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法律状态信息
法律状态
2016-03-09
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/31 授权公告日:20060419 终止日期:20150120 申请日:20030120
专利权的终止
2006-04-19
授权
授权
2003-11-12
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-08-27
公开
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技术领域
本发明涉及鲍氏志贺氏菌15型(Shigella boydii 15)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及鲍氏志贺氏菌15型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型(Shigelladysenteriae 2)和大肠杆菌O112(Escherichia coli O112)并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
志贺氏菌是随着人类进化而发展起来的致病菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，导致自限性化脓性感染病灶，引起人类的细菌性痢疾。人类对志贺氏菌有较高的敏感性，只需要少于十个菌就可以引起人的感染，儿童和成人易感染，特别是儿童，易引起急性中毒性痢疾，而志贺氏菌的O-抗原是志贺氏菌引起疾病的主要原因之一。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：geneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因。其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的合成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型El，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用针对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关系非常近，并且有12种O-抗原是大肠杆菌和志贺氏菌共有的，其中鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112就拥有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of theEnterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships betweenthe enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 and Shigella Oantigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]，传统的血清型方法不能将它们区分。
发明内容
本发明的目的是提供一种对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸。它是鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf6、orf7基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf3、orf4、orf6、orf7基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原是特异的；尤其是表一中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原及检测和鉴定鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112。
本发明的还一目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：
本发明对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长10812个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸，其由8个基因组成，都位于galF基因和gnd基因间。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf6、orf7基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的1041至2432碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的2452至3630碱基的核苷酸；orf3是SEQ ID NO：1中的3630至4610碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4617至5798碱基的核苷酸；orf6是SEQID NO：1中的6766至7647碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO：1中的7653至8393碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸，其中源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf3、orf4、orf6、orf7基因；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1148至1165碱基的核苷酸和1856至1873碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1233至1250碱基的核苷酸和1859至1866碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1460至1477碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的2515至2533碱基的核苷酸和3087至3105碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2935至2952碱基的核苷酸和3392至3411碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2718至2734碱基的核苷酸和3536至3553碱基的核苷酸；源于orf3基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3723至3740碱基的核苷酸和4121至4138碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4103至4121碱基的核苷酸和4506至4525碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3856至3874碱基的核苷酸和4548至4564碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4644至4661碱基的核苷酸和5246至5263碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4649至4667碱基的核苷酸和5452至5471碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5255至5272碱基的核苷酸和5661至5680碱基的核苷酸；源于orf6基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的6861至6880碱基的核苷酸和7309至7328碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6995至7013碱基的核苷酸和7413至7430碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7141至7159碱基的核苷酸和7613至7630碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7731至7747碱基的核苷酸和8096至8113碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7855至7872碱基的核苷酸和8222至8240碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7919至7937碱基的核苷酸和8341至8360碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其中包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞，用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重悬细胞，37℃温育20分后加入溶菌酶裂解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋白质，再加入RNase去除RNA；然后用等体积酚及等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提去除其中的酶和蛋白，再用等体积的乙醚抽提除去残余的酚；用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过Long PCR扩增鲍氏志贺氏菌15型中的O-抗原基因簇：首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒；60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分，得到长度为12235个碱基的PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：
用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；选择合适的反应时间使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经氯仿∶异戊醇抽提和乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到连接产物，用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆构成了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再根据已得到的序列设计引物，该引物，如下所示：5’-GGAGCGATCGTCCGGTCAC-3’和5’-CAGCGCAGCTATGTGTCC-3’；再从鲍氏志贺氏菌15型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对鲍氏志贺氏菌15型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌15型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到8个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的结构。
(6)特异基因的筛选：针对鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf3、orf4、orf6、orf7基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf3、orf4、orf6、orf7基因对鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原都是高度特异的。
也就是本发明的第一个方面，提供了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长10812个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由8个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf6、orf7基因，它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在图二中。本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf6、orf7基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表一中的寡核苷酸对，在表一中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表二所列的其余165株大肠杆菌和41株志贺氏菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定这些引物即表一所列的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112及它们的O-抗原是高度特异的。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的1041至2432碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的2452至3630碱基)，orf3基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的3630至4610碱基)，orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的4617至5798碱基)，orf6基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的6766至7647碱基)，orf7基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的7653至8393碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌15型(SEQ ID NO：1)，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型或大肠杆菌O112。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由鲍氏志贺氏菌15型或痢疾志贺氏菌2型或大肠杆菌O112表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是鲍氏志贺氏菌15型或痢疾志贺氏菌2型或大肠杆菌O112。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌15型或痢疾志贺氏菌2型或大肠杆菌O112。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，发明者相信本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。实施例1：基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2：通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌15型中的O-抗原基因簇：鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇通过Long PCR扩增。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGGATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3：构建O-抗原基因簇文库：
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的TthDNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分，于4℃ 4000rpm离心15分。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0ms毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇文库。实施例4：对文库中的克隆测序：
从文库中挑选插入片段在700bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从鲍氏志贺氏菌15型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。在鲍氏志贺氏菌15型中我们设计了一对引物，如下所示：5’-GGAGCGATCGTCCGGTCAC-3’和5’-CAGCGCAGCTATGTGTCC-3’。实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medicai ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对鲍氏志贺氏菌15型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌15型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(TheNational Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到8个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Streptococcus agalactiae的wzx基因在466个氨基酸的序列中有21％的相同性，45％的相似性，另外还与Streptococcus thermophilus的wzx基因在473个氨基酸的序列中有19％的相同性，43％的相似性，表明它们之间有很高的同源性，并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane andsurface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf1有12个潜在的穿膜区，它与许多wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf1是wzx基因，命名为wzx。orf2与Escherichia coli的wzy基因在395个氨基酸的序列中有20％的相同性，42％的相似性，表明它们之间有很高的同源性，另外通过Eisenberg算法得知orf2有10个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，所以确定orf2是wzy基因，命名为wzy。orf3与Streptococcus agalactiae的N-acetylglucosamine转移酶基因在333个氨基酸的序列中26％的相同性，48％的相似性，另外还与Streptococcus thermophilus的Eps7G基因在328个氨基酸的序列中28％的相同性，47％的相似性，Eps7G是一个糖基转移酶基因，所以推测orf3是一个编码糖基转移酶的基因，命名为orf3。orf4与Streptococcus pneumoniae的糖基转移酶基因在367个氨基酸的序列中有28％的相同性，47％的相似性，另外还与Campylobacter jejuni的wlaE基因在365个氨基酸的序列中有26％的相同性，43％的相似性，表明它们之间有高度的同源性。wlaE基因是一个糖基转移酶基因，所以，可以推测orf4是糖基转移酶基因。Orf5与Bos taurus的D-glucuronyl C5 epimerase基因在617个氨基酸中有32％的相同性，46％的相似性，表明它们之间有高度的同源性，所以可以推测orf5是一个D-glucuronyl C5异位酶基因，命名为orf5。Orf6与Shigella boydii的WbgQ基因在287个氨基酸序列中有44％的相同性，60％的相似性，另外还与Bacteroides fragilis中的WcgB基因在315个氨基酸序列中有35％的相同性，53％的相似性，而WbgQ和WcgB基因都是糖基转移酶基因，所以推测orf6是一个编码糖基转移酶的基因，命名为orf6。Orf7与Escherichia coli O157：H7的糖基转移酶基因在260个氨基酸序列中有39％的相同性，62％的相似性，另外还与Oceanobacillus iheyensis中的糖基转移酶基因在258个氨基酸序列中有44％的相同性，64％的相似性，所以推测orf7是一个编码糖基转移酶的基因，命名为orf7。orf8与Yersinia enterocolitica的gne基因在336个氨基酸序列中有57％的相同性，74％的相似性，表明它们之间有极高的同源性，所以确定orf8是gne基因，命名为wzy。实施例6：特异基因的筛选：针对鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf3、orf4、orf6、orf7基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了鲍氏志贺氏菌15型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了鲍氏志贺氏菌15型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表二中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第23组中含有鲍氏志贺氏菌15型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表一中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表一)，退火时间是50秒，72℃延伸2分，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf3、orf4、orf6、orf7基因，每个基因都有三对引物被检测，每对引物除了在第23组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在第14组和第24组中也都得到同样大小的特异性带。以第14组中的每个菌的基因组DNA做模板PCR后，发现只在大肠杆菌O112中得到了阳性结果。以第24组中的每个菌的基因组DNA做模板PCR后，发现只在痢疾志贺氏菌2型中得到了阳性结果。更详细地说，以上每个基因的每一对引物都在痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112中得到预期大小的正确的PCR产物带。据报道，鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原结构是一样的，我们的结果从另一个侧面证实了这一点。此外，所有的引物在其他组中都没有扩增到任何带，所以wzx、wzy、orf3、orf4、orf6、orf7基因对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从鲍氏志贺氏菌15型中筛选到对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇的结构，共由8个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，这两个基因不负责O-抗原的合成，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌15型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。
序列列表
SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸<130>对鲍氏志贺氏菌15型，痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌O112的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10812<212>DNA<213>Shigella boydii<400>1CTCCTGGTAA CTCATGCGTC CAAGAACGCG GTCGAAAACC ACTTCGACAC CTCTTATGAA 60TTAGAATCTC TCCTTGAACA GCGCGTGAAG CGTCAACTGC TGGCGGAAGT ACAGTCTATC 120TGTCCGCCGG GCGTGACCAT TATGAACGTG CGTCAGGGCG AACCTTTAGG TTTGGGCCAC 180TCCATTTTGT GTGCACGACC CGCCATTGGT GACAACCCAT TTGTCGTGGT ACTGCCGGAC 240GTTGTGATCG ACGACGCCAG TGCCGACCCG CTGCGCTACA ACCTTGCTGC CATGATTGCG 300CGTTTCAATG AAACGGGCCG TAGCCAGGTG CTGGCAAAAC GTATGCCGGG TGACCTTTCT 360GAATACTCCG TTATTCAGAC CAAAGAGCCG CTGGATCGTG AAGGCAAAGT CAGCCGCATT 420GTTGAATTTA TCGAAAAACC GGATCAGCCG CAGACGCTGG ACTCAGACAT CATGGCCGTT 480GGTCGCTATG TGCTTTCTGC CGATATTTGG CCGGAACTTG AACGCACTCA ACCTGGTGCA 540TGGGGGCGTA TTCAGCTGAC TGATGCCATT GCTGAACTGG CGAAAAAACA GTCCGTTGAT 600GCAATGCTGA TGACTGGTGA CAGCTACGAC TGCGGTAAAA AAATGGGCTA TATGCAGGCG 660TTTGTGAAGT ATGGCTTACG CAACCTGAAA GAAGGGGCGA AGTTCCGTAA AGGTATTGAG 720AAACTGTTAA GCGAATAATG AAAATCTGAC CGGATGTAAC GGTTGATAAG AAAATTATAA 780CGGCGGTGAA GATTCCTGTG GAGAGTAATT TGTTGCGATT ACCACTGTCG TTATTCAACT 840ATAAGCATAA AAAAGTTAAA TATAATTTGG GGATTTTAAG TATATGGAAA CGCCTTTGTC 900TACTGAATAA GTAAGGTATT AACTGTAAGA AAAGCGTGAA TGGTGTTCCC TACATAATTT 960AAAGATGTTC AGTCTACTGG TAGCTGTTAA GCCAGGGGCG GTAGCGTGGA TAATTTTGAA 1020AAAAAAGATT AGAGCATAAA ATGAATTTAC TTAAAGGGAC AATAATATAT ACATTGTCAA 1080ATTTGACAAT TAAATTTGGT GCAGTTTTAC TGCTTCCTAT ATTAACTCAT TTACTTAATC 1140CAGAAGAGTA TGGGATGGTA GGATTGTATG TTACACTTAC TTCCTTTCTT ACAATAATTT 1200TAGGGCTTGG TTTTTATACA CCCTTAATGA AAACTCAGTC GGAGCAGAAA AGCAATATTG 1260CAACTTCTAG CCATGTGAAT TTTTGTGCAA TAATATTTCT TATCGCAGTT TATTTATTAT 1320TGCTTTTATT TCTTTACTTT ATATTGAAGT CGTCTTTAGT TATTGATTTG TTGGGAGAGG 1380TGAAACTAGA TAGCAAATTA ATTTATTTGG CAGTTATTGT ATCAATGTTT TCTGCAATTA 1440ATATTATTAT GAACACGTCG TTTAGAATGG ACGAGAATTA TATATTAGTT GCAATATTGT 1500CAATTTTATC TTTTGTGTTA TTTTATTCCT CTGCTATAAT ATTCATTAAA CAGTTCAATT 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TCAGTTTTAG GTTTGGTAAA GTACAAAAAA TAATAAGGAG 8400GAGTGATGAC AATTTTAGTC ACTGGTGGTG CTGGATATAT TGGCAGTCAC ACTGTTATTG 8460AATTACAGAA AAATGGTTTT GACGTGGTAA TAGTAGATAA TTTTTGTAAT TCATCGCCAT 8520CGGTTTTAAA AAGAATTGAA TTAATTACAG GAAAGGAAAT TAAATGTTAC GATATTGATC 8580TTCTGGATTT TAATTTTCTG CAGAAGGTTT TTGTAACTAA TAATATTAAC TCTGTGATTC 8640ATTTTGCATC TTTAAAATCA GTTTCTGAAT CACTAATCAA ACCAACTGAA TATTATCATA 8700ATAATTTGAG TGGTTGCCTC AATGTCTTGA AAATAATGAA AGAACATAAC GTGAATAATT 8760TCATTTTCAG TTCTTCGGCA ACTGTATATG GCAGTAATAA CAACAATCCT GTTTCAGAAT 8820CTTCATCAGT CGGCACCGCA ACAAATCCTT ATGGAAAATC CAAGATTTTT TTAGAGCAAA 8880TATTGTCTGA TTGCTGTAAA TCAAATCCTA ATTTAAATGT AACTTGCCTG AGGTATTTCA 8940ATCCGGTTGG TGCACATTCT TCAGGTTTGA TAGGAGAATC TCCGAATGGT GTTCCTGCCA 9000ATTTAGTTCC ATATTTAACT CAGGTTGCTT TAGGTAAATT GCCCGTATTA CATATATATG 9060GTAATGACTA TGATACCAAG GATGGGACGG GAGTAAGAGA TTTTATTCAT GTTACGGATT 9120TAGCTAATGG ACACATAGCT GCGCTGAAAA AAATAAATGG TCATAATGGT TTTAAAGTTT 9180ATAATCTTGG TACTGGGCGA GGTTATAGTG 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因及其中的引物及PCR数据
Orf1的起始AAAAAAGATT AGAGCATAAAATGAATTTAC TTAAAGGGAC AATAATATAT ACATTGTCAA 1080ATTGTACAAT TAAATTTGGT GCAGTTTTAC TGCTTCCTAT ATTAACTCAT TTACTTAATC 1140CAGAAGAGTA TGGGATGGTA GGATTGTATG TTACACTTAC TTCCTTTCTT ACAATAATTT 1200TAGGGCTTGG TTTTTATACA CCCTTAATGA AAACTCAGTC GGAGCAGAAA AGCAATATTG 1260CAACTTCTAG CCATGTGAAT TTTTGTGCAA TAATATTTCT TATCGCAGTT TATTTATTAT 1320TGCTTTTATT TCTTTACTTT ATATTGAAGT CGTCTTTAGT TATTGATTTG TTGGGAGAGG 1380TGAAACTAGA TAGCAAATTA ATTTATTTGG CAGTTATTGT ATCAATGTTT TCTGCAATTA 1440ATATTATTAT GAACACGTCG TTTAGAATGG ACGAGAATTA TATATTAGTT GCAATATTGT 1500CAATTTTATC TTTTGTGTTA TTTTATTCCT CTGCTATAAT ATTCATTAAA CAGTTCAATT 1560ATGGAGGCCT TGGCTATATA TATGGCAATT TATTAAGTTC AATAATCATT TTTTTTATAA 1620GTTTCACTTG TTACTATAGA AAATTATCTA TTGCATTTTC ATGGCACAAC GTGAAATTTT 1680TGTGTGGGAA TGGAATTCCA ATGGTTTTTG TAGAGTTATC GGATAAAATA ATTGAAGCCA 1740GCGATAGATT TATTTTAGTC AGATATATTT CACTATCCTC TTTAGGCGTA TATACACTAG 1800CACTAACAGG ATGTAAAGTA TTAAACGTAG TTTTCAATTC TTATATTAGC GCTATCCTTC 1860CCTCTATCTA TAAAAGCGTT GAAAGCCGTG AAGATTCAAA TTATATAAAA GTTAAGCTTG 1920AGAATGCATA CGTGCTTGTA GTAATGATGG TTTTTTTGGG ACAGTTGATA TCAAAAGAAA 1980TAATTGACAT AATTTTTCCT GCATCATATT CAAATTTATT TTTTGTATTT ATATTAGCTT 2040TGCCTGCAAT ATCTCTACAA TATTATTATT TTTTAGATTT CTATTTTCAT AGAAGTGAAG 2100ATAGCCGATT TATTTTATGT TTTACAATAG CAACCTCGAT AATAAATATT ATTCTAAACT 2160TAATTTTTGT TCCCAAATAT GGAGTTTATG CATCTCTTTT ATCAACGTAT ATATCCTATT 2220TAATCAGAAC GCTAGTAGAA ATAAAATTTA TAGCGAGACG GTATAAATTG AAGTTTAGTG 2280TGCTTAAAGT CCTTATGGGA AGCTTTGTTC TGTATACTGT TCCTTTATTA TATCATTATG 2340GTTATTATAC AGTGTTGTTG AGAGTAACTT TGTCAATTGT TTTATTTATA GGTATTATTA 2400
Orf1的终止TGTTTTATAA AAAAAGTAAG ATATTCAATTAAAAGTGAGT GCTAAGTGAT CATGGTTAAT 2460
Orf2的起始GCTAAAAATT TTGTATTAAT TATTTTTGAT GTAATATGTC TTTTTCTTAA TGTTTTTGTT 2520TATGTCCCAC GTCTAATTAT TGGTGTTTTA ACAGTAGATA AAACATTGAT TATTACATTT 2580CCCTTGATGT TATCAGTGTT GGCATATAAT TTTATTCCAC CAGAAACATA TGATCTTTAC 2640AGACATTATG AAAACTATCA AAATTTTTTG AATAATAATG AAGTAAGTTT TATCAGGGAT 2700TTTTTTCTTT ATTTTTTATT TACCGTAGGG AGGCTTTTTG ATTTAAATAA TGGATTTATA 2760GCATTTGTAT CTTGTTATAT CCTCTATTTT TATTGGTTAA AAATATTATA CATTAACTTT 2820GATTATAAAG CCAACAAGAA AAATTTCCCG TTATACTTTT TTATATTTTT TATTACTCCA 2880CCTCTTGTTA TATATACAGG CGTTCGATTT TCCACAGGGC TTATATTAAC ACTATATGGG 2940ATTGTAAACT GGATTCAATT ACGGAATGTA AAACTTGGTA TAGTATATAT TATTTGCGGG 3000TTAACAGCCC ATTTTTCAAT GGCATTGATT GCTTTAATAT TTATTTTCAC ATCATATTTC 3060AATAATATCT TTTCAAATAA ATATTTAAGG GTTGGGCTCG TATTTTCTGC ATTACTTGTA 3120ATCTCATTTA ATGAACAGTT AGTAAGGTTT TTGACAACAG TAATTGAGTT CATTAATCAG 3180TTATTTGATT GGAACTTTAT TAGTATCGAT ACATATATTA CTGGTAAATG GGGGCTGGAG 3240AGGGCGCAGG AATTGAATTC AACCGGACAA TTAGTATTAG GTATACGTAA TTATGGTATG 3300CTCTTTCTAA TATTGCTATT TTGCCCACTA ATATCTTTTA ATAAAAATAA ATATACGAAC 3360TTTTATTATG TAATGTGTGC TGTTACAATA TTAGTTTTCC CTTTTACAGC AGTATTTGAT 3420AGATATGGAA CATTTTTAAT TTTTTTTATT GTATACTATC TTAGTACTCT TCAGAAAAAA 3480ACTAACATTG AAATAATATA TTTTTTAATG TTGATTGTAT ATTTGATTTT CTTTAGAACA 3540ACAGACATCA AAGATAATAT TTCCGTATAC ACTGAAAGCT ATAGTAATAT ATTGAATCTT 3600
Orf2的终止，Orf3的起始TCTTTAATTA AAGTACTGTT AGGAATATAATGCGTAAATA TGAAAATAAC ATTGTTATAA 3660GTGTGATTAT TCCAACATAT AACAATGATA AAACAATCAT AGAGGCTATT CAATCTATAG 3720TAAATGTTGA GATGCCTGTG AAATATGAGG TACTAGTAAT AGACGATGGT TCGGTAGATC 3780AGACATCAAA TTTAATTGCA GAATATATAA GTCAAAGAAA AGATAATACT ATTAAATATT 3840TTTATCAAAA AAACAGTGGT GTAAGCGCTG CGAGAAACGT GGGAATAAAA AATGCATTAG 3900GGAAATATGT TCTATTTTTA GACGCAGATG ATACATATAG TGAACATGTG TTAAAAGAAA 3960TAGATGAAAT ATTAAGTACT AACAATGATA TATATGTGTT TTCATATGAA AAACTGAATA 4020ATAAAAAGGC TATAATATCA AATAAAAAAA ATATTATAAC TCATTATAAT AATAAATATG 4080ATTTTTTAAA CGCCTATATC TCAGGTGAAC TTTTCGGGTG CGTTAGTGTT TGCTCTTGCA 4140TTTTTAGTAA AGAATCATTA ATTAGCAATA ATATTTTTTA CGATAGTAAA ATTGCTTATG 4200GGGAAGATCA ATGGTTTTTG ATAAATGCTC TCAAGGTTTG CAATGATGTA GAGTTCAGAT 4260TAGAACTAAA TTTACTGAAT TATACTTATA ATACGGAGTC GGCGACTAAT CGTTTCAACC 4320TAAGACGTTT TGACGCGATT ACAATGCTAG AAAGAATCAA TCAAGAAGCA TTTAAGGTTA 4380ATCAAGATAT AATTAATGCA AGAATTAATA AAGAATTGGT AAATATAGCA ACAATATATA 4440CGAAATTCAA TTCGTTACAG AAATCAATAA TGTTTGTTAA TAACGTTATA CTCCCAAAAA 4500TAAAAACGGA TAGTGACAAA AGACTATATA TGTTCAAAGA TATGGTTTTC ACTAGATTAC 4560
Orf3的终止 Orf4的起始CATGTTTATA TATAATACTT TATAAACTCT ATATTCAGCTATTTAAGTAA ACTAATATGA 4620ATATTCTTAT AATTATTCCT AAGTTATGTA ACGGTGGGAT TGAAAAGATT GCATCAAACT 4680TTTCTCAATA CTTACCAGAA AGATATAATC AATTTGTATA TTCAATCATG TCACAAGACT 4740CTTCTTATGA TTTTGCGGTA AAGCCCATTA TATTAAATAA AAGTTTAGGT AAAACCTTTA 4800TTGGAAAATT GATTACATTT TTCTACAGGC TTCATTTGGC ACGTAAAATT ATTAGAGAAA 4860ATAACATAGA TATATGCATT AGTTTTGGGG AGAGATGTAA TATTATAAAT ATTCTATCTA 4920TGGGGAAAAC AAAAAAAATC ATTACTATAC ATAGTCAGCT ATCTATTGAA AATAAAACGA 4980AAGGATTATA TGGAAAAGTA ACAACACTAT TTTCAAAATT GCTTTATAAA AATGCGGATG 5040CTACTGTAGC CGTATCAGAA ATAGTGAAGA AGGATGCATG CGGTTTATTA AATTTAGATG 5100CGAATAATGT AGAGATAATT TATAATGGAC ACGATATTGG TTATATCAAA GATAAGTCTA 5160CTGATTATAA AGAATTTGAT ACACCTGTGA TCGACTTCGT GTCTGTAGGG CGAATTACAT 5220ATGCTAAAGG GCATTATCAT CTATTGAGAA GTCCTGCCAT AGTAAAGGAG ACGTATCCTA 5280ATGTAATACT ATATATTGTT GGCACGTATG AAAAAGATAA TTTAAAAAGC ATAATTGATC 5340ATTTAATTGA GAAATACGAT TTATATGATA ATGTGATTTT TACCGGCTTT AGTGACAATC 5400CATATCCTTA CATAAAATCA GCAAAGGCTC TTATACTTAG TTCAATTTTT GAAGGTTTTC 5460CAGGCGTTGT TATCGAGAGT ATTGCGCTTG GAACTCCTGT CATAGCGACA GATTGTGGCG 5520GTGCTTCAGA AGTTTTAAGA AGTCCAGATG CCAAAATAAA GAATAATACG GGAGATGTGG 5580AAATTACTAA ATTAGGAGTA CTGTTACCAA AATTCGATGG GATTTATGAT ATTAATTTGG 5640ATTTTTCGCC CACAGAAAAA AAGATGGCGC AAGTTATGAA TGATATTATA TCAGGGAAGC 5700TGAAATTTAA TGAAGACTTT TTAATTACAA AAGCAAACGA ATATGATATA GATTCTATGA 5760
Orf4的终止，Orf5的起始TGAAAAAATA TACGGACTTA ATAGAGAAAA TAAAATAATG AAAGAAGCTA CTACCTCATA 5820TAAATCAATT CATACTATAT TAGAATATTT TGGTTGGTCT CATGAAGATT ATTGGCATAT 5880CAACTATAAA GTAAATTATG ATTTTTCAAA ATTTAATTAT TATTGGGATT TGACAAAAAA 5940GTATAATTGG TTTAGTGGAC CTTTTGATCA AAATAATATT CCTTTATATC TTGGCACTGA 6000TTCAAAACTG CATTACTCAC CAATTTTTTT AGGGCATTAT GCTCTTGGAG CATATCAAGA 6060ATATTTATTA TCAAATGATA AAAAAGCATA TGACGATTTT ATAAGAATAG CGGATTGGCT 6120GGTTGAAAAT ACAACGACAT ATAAAAAATG TTCTGGAATA TGGATAAATA CATACCCAAT 6180GTCAACTTTT AACTTAAAAG GTAAATGGCA ATCGTGTTTA GCCCAGGCAA AAGGTATATC 6240TGTCCTATGT AGAGCTTATT ATCTTACGCA AAATTTAAAA TATTTGAAGG TAGCTCTTGA 6300CGCATTTGAA TCTTTCAAAA TATATAAAGA AGAAGGTGGA GTTAAGGTAA GGCATAAAAA 6360CGTATTCTTT TGGGAGGAAT ATCCAACTAT AACCAATTCT ATCGTATTGA ATGGACATAT 6420TTTTGCAGTT TGGGCATTGT ACGATTTATC TTTTGTATTA AAAGATAAGA ACGAGTTTAA 6480GCAACAATGG GCGGATATTT ACAGTTATTA TAAAACATCA CTGATTATAT TAAAAGAGAA 6540TTATAAGTTA TGGGATACGC ACTATTGGAC TAGATATGAT ATATGGGATA AACATTTTAA 6600TGTTTCAAGT TTGTTTTATC ATAATCTCCA TATTAAACAA TTCTATATAT TGGCTGTTTT 6660GGGAGATGAT GATGATTTCA AGAAAATTGC TAATAAATGG GCTGGTAAAT TAAAAAATCC 6720
Orf6的起始，Orf5的终止GCTTTTCAGA ATGTATGCGC TTATAAAGAA AGTAGTTTTT AGGTTATGAT TATGAATGTT 6780ATTGATAAAA TTATTATGGG TTTGAAAAGT ATATATTTAA GCTTTCTTTA TACAATATAT 6840AATTTATTTC TTAATGAAAA TAGATTCGAA GAGACAAATG AAGTACATGT TGTTGTAAGT 6900TTGACGTGTT TTCCTGGACG TATAAAAAAA GTATATCTTA CTTTAGAGTC AATTATGGCT 6960CAACAATATA ATAACTTTAA AGTGGTATTG TACTTGTCTC ATGAAGAGTT TCCAAAGGGT 7020TTAGAGGATT TACCTCGTAG TTTAATACGA TTACATAAAA GAGGTGTCGA TATTAATTTT 7080ACGTGTGAAA ATATTCGATC TTATAAGAAG TTACATTATG CGCTGAGTGA TTTCCCAGAA 7140CTACCTGTAA TAACAGCTGA TGATGATGTC TTATATCCCT CGCGATGGGT AAATGATTTT 7200ATGGAGTCAC ATAAGCTTTT TCATGATGAT ATATTATTTG CGAGGGGGCA TCAGATAACA 7260TTTGACCGAA ATGGAAATGT TAAAAAATAT ATCTCTTTCG GAAAACCAGC TGGATATTCA 7320GCATCAAGTC TATATATTCC TACAGGAGTA AGTGGAATTC TATATCCGCC AGGATGTTTT 7380TTTCAAGATG TGCAGAATAA AGATATTTTT ATGAAGTTGG CACCTAACGC AGATGATATA 7440TGGTATAAAG TAATGACTTT GTTAAACGGT CGAAAATCCA GATTGATCTA TAAAAAGCCA 7500ATTCATATTC CACCTATCCT TGGCACGCAG AAGATCTCCT TGCGTAAACA AAACTTATCG 7560AAACAACATT TAAATAATGA TACACAATTA TTAAATTTAA TTGATTATTA TTCTATCGAA 7620
Orf6的终止 Orf7的起始TTAGCTGATT TTAAGAAAAA GGAATAGCTCCTATGGAATT AGTTTCAATT ATAATGCCTT 7680GTTTTAATAA TGAAGCAACT ATAAAAGAAA GTATTAATAG CGTACTATCT CAAAGTTATA 7740AATACTGGGA GTTAATTATT ATCAATGACA ACTCAACAGA TGATTCACAA AATATTATTA 7800ACGACTATGT GAATAGTGAT GAAAGAATAA AACTGATTAC TAATGAAAAA AATATCGGAG 7860CTGGAGGTAG TAGAAAATAA GGAATTGAAA TTGCAAATGG AAGATTCATT GCTTTTTTAG 7920ATGCAGATGA TGTTTGGTTG CCAGAAAAAC TTGCAAAACA AATAAAGTTT ATGAGAGATG 7980GTAATTATGC ACTGACATAT AGTTATTATC AAAAGTTTGA TTCAACTGGA TTGGGAGCGA 8040TCGTCCGGTC ACCTGCGACA ACAACTTATA GGAAATTGTT ATACAGTAAT GTTATTGGAT 8100GTCTAACAGG AATGTATGAT ACTGATTTTT TGGGTAAATG CTATATGCCT TTAATTCGTA 8160AACGACAAGA TATGGGGCTT TGGTTGTCAA TATTGAAAAA GTGTAATAAA GCATATTGCT 8220TACCTGAAGT TTTGGCATAT TATAGAATTG ACTCAGGAAT GACAAAAAAT AAACTTGATG 8280CGGCAAAATA TCAGTGGCGA TTTTATAGGG ATGTAACTAA ACTTAATTTG ATTCAATCAA 8340
Orf7的终止GTTGGTATTT TGTTTGGTAT TCAGTTTTAG GTTTGGTAAA GTACAAAAAA TAATAAGGAG 8400 Orf8的起始GAGTGATGAC AATTTTAGTC ACTGGTGGTG CTGGATATAT TGGCAGTCAC ACTGTTATTG 8460AATTACAGAA AAATGGTTTT GACGTGGTAA TAGTAGATAA TTTTTGTAAT TCATCGCCAT 8520CGGTTTTAAA AAGAATTGAA TTAATTACAG GAAAGGAAAT TAAATGTTAC GATATTGATC 8580TTCTGGATTT TAATTCTTTG CAGAAGGTTT TTGTAACTAA TAATATTAAC TCTGTGATTC 8640ATTTTGCATC TTTAAAATCA GTTTCTGAAT CACTAATCAA ACCAACTGAA TATTATCATA 8700ATAATTTGAG TGGTTGCCTC AATGTCTTGA AAATAATGAA AGAACATAAC GTGAATAATT 8760TCATTTTCAG TTCTTCGGCA ACTGTATATG GCAGTAATAA CAACAATCCT GTTTCAGAAT 8820CTTCATCAGT CGGCACCGCA ACAAATCCTT ATGGAAAATC CAAGATTTTT TTAGAGCAAA 8880TATTGTCTGA TTGCTGTAAA TCAAATCCTA ATTTAAATGT AACTTGCCTG AGGTATTTCA 8940ATCCGGTTGG TGCACATTCT TCAGGTTTGA TAGGAGAATC TCCGAATGGT GTTCCTGCCA 9000ATTTAGTTCC ATATTTAACT CAGGTTGCTT TAGGTAAATT GCCCGTATTA CATATATATG 9060GTAATGACTA TGATACCAAG GATGGGACGG GAGTAAGAGA TTTTATTCAT GTTACGGATT 9120TAGCTAATGG ACACATAGCT GCGCTGAAAA AAATAAATGG TCATAATGGT TTTAAAGTTT 9180ATAATCTTGG TACTGGGCGA GGTTATAGTG TGTTAGAAGT CGTTAGATGT TTTGAGGCTA 9240TTACAGGAAA AAGTATTCCA ATCGAATTTT CGCCTCGCAG AGAAGGTGAT ATCGCTGAAA 9300GTTGGGCAAA TGTTTCCGCA GCAAATTATG AGTTAGAGTG GTTCGCTAAA AAGACATTAA 9360
Orf8的终止CTGATATGTT ACGAGATGCA TGGAAATGGC AAACGTTAAA TCCAAATGGA TTATAAAGAT 9420ATTTAATTTA TATTAAACCT TGCTTATTTA AGATAATGTA AACCGCACCT TTGCGGTAAC 9480CACCCCTGAC AGGAGTAAAC AATGTCAAAG CAACAGATCG GCGTCGTCGG TATGGCAGTG 9540ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT CAACATCGAA AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC 9600CGTTCCCGTG AAAAGACCGA AGAAGTGATT GCCGAAAATC CAGGCAAGAA ACTGGTTCCT 9660TACTATACGG TGAAAGAGTT TGTTGAATCT TTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG 9720GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC GGATGCTGCT ATTGATTCCC TTAAGCCATA TCTCGATAAA 9780GGCGACATCA TCATTGATGG CGGTAACACC TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAACCGT 9840GAGCTTTCTG CCGAAGGCTT TAACTTCATT GGTACCGGTG TCTCCGGTGG TGAAGAAGGC 9900GCGCTGAAAG GTCCTTCCAT TATGCCTGGT GGGCAGAAAG AAGCCTATGA ACTGGTTGCT 9960CCGATCCTGA CCAAAATCGC TGCAGTGGCT GAAGACGGCG AGCCATGCGT TACCTATATT 10020GGTGCCGATG GTGCAGGTCA CTATGTGAAG ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGCGAT 10080ATGCAGCTGA TTGCCGAAGC CTATTCTCTG CTAAAAGGTG GCCTGAACCT TACCAACGAA 10140GAATTGGCAC AGACCTTTAC CGAATGGAAT AACGGTGAAC TGAGCAGCTA CCTGATCGAC 10200ATTACCAAAG ACATCTTCAC TAAAAAAGAT GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATC 10260CTGGATGAAG CGGCAAACAA AGGTACGGGC AAATGGACCA GCCAGAGCGC ACTGGATCTC 10320GGCGAACCGC TGTCGCTGAT TACCGAGTCT GTGTTTGCAC GTTATATCTC TTCTCTGAAA 10380GATCAGCGCG TTGCCGCTTC TAAAGTTCTC TCTGGCCCGC AAGCGCAGCC AGCAGGCGAC 10440AAGGCTGAGT TCATCGAAAA AGTTCGTCGT GCGCTGTATC TGGGCAAAAT CGTTTCTTAC 10500GCTCAGGGCT TCTCTCAGTT GCGTGCTGCG TCTGAAGAAT ACAACTGGGA TCTGAACTAC 10560GGCGAAATCG CGAAGATTTT CCGTGCTGGC TGCATTATCC GTGCGCAGTT CCTGCAGAAA 10620ATCACCGATG CCTATGCCGA AAATCCGCAG ATCGCTAACC TGCTGCTGGC TCCGTACTTC 10680AAGCAAATTG CCGATGACTA TCAGCAGGCG CTGCGTGATG TCGTTGCTTA TGCAGTACAG 10740AACGGTATCC CGGTTCCGAC CTTCGCCGCT GCGGTTGCCT ATTATGACAG CTACCGTGCC 10800GCTGTTCTGC CT 10812
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
机译： 与痢疾志贺氏菌痢疾2-9，志贺氏菌FLEXNER 6，志贺氏菌BOYDII 1-10、14、15，志贺菌SONNEI有关的菌株
机译： 寡核苷酸引物，一种基于聚合酶链反应的方法，用于扩增有毒志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌菌株核酸;用于检测样品中强毒志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌菌株的诊断测试，以及用于该测试的试剂盒。
机译： 弗氏志贺氏菌痢疾志贺氏菌2a肠毒素
