胞。发明人已发现，用编码LIM矿化蛋白的核酸转染非骨细胞，如椎间盘细胞，可导致蛋白聚糖、胶原蛋白和其他椎间盘组分和组织的合成增加。因此，本发明提供了一种治疗与蛋白聚糖、胶原蛋白或其他椎间盘组分丧失相关的椎间盘疾病的方法。

发明人先前从激活的大鼠颅骨成骨细胞培养物中分离得到了LIM矿化蛋白(LMP)(10-4/RLMP)的cDNA序列(序列表，第1、2号序列)(美国专利6,300,127)。该基因已被克隆、测序和测试了其体外增加骨矿化效果的能力。已发现该蛋白(RLMP)能影响骨基质矿化和使细胞分化成为成骨细胞系。与其他已知细胞因子，如骨矿化蛋白(BMPs)不同，RLMP不是分泌蛋白，但它是一种细胞内信号传递分子。因此，少量蛋白就可导致细胞内信号放大，体内应用特异性更好。合适的临床应用包括增强骨折、骨缺损、骨移植的骨修复，和骨质疏松病人骨质的正常体内动态平衡。

其对应于人体蛋白的氨基酸序列，称为人LMP-1(“HLMP1”)，也已被克隆、测序和推倒(美国专利6,300,127)。此种人蛋白在体外和体内都显示提高的骨矿化效果。

发明人也分析了HLMP-1的截断(短)形式-称为HLMP-1s-的特征(参见美国专利6,300,127)。该蛋白是一种可产生终止密码子从而产生截断蛋白的点突变的产物。当HLMP-1s在细胞培养中或体内表达时，它具有完全的功能。

用PCR分析了人心脏的cDNA文库，鉴定出两种交替剪接变体(HLMP-2和HLMP-3)(提交于2000年4月28日的美国专利申请09/959,578)。这些蛋白质的核苷酸序列与HLMP-1不同在于HLMP-1序列的325-444碱基对区域。在这个区域，HLMP-2序列有119个碱基对缺失和17个碱基对插入。与HLMP-1相比，编码HLMP-3的核苷酸序列没有缺失，但有和HLMP-2相同的17个碱基对插入，这些碱基对插入在与HLMP-1序列的第444个碱基对相对应的位置。

LMP能调节或影响许多生物学过程，所以预计LMP的不同剪接变体在哺乳动物体内具有不同的生物学功能，如各种组织的生长、分化和/或再生。例如，一些形式的LMP不仅在骨中表达，也在肌肉、腱、韧带、脊椎、外周神经和软骨中表达。

本发明提供了在哺乳动物中刺激蛋白聚糖或胶原蛋白或两者合成的方法，该方法通过提供包含操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸；将该分离核酸序列转染入能够产生蛋白聚糖的哺乳动物细胞中；并表达编码LIM矿化蛋白的核酸序列，从而刺激蛋白聚糖的合成。哺乳动物细胞可以是非骨细胞，如椎间盘细胞、纤维环细胞或髓核细胞。转染可以通过直接注射病毒或裸DNA，如质粒，在离体或体内进行。在特定实施例中，病毒是重组腺病毒，优选AdHLMP-1。

本发明的另一实施例是一种非骨哺乳动物细胞，它包含编码LIM矿化蛋白的分离核酸序列。该非骨哺乳动物细胞可以是干细胞(如多能干细胞或间充质干细胞)或椎间盘细胞，优选髓核细胞或纤维环细胞。

在一个不同方面，本发明涉及在非骨哺乳动物细胞中表达编码LIM矿化蛋白的分离核苷酸序列的方法，该方法包括提供包含操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸；将该分离核酸序列转染入能够产生蛋白聚糖的哺乳动物细胞中；并表达所述编码LIM矿化蛋白的核酸序列。该非骨哺乳动物细胞可以是干细胞或椎间盘细胞(如髓核或纤维环细胞)。转染可以通过直接注射病毒或裸DNA，如质粒，在离体或体内进行。该病毒可以是重组腺病毒，优选AdHLMP-1。

在另一实施例中，本发明涉及通过逆转、延迟或减慢椎间盘退变治疗椎间盘疾病的方法，该方法提供包含操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸；将该分离核酸序列转染入能够产生蛋白聚糖的哺乳动物细胞中；并通过度表达编码LIM矿化蛋白的核酸序列刺激蛋白聚糖的合成，从而逆转或抑制椎间盘退变。椎间盘疾病可引起下背疼痛、椎间盘突出或脊柱狭窄，此方法可以缓解这些症状。哺乳动物细胞可以是非骨细胞，如干细胞或椎间盘细胞(如纤维环细胞或髓核细胞)。

转染可以通过直接注射病毒或裸DNA，如质粒，在离体或体内进行。在特定的实施例中，该病毒可以是重组腺病毒，优选AdHLMP-1。

本发明涉及新颖的哺乳动物LIM蛋白，本文称为LIM矿化蛋白或LMPs。本发明更具体地涉及人LMP，称为HLMP或HLMP-1，或人LMP的交替剪接变体，称为HLMP-2或HLMP-3。发明人已经发现这些蛋白能增强体外生长的哺乳动物细胞的骨矿化。当LMP在哺乳动物中产生时，它也能诱导体内骨形成。

离体用编码LIM矿化蛋白(如LMP或HLMP)的核酸转染骨髓细胞、成骨前体细胞、外周血细胞和干细胞(如多能干细胞或间充质干细胞)，然后将转染细胞再植入供体动物或人中，这种方法适合于治疗各种骨相关病患或损伤。例如，可以用此方法促进长骨骨折的修复、在节段性缺损中产生骨质，为骨折提供骨移植代替物，促进骨体重建或脊柱融合，并为脆弱或骨质疏松骨头提供局部治疗(通过注射)，如臀骨、椎骨或腕骨骨质疏松的治疗。转染编码LMP或HLMP的核酸也可用于在皮内注射转染骨髓细胞以加速骨折长骨的修复；治疗长骨骨折的延迟愈合或不愈合或脊柱融合的假性关节；和在臀部或膝盖的无血管坏死中的诱导新骨形成。

除了基因治疗的离体方法之外，转染包含编码LMP或HLMP核酸序列的重组DNA载体可在体内完成。当将编码LMP或HLMP的DNA片段插入合适的病毒载体，如腺病毒载体中时，可将该病毒构件直接注射到需要软骨内骨形成的部位。通过用直接、皮内注射以引入LMP或HLMP序列，而完成对骨形成的刺激，无需为获得骨髓细胞(为了离体转染)或将它们重植入病人需要新骨的部位的外科干预。Alden等(Neurosurgical Focus(1998))已经证明可用直接注射克隆腺病毒载体中的BMP-2cDNA方法作基因治疗。

也可将含有编码HLMP核酸序列的，裸露或未包裹的重组质粒直接注射入合适的机体部位进行体内基因治疗。在本发明的这个实施例中，转染发生在裸质粒DNA被靶细胞摄入或内化时。用病毒构件物作体内基因治疗时，直接注射裸DNA的优点是，只需很少或不需外科干预。Baumgartner已经在病人身上成功证明了使用编码内皮细胞有丝分裂原VEGF(血管内皮生长因子)的裸DNA可实现直接基因治疗(Circulation，97，12，1114-1123(1998))。

对于椎间盘应用来说，离体转染可以通过收集椎间盘细胞、用编码LMP的核酸体外转染该细胞、再将该细胞引入椎间盘来完成。该细胞可通过任何本领域技术人员已知的方法从椎间盘收集或再引入，例如任何适合脊柱的外科技术。在一个实施例中，将该细胞通过注射引入椎间盘。

也根据本发明，可用编码LIM矿化蛋白的核酸离体转染干细胞(如多能干细胞或间充质干细胞)，并将其引入椎间盘，例如通过注射。

离体转染的细胞也可与一载体结合形成一种椎间盘植入体。然后，可将此含有转染细胞的载体植入受试者椎间盘中。先前已经报道过合适的载体材料。(例如参见Helm等“为促进脊柱关节固定的骨移植替代物”，Neurosurgical Focus，10(4)(2001))。载体优选地包含生物相容性多孔基质，例如去矿化的骨基质(DBM)、生物相容性合成聚合物基质或蛋白基质。合适的蛋白包括例如，细胞外基质蛋白，如胶原蛋白。可将离体转染了LMP的细胞在植入前掺入到载体中(如结合至多孔性基质的孔隙中)。

类似地，体内转染细胞的椎间盘应用中，可将DNA用本领域技术人员已知的任何合适方法引入椎间盘中。在一个实施例中，将核酸直接注射入椎间隙。

因为腺病毒并不整合入感染细胞的基因组内，当用腺病毒载体向成骨细胞输送LMP时，可获得LMP的瞬时表达。然而，瞬时表达不足以获得本发明的目的。然而可利用一种能掺入靶细胞基因组的载体来实现LMP的稳定表达。例如，逆转录病毒载体就适合于这个目的。

LMP的稳定表达尤其适用于治疗各种系统性骨相关疾病，例如骨质疏松和成骨不全症。本发明的这个实施例中，可将一个可调节启动子与LMP的多聚核苷酸序列组合掺入病毒载体。所述启动子可包含一个接触外源性诱导剂，如四环素时而受其控制的序列。

用此方法，通过给予有效量的外源性诱导剂即可刺激系统性新骨的形成。一旦达到所需骨质量，即可停止给予该外源性诱导剂。该过程可按需重复以解决如骨质疏松造成的骨损失。

HLMP特异性抗体尤其适用于检测病人细胞的成骨诱导或骨形成潜力的方法，该方法是为了鉴定危险状态病人缓慢或受损的骨修复。同时，HLMP特异性抗体也适用于标记试验，以鉴定骨退变疾病，如骨质疏松中的危险因子。

根据公知和常规的方法，本发明的基因治疗载体通过将编码LMP的多聚核苷酸序列连接于含克隆或表达载体的核酸序列来制备。优选此种载体既能克隆也能表达LMP的DNA序列。构建和分析这些重组载体所需的方法是分子生物学领域技术人员公知的，其描述例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港出版社(1988)；Davis等的分子生物学基本方法，Elsevier(1986)；和Ausubel等的分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，WileyInterscience(1988)中。

美国专利4,800,159(Mullis等)描述了提供扩增LMP cDNA序列方法的聚合酶链反应。DNA扩增的试剂盒可从市场买到，其包含从有限量样品中制备多量拷贝cDNA所必需的酶和相关试剂。

LIM矿化蛋白表达载体可包含用于表达具有骨形成活性的LIM矿化蛋白的模板的任何多聚核苷酸序列。保守的氨基酸取代基或其他修饰，如出现氨基末端为甲硫氨酸残基也在本发明的范围之内，因为这些取代和修饰是本邻域技术人员公知的。

将涉及所选择宿主表达系统的核糖体结合位点，连接于嵌合性LMP编码序列的5’末端，形成一个可插入表达载体内的合成基因。也可为该嵌合编码序列的表达提供一个可调节的启动子，如大肠杆菌lac启动子。其他合适的可调节启动子包括，例如trp、tac、recA、T7和λ启动子。

可将编码LMP的DNA通过任何本领域技术人员已知方法转染到受体细胞中，如磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔或原生质体融合，以形成稳定的转染株。磷酸钙沉淀可根据Graham等(病毒学，52，456(1973))的方法进行。简要地说，将一等份用鲑鱼精子或小牛胸腺DNA作为载体的40-50微克DNA接种于100毫米培养皿的0.5×10⁶个细胞上。用0.5毫升2XHepes溶液(280毫摩尔NaCl，50毫摩尔Hepes和1.5毫摩尔Na₂PO₄，pH 7.0)混匀DNA，再加入等体积的2xCaCl₂(250毫摩尔CaCl₂和10毫摩尔Hepes，pH 7.0)。将30-40分钟后出现的白色粒状沉淀一滴滴均匀分布在细胞上，37℃孵育细胞4-16小时。取出培养基，使细胞与15％甘油的PBS溶液接触3分钟。去除甘油后，用含10％胎牛血清的Dulbecco’s基础必需培养基(DMEM)培养细胞。

DNA也可下述方法转染，见Kimura等(病毒学，49：394(1972))和Sompayrac等(美国国家科学院院刊，78，7575(1981))的DEAE-葡聚糖方法，Potter(美国国家科学院院刊，81，7161(1984))的电穿孔方法或Goddin等(Molec.Cell.Biol.，1，743(1981))的原生质体融合法。

本发明也包括在标准条件下能与任何编码本发明的LIM矿化蛋白的核酸序列、或其互补序列杂交的核酸分子。“标准杂交条件”视探针大小、核酸试剂的背景和浓度以及杂交类型而不同。例如，可使用原位、DNA印迹或DNA-RNA杂交(RNA印迹)。“标准杂交条件”的确定是本领域技术人员水平范围内的。所述条件的描述可见，例如：美国专利5,580,775(Fremeau等)，Southern的分子生物学杂志98：503(1975)，Alwine等的酶学方法，68：220(1979)和Sambrook等的分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港出版社，7.19-7.50(1989)。

一种优选的标准杂交条件在如下述溶液中42℃预杂交2小时，所述溶液为50％甲酰胺，5X SSPE(150纳摩尔NaCl，10毫摩尔NaH₂PO₄[pH 7.4]，1毫摩尔EDTA[pH8.0])15Xdenhardt’s溶液(每100毫升水含20毫克Ficoll，20毫克聚乙烯吡咯烷酮和20毫克牛血清白蛋白)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS和100微克/毫升鲑鱼精子DNA。加入³²P标记的cDNA探针，进行14小时杂交。然后用2X SSPE洗涤印迹点两次，用0.1％SDS 22℃洗涤20分钟，用0.1X SSPE、0.1％SDS 65℃洗涤1小时。然后干燥印迹点，在增光屏存在下曝光X射线胶片5天。

在“高度严谨条件”下，如果探针与靶序列基本相同，探针就会与靶序列杂交。和标准杂交条件一样，高度严谨条件可由本领域技术人员视特定杂交目而定。

本发明一方面提供了包含编码LIM矿化蛋白的核酸序列的分离核酸分子。本发明的核酸分子可以是能在标准条件下与序列表中第25号序列全长的互补核酸分子杂交的分子，也可以是能在高度严谨条件下与序列表中第26号序列全长的互补核酸分子杂交的分子，或者能与两者杂交的分子。更具体说，本发明的分离核酸分子可以编码HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。

本发明另一方面包括所述核酸序列编码的蛋白质。在另一实施例中，本发明涉及根据抗LMP抗体鉴定这类蛋白质。在该实施例中，通过裂解细胞并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白来制备蛋白质印迹分析的蛋白样品。用Ausubel等的分子生物学现代方法，John Wiley and Sons(1987)中描述的方法，将蛋白通过电印迹转移至硝酸纤维素膜上。用速溶脱脂奶粉(100毫升PBS中1毫克)封闭膜后，在膜上加入抗LMP抗体室温孵育1小时。用磷酸盐缓冲液(PBS)彻底洗涤膜，再与辣根过氧化物酶(HRPO)-抗体偶联物室温孵育1小时。再用PBS彻底洗涤膜，然后加入二氨基联苯胺(DAB)以鉴定抗原条带。

单一特异性抗体是本发明选择的试剂，它们具体用于分析病人细胞与LMP表达相关的特定特征。本文使用的“单一特异性抗体”定义为一种或多种具有与LMP同源结合特征的抗体种类。本文使用的“同源结合”指该种类抗体结合于某特定抗原或抗原表位的能力，如上述的那些与LMP相关的抗原或表位。LMP的单一特异性抗体可从含有抗LMP活性抗体的哺乳动物抗血清中纯化获得或用Kohler等(自然，256，495-497(1975))描述的技术制备单克隆抗体。LMP特异性抗体通过用合适浓度的LMP加或不加免疫佐剂免疫动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊或马来生产。第一次免疫之前收集免疫前血清。每个动物接受大约0.1毫克至1000毫克LMP，如果需要，和一种可接受的免疫佐剂。可接受的佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾沉淀物、含棒状杆菌的水包油乳液和tRNA佐剂。首次免疫包括将LMP，优选加弗氏完全佐剂的LMP通过皮下(SC)或/和腹腔内(IP)多点注射。每个动物在规则的时间间隔抽血，优选每星期一次，以确定抗体滴度。动物在首次免疫后可以或不必进行加强注射。接受加强注射的那些动物，通常以相同途径给予用弗氏不完全佐剂配的相同量抗原。加强注射间隔大约3周时间，直到获得最大滴度。每次加强注射后7天或单次免疫后大约一周，动物采血，收集血清，并等份储存于大约-20℃。

与LMP反应的单克隆抗体(mAb)通过用LMP免疫纯种小鼠，优选Balb/c小鼠制备。如上所述，用溶解于大约0.5毫升缓冲液或盐水中约0.1毫克至10毫克，优选1毫克的LMP和等体积的可接受的佐剂免疫小鼠。优选弗氏完全佐剂。第0天小鼠接收首次免疫，然后休息3-30周。通过静脉内(IV)途径给予免疫的小鼠一次或多次加强免疫，加强免疫剂量是溶解于缓冲液，如磷酸盐缓冲液的约0.1至10毫克LMP。通过本领域公知的标准程序取得免疫小鼠的脾脏，获得抗体阳性小鼠的淋巴细胞，优选脾淋巴细胞。杂交瘤细胞通过将该脾淋巴细胞与合适的融合伴侣，优选骨髓瘤细胞在允许形成稳定杂交瘤的条件下相混合而产生。融合伴侣可包括但不限于：小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag 4-1；MPC11；S-194和Sp 2/0，优选Sp 2/0细胞。将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞在分子量约1000、浓度约30％-50％的聚乙二醇中融合。融合的杂交瘤通过本领域已知程序可在含次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨基喋呤(HAT)的补充Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)中生长而得以选择。在第14、18和21天收集生长阳性孔的上清液，用免疫试验(LMP作为抗原)如固相免疫放射试验(SPIRA)筛选抗体产生。也将培养液体在奥脱洛尼氏(Ouchterlony)沉淀试验中进行测试，以确定该mAb的同功型。用如MacPherson(软琼脂技术：组织培养方法和应用，Kruse andPaterson(主编)，Academic Press(1973))或Harlow等(抗体：实验室手册，冷泉港实验室(1988))描述的软琼脂技术克隆抗体阳性孔中的杂交瘤细胞。

单克隆抗体也可通过下述方法体内生产：用每鼠0.5毫升的降植烷处理Balb/c小鼠约4天后，给小鼠注射(腹腔内)约2×10⁶至6×10⁶的杂交瘤细胞。细胞注射后约8-12天收集腹水液，用本领域已知技术纯化单克隆抗体。

体外生产抗LMP mAb可通过在含有2％胎牛血清的DMEM中培养杂交瘤细胞系，以获得足够量的特异性mAb。用本领域已知技术纯化该mAb。

用各种血清学或免疫学试验测定腹水或杂交瘤培养液的抗体滴度，包括但不限于沉淀、被动凝结、酶联免疫吸附抗体(ELISA)技术和放射免疫试验(RIA)技术。可用类似试验检测体液或组织和细胞抽提物中LMP的存在。

本领域技术人员不难明白，上述生产单克隆抗体的方法可用于生产LMP多肽片段、全长初生LMP多肽或其变体或等位基因产物的特异性抗体。

在另一实施例中，本发明涉及HLMP-1的交替剪接变体。人心脏cDNA的PCR分析揭示了两种HLMP交替剪接变体，称为HLMP-2和HLMP-3，它们与HLMP-1的不同之处在于HLMP-1序列的325和444碱基对之间的区域。HLMP-2序列在此区域具有119个碱基对缺失和17个碱基对插入。这些变化保留了阅读框，产生一种423个氨基酸的蛋白，与HLMP-1相比，该蛋白净损失34个氨基酸(40个氨基酸缺失加上6个插入氨基酸)。HLMP-2含有HLMP-1中存在的c末端LIM结构域。

与HLMP-1相比，HLMP-3没有缺失，但其在444位有相同的17个碱基对的插入。该插入使阅读框漂移，导致459-461碱基对处产生一个终止密码子。结果是，HLMP-3编码了一个153个氨基酸的蛋白。该蛋白缺少HLMP-1和HLMP-2中存在的c末端LIM结构域。HLMP-2和HLMP-3编码蛋白的预计大小已通过蛋白质印迹分析得到确认。

这三种剪接变体组织分布的PCR分析揭示了它们是差别性表达的，特定的同功型在不同组织中占优势地位。HLMP-1形式明显优势表达于白细胞、脾脏、肺、胎盘和胎肝中。HLMP-2看来是骨骼肌、骨髓和心脏组织中的优势同功型。然而HLMP-3在任何受检组织中不是优势同功型。

HLMP-3在次代大鼠成骨细胞中的过度表达诱导了骨节结形成(287±7)，这与糖皮质激素(272±7)和HLMP-1(232±200)引起的效应相似。因为HLMP-3缺少c末端LIM结构域，所以该区域并不是成骨诱导活性所必需的。

然而，HLMP-2的过度表达并不诱导节结形成(11±3)。这些数据表明，缺失的119个碱基对所编码的氨基酸是成骨诱导所必需的。这些数据也表明，HLMP剪接变体的分布对组织特异性功能是重要的。令人惊讶的是，发明人证明了在次代大鼠成骨细胞培养中，HLMP-2抑制类固醇诱导的成骨细胞形成。因此，当不需要骨形成的临床情况下，HLMP-2可能具有治疗用途。

美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，马里兰州罗克维尔20852)于1997年7月22日保存了在载体中的10-4/RLMP样品，称为pCMV2/RLMP(载体pRc/CMV2含插入物10-4克隆/RLMP)。该保存的培养物登录号为209153。美国典型培养物保藏中心(ATCC)于1998年3月19日保存了含插入物HLMP-1s的载体pHis-A样品。该保存的培养物登录号为209698。在布达佩斯条约规定的条件下，美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学路，美国弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)于2000年4月14日保存了质粒pHAhLMP(载体pHisA含衍生自人心肌cDNA的cDNA与HLMP-2的插入物)和pHAhLMP-3(载体pHisA含衍生自人心肌cDNA的cDNA与HLMP-3的插入物)的样品。这些保存的培养物登录号分别为PTA-1698和PTA-1699。按照布达佩斯条约的要求，这些保存物将在ATCC中至少保存30年，并在授予专利公开它们之后，为公众可获得。应理解，获得保存物不构成在未获政府行为授予专利权的情况下允许实施该专利。

在评价本发明的核酸、蛋白或抗体中，可采用酶试验、蛋白纯化和其他常规生化方法。DNA和RNA可分别用DNA印迹和RNA印迹技术分析。一般来说，可用凝胶电泳按大小分离分析样品。然后将凝胶中的DNA和RNA转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上。使凝胶中样品模式复制而得的印迹与探针杂交。一般来说，探针是同位素，优选³²P标记的，，虽然可用其他本领域技术人员已知的信号产生分子标记探针。然后用检测系统，如放射性自显影显色感兴趣的特异性条带。

为了说明本发明的优选实施例，本文包括了下面的非限制性实施例。这些结果证明用本发明的LIM矿化蛋白，以及编码这些蛋白的分离核酸分子诱导或增强骨形成是可行的。

实施例1：颅骨细胞培养

大鼠颅骨细胞，也称为大鼠成骨细胞(“ROB”)，获自20天的分娩前大鼠，见之前Boden等(Endocrinology，137，8，3401-3407(1996))所述。当原代培养物生长至融合(7天)，用胰酶消化后传代至6孔板(1×10⁵细胞/35毫米孔)中，作为第一代亚培养细胞。该亚培养细胞在第0天长至铺满后再培养7天。从第0天开始，每3或4天在层流净化罩下调换培养基并进行处理(Trm和/或BMPs)。标准细胞培养程序如下：第1-7天，MEM，10％FBS，50微克/毫升抗坏血酸，±刺激源；第8-14天，BGJb培养基，10FBS，5毫摩尔β-GlyP(作为无机磷酸盐来源以允许矿化进行)。骨节结形成和骨钙素分泌的终点分析在第14天进行。基于此系统的选择50纳克/毫升剂量的BMP前导实验，证明对于所有研究的BMP剂量反应曲线，具有中等范围的效果。

实施例2：反义链处理和细胞培养

为探索在膜状骨形成中，LMP的潜在功能作用，我们合成了反义寡核苷酸以阻断LMP-1的mRNA翻译并处理正经历糖皮质激素诱导分化的次代成骨细胞培养物。用高度特异性的、对应于25bp序列跨跃推定翻译起始位点(序列表，第42号序列)的反义寡核苷酸(与已知大鼠序列没有明显同源性)，实现了对RLMP表达的抑制。对照培养物或者不接受寡核苷酸，或者接受正义寡核苷酸。在脂质转染胺试剂存在(预孵育)或不存在的情况下进行实验。简要说，室温下将22微克正义或反义RLMP寡核苷酸孵育在MEM中45分钟。孵育后，加入更多MEM或者加入预孵育的脂质转染胺试剂/MEM(7％v/v；室温孵育45分钟)以使寡核苷酸浓度达到0.2微摩尔。产生的混合物在室温下孵育15分钟。然后将寡核苷酸混合物与MEM/抗坏血酸盐/±Trm相混合，以使最终寡核苷酸浓度达到0.1微摩尔。

在存在或不存在合适的寡核苷酸时，将细胞培养于培养基(±刺激源)。最初与脂质转染胺试剂孵育的细胞再培养(37℃。5％CO₂)4小时后，用不含脂质转染胺试剂或不含寡核苷酸的培养基培养。寡核苷酸浓度通过每24小时加入培养物来维持。

LMP-1反义寡核苷酸以剂量依赖形式抑制矿化节结的形成和骨钙素分泌，类似于由BMP-6寡核苷酸观察到的效果。LMP-1反义链阻断成骨细胞分化不能通过加入外源性BMP-6二恢复，但BMP-6反义寡核苷酸抑制可以通过加入BMP-6逆转，这证实了在成骨细胞分化途径中，LMP-1处在BMP-6的上游位置。LMP-1反义寡核苷酸在原代大鼠成骨细胞培养中也抑制自发性成骨细胞分化。

实施例3：矿化骨节结形成的定量

根据实施例1和2制备的ROB的培养物在70％乙醇中固定过夜，然后用Kossa银染料染色。用半自动计算机视频图像分析系统定量测定各孔中的节结数量和节结面积(Boden等，Endocrinology，137，8，3401-3407(1996))。然后将这些值用于计算每个节结值的面积。将此自动化过程以手工计数技术验证，显示相关系数为0.92(p＜0.000001)。所有数据都表示为每种条件下5或6孔计算的平均值±该平均值的标准差(标准差)。每种实验用不同颅骨细胞至少重复两次。

实施例4：骨钙素分泌的定量

用发明人制备的抗大鼠骨钙素c末端九肽的单一特异性多克隆抗体(Pab)作竞争性放射性免疫试验，测量培养基中骨钙素浓度。见Nane等所述(Endocrinology，127：588(1990))。简要说，通过乳糖过氧化物酶方法，用1mCi的¹²⁵I-Na碘化1微克的九肽。向含有200gl试验缓冲液(0.02摩尔磷酸钠，1毫摩尔EDTA，0.001％柳硫汞，0.025％牛血清白蛋白)的试管中加入细胞培养物的培养液或骨钙素标准品(0-12,000弗摩尔)100gl/管(用试验缓冲液配)。然后加入Pab(1∶40,000；100微升)，然后是碘化肽(12,000cpm；100微升)。测试非特异性结合的样品以类似方法制备，但不含抗体。

加入700微升山羊抗兔IgG抗体，4℃孵育18小时分离结合和游离的PABs。样品1200rpm离心45分钟后，倾去上清，沉淀在Gamma计数器中计数。骨钙素值报告为弗摩尔/100微升，然后将这些值除以100转变为皮摩尔/毫升培养基(3天生产)。数值表示为每种条件下5-6孔三次测定的平均值±标准差。每种实验用不同颅骨制品的细胞至少确证两次。

实施例5：Trm和RLMP对体外矿化的影响

正义或反义寡核苷酸对非刺激的细胞培养系统中骨节结的产生总量几乎没有明显的影响。然而当用Trm刺激ROBs时，RLMP的反义寡核苷酸抑制了＞95％的节结矿化。在寡核苷酸处理的培养物中加入外源性BMP-6不能恢复RLMP反义链处理节结的矿化。

长期以来，骨钙素都与骨矿化同义，骨钙素浓度与骨节结产生和矿化相关。RLMP反义寡核苷酸明显降低骨钙素的产生，但反义链处理培养物中的节结计数无明显变化。在这种情况下，在RLMP反义链处理的培养物中加入外源性的BMP-6仅恢复骨钙素产生10-15％。这提示，RLMP的作用在BMP-6的下游，并且比BMP-6特异性更强。

实施例6：收获并纯化RNA

用4摩尔异硫氰酸胍(GIT)溶液收集ROBs(根据实施例1和2在6孔培养皿中制备)双复孔中的细胞RNA，获得有统计学意义的三个量。简要说，吸取孔中培养物上清液，然后叠加以GIT溶液，每双复孔收集0.6毫升。加入GIT溶液后，旋转该板5-10分钟。进一步处理前将样品贮存于-70℃ 7天以上。

用稍微修改的Sambrook等(分子克隆：实验室手册，第7.19章，第二版，冷泉港出版社(1989))的标准方法纯化RNA。简要说，在融化样品中加入60微升2.0摩尔醋酸钠(pH 4.0)，550微升苯酚(水饱和)和150微升氯仿∶异戊醇(49∶1)。涡旋混匀后，离心样品(10000x g；20分钟；4℃)，将水相转移至一新管，加入600微升异丙醇，-20℃沉淀RNA过夜。

过夜孵育后，离心样品(10000x g；20分钟)，然后小心吸弃上清。将沉淀重悬于400微升DEPC处理的水中，用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，加入40微升醋酸钠(3.0摩尔/升；pH 5.2)和1.0毫升无水乙醇后，-20℃沉淀过夜。为回收细胞RNA，离心样品(10000x g；20分钟)，用70％乙醇洗涤一次，空气中干燥5-10分钟并重悬于20微升DEPC处理的水中。RNA浓度通过分光光度计测定的光密度来计算。

实施例7：逆转录聚合酶链反应

将加热的总RNA(65℃下，5微克RNA在总体积为10.5微升的DEPC-H₂O中溶解5分钟)加入到含有4微升5X MMLV-RT缓冲液、2微升dNTPs、2微升dT17引物(10皮摩尔/毫升)、0.5微升RNA酶抑制剂(40单位/毫升)和1微升MMLV-RT(200单位/微升)的试管中。37℃孵育样品1小时，然后95℃5分钟灭活MMLV-RT。然后加入80微升水稀释样品。

用标准方法(总体积50微升)对逆转录样品(5微升)进行聚合酶链反应。简要说，将样品加入含有水和适量PCR缓冲液、25毫摩尔MgCl₂、dNTPs、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)和/或BMP-6的正向和反向引物、³²P-dCTP和Taq聚合酶的试管中。除非特别注明，引物标准化地连续运行22轮循环(94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，20秒)。

实施例8：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和磷光成像分析定量RT-PCR产物

向RT-PCR产物中加入5微升/管的加样染料，混合，加热至65℃10分钟，离心。取每个反应10微升样品在标准条件下进行PAGE(12％聚丙烯酰胺：双丙烯酰胺；15V/孔；稳流)测定。然后将凝胶在凝胶保存缓冲液(10％v/v甘油，7％v/v醋酸，40％V/v甲醇，43％去离子水)中孵育30分钟，真空干燥(80℃)1-2小时，用电子增强磷光成像系统显影6-24小时。分析显色的条带。用图表表示每一条带上的计数。

实施例9：差别显示PCR

提取用糖皮质激素(Trm，1纳摩尔)刺激细胞的RNA。对加热的DNA酶处理的总RNA(65℃下，5微克RNA在总体积为10.5微升的DEPC-H₂O中溶解5分钟)作反转录，如实施例7所述，但用H-T₁₁M(序列表，第4号序列)作为MMLV-RT的引物。如上述，PCR扩增产生的cDNA，但采用不同的商品化引物组(例如，H-T11G(序列表，第4号序列)和H-AP-10(序列表，第5号序列)；GenHunter公司，田纳西州纳什维尔)。在DNA测序凝胶上进行凝胶电泳分离同位素标记的PCR产物。电泳后，真空干燥产生的凝胶，并放射性自显影过夜。从凝胶上切下代表差异性表达cDNA的条带，再用Conner等描述的方法(美国国家科学院院刊，88，278(1983))进行PCR扩增。将PCR再扩增产物克隆入载体PCR-11(TA克隆试剂盒，Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。

实施例10：对UMR106大鼠骨肉瘤细胞cDNA文库进行筛选

将UMR106文库(2.5×10¹⁰空斑形成单位/毫升)以5×10⁴空斑形成单位/毫升接种在琼脂平板(底部为LB琼脂)上，37℃孵育该板过夜。将滤膜覆盖在平板上2分钟。一旦取下滤膜，立即将其变性、淋洗、干燥并紫外照射交联。然后将滤膜在预杂交缓冲液(2xPIPES[pH 6.5]，5％甲酰胺，1％SDS和100微克/毫升变性鲑鱼精子DNA)中，42℃培育2小时。在整个杂交混合物/滤膜中加入260个碱基对的同位素标记探针(序列表，第3号序列；通过随机引物进行³²P标记)，然后42℃杂交18小时。室温洗涤膜一次(10分钟，1x SSC，0.1％SDS)，55℃洗涤三次(15分钟，0.1x SSC，0.1％SDS)。

洗涤完毕后，如上所述作放射性自显影对膜进行分析。阳性克隆作空斑纯化。用第二张滤膜重复四次该程序以使假阳性结果减至最小。空斑纯化的克隆可用lambda SK(-)噬菌粒拯救。如下所述对克隆的cDNA测序。

实施例11：克隆的测序

用标准方法对克隆的cDNA插入片段进行测序。简要说，将合适浓度的终止混合物、模板和反应混合物进行合适的循环程序(95℃，30秒；68℃，30秒；72℃，60秒；25轮循环)。加入停止混合物以终止测序反应。92℃加热3分钟后，将这些样品上样至变性6％聚丙烯酰胺测序凝胶(29∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)上。样品在60伏稳流下电泳大约4小时。电泳后，真空干燥凝胶，并进行放射性自显影。

手工分析放射性自显影图像。用设置了默认参数的BLASTIN程序在国家生物技术信息中心维护的数据库(NIH，马里兰州贝塞斯达；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中对产生的序列进行筛选。根据序列数据，制备新的测序引物并重复进行该步骤直到完成整个基因的测序。所有序列都经过至少3次双向测定得以确认。

也用PCGENE软件包(版本号16.0)分析核苷酸和氨基酸序列。用NALIGN程序计算核苷酸序列的同源性百分比值，所用的参数如下：非匹配核苷酸权重，10；非匹配缺口权重，10；考虑的最大核苷酸数量，50；和考虑的最小核苷酸数量，50。

用PALIGN计算氨基酸序列的同源性百分比值。所选开放缺口成本和单位缺口成本的值均为10。

实施例12：RLMP cDNA的克隆

实施例9描述的差别显示PCR扩增产物含有一个大约有260碱基对的主要条带。用该序列筛选大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文库。对阳性克隆进行嵌套引物分析，获得扩增全长cDNA(序列表，第11、12、29、30和31号序列)所需的引物序列。这些阳性克隆中选作进一步研究的一个克隆命名为克隆10-4。

对嵌套引物分析测定的克隆10-4的全长cDNA序列分析，显不克隆10-4含有差别显示PCR所鉴定的原始260个碱基对片段。克隆10-4(1696碱基对；序列表，第2号序列)包含一个1371碱基对的开放阅读框，它编码一个457个氨基酸的蛋白质(序列表，第1号序列)。终止密码子TGA位于1444-1446位核苷酸。1675-1680位核苷酸为聚腺苷酸化信号和邻接的多聚(A)⁺尾位于3’非编码区。有两个潜在的N-糖基化位点，即天冬酰胺-赖氨酸-苏氨酸和天冬酰胺-精氨酸-苏氨酸，分别位于序列表第1号序列的113-116和257-259氨基酸位置。有五个潜在的蛋白激酶C丝或苏氨酸的磷酸化位点位于3、115、166、219、442氨基酸位置。在272-279氨基酸位置测到了一个潜在ATP/GTP结合位点基序A(P-环)，即甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-苏氨酸。

另外，还在341-391和400-451氨基酸位置发现了两个高度保守的假定的LIM结构域。该新鉴定的大鼠cDNA克隆中假定的LIM结构域，与其他已知LIM蛋白的LIM结构域具有相当大的同源性。然而，与其他大鼠LIM蛋白的总体同源性小于25％。RLMP(也称为10-4)与人ENIGMA蛋白有78.5％氨基酸同源性(参见美国专利5,504,192)，然而与其最近的大鼠同源物CLP-36和RIT-18仅分别有24.5％和22.7％的氨基酸同源。

实施例13：RLMP表达的RNA印迹分析

用甲醛凝胶电泳将30微克实施例1和2制备的ROBs总RNA作大小分离，所用的凝胶是1％琼脂糖平板凝胶，然后通过渗透转印至尼龙膜上。用全长10-4cDNA的600碱基对的EcoR1片段探测该印迹，该EcoR1片段通过随机引物标记了³²P-dCTP。

RNA印迹分析显示一个1.7kb的mRNA与RLMP探针杂交。接触BMP-624小时后，ROBs中的RLMP mRNA上调了大约3.7倍。而BMP-2或BMP-4刺激ROBs 24小时后，没有观察到RMLP的上调。

实施例14：统计方法

对于每个报告的节结/骨钙素结果，用代表性实验的5-6孔得到的数据计算平均值±标准差。对每个参数数据均标准化到最大值绘制图表，同时对节结数、矿化面积和骨钙素作图。

对于每个报告的RT-PCR，RNA酶保护试验或蛋白质印迹分析，用代表性实验的三个重复样品得到的数据确定平均值±标准差。显示了标准化到第0天或阴性对照的图表，图表表示为与对照值相比增加的倍数。

用方差的单程分析评价统计显著性，该单程分析以Bonferroni的事后多种比较修正(D.V.Huntsberger，“变量分析”，Elements of Statistical Variance，P.Billingsley(主编)，Allyn和Bacon公司，马萨诸塞州波士顿，298-330(1977)和SigmaStat，Jandel Scientific，加利福尼亚州Corte Madera)为宜。显著性达到Alpha水平定义为p＜0.05。

实施例15：用蛋白质印迹分析检测大鼠LIM矿化蛋白

根据England等(生物化学和生物物理学年鉴，623，171(1980))和Timmer等(J.Biol.Chem.，268，24863(1993))的方法制备了多克隆抗体。

用pCMV2/RLMP转染Hela细胞。根据Hair等(Leukemia Research，20，1(1996))的方法收集转染细胞中的蛋白。对天然RLMP的蛋白质印迹分析按Towbin等(美国国家科学院院刊，76：4350(1979))所述进行。

实施例16：合成衍生自人PCR产物的大鼠独特LMP(RLMPU)

根据大鼠LMP-1的cDNA序列，合成正向和反向PCR引物(序列表，第15和16号序列)，PCR扩增大鼠LMP-1cDNA中的223个碱基对的独特序列。从用同样PCR引物扩增的人KG63骨肉瘤细胞cDNA分离得到类似的PCR产物。

收集培养在T-75瓶中MG63骨肉瘤细胞的RNA。吸除培养上清液，双瓶中各覆盖3.0毫升GIT溶液，涡旋混合5-10秒，将所得溶液转移至1.5毫升eppendorf管中(6管，0.6毫升/管)。用稍微修改的标准方法(Sambrook等。分子克隆：实验室手册，第7章，第19页，第二版，冷泉港出版社(1989)和Boden等，Endocrinology，138，2820-2828(1977))纯化RNA。简要说，在0.6毫升样品中加入60微升2.0摩尔的醋酸钠(pH 4.0)，550微升水饱和苯酚和150微升氯仿∶异戊醇(49∶1)。加入这些试剂后，涡旋混合样品并离心(10000x g；20分钟；4℃)，将水相转移至一新试管。加入异丙醇(600微升)，-20℃沉淀RNA过夜。离心样品(10000x g；20分钟)，然后小心吸弃上清。将沉淀重悬于400微升DEPC处理的水中，用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，加入40微升醋酸钠(3.0摩尔；pH 5.2)和1.0毫升无水乙醇，-20℃沉淀过夜。沉淀后，离心样品(10000x g；20分钟)，用70％乙醇洗涤一次，空气干燥5-10分钟，重悬于20微升DEPC处理的水中。由光密度获得RNA浓度。

将总RNA(在总体积为10.5微升的DEPC-H₂O中含5微克RNA)65℃加热5分钟，然后将其加入到含4微升5X MMLV-RT缓冲液、2微升dNTPs、2微升dT17引物(10皮摩尔/毫升)、0.5微升RNA酶抑制剂(40单位/毫升)和1微升MMLV-RT(200单位/微升)的试管中。37℃反应1小时，然后通过95℃加热5分钟使MMLV-RT失活。加入80微升水稀释样品。

用标准方法(总体积50微升)对转录样品(5微升)进行聚合酶链反应，如Boden等(Endocrinology，138，2820-2828(1977))和Ausubel等(“通过聚合酶链反应定量少量DNAs”，分子生物学现代方法，第15.31-1章，Wiley&Sons，新泽西州塔伦顿(1990))所述。简要说，将样品加入到含水和适量PCR缓冲液(25毫摩尔MgCl₂、dNTPs、正向和反向引物(RLMPU的引物；序列表，第15和16号序列))、³²P-dCTP和DNA聚合酶的试管中。设计的引物连续运行22轮循环，用作放射性条带检测；和引物运行33轮循环所得扩增PCR产物，用作筛选探针(循环程序：94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，20秒)。

对琼脂糖凝胶纯化的MG-63骨肉瘤产生的PCR产物测序显示，该序列与RLMPU的PCR产物同源性高于95％。将该序列命名为HLMP独特区(HLMPU；序列表，第6号序列)。

实施例17：逆转录酶衍生MG63cDNA的筛选

用特定引物(序列表，第16和17号序列)作PCR进行筛选，如实施例7所述。用琼脂糖凝胶纯化得到MG63的PCR产物，具有717个碱基对。然后用给定引物(序列表，第12、15、16、17、18、27和28号序列)测序。至少两次双向测序确证这些序列。将MG63诸序列互相排列对比，然后与大鼠LMP cDNA全长序列对比，获得人LMP的部分cDNA序列(序列表，第7号序列)。

实施例18：人心脏cDNA文库的筛选。

根据RNA印迹实验，确定LMP-1在几种不同组织中表达水平有所不同，包括人心肌。因此检查了人心肌cDNA文库。

将该文库以5×10⁴空斑形成单位/毫升接种在琼脂平板(底部为LB琼脂)上，该板37℃培养过夜。将滤膜覆盖在该板上2分钟。然后将滤膜变性、淋洗、干燥、紫外线照射交联，在预杂交缓冲液(2xPIPES[pH 6.5]，5％甲酰胺，1％SDS和100克/毫升变性的鲑鱼精子DNA)中，42℃培育2小时。加入LMP独特的、223个碱基对的同位素标记探针(随机引物³²P标记；序列表，第6号序列)，然后42℃杂交18小时。杂交后，室温洗涤膜一次(10分钟，1x SSC，0.1％SDS)，55℃洗涤三次(15分钟，0.1xSSC，0.1％SDS)。根据制造商的操作程序(Strategene，加利福尼亚州拉霍亚)，用lambda噬菌粒拯救放射性自显影鉴定的双阳性空斑纯化的心肌文库克隆。

阳性克隆的限制性酶切产生大小不同的cDNA插入物。经测序选择长度大于600个碱基对的插入物用于初步筛选。用实施例11所述的标准方法测序这些插入物。

也用序列表中第11-14、16和27号序列相对应的引物对第7号克隆进行自动序列分析。这些方法获得的序列通常97-100％同源。克隆7(心肌文库的人LMP部分cDNA；序列表，第8号序列)在翻译区含有一个与大鼠LMP cDNA序列同源性超过87％的序列。

实施例19：全长人LMP cDNA序列的测定

采用MG62人骨肉瘤细胞cDNA序列和人心脏cDNA克隆7序列的重叠区域排列对比这两个序列，获得一个完整的1644个碱基对的人cDNA序列。用PCGENE软件包中的NALIGN程序对比这两个序列。这两个序列的重叠区域包括大约360个碱基对，除有一个核苷酸取代外，完全同源。该取代在克隆7位于MG63 cDNA(序列表，第7号序列)672位核苷酸为“A”，而相应的516位核苷酸(序列表，第8号序列)为“G”。

将这两个对比序列用PCGENE的另一个亚程序SEQIN相连接，用“G”取代MG63骨肉瘤的cDNA克隆。产生的序列显示在序列表中第9号序列。用NALIGN进行该全新人序列与大鼠LMP-1cDNA的对比。人LMP-1的cDNA全长序列(序列表，第9号序列)与大鼠LMP-1cDNA序列的翻译部分87.3％同源。

实施例20：人LMP-1氨基酸序列的测定

人LMP-1假定氨基酸序列的测定采用PCGENE的TRANSL亚程序。序列表中第9号序列的开放阅读框编码一个包含457个氨基酸的蛋白质(序列表，第10号序列)。使用PCGENE的PALIGN亚程序，发现人LMP-1氨基酸序列与大鼠LMP-1氨基酸序列94.1％同源。

实施例21：人LMP cDNA的5’非翻译区的测定

用5’快速扩增cDNA末端(5’RACE)实验程序对MG63总RNA进行嵌套RT-PCR，扩增MG63的5’cDNA。该方法包括采用在3’末端含两个简并核苷酸位置的锁定停靠寡核苷酸(dT)引物，合成第一条链(Chenchick等，克隆技术，X：5(1995)；Borson等，PC方法应用，2，144(1993))。根据Gubler等(Gene，2，263(1983))的方法，用大肠杆菌DNA聚合酶1、RNA酶H和大肠杆菌DNA连接酶的混合物进行第二条链的合成。用T4DNA聚合酶产生平端后，将双链cDNA连接于片段(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)(序列表，第19号序列)。RACE之前，将衔接子连接的cDNA稀释至适合马拉松RACE反应的浓度(1∶50)。然后，即可特异性克隆衔接子连接的双链cDNA。

用衔接子特异性寡核苷酸、作为正义引物的5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(API)(序列表，第20号序列)和实施例16中所述独特区域(HLMPU)的基因特异性引物(GSP)进行第一轮PCR。用嵌套引物GSP1-HLMPU(反义/反向引物)(序列表，第23号序列)和GSP2-HLMPUF(序列表，第24号序列)进行第二轮PCR(参见实施例16；正义/正向引物)。用商品化试剂盒(Advantage cDNA PCR核心试剂盒；CloneTech Laboratories Inc.，加利福尼亚州帕洛阿尔托)进行PCR，它采用抗体介导的而不是标准化的热启动程序。MG63 cDNA的PCR条件包括起始的热启动变性(94℃，60秒)，然后是：94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，4分钟；30轮循环。第一轮PCR产物长度大约为750个碱基对，而嵌套PCR产物为大约230个碱基对。将第一轮PCR产物克隆到线性化的pCR 2.1载体(3.9kb)中。用M13正向和反向引物(序列表，第11号序列；序列表，第12号序列)对插入物进行双向测序。

实施例22：用5’UTR进行人LMP-1cDNA的全长测定

排列对比了重叠的MG63人骨肉瘤细胞cDNA 5’-UTR序列(序列表，第21号序列)、MG63的717个碱基对序列(实施例17；序列表，第8号序列)和人心脏cDNA克隆7的序列(实施例18)，获得一个全新的1704个碱基对的人cDNA序列(序列表，第22号序列)。用NALIGN进行该项对比，(PCGENE和Omiga 1.0；Inteligenetics)。重叠序列几乎占全部的717个碱基对区域(实施例17)，同源性100％。用SEQIN进行对比序列的连接。

实施例23：构建LIM蛋白表达载体

用实施例17和18描述的序列进行pHIS-5ATG LMP-1s表达载体的构建。用ClaI和EcoRV酶切所述717个碱基对的克隆。凝胶纯化小片段(～250碱基对)。用ClaI和XbaI酶切克隆7(实施例18；序列表，第8号序列)，凝胶纯化1400个碱基对的片段。将分离的250个碱基对和1400个碱基对的限制性片段连接形成～1650碱基对的片段。

由于克隆7中有一个核苷酸取代(相对于717个碱基对的PCR序列和原始大鼠序列)，在翻译碱基对672处产生了一个终止密码子。因为这个终止密码子，而编码了一个截断(短)蛋白，因此称为LMP-1s。这是表达载体(序列表，第32号序列)中所用的构建物。将序列表中的第32号序列与5’RACE序列(序列表，第21号序列)排列对比产生含有5’UTR的全长cDNA序列(序列表，第33号序列)。然后，推导出LMP-1s的氨基酸序列(序列表，第34号序列)为223个氨基酸的蛋白，并经蛋白印迹证实(如实施例15)，电泳时预计分子量为～23.7kD。

用EcoRV和XbaI酶切pHis-ATG载体(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。回收该载体，并将650碱基对的内切片段即连接入线性化pHis-ATG中。克隆并扩增该连接产物。

用标准方法纯化pHis-ATG-LMP-1s表达载体，也称为含有插入HLMP-1s的pHIS-A。

实施例24：体外用LMP表达载体诱导骨节结形成和矿化

分离大鼠颅骨细胞并按实施例1进行次代培养。用糖皮质激素(GC)刺激或不刺激培养物，如实施例1所述。使用修改的Superfect试剂(Qiagen，加利福尼亚州巴伦西亚)转染程序在次代大鼠成骨细胞培养物中转染每种载体3微克/孔，如实施例25所述。

矿化的节结可通过Von Kossa染色观察，如实施例3所述。人LMP-1s基因产物单独过度表达，能在体外诱导骨节结形成(～203节结/孔)。节结水平大约是阳性对照GC(～412节结/孔)诱导的50％。其他阳性对照包括pHisA-LMP-大鼠表达载体(～152节结/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向表达载体(～206节结/孔)，而阴性对照包括pCMV2/LMP-大鼠-反向表达载体(～2节结/孔)和未处理(NT)平板(～4节结/孔)。这些数据证明人cDNA至少具有与大鼠cDNA相当的成骨诱导能力。该效果低于用GC刺激所观察到的效果，最可能是由于表达载体为亚适剂量。

实施例25：在体外和体内LMP诱导的细胞分化

通过NotI和ApaI双酶切(37℃过夜)，将克隆10-4中的大鼠LMP cDNA(参见实施例12)从载体上切下来。用相同的限制性酶酶切载体pCMV2 MCS(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。克隆10-4的线性cDNA片段和pCMV2用凝胶纯化、抽提并用T4连接酶连接。凝胶纯化、抽提连接的DNA，用于转化大肠杆菌JM109细胞以扩增。选择阳性琼脂菌落，用NotI和ApaI酶切，通过凝胶电泳检查限制性酶切产物。制备阳性克隆的储存培养物。

以类似方式制备反向载体，不同的是使用的限制性酶是XbaI和HindIII。因为采用了这些内切酶，可将克隆10-4的LMP cDNA片段反向(即不可翻译地)插入pRc/CMV2中。产生的重组载体称为pCMV2/RLMP。

将适量的pCMV10-4(最佳的终浓度为60纳摩尔[3微克]；对于本实验，优选终浓度范围是0-600纳摩尔/孔[0-30微克/孔])重悬于基础Eagle培养基(MEM)中，使最终体积为450微升，然后涡旋混合10秒。加入Superfect(最终溶液为7.5微升/毫升)，涡旋混合该溶液10秒，然后室温孵育10分钟。孵育后，加入含有10％FBS的MEM(1毫升/孔；6毫升/板)并吹打混匀。

然后将所得溶液迅速吸移(1毫升/孔)至洗涤过的ROB培养物上。将该培养物置于含有5％CO₂的潮湿环境中37℃孵育2小时。然后用无菌PBS轻柔洗涤细胞一次，加入合适的正常培养基。

结果证明pCMV10-4在所有大鼠细胞培养物中诱导了明显的骨节结形成。例如，pCMV10-4转染细胞产生了429节结/孔。接触Trm的阳性对照培养物，产生460节结/孔。相反，没有接受处理的阴性对照产生1节结/孔。类似地，当培养物转染pCMV10-4(反向)时，没有观察到节结。

为证明体内骨可能从头形成，吸取4-5周龄正常大鼠(rnu/+；隐性无胸腺杂合子)的下肢骨髓。用alpha MEM洗涤吸取的骨髓细胞，离心，将沉淀重悬于含0.83％NH₄Cl的10毫摩尔Tris(pH 7.4)溶液中，裂解红细胞。用MEM洗涤剩余的骨髓细胞3次，每3×10⁶细胞用9微克pCMV-LMP-1s(正向或反向)转染2小时。然后用MEM洗涤转染细胞2次，重悬至浓度3×10⁷细胞/毫升。

用无菌微量移液器将细胞悬液(100微升)转移至一个无菌、2×5毫米的I型牛胶原蛋白盘(Sulzer整形外科，科罗拉多州惠特里)中。将该盘以手术皮下植入4-5周龄无胸腺大鼠(rnu/rnu)的颅骨、胸、腹或背节脊柱。3-4周后将动物处死，此时切取该盘或手术区域在70％酒精中固定。用放射线照相术分析固定的标本，对5微米厚切片用Goldner Trichrome染色进行非脱钙组织学检查。还用失活的(胍萃取)去矿化骨基质(Osteotech，新泽西州什鲁斯伯里)代替胶原蛋白盘进行实验。

放射显影图显示了高水平的矿化骨形成，证实形成了含有LMP-1s转染骨髓细胞的原始胶原蛋白盘。在阴性对照(转染了不能编码翻译蛋白的反向LMP-1s cDNA的细胞)中没有观察到矿化骨形成，显示正在进行载体的吸收。

组织学揭示LMP-1s转染的植入物中新的骨小梁与成骨细胞线性排列。在阴性对照中，伴随载体的部分吸收，并没有观察到骨(形成)。

在无胸腺大鼠腰椎和胸椎之间交互部位加入18组(9个阴性对照pCMV-LMP-REV和9个实验pCMV-LMP-1s)植入物的进一步实验的放射显影图显示：9个阴性对照植入物没有一个显示在椎骨之间形成了骨(脊椎融合)。而所有9个pCMV-LMP-1s处理的植入物都显示椎骨之间形成了硬骨融合。

实施例26：由实施例2和3显示的序列合成pHIS-5’ATG LMP-1s表达载体

用ClaI和EcoRV(New England Biologicals，马萨诸塞州城)酶切上述717个碱基对的克隆(实施例17)。凝胶纯化获得小片段(～250碱基对)。用ClaI和XbaI酶切第7号克隆(实施例18)。凝胶纯化酶切产物中的1400个碱基对片段。用标准方法连接分离的250个碱基对和1400个碱基对的cDNA片段，形成一个～1650bp的片段。用EcoRV和XbaI酶切pHis-A载体(Invitrogen)。回收该线性化载体连接于嵌合性1650个碱基对cDNA片段。用标准方法克隆并扩增连接产物。如前所述，将phis-A-5’ATG LMP-1s表达载体，也称为含有插入HLMP-1s的载体pHis-A，已经保存在ATCC。

实施例27：体外用pHis-5’ATG LMP-1s表达载体诱导骨节结形成和矿化

分离大鼠颅骨细胞并按实施例1进行次代培养。用糖皮质激素(GC)刺激或不刺激培养物，如实施例1所述。培养物用重组pHis-A载体DNA 3微克/孔转染，如实施例25所述。矿化节结用实施例3的Von Kossa染色观察。

人LMP-1s基因产物单独过度表达(如没有GC刺激时)，能在体外显著诱导骨节结形成(～203节结/孔)。这大约是接触阳性对照GC的细胞所产生节结数量(～412节结/孔)的50％。用pHisA-LMP-大鼠表达载体(～152节结/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向表达载体(～206节结/孔)转染的培养物中获得了类似的结果。相反，阴性对照pCMV2/LMP-大鼠-反向表达载体产生～2节结/孔，而未处理平板中观察到大约4节结/孔。这些数据证明在这个模型系统中，人LMP-1cDNA至少和大鼠cDNA的成骨诱导能力相当。本实验的效果低于用GC刺激观察到的效果；但是在某种方面上，该效果是相当的。

实施例28：LMP诱导可溶性成骨诱导因子的分泌

如实施例24所述，RLMP-1或HLMP-1s在大鼠颅骨成骨细胞培养物中的过度表达，导致骨节结形成显著增多(与阴性对照观察到的结果相比)。为了研究LIM矿化蛋白的作用机制，收集不同时间点的条件培养基，浓缩10倍，过滤除菌，用含新鲜血清的培养基稀释至其最初浓度，用于培养未转染的细胞4天。

在第4天收集转染RLMP-1或HLMP-1s细胞的条件培养基，其诱导骨节结形成的效果与直接在转染细胞中过表达RLMP-1的效果大约相当。转染反向RLMP-1或HLMP-1细胞的条件培养基对骨节结形成没有明显效果。在第4天之前收集的LMP-1转染培养物的条件培养基不诱导骨节结形成。这些数据表明LMP-1的表达引起了一种可溶性因子的合成和/或分泌，直到转染4天后，培养基中才会出现有效量的该因子。

因为rLMP-1的过表达可导致成骨诱导因子分泌进入培养基中，故采用蛋白质印迹分析来测定培养基中是否存在LMP-1蛋白。RLMP-1蛋白的存在可用LMP-1特异性抗体(QDPDEE)进行评估，用常规方法检测。只在培养物的细胞层中发现LMP-1蛋白，而在培养基中没有检测到它的存在。

用标准25％和100％硫酸铵逐次处理后，再进行DE-52阴离子交换批量层析(100毫摩尔或500毫摩尔的NaCl)实现了成骨诱导可溶性因子的部分纯化。在高浓度的硫酸铵和高浓度的NaCl组分中观察到所有的活性。这种定位与负责条件培养基单一因子的可能性相一致。

实施例29：低剂量腺病毒介导的腰椎融合基因治疗

本研究确定了在正常的即有免疫能力的家兔中能促进脊椎融合输送LMP-1cDNA(序列表，第2号序列)的腺病毒的最优剂量。

用AdenoQuest^TM试剂盒(Quantum生物科技公司，蒙特利尔)，构建了含CMV启动子驱动的LMP-1cDNA(序列表，第2号序列)的复制缺陷型人重组腺病毒。用市售(Quantum生物科技公司，蒙特利尔)的含β-半乳糖苷酶的重组腺病毒作为对照。

首先，进行体外剂量反应实验以确定输送LMP-1的腺病毒(“AdV-LMP-1”)诱导大鼠颅骨成骨细胞培养物骨分化的最优浓度；即采用60分钟转导，每个细胞的病毒感染复数(MOI)分别为0.025、0.25、2.5或25空斑形成单位(pfu)。阳性对照培养物接触10⁹摩尔的糖皮质激素(GC)7天后发生分化。阴性对照培养物不处理。在第14天，用yon Kossa染色培养物后计数矿化骨节结，用放射性免疫试验测定分泌到培养基(皮摩尔/毫升)中的骨钙素浓度(平均值±SEM)。

本实验的结果见下表I。未处理的阴性对照培养物中基本上没有自发性节结形成。数据显示等于0.25pfu/细胞的MOI对成骨诱导骨节结最有效。达到了相当于阳性对照(GC)的水平。较低或较高剂量的腺病毒效果较差。

表I

结果 Adv-LMP-1剂量(MOI) 阴性对照 GC 0.025 0.25 2.5 25 骨节结 0.5±0.2 188±35 79.8±13 145.1±13 26.4±15 87.6±2 骨钙素 1.0±.1 57.8±9 28.6±11 22.8±1 18.3±3 26.0±2

然后进行体内实验，确定体外能促进骨骼成熟新西兰白兔体内脊椎横突融合的最优剂量。将九只家兔麻醉，用18号针头从在大腿骨末梢的髁间缺口吸取3毫升骨髓。分离暗黄层，用AdV-LMP-1进行10分钟转导，然后将细胞送回手术室供植入。通过脊椎横突皮质剥除插入含有800-1500万自身暗黄层有核细胞的运载体(兔失活的骨基质或胶原蛋白海绵)进行单一水平后外侧腰椎关节定位术，所述有核细胞转导有AdV-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)。5周后，无痛处死家兔，用手工触诊、普通X射线术、CT扫描和非脱钙组织学评估其脊柱融合。

在所有9只家兔中，接受AdV-LMP-1的脊柱融合部位都诱生了硬的、连续的脊柱融合块。相反，接受AdV-Bgal或低剂量AdV-LMP-1(MOI＝0.04)的部位几乎不或不产生骨，其产生的脊柱融合速率与单用载体相当(＜40％)。经手工触诊、CT扫描和组织学分析评价，这些结果是一致的。然而，普通放射显影有时高估了存在的骨量，尤其是对照部位。用测试的两种载体材料都成功地进行LMP-1cDNA输送和骨诱导。没有证据显示动物对腺病毒载体有全身或局部免疫反应。

这些数据证明在前面已验证的兔脊柱融合模型中骨诱导的一致性。此种外科手术离体基因转导(10分钟)采用自身骨髓细胞的方法，比其他需要过夜转导或数周培养扩增细胞的方法在临床上更可行。另外，重组腺病毒的最有效剂量(MOI＝0.25)大大低于其他基因治疗应用报道的剂量(MOI 40-500)。发明人相信这是由于LMP-1是细胞内信号传递分子，可能具有强效信号放大级联反应的缘故。还有，与细胞培养物中诱导骨形成相同浓度的AdV-LMP-1在体内一样有效，此发现令人惊讶，因为当将其他生长因子从细胞培养中转换至动物试验时，通常需要增加剂量。总而言之，这些观察表明用腺病毒输送LMP-1cDNA进行局部基因治疗是可能的，所需剂量低将可能使对腺病毒载体的免疫反应副作用减至最小。

实施例30：采用外周静脉血有核细胞(暗黄层)作LMP-1cDNA基因治疗产生骨。

我们在4只家兔中进行了上述(实施例29)的脊柱融合外科手术，不同之处在于转导细胞是静脉血的暗黄层细胞，而不是骨髓。用AdLMP或pHIS-LMP质粒转染这些细胞，获得了与用骨髓细胞相等的成功结果。采用普通静脉血细胞能进行基因输送的这个发现使基因治疗在临床上更可行，因为它避免了全身麻醉下收集骨髓的痛苦，并且每毫升起始材料可产生两倍以上的细胞。

实施例31：人LMP-1剪接变体的分离

内含子/外显子mRNA转录剪接变体是在信号转导和细胞/组织发育中一种相当普遍的调节机制。已证明各种基因的剪接变体能够改变蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA和蛋白-底物的相互反应。剪接变体也能控制基因表达的组织特异性，使其在不同组织中的表达形式不同(因此功能不同)。剪接变体是细胞中的普遍调节现象。LMP间接变体可能在其他组织中发挥作用，如神经再生、肌肉再生或其他组织的发育。

为筛选人心脏cDNA文库中的HLMP-1序列剪接变体，制备了对应于序列表中第22号序列部分的一对PCR引物。用标准技术合成的正向PCR引物对应于序列表中第22号序列的33-54位核苷酸。其序列如下：

5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’ (序列表，第35号序列)

反向PCR引物，即序列表中第22号序列的820-839位核苷酸的反向互补序列，其序列如下：

5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’ (序列表，第36号序列)

通过标准技术，用该正向和反向PCR引物筛选人心脏cDNA(ClonTech，目录号7404-1)中与HLMP-1相似的序列，所用的循环程序为94℃ 30秒，64℃ 30秒和72℃1分钟，重复30次，然后72℃孵育10分钟。凝胶纯化扩增的cDNA序列，然后用EmoryDNA Sequence Core Facility对其测序。用标准技术测序这些克隆，用PCGENE(Intelligenetics；SEQUIN和NALIGN程序)检查序列以确定与序列表中第22号序列的同源性。然后，用Intelligenetic的程序TRANSL将含有相当于序列表第22号序列的假定交替剪接位点的两个同源性核苷酸序列各自翻译成它们的蛋白产物。

这两个全新的人cDNA序列之一(序列表，第37号序列)包含1456bp：

CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG 60

GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT 120

GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC 180

GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA 240

GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG 300

X X

CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG 360

GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGGCTGATG GAGAACACAG AGGACTGGCG GCCGCGGCCG 420

GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTCCGCATC CTTGCCCACC TCACAGGCAC CGAGTTCATG 480

CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTGAAGAAA TCAAGCCAGG TGCCCAGGAC AGAAGCCCCA 540

GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAGGAGCCC TGGCCTGGCC CTACCGCCCC CAGCCCTACC 600

AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGACCCTGCG TTTGCCGAGC GCTATGCCCC GGACAAAACG 660

AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGCCAGCCG GCCACGCCCA CGCCGCTGCA GAGCCGCACC 720

TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGAGGGGTG CCAGGAGGGG GCAGCAACAA CGGCAAGACT 780

CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAGGTCATC CGGGGCCGCT ACCTGGTGGC GTTGGGCCAC 840

GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTGTGTAGC CAGTGTGGGA AGGTCCTGGA AGAGGGTGGC 900

TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATCTTCTGC CCACCATGCT ATGACGTGCG CTATGCACCC 960

AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAGATTACA GGCGAGATCA TGCACGCCCT GAAGATGACC 1020

TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGTGCTGCC TGCAAGACGC CCATCCGGAA CAGGGCCTTC 1080

TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTATTGCGAG CGAGACTATG AGAAGATGTT TGGCACGAAA 1140

TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATCGACGCT GGGGACCGCT TCCTGGAGGC CCTGGGCTTC 1200

AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTCTGTGCG ATATGTCAGA TCAACCTGGA AGGAAAGACC 1260

TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCTCTCTGC AAGAGCCATG CCTTCTCTCA TGTGTGAGCC 1320

CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGTGGCCCC TAGCCTGAGG GGCCTGGAGT CGTGGCCCTG 1380

CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATGGTTGCC TTAACCCTGG CTCCTGGCCC GAGCCTGGGC 1440

TCCCGGGCCC TGCCCA 1456

119bp片段(X之间)缺失所引起的阅读框漂移和加入的17bp片段(下划线)导致产生一种截断的基因产物，其氨基酸序列如下(序列表，第38号序列)：

Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe

1 5 10 15

Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp

35 40 45

Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile

50 55 60

Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln LysVal Gln Thr

85 90 95

Pro Asp LysGln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln

100 105 110

Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly

115 120 125

Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe

130 135 140

Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro

145 150 155 160

Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp

165 170 175

Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val

180 185 190

Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val

195 200 205

Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg

210 215 220

Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg

245 250 255

Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe

260 265 270

Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu

275 280 285

Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala

290 295 300

Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His

305 310 315 320

Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys

325 330 335

Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly Val Pro

340 345 350

Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp

355 360 365

Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly

370 375 380

Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln He Asn

385 390 395 400

Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys

405 410 415

Ser His Ala Phe Ser His Val

420

这423个氨基酸的蛋白质与序列表中第10号序列显示的蛋白，除重点标出区域的序列(94-99号氨基酸)由于上述核苷酸改变而不同外，同源性为100％。

第二个全新的人心脏cDNA序列(序列表，第39号序列)包含1575bp：

CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG 60

GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT 120

GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC 180

GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA 240

GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG 300

CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGCCTCC GCCCCCGCCG CGGACCCTCC GCGGTACACC 360

TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAACAAGACG GCCCGGCCCT TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT 420

GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGGGTGCAGA CCCCTGACAA ACAGCCGCTC CGACCGCTGG 480

TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGGCTGATGG AGAACACAGA GGACTGGCGG CCGCGGCCGG 540

GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTCCGCATCC TTGCCCACCT CACAGGCACC GAGTTCATGC 600

AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTGAAGAAAT CAAGCCAGGT GCCCAGGACA GAAGCCCCAG 660

CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAGGAGCCCT GGCCTGGCCC TACCGCCCCC AGCCCTACCA 720

GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GACCCTGCGT TTGCCGAGCG CTATGCCCCG GACAAAACGA 780

GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGCCAGCCGG CCACGCCCAC GCCGCTGCAG AGCCGCACCT 840

CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGAGGGGTGC CAGGAGGGGG CAGCAACAAC GGCAAGACTC 900

CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAGGTCATCC GGGGCCGCTA CCTGGTGGCG TTGGGCCACG 960

CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTGTGTAGCC AGTGTGGGAA GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT 1020

TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATCTTCTGCC CACCATGCTA TGACGTGCGC TATGCACCCA 1080

GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAGATTACAG GCGAGATCAT GCACGCCCTG AAGATGACCT 1140

GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGTGCTGCCT GCAAGACGCC CATCCGGAAC AGGGCCTTCT 1200

ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TATTGCGAGC GAGACTATGA GAAGATGTTT GGCACGAAAT 1260

GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATCGACGCTG GGGACCGCTT CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA 1320

GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTCTGTGCGA TATGTCAGAT CAACCTGGAA GGAAAGACCT 1380

TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCTCTCTGCA AGAGCCATGC CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC 1440

CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGTGGCCCCT AGCCTGAGGG GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC 1500

ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATGGTTGCCT TAACCCTGGC TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT 1560

CCCGGGCCCT GCCCA 1575

加入17bp片段(粗体、斜体和下划线)所引起的阅读框漂移导致在565-567位(下划线)产生了一个早期终止密码子。

获得的氨基酸序列(序列表，第40号序列)由以下153个氨基酸组成：

Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe

1 5 10 15

Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp

35 40 45

Trp Val Leu Ser Ile Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile

50 55 60

Glu Ala Gln Asn Lys lie Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln LysAla Ser Ala

85 90 95

Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arcr Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu

100 105 110

Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala

115 120 125

Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arq Pro Leu Thr Asn Ser Ara Ser Asp Arg

130 135 140

Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly

145 150

该蛋白质显示与序列表中第10号序列94位氨基酸之前的同源性为100％，从94号氨基酸开始，在核苷酸序列中加入17bp片段导致阅读框漂移。在94-153号氨基酸区域，该蛋白与序列表中的第10号序列不同源。由于核苷酸序列中所述的早期终止密码子，序列表中第10号序列的154-457号氨基酸不存在。

实施例32：基因组HLMP-1核苷酸序列

申请人鉴定了编码HLMP-1的基因组DNA序列，包括假定与HLMP-1表达相关的调节元件。整个基因组序列见序列表中的第41号序列。该序列得自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因组测序中心，华盛顿大学医学院，密苏里州圣路易斯。

HLMP-1的假定启动子区域包括序列表中第41号序列的2,660-8,773号核苷酸。该区域的其他元件包括至少10个潜在的糖皮质激素反应元件(GREs)(6148-6153，6226-6231，6247-6252，6336-6341，6510-6515，6552-6557，6727-6732，6752-6757，7738-7743和8255-8260号核苷酸)，12个潜在的果蝇dpp基因的Sma-2同源物(SMAD)结合元件位点(3569-3575，4552-4558，4582-4588，5226-5232，6228-6234，6649-6655，6725-6731，6930-6936，7379-7384，7738-7742，8073-8079和8378-8384号核苷酸)和三个TATA框(5910-5913，6932-6935和7380-7383号核苷酸)。这三个TATA框、所有的GRE和8个SMAD结合元件(SBEs)都组成了跨越序列表中第41号序列5,841-8,733号核苷酸的区域内。这些调节元件可用于，例如调节编码参与骨形成过程蛋白质外源性核苷酸序列的表达。这将得以全身给予治疗性骨形成和修复相关因子或基因、以及给予组织分化和发育相关因子和基因。

除假定的调节元件之外，还鉴定了与编码HLMP-1核苷酸序列相对应的13个外显子。这些外显子跨越序列表中第41号序列的下述核苷酸位置：

外显子1 8733-8767

外显子2 9790-9895

外显子3 13635-13787

外显子4 13877-13907

外显子5 14387-14502

外显子6 15161-15297

外显子7 15401-15437

外显子8 16483-16545

外显子9 16689-16923

外显子10 18068-18248

外显子11 22117-22240

外显子12 22323-22440

外显子13 22575-22911

在HLMP-2中有另一外显子(外显子5A)，其跨越核苷酸14887-14904。

实施例33：HLMP-1在椎间盘细胞中的表达

LIM矿化蛋白-1(LMP-1)是一种细胞内蛋白质，能指导骨或非骨组织细胞分化。本实施例证明，在椎间盘细胞中表达人LMP-1(HLMP-1)能增加蛋白聚糖的合成并促进更强的软骨细胞表型。另外，通过测定聚集蛋白聚糖和BMP-2基因表达证明了HLMP-1表达对细胞基因表达的作用。用温和的酶消化收集Sprague-Dawley大鼠的腰椎间盘细胞，以单层培养在含有10％FBS的DMEM/F12中。然后将这些细胞分置于6孔板中，每孔约200,000细胞，继续培养约6天直到细胞达到每孔约300,000个。将培养基换成1％FBS DMEM/F12，并将这一天视为第0天。

前已描述过(例如美国专利6,300,127)含操作性连接于巨细胞病毒(CMV)启动子的HLMP-1cDNA的复制缺陷5型腺病毒。除HLMP-1cDNA被LacZ cDNA替换外，阴性对照腺病毒与实验腺病毒相同。所用的阳性对照是在浓度为100纳克/毫升BMP-2连续存在下培养的未感染的培养物。

第0天，将培养物在含有1％FBS的300微升培养基中，37℃感染腺病毒30分钟。用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析用含绿荧光蛋白(GFP)基因腺病毒(AdGFP)处理的细胞，以确定使转基因表达的最优剂量范围。用含人LMP-1cDNA的腺病毒(AdHLMP-1)(MOI为0、100、300、1000或3000)或含LacZ标记基因的腺病毒(AdLacZMOI为1000)(阴性对照)处理细胞。感染后第3天和第6天调换细胞培养基。

用二甲基亚甲基蓝(DMMB)热计量试验测定培养基中存在的硫酸葡糖胺多糖(sGAG)(第0、3和6天)，估计蛋白聚糖的产量。

为了定量测定聚集蛋白聚糖和BMP-2mRNA，在第6天收集细胞，用Trizol技术抽提mRNA。用逆转录酶将该mRNA转变为cDNA并用于实时PCR，这可以确定待测聚集蛋白聚糖和BMP-2信使的相对丰度，先前的实验中设计并测试了这两种物质的实时引物。使用了Cybergreen技术。用标准曲线定量mRNA丰度。

对于转染细胞，用光学显微镜记录细胞形态。用AdHLMP-1(MOI 1000)处理的细胞变得更圆，但用AdLacZ处理的细胞没有这种变化。AdLacZ感染不明显改变细胞形态。

用FACS分析感染1000个MOI的ADGFP的大鼠椎间盘细胞，显示感染细胞达到最高百分比(45％)。

sGAG产生和AdhLMP-1MOI之间存在剂量依赖性增加。这些数据可参见图1，显示单层培养的大鼠椎间盘细胞经不同MOI感染过表达HLMP-1后sGAG的产量。结果已标准化到第0天未处理细胞。误差条代表平均值的标准差。如图1所示，在第3天观察到的sGAG产生相当少，表明在感染和细胞产生GAG之间有一段滞后时间。用AdLacZ处理不明显改变sGAG的产生。如图1所示，最优剂量的AdhLMP-1是1000个MOI，导致第6天sGAG的产生比未处理对照增加260％。更高或更低剂量的AdhLMP-1都导致反应减小。

AdhLMP-1剂量(MOI)对sGAG产生的影响进一步在图2中说明。图2是显示以不同MOI感染AdhLMP-1处理后第6天，大鼠椎间盘sGAG水平的图表。从图2中可以看到，AdhLMP-1的最优剂量为MOI 1000。

图3显示聚集蛋白聚糖和BMP-2的mRNA的产量。该图显示过表达HLMP-1后聚集蛋白聚糖和BMP-2mRNA增加。对第6天抽提自大鼠椎间盘细胞的mRNA进行实时PCR，比较未处理(NT)细胞和用MOI 250感染AdhLMP-1处理的细胞。图3的数据表示为相对于未处理样品的增加百分比。如图3所示，AdhLMP-1处理后，可见聚集蛋白聚糖和BMP-2mRNA明显增加。BMP-2表达的增加提示BMP-2是介导HLMP-1刺激蛋白聚糖合成的下游基因。

这些数据证明转染AdhLMP-1能有效增加椎间盘细胞的蛋白聚糖合成。产生最高转基因表达的病毒剂量(MOI 1000)也能对sGAG产生最大诱导，这提示HLMP-1表达和sGAG诱导之间存在相关性。这些数据说明HLMP-1基因治疗是提高椎间盘细胞蛋白聚糖合成的一种方法，也说明HLMP-1是一种治疗椎间盘疾病的药物。

图4A是显示以不同MOI Ad-hLMP-1感染12小时后HLMP-1mRNA表达的图表。在图4A中，用不同剂量(MOI)的Ad-hLMP-1病毒诱导外源LMP-1表达，并用实时PCR定量。为了比较目的，将这些数据都标准化至Ad-LMP-1的MOI为5时的HLMP-1mRNA水平。阴性对照、未处理(NT)或Ad-LacZ处理(LacZ)组中没有检测到HLMP-1。当MOI为25和50时，HLMP-1mRNA水平以剂量依赖的方式达到大约8倍的平台。

图4B是显示感染后3至6天，培养基中的sGAG产量的图表。用DMMB试验定量测定了感染后3-6天的总sGAG产量。将图4B的数据标准化至对照(即未处理)组。从图4B中可见，sGAG呈剂量依赖性增加，峰值达到对照的大约3倍(用MOI 25和50时)。阴性对照、以MOI 25的Ad-LacZ感染不增加sGAG。在图4B中，每个结果都表示为三个样品的平均值和标准差。

图5是显示sGAG的产量随时间变化的图表。从图5可见，MOI为25和50时，第3天的sGAG产量明显增加。在第六天，对AdLMP的反应中sGAG产量呈剂量依赖性增加。sGAG增加在MOI 25时达到平台期。从图5也可见，用AdLacZ(LacZ)处理不明显改变sGAG的产量。每个结果都表示为6-9个样品的平均值和标准差。图5中，“**”表示该数据点与未处理对照相比时P值＜0.01。

图6A和6B是分别显示大鼠纤维环细胞中聚集蛋白聚糖和BMP-2基因对LMP-1过表达反应的图表。以MOI 25Ad-LMP-1(LMP-1)感染后第3天进行了定量实时PCR。从图6A和6B可见，与未处理对照(NT)相比，感染Ad-LMP-1后聚集蛋白聚糖和BMP-2基因表达明显增加。还有，与未处理对照(NT)相比，以MOI 25的AdLacZ(LacZ)处理不明显改变聚集蛋白聚糖和BMP-2基因的表达。在图6A和6B中，每个结果都表示为六个样品的平均值和SD。在图6A和6B中，“**”表示该数据点的P值＜0.01。

图7是显示大鼠纤维环细胞经MOI 25AdLMP-1感染后，其中HLMP-1mRNA水平随时间变化的图。数据表示为，与MOI 5的AdLMP-1感染相比增加的倍数(用18S标准化后)和过度表达LMP-1引物的复制系数。从图7可见，早在感染后12小时时，HLMP-1mRNA已明显上调。另外，第1天和第3天之间表达水平也有显著增加。图7的每个结果表示为六个样品的平均值和标准差。

图8是显示对HLMP-1过表达反应中BMPs和聚集蛋白聚糖mRNA水平变化的图表。用实时PCR对用MOI 25Ad-hLMP-1感染后，不同时间点BMP-2、BMP-4、BMP-6、BP-7和聚集蛋白聚糖mRNA水平进行测定。从图8可见，早在感染Ad-hLMP-1后12小时，BMP-2mRNA已明显上调。另一方面，聚集蛋白聚糖mRNA直到感染3天后才上调。每个结果表示为六个样品的平均值和SD。在图8中，“**”表示感染AdLMP-1的数据点与未处理对照相比时P值＜0.01。

图9是显示对HLMP-1表达反应中sGAG产量增加的时间变化。图9中的数据是大鼠环细胞用MOI 25Ad-HLMP-1感染所得。感染后每3天调换一次培养基，并用DMMB试验测定一次sGAG。该数据显示在第6天sGAG产量达到平台，并基本上维持至第9天。

图10显示成头蛋白(一种BMP拮抗剂)对LMP-1介导sGAG产量增加的影响。如图10所示，大鼠环细胞用MOI 25Ad-LMP-1感染导致在第3-6天之间产生的sGAG增加三倍。这种增加因加入浓度3200纳克/毫升和800纳克/毫升的成头蛋白而被阻断。然而，如图10所示，成头蛋白不明显改变未感染细胞中的sGAG产生。从图10也可见，加入BMP-2后，用10纳克/毫升的rhBMP-2刺激导致在第3-6天之间sGAG的产量增加三倍。800纳克/毫升的成头蛋白也可阻断此种增加。

图11是显示在培养基中单层培养6天后，LMP-1对sGAG的影响。数据点表示与未处理细胞相比的增加倍数。如图11所示，含CMV启动子的LMP当通过AAV载体输送时，仍能有效刺激单层培养的大鼠椎间盘细胞的葡糖胺多糖合成。

表2：用于RT-PCR和SYBR绿实时PCR的引物序列

引物序列聚集蛋白聚糖(正向) 聚集蛋白聚糖(反向) BMP-2(正向) BMP-2(反向) GAPDH(正向) GAPDH(反向) AGGATGGCTTCCACCAGTGC TGCGTAAAAGACCTCACCCTCC CACAAGTCAGTGGGAGAGC GCTTCCGCTGTTTGTGTTTG ACCACAGTCCATGCCATCAC TCCACCACCCTGTTGCTGTA

表2中的GAPDH指甘油醛磷酸脱氢酶

表3：用于TaqMan^实时PCR的引物和探针序列

引物序列过表达LMP-1(正向) 过表达LMP-1(反向) 过表达LMP-1(探针) AATACGACTCACTATAGGGCTCGA GGAAGCCCCAAGGTGCT -FAM-AGCCGGCATCATGGATTCCTTCAA-TAMRA

采用TaqMan^核糖体RNA控制试剂(编号4308329，Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城)作为18S核糖体RNA(rRNA)基因的正向引物、反向引物和探针。

骨形成机制-多种BMPs诱导的证据

动物和体外研究已经证明，用较低剂量的腺病毒或质粒载体将LIM矿化蛋白-1(LMP-1)cDNA进行离体基因转移，能够产生明显和-致的骨形成效果(Boden等，“基础科学领域的沃尔沃奖：用编码全新成骨诱导蛋白(LMP-1)的cDNA进行局部基因治疗引起腰椎融合”，Spine，23，2486-2492(1998))。然而关于LMP-1的作用机制，转导的细胞能够存活多久，或者哪种成骨诱导生长因子和细胞参与了新骨诱导和成骨细胞分化还知之甚少(参见Boden等，“LMP-1，一种LIM结构域蛋白，介导BMP-6对骨形成的作用”，Endocrinology，139，5125-5134(1998)和Boden等，Spine，2486-2492(1998))。而且，体内骨形成的机制(如软骨与膜状骨)仍未有定论。了解LMP-1的作用机制对于临床上最优控制LMP-1诱导的骨形成和进一步了解成骨细胞分化相关细胞内信号传导途径是有帮助的。

LMP-1是异质性LIM结构域蛋白家族的一员，并且是与成骨细胞分化直接相关的第一成员(Kong等，“肌肉LIM蛋白可通过增强MyoD的活性促进肌生成”，Mol.Cell.Biol.，17，4750-4760(1997))。LIM-1在受糖皮质激素刺激的大鼠颅骨成骨细胞的信使核糖核酸(mRNA)中鉴定到，后来从骨肉瘤的互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库中分离得到(Boden等，Endocrinology，139，5125-5134(1998))。与通过细胞表面受体起作用的细胞外蛋白BMPs不同，认为LMP-1是细胞内信号传递分子，直接参与成骨细胞的分化(Boden等，Spine，20，2626-2632(1995)；Cook等，“重组人生骨蛋白-1在非人灵掌类中对节段性缺损愈合的影响”，J.Bone Joint Surg.，77-A，734-750(1995)；Schimandle等，“用重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-1)产生的实验性脊柱融合”，Spine，20，1326-1337(1995))。因此，LMP的治疗性用途可包括其cDNA的基因转移。根据它与骨发育的关系以及抑制和过度表达实验的结果，认为LMP能够诱导具有成骨诱导活性的可溶性因子的分泌，并且是体内体外成骨细胞分化和成熟的一种重要调节剂。

下面描述进行的几方面研究：1)鉴定LMP-1诱导的分泌型成骨诱导因子的候选物；2)描述LMP-1诱导的骨形成的组织学顺序和类型；3)确定过度表达LMP-1的植入细胞在体内存活多长时间。

本研究中，利用人肺癌(A549)细胞确定LMP-1过度表达是否能体外诱导骨形态发生蛋白的表达。用含有LMP-1或LacZ cDNA的重组复制缺陷型人腺病毒5型感染培养的A549细胞。48小时后用免疫组化分析细胞。最后，16只无胸腺大鼠接受由载有感染了上述两种病毒之一的人暗黄层细胞的胶原蛋白盘组成的皮下植入物。一定时间间隔后，无痛处死大鼠，取出植入物，用组织学和免疫组化分析。

材料和方法

第1阶段：体外检测LMP诱导的成骨诱导因子

将带有人巨细胞病毒启动子的人LMP-1cDNA克隆入一个转移载体中，然后转移到上述重组复制缺陷型(E1、E3缺失)腺病毒中。

已知人肺癌细胞(A549)受人5型腺病毒的感染率很高。将这些细胞以50,000细胞/厘米2的密度接种于2孔室载玻片上(Nalge Nunc International，伊利诺斯州内珀维尔)，在含10％胎牛血清的F12Kaighn’s培养基(Gibco BRL)中增殖，37℃培养在潮湿的5％CO₂培养箱中。

在孔室上，37℃感染A549细胞30分钟，感染复数(MOI)为10pfu/孔。加入含10％FBS的培养基后37℃培养细胞48小时。细胞分别用人巨细胞病毒启动子驱动的AdLMP-1(活性LMP)或AdLacZ(Ad βgal-腺病毒对照)感染(Boden等，Endocrinology，139，5125-5134(1998)和Boden等，Spine，23，2486-2492(1998))。作为另一阴性对照，一些细胞不感染腺病毒(未处理对照)。48小时后，将孔室载玻片上的细胞置于50％丙酮/50％甲醇中固定2分钟，然后用免疫组化分析(见下述)，所用抗体是LMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1、MyoD和II型胶原蛋白的特异性抗体。

第2阶段：体内骨形成的组织学顺序

本实验方案得到了实验动物照料和使用委员会和人类研究委员会的审查和批准。静脉穿刺获得兔或人外周血(3毫升)，1200xg，10分钟简单离心分离得到暗黄层细胞。计数这些细胞，用腺病毒(AdLMP-1或AdLacZ)以MOI 4.0pfu/细胞37℃感染1×10⁶细胞10分钟。感染后，将细胞重悬，至最终体积80微升，施加至7毫米×7毫米×3毫米的胶原盘(牛I型胶原)上。

购得(Harlan，印第安纳州印第安纳波利斯)16只4-5周龄的无胸腺大鼠，饲养在无菌环境下。吸入1-2％异氟烷使大鼠麻醉。在无胸腺大鼠的胸部作4个10毫米的皮肤切口，通过钝器解剖将其扩大成袋，然后将含有细胞的胶原盘植入各个袋中。植入物由载有感染了AdLMP-1(每只鼠2个)或AdLacZ(每只鼠2个)的暗黄层细胞的胶原盘组成。用可吸收缝线缝合皮肤。植入后1天、3天、5天、7天、14天、21天和28天分别处死动物，取出植入物，用组织学和免疫组化分析。

样品在10％福尔马林中性缓冲液中固定24小时。将样品制备成非脱钙和脱钙切片。通过梯度乙醇液将非脱钙切片样品脱水，石蜡包埋。用10％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液将植入后21天和28天的样品脱钙3至5天。脱钙后，用梯度乙醇将样品脱水石蜡包埋。将样品在显微切片机(Reichert Jung GmbH，德国海德尔堡)上切成5微米厚的薄片。用苏木精和伊红染色、Goldner’s三色染色薄片，并用BMP-4、BMP-7、CD-45和I型胶原蛋白的特异性抗体进行免疫组化研究。

制备第一抗体

抗LMP-1抗体：抗LMP-1抗体是亲和纯化的针对人LMP-1某内部区域的兔多克隆抗体，能与兔和人源的LMP-1反应。该抗体可用于鉴定LMP-1蛋白，稀释度是1∶500或1∶1000。

抗BMP-2、抗BMP-4、抗BMP-6、抗BMP-7和抗TGF-β1抗体：多克隆山羊抗BMP-2、抗BMP-4、抗BMP-6、抗BMP-7和抗TGF-β1抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼亚州圣克鲁斯)能与小鼠、大鼠和人BMPs交叉反应。抗BMP-2、抗BMP-4和抗BMP-6抗体针对人源BMP-2、BMP-4和BMP-6的氨基末端某表位。抗BMP-7抗体是亲和纯化的针对人BMP-7内部某区域免疫的山羊多克隆抗体。抗TGF-β1抗体是亲和纯化的针对人TGF-β1前体羧基末端的山羊多克隆抗体。这些抗体的应用稀释度为1∶100和1∶500或1∶1000。

抗CD45抗体：单克隆小鼠抗人白细胞共同抗原(LCA)CD45抗体(纯化的IgG 1，κ；DAKO公司，加利福尼亚州Carpinteria)由两个抗体组成，即针对不同表位的PD7/26和2B11抗体。PD7/26获自T细胞生长因子维持的外周血白细胞。2B11由分离自T细胞淋巴瘤或白血病的肿瘤细胞获得。免疫荧光测试时，这两种抗体能结合94-96％的白细胞或单核细胞。本研究中，该抗体以1∶100稀释度用于鉴定人白细胞。

抗I型胶原蛋白抗体：单克隆抗I型胶原蛋白抗体(小鼠IgG 1同种型；Sigma化学品公司，密苏里州圣路易斯)由I型胶原蛋白杂交瘤获得，该杂交瘤是用牛皮肤I型胶原蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合产生的。该抗体能与人、牛、兔、鹿、猪和大鼠I型胶原蛋白反应，应用稀释度为1∶100。

抗II型胶原蛋白抗体：多克隆兔抗II型胶原蛋白抗体(Santa CruzBiotechnology，Inc.，加利福尼亚州圣克鲁斯)针对人II型胶原蛋白α-1链氨基末端某相应表位。该抗体能与小鼠、大鼠和人源I型胶原蛋白α-1链反应，应用稀释度为1∶100。

抗MyoD抗体：多克隆兔抗MyoD抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼亚州圣克鲁斯)针对代表全长鼠源MyoD蛋白1-318号氨基酸相应的某表位。该抗体能与小鼠、大鼠和人源MyoD反应(不与肌细胞生成素、Myf-5或Myf-6反应)，应用稀释度为1∶1000。

免疫组化染色

用标记的链霉亲和素-生物素方法(LSAB法)进行染色程序。用试剂盒(通用LSAB试剂盒，过氧化物酶；DAKO公司，加利福尼亚州Carpinteria)和抗LMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1、CD-45、MyoD、I型胶原蛋白和II型胶原蛋白抗体进行免疫染色。根据产生第一抗体动物种类采用合适的生物素化第二抗体。用含0.3％过氧化氢的甲醇封闭内源性过氧化物酶。用含5％正常兔血清或5％正常山羊血清，和1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)室温孵育样品15分钟，以避免非特异性结合，然后用合适浓度的第一抗体，在4℃潮湿箱中孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5分钟后，用生物素化第二抗体和链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物在潮湿箱中室温孵育10分钟，用3，3-四氯化二氨基联苯胺(DAB；DAKO公司，加利福尼亚州Carpinteria)显色。最后，用苏木精复染切片。阴性对照在第一抗体与样品孵育前，用相应的封闭肽(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼州圣克鲁斯)室温孵育3小时。在一些实验中，只用第一抗体或第二抗体作为附加阴性对照。

结果

第1阶段：体外检测LMP诱导的成骨诱导因子

如图12A-12D所示，转染AdLMP-1的A549细胞，显示细胞内LIM-1蛋白染色很强。图12A-12D是A549细胞感染AdLMP-1(图12A)、Adβgal(图12C)48小时后或未处理细胞(图12D)的LIM-1蛋白免疫组化染色显微照片。从图12A、12C和12D可见，感染AdLMP-1(图12A)的细胞中出现特异性细胞内反应，而两个对照(图12C和12D)中无反应。由于第一抗体预先接触封闭肽而去除了阳性细胞内染色(图12B)，从而避免非特异性反应的可能。图12A-12D的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

在AdLMP-1处理细胞，尤其在胞浆中中观察到BMP-2、BMP-4和BMP-7的强染色，如图13A-13F所示。图13A-13F是A549细胞感染AdLMP-1(上排-图13A、图13B和图13C)或Adβgal(下排-图13D、图13E和图13F)48小时后，免疫组化染色的显微照片。在AdLMP-1处理细胞中存在BMP-2(图13A)、BMP-4(图13B)和BMP-7(图13C)的特异性细胞内染色，而Adβgal处理细胞(分别是图13D、13E和13F)中没有。图13A-13F的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

图3A-3D显示采用抗BMP-6和抗TGF-β1抗体，AdLMP-1处理细胞也呈阳性染色。图14A-14D是A549细胞感染AdLMP-1(上排-图14A和图14B)或Adβgal(下排-图14C和图14D)48小时后，免疫组化染色的显微照片。AdLMP-1处理细胞中存在BMP-6(图14A)和TGF-β1(图14B)特异性细胞内染色，而Adβgal处理细胞(分别是图14C和14D)中没有。然而，这些反应比其他BMPs看到的反应稍弱。在Adβgal感染的和未处理对照中，细胞对LMP-1、任何BMPs或TGF-β1均无特异性反应。每种抗体的封闭肽确证了此反应的特异性。用抗II型胶原蛋白或抗MyoD抗体没有发现特异性反应(数据未显示)。图14A-14D的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

第2阶段：体内骨形成的组织学顺序

组织学检查-免疫组化

白细胞的免疫学定位。植入后1天和3天，在AdLMP-1(活性)和Adβgal(对照)处理植入物中的暗黄层细胞制品中出现了大量抗CD-45抗体染色的细胞，见图15A-15D所示。

图15A-15D是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部3天(图15A和C)或5天(图15B和D)后切取的感染AdLMP-1(上排-图15A和图15B)或Adβgal(下排-图15C和图15D)的人暗黄层细胞中，白细胞表面标记CD45的免疫组化染色显微照片。CD45抗原特异性染色细胞的数量在两个处理组中均迅速降低。该发现提示植入的人细胞不能长期存活，骨形成可能依赖于宿主细胞的流入。特异性抗-人CD-45反应染色的细胞数量在第3天后减少，尤其是在植入物的中心。第5天在植入物外围仍可见阳性染色，但是植入10天后，被抗CD-45染色的细胞就很少了。这种染色减少的模式在活性和对照植入物中是相同的。图15A-15D的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

BMPs的免疫学定位。在AdLMP-1处理的植入物中，植入3和5天后，免疫组化揭示胶原纤维上细胞内呈BMP-4(图16A-16D)和BMP-7(图17A-17D)强染色。

图16A-16D是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部3天(图5A和C)或5天(图5B和D)后切取的感染AdLMP-1(上排-图16A和图16B)或Adβgal(下排-图16C和图16D)的人暗黄层细胞，BMP-4的免疫组化染色显微照片。AdLMP-1处理细胞的BMP-4特异性细胞内染色在Adβgal处理细胞中不存在。图16A-16D的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

图17A-17D是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部3天(图17A和C)或5天(图17B和D)后切取的感染AdLMP-1(上排-图17A和图17B)或Adβgal(下排-图17C和图17D)的人暗黄层细胞，BMP-7的免疫组化染色显微照片。AdLMP-1处理细胞的BMP-7特异性细胞内染色在Adβgal处理细胞中不存在。图17A-17D的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

从图16A-16D和17A-17D可见，在Adβgal(对照)植入物的细胞中没有发现BMP-4或BMP-7的特异性染色。而且，在植入超过10天的每个时间点，AdLMP-1植入物中也可见抗BMP-4和抗BMP-7强染色。在两个时间阶段都观察到了BMP-4和BMP-7强染色：第一阶段是早期(即植入后3和5天)暗黄层细胞的数目已有限，第二阶段是10天后见于基质包围的成骨样细胞中这类细胞很可能是反应性细胞而非移植的暗黄层细胞，如图18所示。

图18是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部14天后切取的感染AdLMP-1的人暗黄层细胞，BMP-7的免疫组化染色高倍显微照片。与较早期时间点相比，BMP-7的染色更强，现已伴有大多数与新骨基质形成密切相关的细胞。图18的显微照片是原始放大132倍拍摄的。

I型胶原蛋白的免疫学定位：在植入后7、10、14、21和28天的AdLMP-1植入物中观察到抗I型胶原蛋白抗体产生的强染色。在早期时间点，特异性反应出现在成骨样细胞毗邻区域以及细胞本身的周围。在用Adβgal处理的对照植入物中，I型胶原蛋白染色极少。

苏木精和伊红，以及Goldner’s三色染色

无论用兔或人暗黄层细胞的结果都相同。为避免重复，下面的描述和相应的说明只针对人源细胞。在植入后1和3天，在Ad-LMP植入物边缘的细胞数量增加，如图19A-19D所示。

图19A-19D是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部1天(图19A和19C)或3天(图19B和19D)后切取的感染AdLMP-1(上排-图19A和图19B)或Adβgal(下排-图19C和图19D)的人暗黄层细胞的显微照片。在两个时间点的AdLMP-1植入物中，植入物外围细胞密度较高，提示了宿主细胞的迁移。图19A-19D的显微照片是用Goldner三色染色后，原始放大33倍拍摄的。

在Adβgal对照中，在相同时间点(即植入后1和3天)外围几乎看不到细胞。这些观察结果提示表达LMP-1的宿主细胞迁移进入植入物中，如图20A和20B所示。这些细胞是单核细胞和多形核白细胞的混合物。图20A和20B是用胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部1天后切取的感染AdLMP-1或Adβgal的人暗黄层细胞的高倍显微照片。如图20A所示，在含感染Adβgal细胞的胶原(C)植入物外围细胞相当少(箭头)。在植入物中心可见暗黄层细胞和红细胞影。如图20B所示，在AdLMP植入物中，胶原(C)植入物外围的有核细胞密度较高，提示宿主细胞从周围软组织的迁入。这些细胞包括单核细胞、多形核细胞和组织细胞类似细胞。图20A-20D的显微照片是用苏木精和伊红染色后，原始放大100倍(图20A)和160倍(图20B)拍摄的。

图21A-21J是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部后不同时间点切取的感染AdLMP-1(上排-图21A-21E)或Adβgal(下排-图21F-21J)的人暗黄层细胞的显微照片。至第7天观察到的矿化基质证明已进展到膜状骨的形成(图21C)。在包含感染Adβgal的细胞的植入物中，没有看到骨形成(图21F-21J)。图21A-21J的显微照片是用Goldner三色染色后，原始放大33倍拍摄的。

如图21A-21E所示，随时间推移，与胶原纤维结合的暗黄层细胞越来越少，至植入后5大Adβgal处理的植入物中心存活细胞数目减少。

图22A-22C是胶原基质皮下植入无胸腺大鼠胸部后的不同时间点切取的感染AdLMP-1的人暗黄层细胞的高倍显微照片。从图22A可见，植入7天后的AdLMP-1植入物外围，毗邻成骨样细胞(箭头)的胶原纤维之间，可以看到新的矿化骨基质(B)。成骨样细胞(箭头)周围的基质迅速矿化，但没有典型类骨质接缝和特定取向。从图22B可见，整个AdLMP-1移植物所处空间中已经形成成熟的新骨；至第28天，大多数胶原蛋白骨架已重吸收。当看到成骨细胞(OC)重建原代编织骨(B)时，可以看到成骨细胞(箭头)覆盖了类骨质和新形成骨的表面。最后，从图22C可见，在骨(B)内部形成了造血骨髓组织，包括骨髓基质(S)和血管(V)。图22A-22C的显微照片是用Goldner三色染色后，原始放大160倍拍摄的。

从图22A可见，植入7天后的AdLMP-1植入物外围，与成骨样细胞毗邻的胶原纤维之间，可以看到新的骨基质。周围基质迅速矿化，但没有典型类骨质接缝和特定取向。缺乏有组织的骨生长取向并不令人惊讶，因为这些是没有受到明显负荷的皮下植入物。植入后10天，在AdLMP-1植入物中观察到了更丰富的成骨样细胞，它们正长入胶原纤维的空隙内。至植入后14天，成骨样细胞已占据AdLMP-1植入物的中心区域。相反，在Adβgal处理的植入物中，成骨样细胞充满了胶原蛋白的空隙。植入后21天，在AdLMP-1植入物中心区域的大部分或全部，新的骨基质已矿化并形成。植入后28天，在AdLMP-1植入物最中心区域的空间中形成了成熟新骨。当看到成骨细胞重建初级编织骨的同时可以看到成骨细胞覆盖了类骨质和新形成骨的表面(图22B)。在骨内部也可见造血骨髓组织正在形成(图22C)。在Adβgal处理的对照中，至28天，大部分植入的胶原已被吸收，为纤维组织所替代。

如上所述，体外用A549细胞进行的实验显示，AdLMP-1感染的细胞表达高水平的BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和TGF-β1蛋白。当感染了AdLMP-1的人暗黄层细胞异位移植于无胸腺大鼠后72小时，显示BMP-4和BMP-7蛋白水平升高，这确证了体外的假设。

根据上述研究的结果，因此证明LMP-1的成骨诱导性能涉及几种BMPs的合成和分化并参与直接膜状骨形成的宿主细胞的聚集。因此，用LMP-1cDNA进行的基因治疗可能为大剂量植入单一BMPs以诱导新骨形成提供一种替代方法。

本发明提供一种在细胞中诱导一种或多种骨形态发生蛋白或转化生长因子-β(TGF-βs)蛋白表达的方法。该方法包括用含有操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核酸序列的分离核酸转染细胞。可根据本发明诱导选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1及其组合的一种或多种蛋白的表达。所述分离核酸可以是能在标准条件下与序列表中第25号序列的全长互补核酸分子杂交的核酸；和/或能在高度严谨条件下与序列表中第26号序列的全长互补核酸分子杂交的核酸。所述细胞可以是暗黄层细胞、干细胞(如间充质干细胞或多能干细胞)或椎间盘细胞(如髓核细胞或纤维环细胞)。可以在离体或体内转染该细胞。例如，可通过把核酸直接注射到哺乳动物的椎间盘内体内转染细胞。

所述核苷酸序列编码的LIM矿化蛋白可以是RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2或HLMP-3。所述启动子可以是巨细胞病毒启动子。根据本发明的一个实施例，LIM矿化蛋白是一种LMP-1蛋白。所述核酸可包含在载体(例如表达载体，如质粒)中。此载体也可以是病毒，如腺病毒或逆转录病毒。本发明可用的一个腺病毒实例是AdLMP-1。

本发明的第二方面提供过表达一种或多种骨形态发生蛋白或转化生长因子-β蛋白质的细胞。该细胞可以是能过表达选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1及其组合的一种或多种蛋白质的细胞。该细胞可以是暗黄层细胞、椎间盘细胞、间充质干细胞或多能干细胞。也提供一种包含上述细胞和载体材料的植入物。本发明还提供一种在哺乳动物中诱导骨形成的方法，该方法包括将上述细胞或植入物引入哺乳动物中；还提供一种治疗哺乳动物椎间盘疾病的方法，该方法包括将上述细胞引入哺乳动物的椎间盘中。

本发明内容中骨形态发生蛋白或转化生长因子-β蛋白的过表达是指，细胞表达该蛋白质的水平高于该特定细胞中的正常表达水平(如所述蛋白表达水平高于未转染含有操作性连接于一启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列分离核酸的细胞的表达水平)。所述细胞可以是能正常表达一种或多种骨形态发生蛋白或转化生长因子-β蛋白的细胞。所述细胞也可以是不能正常表达一种或多种骨形态发生蛋白或转化生长因子-β蛋白的细胞。

虽然以上说明书提出了本发明的原理，为阐述也提供了实施例，但是本领域技术人员明白通过阅读本发明可容易地进行各种形式和细节的改变，但这些改变仍属于本发明的实际范围。

PCT 057125

0-1 0-1-1 表格-PCT/RO/134(EASY) 有关保藏的微生物或其他生物材料的说明(PCT细则第13条之二) 软件版本 PCT-EASY Version 2.92 (更新日期01.07.2003) 0-2 国际申请号. PCT/US2004/007616 0-3 申请人或代理人的档案号 2699732-2147 1 1-1 1-2 下面的说明与本申请说明书中此页提到的保藏的微生物或其他生物材料相关：页码行号： 13 21-23 1-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3 1-3-4 有关保藏的资料保藏机构名称保藏机构地址保藏日期入藏号美国典型培养物保藏中心美国，弗吉尼亚州 1997年07月22日(22.07.1997) ATCC 209153 1-4 补充说明载体pRc/CMV2中的LIM矿化蛋白(大鼠) 1-5 这些说明系对以下指定国作出：所有指定国 2 下面的说明与本申请说明书中此页提到的保藏的微生物或其他生物材料相关： 2-1 页码 13 2-2 行号： 23-25 2-3 有关保藏的资料 2-3-1 保藏机构名称美国典型培养物保藏中心 2-3-2 保藏机构地址美国，弗吉尼亚州 2-3-3 保藏日期 1998年03月19日(19.03.1998) 2-3-4 入藏号 ATCC 209698 2-4 补充说明载体pHis-A中的人LIM矿化蛋白(截短的) 2-5 这些说明系对以下指定国作出：所有指定国 3 下面的说明与本申请说明书中此页提到的保藏的微生物或其他生物材料相关： 3-1 页码 13 3-2 行号： 25-29 3-3 有关保藏的资料 3-3-1 保藏机构名称美国典型培养物保藏中心 3-3-2 保藏机构地址美国，弗吉尼亚州 3-3-3 保藏日期 2000年04月14日(14.04.2000) 3-3-4 入藏号 ATCC PTA-1698 3-4 补充说明载体pHisA中的人LIM矿化蛋白剪切变体2DNA序列 3-5 这些说明系对以下指定国作出：所有指定国

4 下面的说明与本申请说明书中此页提到的保藏的微生物或其他生物材料相关： 4-1 页码 13 4-2 行号： 25-29 4-3 有关保藏的资料 4-3-1 保藏机构名称美国典型培养物保藏中心 4-3-2 保藏机构地址美国，弗吉尼亚州 4-3-3 保藏日期 2000年04月14日(14.04.2000) 4-3-4 入藏号 ATCC PTA-1699 4-4 补充说明载体pHisA中的人LIM矿化蛋白剪切变体3DNA序列 4-5 这些说明系对以下指定国作出：所有指定国由受理局填写 0-4 本表格与国际申请一起收到： (是或否) 0-4-1 审查官员

由国际局填写

0-5 国际局收到本表格日期： 0-5-1 审查官员

序列表

<110>W.F.麦克凯(McKay，William F.)

S.伯登(Boden M.D.，Scott D)

S.永恩(Yoon，Sangwook T.)

<120>在细胞中诱导骨形态发生蛋白(BMPs)和转化生长因子-β蛋白(TGF-βs)表达的方法

<130>3819-002-53

<140>

<141>

<150>US 60/331,321

<151>2001-11-14

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<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>457

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>1

Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe

1 5 10 15

Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp

35 40 45

Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile

50 55 60

Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr

85 90 95

Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu

100 105 110

Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala

115 120 125

Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser

130 135 140

Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly

145 150 155 160

Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr

165 170 175

Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln

180 185 190

Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ile Pro Gln Glu

195 200 205

Ser Trp Pro Gly Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp

210 215 220

Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser

225 230 235 240

Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln

245 250 255

Asn Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Ile

275 280 285

Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu

290 295 300

Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe

305 310 315 320

Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Ser Cys Tyr Asp Val Arg

325 330 335

Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile

340 345 350

Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Pro Cys Phe Thr Cys Ala

355 360 365

Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly

370 375 380

Ala Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys

385 390 395 400

Arg Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala

405 410 415

Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln

420 425 430

Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu

435 440 445

Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val

450 455

<210>2

<211>1696

<212>DNA

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>2

gcacgaggat cccagcgcgg ctcctggagg ccgccaggca gccgcccagc cgggcattca 60

ggagcaggta ccatggattc cttcaaggta gtgctggagg gacctgcccc ttggggcttc 120

cgtctgcaag ggggcaagga cttcaacgtg cccctctcca tctctcggct cactcctgga 180

ggcaaggccg cacaggccgg tgtggccgtg ggagactggg tactgagtat cgacggtgag 240

aacgccggaa gcctcacaca cattgaagcc cagaacaaga tccgtgcctg tggggagcgc 300

ctcagcctgg gtcttagcag agcccagcct gctcagagca aaccacagaa ggccctgacc 360

cctcccgccg accccccgag gtacactttt gcaccaagcg cctccctcaa caagacggcc 420

cggcccttcg gggcaccccc acctactgac agcgccctgt cgcagaatgg acagctgctc 480

agacagctgg tccctgatgc cagcaagcag cggctgatgg agaatactga agactggcgc 540

ccgcggccag ggacaggcca gtcccgttcc ttccgcatcc ttgctcacct cacgggcaca 600

gagttcatgc aagacccgga tgaggaattc atgaagaagt caagccaggt gcccaggaca 660

gaagccccag ccccagcctc aaccataccc caggaatcct ggcctggccc caccaccccc 720

agccccacca gccgcccacc ctgggccgta gatcctgcat ttgctgagcg ctatgcccca 780

gacaaaacca gcacagtgct gacccgacac agccagccag ccacacctac gcctctgcag 840

aaccgcacct ccatagttca ggctgcagct ggagggggca caggaggagg cagcaacaat 900

ggcaagacgc ctgtatgcca ccagtgccac aagatcatcc gcggccgata cctggtagca 960

ctgggccacg cgtaccatcc tgaggaattt gtgtgcagcc agtgtgggaa ggtcctggaa 1020

gagggtggct tcttcgagga gaagggagct atcttttgcc cctcctgcta tgatgtgcgc 1080

tatgcaccca gctgtgccaa atgcaagaag aagatcactg gagagatcat gcatgcgctg 1140

aagatgacct ggcatgttcc ctgcttcacc tgtgcagcct gcaaaacccc tatccgcaac 1200

agggctttct acatggagga gggggctccc tactgcgagc gagattacga gaagatgttt 1260

ggcacaaagt gtcgcggctg tgacttcaag atcgatgccg gggaccgttt cctggaagcc 1320

ctgggtttca gctggcatga tacgtgtttt gtttgcgcaa tatgtcaaat caacttggaa 1380

ggaaagacct tctactccaa gaaggacaag cccctgtgca agagccatgc cttttcccac 1440

gtatgagcac ctcctcacac tactgccacc ctactctgcc agaagggtga taaaatgaga 1500

gagctctctc tccctcgacc tttctgggtg gggctggcag ccattgtcct agccttggct 1560

cctggccaga tcctggggct ccctcctcac agtccccttt cccacacttc ctccaccacc 1620

accaccgtca ctcacaggtg ctagcctcct agccccagtt cactctggtg tcacaataaa 1680

cctgtatgta gctgtg 1696

<210>3

<211>260

<212>DNA

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>3

ttctacatgg aggagggggc tccctactgc gagcgagatt acgagaagat gtttggcaca 60

aagtgtcgcg gctgtgactt caagatcgat gccggggacc gtttcctgga agccctgggt 120

ttcagctggc atgatacgtg ttttgtttgc gcaatatgtc aaatcaactt ggaaggaaag 180

accttctact ccaagaagga caagcccctg tgcaagagcc atgccttttc ccacgtatga 240

gcacctcctc acactactgc 260

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>莫落尼鼠类白血病毒(MMLV)

<400>4

aagctttttt tttttg 16

<210>5

<211>13

<212>DNA

<213>莫落尼鼠类白血病毒(MMLV)

<400>5

aagcttggct atg 13

<210>6

<211>223

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

atccttgctc acctcacggg caccgagttc atgcaagacc cggatgagga gcacctgaag 60

aaatcaagcc aggtgcccag gacagaagcc ccagccccag cctcatctac accccaggag 120

ccctggcctg gccctaccgc ccccagccct accagccgcc cgccctgggc tgtggaccct 180

gcgtttgccg agcgctatgc cccagacaaa accagcacag tgc 223

<210>7

<211>717

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60

ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120

caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180

ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240

ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300

cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360

gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420

ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480

acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540

gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600

ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660

cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacg 717

<210>8

<211>1488

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

atcgatggcg agaatgcggg tagcctcaca cacatcgaag ctcagaacaa gatccgggcc 60

tgcggggagc gcctcagcct gggcctcagc agggcccagc cggttcagag caaaccgcag 120

aaggcctccg cccccgccgc ggaccctccg cggtacacct ttgcacccag cgtctccctc 180

aacaagacgg cccggccctt tggggcgccc ccgcccgctg acagcgcccc gcaacagaat 240

ggacagccgc tccgaccgct ggtcccagat gccagcaagc agcggctgat ggagaacaca 300

gaggactggc ggccgcggcc ggggacaggc cagtcgcgtt ccttccgcat ccttgcccac 360

ctcacaggca ccgagttcat gcaagacccg gatgaggagc acctgaagaa atcaagccag 420

gtgcccagga cagaagcccc agccccagcc tcatctacac cccaggagcc ctggcctggc 480

cctaccgccc ccagccctac cagccgcccg ccctgagctg tggaccctgc gtttgccgag 540

cgctatgccc cggacaaaac gagcacagtg ctgacccggc acagccagcc ggccacgccc 600

acgccgctgc agagccgcac ctccattgtg caggcagctg ccggaggggt gccaggaggg 660

ggcagcaaca acggcaagac tcccgtgtgt caccagtgcc acaaggtcat ccggggccgc 720

tacctggtgg cgttgggcca cgcgtaccac ccggaggagt ttgtgtgtag ccagtgtggg 780

aaggtcctgg aagagggtgg cttctttgag gagaagggcg ccatcttctg cccaccatgc 840

tatgacgtgc gctatgcacc cagctgtgcc aagtgcaaga agaagattac aggcgagatc 900

atgcacgccc tgaagatgac ctggcacgtg cactgcttta cctgtgctgc ctgcaagacg 960

cccatccgga acagggcctt ctacatggag gagggcgtgc cctattgcga gcgagactat 1020

gagaagatgt ttggcacgaa atgccatggc tgtgacttca agatcgacgc tggggaccgc 1080

ttcctggagg ccctgggctt cagctggcat gacacctgct tcgtctgtgc gatatgtcag 1140

atcaacctgg aaggaaagac cttctactcc aagaaggaca ggcctctctg caagagccat 1200

gccttctctc atgtgtgagc cccttctgcc cacagctgcc gcggtggccc ctagcctgag 1260

gggcctggag tcgtggccct gcatttctgg gtagggctgg caatggttgc cttaaccctg 1320

gctcctggcc cgagcctggg ctcccgggcc cctgcccacc caccttatcc tcccacccca 1380

ctccctccac caccacagca caccggtgct ggccacacca gccccctttc acctccagtg 1440

ccacaataaa cctgtaccca gctgaattcc aaaaaatcca aaaaaaaa 1488

<210>9

<211>1644

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9