从脐带血中分离并扩大培养间充质干细胞 /祖细胞及将脐带血来源的间充质干细胞 /祖细胞分化成各种间充质组织的方法

摘要

本发明涉及从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞的方法，还涉及将脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化成各种间充质组织的方法。所述方法包括如下步骤：将脐带血覆盖在Ficoll－Hypaque溶液上；将Ficoll－Hypaque溶液上的脐带血离心，获得单核细胞层；使通过单核细胞单层培养获得的细胞与针对间充质干细胞/祖细胞特异性抗原的抗体反应预定的孵育期；使用细胞分选仪仅分离与其相应抗体相结合的细胞；将分离的细胞培养，从而获得具有高纯度和极好生存能力的间充质干细胞/祖细胞。本发明的间充质干细胞/祖细胞能够分化成包括软骨细胞和成骨细胞在内的各种间充质组织。因此，根据本发明的细胞分离和培养方法能够实现间充质干细胞/祖细胞的大规模生产，本发明获得的细胞在受损间充质组织的再生和治疗上是有用的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞的方法，以及将脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化成各种间充质组织的方法。

背景技术

慢性疾病和癌症所损伤的组织和器官的治疗方法主要有两种治疗选项，诸如药物治疗和手术操作。但是，这些技术具有一些问题，它们大多仅是对症治疗，仅减轻症状；经常导致手术并发症；并在长期治疗上强加重大的经济负担。

最近，对使用能够自我更新和分化的细胞作为受损组织和器官的移植来源的方法有了新的关注，该方法能够作为治疗受损组织和器官的一个权益之计，该权益之计能够克服前面所述的问题，并显示出更为卓越的治疗效果。

这种细胞的典型实例包括间充质干细胞、祖细胞和造血干细胞。造血干细胞分化成血管内的血细胞，包括红血球细胞、白细胞和血小板；而间充质干细胞/祖细胞是能够分化成各种细胞的多能干细胞。

间充质干细胞/祖细胞可以分化成组成人体的各种细胞和组织，包括骨髓基质细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、腱细胞、韧带细胞和神经细胞。因此，从再生药物的实际应用角度考虑，它们突出成为最重要的细胞。

迄今为止，骨髓是间充质干细胞/祖细胞的主要来源。

骨髓中富含间充质干细胞/祖细胞，但是骨髓采集是一项入侵性技术，包括用一个活组织检查针穿刺数次，因此在实际应用上具有难度。另外，骨髓采集需要在手术操作时进行全身麻醉，因此给患者带来严重的精神和身体负担，并且还在手术操作时导致剧烈疼痛。由于在该采集过程中的难度，构建包括骨髓保存库的基础设施是不实际的。

另一方面，分娩后可以简单地进行脐带血的采集，并且不导致对母亲和婴儿的伤害，因此具有很高的实际应用可能性。此外，对于公众来说脐带血的保存和建库(banking)成为了如此普遍和积极的进步，因此易于寻找其供体。

脐带血是造血干细胞的极好来源，使用脐带血进行的造血干细胞移植在临床上是积极的。但是，由于脐带血干细胞能否作为间充质干细胞/祖细胞的极好来源尚未确定，本发明旨在提供一种从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞的技术，并说明脐带血来源的细胞作为间充质干细胞/祖细胞的特征。

由于脐带血中存在包括造血血细胞的各种细胞，间充质干细胞/祖细胞仅是其中非常小的一部分，因此从脐带血中获得间充质干细胞/祖细胞的技术必须考虑到：它能够在维持细胞高纯度和极好生存能力的同时仅分离和培养间充质干细胞/祖细胞。

作为分离和培养间充质干细胞/祖细胞的技术，主要使用Ficoll-Hypaque离心。但是，该技术具有一个问题，就是它仅除去存在于脐带血的各种细胞中的白细胞。因此分离的细胞中基本上可得到的间充质干细胞/祖细胞数目非常小，并且在转种过程中还受到其他细胞的影响，因而降低了它们的生存能力。

由于这些细胞数目和质量的降低，因此不能很好地完成这些细胞分化成间充质组织的诱导，这些细胞分化成特定组织的条件不能成立。

因此，有必要寻找一种从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞的有效方法，以及将这些细胞分化成间充质组织的方法。

本发明旨在提供一种使用间充质干细胞/祖细胞相关抗体、通过抗原-抗体反应从脐带血中有效分离和培养间充质干细胞/祖细胞的方法，还旨在提供一种将这些细胞分化成间充质组织的方法。

发明内容

本发明提供了一种从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞的方法。

根据本发明的细胞分离和培养的方法包括如下步骤：将脐带血覆盖在Ficoll-Hypaque溶液上；将Ficoll-Hypaque溶液上的脐带血离心，获得单核细胞；使通过单核细胞单层培养获得的细胞与针对间充质干细胞/祖细胞特异性抗原的抗体反应预定的孵育期；使用细胞分选仪分离仅与其相应抗体相结合的细胞；将分离的细胞培养。

在根据本发明分离和培养间充质干细胞/祖细胞的方法中，脐带血定义为：采集自和哺乳动物胎儿胎盘相连的脐静脉的血液。在根据本发明的细胞分离和培养方法中，优选使用人脐带血。

用在本发明细胞分离和培养方法中的Ficoll-Hypaque溶液优选具有1.077g/ml的密度。

用在本发明细胞分离和培养方法中的、针对间充质干细胞/祖细胞相关抗原的抗体是一种或多种选自针对由间充质干细胞/祖细胞表达的细胞表面抗原的抗体。具体地说，它们是一种或多种选自针对CD105、stro-1、SH3和SH4的抗体，这些抗体优选一起使用，以将细胞纯度增加至最大。

用在本发明细胞分离和培养方法中的、针对间充质干细胞/祖细胞相关抗原的抗体具有与之相吸附的适当标记物，该标记物根据细胞分选仪的特征而变动。具体地说，当使用磁性细胞分选仪时，使用具有与之相吸附的磁性微珠的抗体。但使用FACsorter时，使用的抗体上吸附有诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红素(PE)、PerCP等的荧光染料。

在如上所述分离的细胞中将仅存在表达抗原的细胞，即间充质干细胞/祖细胞。

在本发明中，通过使用上述针对间充质干细胞/祖细胞特异抗原的抗体进行抗原和抗体之间的免疫反应，从而仅使脐带血中存在的各种细胞中的间充质干细胞/祖细胞得以分离和培养。因此，可获得干细胞的基本数目得以增加。

本发明提供了通过上述的细胞分离和培养方法获得的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞。

在本发明中，祖细胞定义为：在脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向软骨细胞和成骨细胞分化的过程中能够获得的所有祖细胞。

脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞具有免疫表型特征，因为它们对针对CD29、CD49e、CD44、CD54、CD13、CD90、SH2、SH3和SH4抗原的抗体显示阳性反应，对针对CD45、CD34、CD14、HLA-DR、CD31、CD51/61、CD49d、CD106和CD64抗原的抗体显示阴性反应。

下文将详细描述根据本发明的脐带血来源间充质干细胞/祖细胞的免疫表型特征。

本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对造血抗原CD45、CD34和CD14以及组织相容性抗原HLA-DR显示为阴性反应，因此它们能够将排斥反应降至最小，而排斥反应是组织或器官移植中的最大问题。因此，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞在作为同种移植细胞以及作为通用供体细胞的来源方面是有用的。

本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对内皮细胞相关抗原CD31以及破骨细胞相关抗原CD51/61显示为阴性。

因此，当本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞用于组织移植时，生成软骨细胞和成骨细胞的过程中非必要血管的产生或细胞向破骨细胞的分化所导致的副作用降至最小。

本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对整合素受体相关抗原的CD29和CD49e显示为阳性反应，对CD49d显示为阴性反应。

本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对基质受体相关抗原CD44和CD54显示为阳性反应，对CD106显示为阴性反应。

本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对针对称作CD13和CD90的其他抗原的抗体显示为阳性反应，对针对CD64抗原的抗体显示为阴性反应。

本发明的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对针对间充质干细胞/祖细胞相关抗原SH2、SH3和SH4的抗体显示为阳性反应，该免疫表型特征即使在数次传代之后也稳定存在。

上述创造性细胞的免疫表型特征和典型间充质干细胞/祖细胞的免疫表型特征相同。

本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞在适当的条件下具有自我更新能力，因此在不分化成特定细胞或组织的时候它们能够持续扩大培养。

和来源于分离自一般间充质组织，包括骨髓、肌肉和皮肤组织的间充质干细胞相比，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是来源于更幼小群体的细胞，因此它们具有更为卓越的分化能力。

由于这种多能性，本发明的细胞在适当的条件下能够分化成间充质组织，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、腱细胞等等。

具体地说，本发明提供了一种将脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化成间充质细胞的方法。

根据本发明的细胞分化方法包括将脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞在适当的条件下于细胞分化培养基中培养预定的孵育期，所述条件的变动依赖于要分化形成的间充质组织细胞的类型。

在根据本发明的细胞分化方法中，间充质细胞具体可以是软骨细胞或成骨细胞。用于本发明的软骨分化培养基和成骨分化培养基组分分别如下面的表1和表2所示。

表1：根据本发明的软骨分化培养基组分

                         组分    浓度                         TGF-βIII    10ng/ml  ITS-Plus    牛胰岛素    铁传递蛋白    亚硒酸    6.25μg/ml    6.25μg/ml    5.35μg/ml                亚油酸           牛血清白蛋白(BSA)    1.25μg/ml    100μg/ml    丙酮酸钠    100nM    地塞米松    100nM    抗坏血酸2-磷酸    50μg/ml    脯氨酸    40μg/ml

表2：根据本发明的成骨分化培养基组分

    组分    浓度    地塞米松    0.1μM    β-甘油磷酸    10mM    抗坏血酸2-磷酸    50μM

表1和2所示组分加入一种常规细胞培养基中之后使用，所述的常规细胞培养基包括DMEM、α-MEM、McCoys 5A培养基、Eagle’s基本培养基、CMRL培养基、Glasgow最小限度培养基、Ham’s F-12培养基、Iscove’s改进的Dulbecco’s培养基、Liebovitz’L-15培养基和RPMI 1640培养基等。在软骨分化培养基的情况下，优选使用DMEM培养基；在成骨分化培养基的情况下，优选使用α-MEM培养基。

另外，如果必要的话，除了上述的组分之外，用于本发明的细胞分化培养基还可以额外包含一种或多种辅助试剂。这种辅助试剂包括生长因子和马血清或人血清，以及抗生素和抗真菌试剂，包括青霉素G、链霉素硫酸盐、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，可以加入这些抗生素和抗真菌试剂以防止微生物污染。

从下面的实施例中显然可以看出，根据本发明的细胞分离和培养方法可以从脐带血中获得具有高纯度和极好生存能力的间充质干细胞/祖细胞。

本发明的间充质干细胞/祖细胞可以分化成各种间充质组织，从而能够在适当的软骨培养基和条件下表达作为软骨细胞典型标记物的II型胶原、X型胶原和聚集蛋白聚糖基因。

此外，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞可以在适当的成骨培养基和条件下表达作为成骨细胞标记物的骨钙蛋白、骨桥蛋白和碱性磷酸酶基因，并且可以与成骨细胞相同的方式实现细胞外的钙积累。

结果，本发明的细胞分离和培养方法可以用于所谓多能细胞的间充质干细胞/祖细胞的大规模生产。同时，该方法还将表现出与脐带血保存系统的扩大相一致的实用性，所述脐带血系统的扩大目前正通过脐带血保存库积极地实施。

另外，如果必要的话，通过本发明的细胞分离和培养方法获得的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞可以分化形成各种组织。因此，在再生困难的受损间充质组织治疗方面，这些间充质干细胞/祖细胞会带来重大进展。

附图说明

图1是说明包含采自脐静脉的脐带血的采集袋的图。

图2是说明本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞形态学特征的图。

图3是说明检验本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否表达造血抗原和组织相容性抗原的试验结果的图。

图4是说明检验本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否表达内皮细胞相关抗原和破骨细胞相关抗原的试验结果的图。

图5是说明检验本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否表达整合素受体相关抗原的试验结果的图。

图6是说明检验本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否表达基质受体相关抗原的试验结果的图。

图7是说明检验本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否表达其他抗原的试验结果的图。

图8是说明检验间充质干细胞/祖细胞的表面抗原是否在本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞中表达的试验结果的图。

图9是说明本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化为软骨细胞后对软骨相关蛋白进行免疫染色的结果的图。

图10是说明本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化为软骨细胞后对软骨相关基因进行RT-PCR的结果的图。

图11是说明本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化为成骨细胞后对骨相关蛋白和无机物质进行组织化学染色的结果的图。

图12是说明本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化为成骨细胞后对骨相关基因进行RT-PCR的结果的图。

具体实施方式

下文将通过实施例对本发明作更为详细地描述。应该牢记的是本发明并不局限于或受限于这些实施例。

实施例1：根据本发明从脐带血中分离和培养间充质干细胞/祖细胞

1)间充质干细胞/祖细胞从脐带血中的分离和离体(ex vivo)培养

分娩后从脐静脉中采集脐带血。在采集脐带血的过程中，用酒精和聚维酮碘充分对脐带进行消毒，然后用和包含23ml CDPA-1抗凝剂的脐带血采集袋相连的16G针头穿刺脐静脉，从而通过重力作用将脐带血采集到采集袋中(参见图1)。

将15ml Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml)加入50ml锥形瓶中，然后将如上所述采集的25ml脐带血缓慢覆盖到Ficoll-Hypaque上，于室温下400xg离心40分钟，使形成单核细胞层。弃除上清液之后，将单核细胞层转移到一个新管中。往单核细胞中加入30ml包含2％胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)，于200xg离心10分钟，然后洗涤。

洗涤重复两次之后，单核细胞层中加入30ml NH₄Cl-Tris溶液，静置15分钟，于室温下200xg离心10分钟。弃除上清液之后，往单核细胞中加入30ml2％FBS-PBS，于室温下200xg离心10分钟，然后洗涤。

该程序再次重复之后，通过弃除上清液所获得的单核细胞中加入10ml包含10％FBS的基础培养基(α-MEM或DMEM培养基)，充分混匀。

测定如上所述分离的单核细胞的生存能力和细胞计数，以适当的数目(5×10⁵至1×10⁶细胞/cm²)连同基础培养基一起加入到细胞培养容器中，然后于5％CO₂孵箱中孵育。孵育时细胞于37℃进行单层培养。

每天用显微镜观察集落的出现，以验证集落是否贴壁良好，以及是否在培养容器的底面上生长为单层。

当细胞长至90％满时，使用抽液泵和移液管除去培养基，用已经去除钙和镁的PBS洗涤细胞。洗涤的细胞加入0.25％胰酶/EDTA溶液，在5％CO₂孵箱中于37℃静置10分钟。从细胞培养容器中分离的细胞再次收集到一个管中，于室温下200xg离心10分钟，然后洗涤。

使洗涤的细胞和针对间充质干细胞/祖细胞特异性抗原的抗体反应给定的孵育期。针对间充质干细胞/祖细胞特异性抗原的抗体是CD105、stro-1、SH3和SH4的抗体，其中各抗体都具有与之相吸附的磁珠或荧光染料，如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红素(PE)或PerCP等。

与抗体反应之后，使用诸如磁性细胞分选仪或FACsorter之类的细胞分离设备分离与其相应抗体结合的间充质干细胞/祖细胞。

往如上所述分离的细胞中加入10ml包含10％FBS的基础培养基，彻底混匀，测定其生存能力和细胞计数。将基础培养基和适当数目的间充质干细胞/祖细胞(4至5×10⁴细胞/cm²)铺到细胞培养容器中，在5％CO₂孵箱中于37℃培养。

然后，只要细胞长至100％满时，就进行重复亚培养，从而使脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞得以离体扩大培养。

图2说明了根据本发明方法分离的细胞的形态学特征。在图2a中，通过创造性方法分离的细胞以纺锤形和均一成纤维细胞样集落形的形式生长，其中纺锤形是间充质干细胞/祖细胞的典型形状。如图2b所示，本发明的细胞用台盼蓝染色，测定其生存能力，结果显示了非常好的、98％～99％的生存能力。

因此，本发明的方法能够实现间充质干细胞/祖细胞从脐带血中的有效分离和培养。

2)通过本发明获得的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞的特征分析

为了验证通过本发明获得的脐带血来源的细胞是否具有间充质干细胞/祖细胞的特征，实施例1的1)中获得的细胞的细胞表面抗原的表达模式分析如下：

该实施例中免疫表型得以验证的抗原是作为造血抗原的CD45、CD34和CD14；作为组织相容性抗原的HLA-DR；作为内皮细胞相关抗原的CD31；作为破骨细胞相关抗原的CD51/CD61；作为整合素受体相关抗原的CD29、CD49d、D49e；作为基质受体相关抗原的CD44、CD54和CD106；作为间充质干细胞/祖细胞特异性抗原的SH2、SH3和SH4；以及其他抗原CD13、CD64和CD90。

将上述1)中培养的2×10⁶细胞用包含2％FBS的PBS溶液洗涤，并于室温下与对应于各抗原的抗体反应。使用流式细胞仪验证抗原的表达，其结果如图3至图7所示。也就是说，图3所示为造血抗原和组织相容性抗原的结果，图4所示为内皮细胞相关抗原和破骨细胞相关抗原的结果，图5所示为整合素受体相关抗原的结果，图6所示为基质受体相关抗原的结果，图7所示为其他抗原的结果。

如图3所示，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对作为造血抗原的CD45、CD34和CD14以及作为组织相容性抗原的HLA-DR的抗体显示为阴性反应。

因此，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞缺失造血抗原和组织相容性抗原，因此它们能够将组织移植中作为一个难题的排斥反应降至最小。

如图4所示，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对作为内皮细胞相关抗原的CD31以及作为破骨细胞相关抗原的CD51/61的抗体显示为阴性反应。

因此，可以发现，当本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞用于组织移植时，不存在软骨细胞或成骨细胞生成过程中非必要血管的产生和细胞向破骨细胞的分化所导致的副作用。

如图5所示，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对作为整合素受体相关抗原的CD29和CD49e的抗体显示为阳性反应，而对CD49d抗原的抗体显示为阴性反应。

如图6所示，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对作为基质受体相关抗原的CD44和CD54的抗体显示为阳性反应，而对CD106抗原的抗体显示为阴性反应。

如图7所示，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞对其他抗原，即CD13和CD90的抗体显示为阳性反应，而对CD64抗原的抗体显示为阴性反应。

另外，还进行了试验，以验证本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞的第一次、第五次、第十次和第十五次传代培养物是否表达间充质干细胞/祖细胞的典型表面抗原SH2、SH3和SH4。结果如图8所示，可以发现和骨髓来源的间充质干细胞/祖细胞的第一次传代培养物一样，本发明的细胞对这些抗原显示为阳性反应，即使在数次亚培养之后也显示为阳性反应，并且这种免疫表型即使在数次传代之后也稳定维持。

图3～8所示的、本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞的免疫表型和现有的间充质干细胞/祖细胞的免疫表型相同。这说明通过本发明方法从脐带血中分离的细胞具有间充质干细胞/祖细胞的卓越特征。

实施例2：本发明的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向软骨细胞的分化

1)本发明的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向软骨细胞的分化

为了验证本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否具有分化成间充质组织的特征，诱导了这些细胞向软骨细胞的分化。

用于向软骨细胞分化的培养基具有上表1中给定的组分，在沉淀的培养物中对细胞进行分化。每三天更换培养基，分化诱导之后以一周的间隔取细胞样品，进行免疫标记物表达分析和分子生物学分析。

2)软骨分化组织的免疫化学分析

分化成软骨细胞之后，为了验证本发明的细胞是否表达软骨细胞特异性抗原II型胶原，如下所述对这些细胞进行免疫染色。

诱导分化成软骨细胞之后，以一周的间隔收集的细胞沉淀样品包埋在石蜡中，或冷冻并制成切片，以充分地维持表位的抗原性。然后，将沉淀组织固定在载玻片上至厚度为3～5μm，并进行免疫染色。

各载玻片用过氧化氢处理5分钟，以除去细胞内存在的过氧化物酶，然后用蛋白质封闭试剂处理5分钟。

然后，将它们和大鼠单克隆抗体一起孵育10分钟。洗涤后，用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶对之处理10分钟。然后，用染料对之进行处理，使发生颜色反应，并用苏木精进行复染。

结果，诱导本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化成软骨细胞一周之后，在一部分沉淀物中观察到了阳性结果。另外，如图9所示，分化诱导三周之后，在所有沉淀物中都观察到了阳性结果。

考虑到如上所述分化细胞分泌作为细胞外基质(ECM)的重要组分的II型胶原的事实，可以认为本发明的细胞能够充分实现软骨细胞的功能。

3)软骨分化组织的分子生物学分析

诱导创造性的细胞向软骨细胞分化之后，如下所述进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，以验证创造性的细胞是否表达软骨细胞特异性基因。

诱导向软骨细胞的分化之后以一周间隔收集的细胞沉淀物用Trizol R处理5分钟，并用氯仿处理，然后于15000rpm离心15分钟。吸取上清液并加入异丙醇以沉淀RNA。

在RT反应中，将如上所述获得的RNA、1μl寡聚(oligo)d(T)引物、1μl dNTP混合溶液和无核糖核酸酶(RNase)水混匀，于65℃反应5分钟。往该混合物中加入4μlRT反应缓冲液、2μl DTT和1μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，于42℃反应2分钟。然后往混合物中加入逆转录酶，于42℃反应50分钟。如上所述获得的cDNA于70℃灭活15分钟，用作PCR模板。

在PCR反应中，使用I型胶原、II型胶原、X型胶原和聚集蛋白聚糖基因作为引物。选择人关节软骨细胞作为阳性对照，选择在细胞中总是以恒定水平表达的GAPDH基因作为阴性对照。

往各反应管中加入5μl cDNA、引物、dNTP混合溶液、氯化镁、10倍PCR反应缓冲液和Taq聚合酶，并加入灭菌的三蒸水，以将终反应体积调整至50μl。然后，以50μl终反应体积进行PCR反应。各基因引物的碱基序列和反应条件如下面的表3所示。

表3：

    基因    引物的碱基序列  PCR组分  PCR条件GAPDH 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(正向，SEQ ID NO：1)5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(反向，SEQ ID NO：2) cDNA模板：5μl 各引物：2.5μl PCR混合溶液：7.7μl首先94℃变性2min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；最后72℃延伸7minI型胶原5′-CCCCCTCCCCAGCCACAAAGA-3′(正向，SEQ ID NO：3)5′-TCTTGGTCGGTGGTGGACTCT-3′(反向，SEQ ID NO：4)首先94℃变性2min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；最后72℃延伸7minII型胶原5′-TTTCCCAGGTCAAGATGGTC-3′  (正向，SEQ ID NO：5)5′-CTTCACCACCTGTCTCACCA-3′ (反向，SEQ ID NO：6)首先94℃变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；最后72℃延伸7minX型胶原5′-CCCTTTTTGCTGCTAGTATCC-3′(正向，SEQ ID NO：7)5′-CTGTTGTCCAGGTTTTCCTGGCAC-3′(反向，SEQ ID NO：8)首先94℃变性2min；94℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；最后72℃延伸7min聚集蛋白聚糖5′-TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC-3′(正向，SEQ ID NO：9)5′-GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA-3′(反向，SEQ ID NO：10)首先94℃变性2min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；最后72℃延伸7min

对各PCR产物进行电泳，其结果在图10中示出。

如图10所示，在诱导本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向软骨细胞分化一周之后，这些细胞表达所有的II型胶原、X型胶原和聚集蛋白聚糖基因。

具体地说，各基因的表达水平随着分化时间的延长而进一步增加。分化诱导四周之后，细胞中各基因的表达水平和作为阳性对照的人关节软骨细胞(称作“chon”)一样高。

另一方面，作为阴性对照的GAPDH基因的表达水平是恒定的，和分化诱导时间无关。

因此，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞可以在适当的条件下分化成软骨细胞。

实施例3：本发明的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向成骨细胞的分化

1)本发明的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向成骨细胞的分化

为了验证本发明的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞是否具有分化为成骨细胞的特征，诱导了这些创造性细胞向成骨细胞的分化。

用于向成骨细胞分化的培养基具有上表2中给定的组分，细胞在单层培养物中进行分化。每三天更换培养基，分化诱导之后以一周的间隔取细胞样品，进行免疫标记物表达分析和分子生物学分析。

2)成骨分化组织的组织化学分析

分化为成骨细胞之后，为了验证本发明的细胞是否表达成作为骨细胞特异性抗原的碱性磷酸酶，如下所述对这些细胞进行组织化学染色。

通过单层培养诱导分化成成骨细胞之后，以一周的间隔收集的细胞用甲醇固定，对作为成骨细胞特异性抗原的碱性磷酸酶进行组织化学染色。另外，为了验证是否积累了作为细胞外组分的钙，通过von Kossa染色对细胞进行检验。结果如图11所示。

如图11所示，从诱导本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞分化为成骨细胞一周起，在一部分组织中观察到了阳性结果。分化诱导三至四周之后，在所有组织中都观察到了阳性结果。

von Kossa染色结果表明，细胞外的钙积累是逐渐增加的。

考虑到如上所述分化细胞表达作为成骨细胞重要组分的碱性磷酸酶以及允许细胞外钙积累的事实，因此我们认为本发明的细胞能够充分实现成骨细胞的功能。

3)成骨分化组织的分子生物学分析

分化为成骨细胞之后，如下所述进行RT-PCR，以验证本发明的细胞是否表达成骨细胞特异性基因。

分化为成骨细胞之后以一周间隔收集的组织用Trizol R处理5分钟，并用氯仿处理，然后于15000rpm离心15分钟。吸取上清液并加入异丙醇以沉淀RNA。

在RT反应中，将如上所述获得的RNA、1μl oligo d(T)引物、1μl dNTP混合溶液和无RNase水混匀，于65℃反应5分钟。往该混合物中加入4μl RT反应缓冲液、2μl DTT和1μl RNase抑制剂，于42℃反应2分钟。然后，往混合物中加入逆转录酶，于42℃反应50分钟。如此获得的cDNA于70℃灭活15分钟，用作PCR模板。

在PCR反应中，使用作为成骨细胞特异性基因的骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶基因作为引物。选择在细胞中总是以恒定水平表达的GAPDH基因作为阴性对照。

往各反应管中加入5μl cDNA、引物、dNTP混合溶液、氯化镁、10倍PCR反应缓冲液和Taq聚合酶，并加入灭菌的三蒸水，以将最终反应体积调整至50μl。然后，以50μl终反应体积进行PCR反应。各基因引物的碱基序列和反应条件如下面的表4所示。

表4：

    基因    引物的碱基序列  PCR组分  PCR条件GAPDH5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(正向，SEQ ID NO：1)5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(反向，SEQ ID NO：2)cDNA模板：5μL 各引物：2.5μL PCR混合溶液：7.7μL首先94℃变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃30sec，35个循环；最后72℃延伸7min骨钙蛋白5′-CATGACAGCCCTCACA-3′(正向，SEQ ID NO：11)5′-AGAGCGACACCCTAGAC-3′(反向，SEQ ID NO：12)骨桥蛋白5′-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3(正向，SEQ ID NO：13)5′-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3′(反向，SEQ ID NO：14)碱性磷酸酶5′-TGGAGCTTCAGAGACTCAACACCA-3′(正向，SEQ ID NO：15)5′-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC-3′(反向，SEQ ID NO：16)

对各PCR产物进行电泳，其结果在图12中示出。

如图12所示，在诱导本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞向成骨细胞分化一周之后，这些细胞表达所有的骨钙蛋白、骨桥蛋白和碱性磷酸酶。各基因的表达水平随着分化时间的延长而进一步增加。

另一方面，作为阴性对照的GAPDH基因的表达水平是恒定的，与经历的分化诱导时间无关。

因此，本发明中脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞可以在适当的条件下分化为成骨细胞。

工业应用

如上所述，根据本发明的细胞分离和培养方法在维持细胞的高纯度和生存能力的同时，具有从脐带血中分离间充质干细胞/祖细胞的效果。

根据本发明从脐带血中分离和培养的间充质干细胞/祖细胞可以在适当的条件下分化成各种间充质组织，包括软骨细胞和成骨细胞。

因此，根据本发明的细胞分离和培养方法以及通过该方法分离和培养的脐带血来源的间充质干细胞/祖细胞在受损组织的再生和治疗中是有用的。

                                        序列表

<110>Medipost

<120>间充质干细胞/祖细胞从脐带血中的分离和扩大培养方法，以及脐带血来源的间充质干

     细胞/祖细胞分化成各种间充质组织的方法

<130>03PP018

<150>KR 10-2002-0008639

<151>2002-02-19

<150>KR 10-2003-0010269

<151>2003-02-19

<160>16

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增GAPDH基因的正向引物

<400>1

accacagtcc atgccatcac                                                  20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增GAPDH基因的反向引物

<400>2

tccaccaccc tgttgctgta                                                  20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增1型胶原基因的正向引物

<400>3

ccccctcccc agccacaaag a                                                21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增1型胶原基因的反向引物

<400>4

tcttggtcgg tggtggactc t                                                21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增2型胶原基因的正向引物

<400>5

tttcccaggt caagatggtc                                                  20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增2型胶原基因的反向引物

<400>6

cttcaccacc tgtctcacca                                                  20

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增10型胶原基因的正向引物

<400>7

ccctttttgc tgctagtatc c                                                21

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增10型胶原基因的反向引物

<400>8

ctgttgtcca ggttttcctg gcac                                             24

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增聚集蛋白聚糖基因的正向引物

<400>9

tgaggagggc tggaacaagt acc                                              23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增聚集蛋白聚糖基因的反向引物

<400>10

ggaggtggta attgcaggga aca                                              23

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增骨钙蛋白基因的正向引物

<400>11

catgacagcc ctcaca                                                      16

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增骨钙蛋白基因的反向引物

<400>12

agagcgacac cctagac                                                     17

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增骨桥蛋白基因的正向引物

<400>13

ccaagtaagt ccaacgaaag                                                  20

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增骨桥蛋白基因的反向引物

<400>14

ggtgatgtcc tcgtctgta                                                   19

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增碱性磷酸酶基因的正向引物

<400>15

tggagcttca gagactcaac acca                                             24

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增碱性磷酸酶基因的反向引物

<400>16

atctcgttgt ctgagtacca gtcc                                             24