使用具有催化性能的咪唑(如组氨酸)官能团催化剂稳定的过渡配合物进行酰基转移

摘要

本发明涉及一种进行试剂和底物间化学反应的方法,包括一种酰基转移机理,是在一种可与底物形成一种过渡配合物的咪唑基催化剂存在下进行的。具有催化性能的咪唑官能团,是由一种含有一种非必须取代的咪唑基团的化学结构单元提供的,非必须取代的咪唑基团在其一个或两个侧面连接有可通过与酰基的分子间相互作用可稳定该过渡配合物的一种或多种基团。本发明还涉及这类设计化学结构单元以及采用重组DNA技术和其载体制备结构单元的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及化学反应的催化作用，特别是涉及酰基转移反应的催化作用。

发明背景

所谓酰基转移反应包括酰基(有机酸脱除羧基的羟基后的余下部分)的转移，可以是在一种化学物种内部进行转移，也可以是由一种化学物种转移到另一种化学物种之上。例如，酰胺的形成，酯交换作用和水解作用。

众所周知，酰基转移反应可在水溶液中由咪唑所催化，咪唑是一种强的亲核物质，可与酰基形成中间反应配合物。聚合物负载的咪唑也可用作酰基转移反应的催化剂(参见Skjujins,A.,et al.,Latv.PSR Zinat.Akad.Vestis,Kim.Ser.1998(6),720-5)。

进一步的研究表明，含有组氨酸(His)残基(一种含有咪唑基的氨基酸)的较小的肽具有水解活性。

最近在设计结构蛋白和肽方面的研究进展，导致了一些具有相当催化活性的肽的制备(W.F.DeGrado,Nature,365,488(1993))。例如，K.Johnsson等人在Nature,365,530(1993)中公开了一种短自缔合的富含Leu-Lys的螺旋肽，它可借助在一种草酰乙酸底物和一种具有静电降低的酸常数(Ka)的胺间的一种Schiff碱性中间体加速脱羧作用。它指出二级结构对活性是非常重要的。

本发明提供了含有一种咪唑基催化官能团的设计的催化结构的改进。

发明概述

根据本发明，发现如果咪唑基位于一个化学结构中，该化学结构的一面或两面连有一个基团，该基团性质和位置可使其能稳定咪唑基和酰基间形成的过渡配合物，则上述咪唑引发的催化活性可得到很大的提高。为实现这种稳定化作用，一个或个侧面连接的基团应该能与酰基配合物分子间互作用，如利用氢键、静电或疏水作用、或范德华力(分子间的极化作用)。

提高的催化活性可与有或没有立体定向性的分子内及分子间溶液反应一起使用。如果不具有立体定向性，则使肽和其它的分子进行位点选择官能化作用是可能的。位点选择官能化作用将尤其能使分子进行位点选择固定化作用，如生物分子，例如抗体或其它蛋白质或多肽。

本发明的一个目的是提供一种采用咪唑基催化剂进行酰基转移型反应的方法。

因此，本发明的第一个方面是提供一种进行涉及酰基转移机理的化学反应的改进方法，是在可与酰基形成过渡配合物的咪唑基催化剂存在下进行的。该方法的特征在于咪唑官能团，是由一种在其的一个面或两面连接一个基团的包括咪唑基的化学结构单元所提供的，所述基团能通过与酰基的分子作用稳定过渡配合物。这种分子间作用可选自氢键、静电作用和疏水作用。

在本方法的一个优选实施方案中，该化学结构单元构成或者部分构成一种带有官能团的较大结构，该官能团处于邻位，使它经过上述的中间体配合物可通过酰基转移进行特定位置的官能化作用。

本发明的另一个目的，是提供一种可提高酰基转移反应催化性能的化学结构单元。

因此，本发明的第二个方面，是提供一种化学结构单元，该化学结构单元构成或包括一种含有一种咪唑官能团的骨架结构，该单元的特征在于咪唑官能团通过一种侧基连接在所述的骨架结构的一面或两面上，所述侧基团通过与酰基的分子间相互作用可以稳定过渡配合物。

在一个实施方案中，该结构单元可为一种分子，如肽或蛋白质，它含有一种处于邻位的官能团，该官能团经过上述的中间体配合物通过酰基转移实现特定位置的官能化作用。

本发明的又一个目的，是提供一种采用遗传工程制备蛋白质或肽的方法，这种蛋白质或肽构成或包括一种带有通过一种可稳定过渡配合物的基团连接在其一面或两面的咪唑官能团的结构单元。

因此，本发明的第三个方面，是提供一种制备蛋白质或肽的方法，这种蛋白质或肽构成或包括一种带有如上所述咪唑官能团的结构单元，该方法包括：用含有载体和编码所述蛋白质或肽的DNA序列的重组DNA构建体转化宿主生物，培养宿主生物以表达所述的蛋白质或肽，并将蛋白质或肽从培养基中分离出来。

在本方法的一个优选实施方案中，结构单元是含有一种与咪唑官能团相邻的官能团，该官能团可由咪唑官能团催化的酰基转移实现特定位置的官能化作用。

本发明还有一个目的，是提供一种含有编码上述蛋白质或肽的核酸序列的载体。

因此，本发明的第四个方面，是提供一种含有载体和编码蛋白质或肽的DNA序列的重组DNA构建体，它包括上述定义的含有咪唑官能团结构单元。

在一个优选的载体实施方案中，DNA序列也编码一种在咪唑官能团的邻位的特定官能团，该官能团可由咪唑官能团催化的酰基转移而被特定位置官能化。

本发明的前述的和其它的目的、方面、特点和优点，可从下面本发明的详细说明书中得到进一步的说明，同时可加深对本发明的理解。并请参见附图。

附图简要说明

图1A和图1B为四种设计多肽即SA-42、RA-42、PA-42(图1A)和KO-42(图1B)的螺旋-环-螺旋结构的示意图，所示为它们的设计反应中心。

图2为富马酸单对硝基苯基酯与本发明的含有咪唑的结构(RA-42)在酰基转移反应中，释放对硝基苯酚的二级速率常数的对数与pH的关系曲线。点画线表示期望的由pKa为10.4的去质子化的鸟氨酸催化的反应速率常数与pH的关系。

发明的详细说明

如上所述，本发明的目的是为了提高酰基转移反应中的咪唑型的催化活性，它是通过提供一种其上带有咪唑官能团的骨架结构，该骨架结构带有在咪唑官能团的一个或两个侧面之上的侧面连接基团或链，该侧面连接基团可与所形成的咪唑-酰基配合物相互作用，从而稳定配合物。正如下面将要说明的，所期望的酰基转移反应如酰胺化作用、酯交换作用、水解作用或硫解作用的反应速率，因而可得到相当大的提高。虽然酯类是通常的优选底物，例如酰胺和酸酐物质也是可以使用的。

此处的“咪唑官能团”可以作广义地理解，它可包括那些具有期望的催化活性的咪唑型结构。咪唑基随后可用不同的方法进行改性。一种有利的多功能咪唑官能团是基于氨基酸组氨酸(α-氨基-4-(或5)-咪唑丙酸)。例如：咪唑官能团中的一个或两个碳原子，可单独地被烷基或卤素所取代。咪唑基团也可在1位被烷基取代。烷基优选具有1-6个碳原子，尤其是1-4个碳原子，如甲基或乙基。卤素包括氟、氯、溴和碘。

该侧面连接基团包括一个键或链，如具有1-6个原子，优选地1-4个原子，通常为碳原子，它连接在端基官能团或其它的可使期望的分子与酰基过渡配合物发生相互作用的基团。

如果催化结构单元是一种肽，咪唑官能团是组氨酸残基的一部分，则该侧面连接的链可为其它氨基酸如选自赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和/或组氨酸的质子供体部分的侧基。

根据咪唑官能团在进行所期望的过渡配合物的稳定化作用时的最佳几何关系，负载有催化性能的咪唑官能团的化学结构单元，优选为具有一定程度的刚性，如二级结构，以定位该侧面连接基团。在一个优选的实施方案中，化学结构单元是一种具有稳定的二级结构的所谓设计多肽，如α-螺旋盘绕卷。例如，J.W.Bryson等人在Science,270,935(1995)中公开了设计螺旋肽。不过，该结构单元并不仅限于肽。相反，它可以是对本发明的技术人员来说是清楚的组成的任何一种，并包括或是其它类型的结构，如一种碳水化合物、一种天然或合成的聚合物等的一部分。化学结构的尺寸没有限定，例如，它可以为一种少至含有五个氨基酸的肽。至于咪唑官能团和一个或多个侧面连接基团间所需要的几何关系，每个特定位置的官能团的排列，本领域技术人员阅读了本发明即可容易地设计。

依照稳定配合物的侧面连接链的官能团的不同，过渡配合物可与这类侧面连接链在分子间发生相互作用。这类分子间的作用可用来选择性的官能化肽、蛋白质和其它分子。下列给出的反应式为这类分子间反应的一个实施例。

在上述的反应式中，咪唑基结构为组氨酸(His)残基的一部分，氨基丙基链为鸟氨酸(Orn)残基的一部分，两者均包括在设计α-螺旋多肽中相互间距离四个碳原子(即位于“i”(His)和“i+4”(Orn)),His和Orn残基从而固定在螺旋(每圈中有4个碳原子)的同侧。“I”表示一种具有活性的酯，具体是指富马酸单对硝基酯。反应是在鸟氨酸中的氨基几乎全部质子化的pH值下进行的，因而不能与活性酯直接进行反应。一个这类α-螺旋多肽的实施例为RA-42，如图1A中所示的其超二级结构。RA-42具有42个氨基酸，和His-15、Orn-15和Orn-34残基。多肽RA-42将在下列的实验部分作更详细的描述。

反应是从His的咪唑残基起始进攻具有活性的酯形成一种酰基中间体开始的，同时释放对硝基苯酚。该酰基中间体可采用鸟氨酸侧链来稳定，该侧链可向酰基配合物的两端伸缩，并通过在质子化的氨基和形成的酰基氧离子之间的氢键与酰基配合物发生相互作用。该酰基接着从组氨酸残基转移到鸟氨酸残基上，重新释放出游离的组氨酸。

在组氨酸残基的另一侧带有一个附加稳定化链也是可行的。最终形成的过渡配合物如下图所示。

研究表明，如果组氨酸残基连接有另外两个组氨酸残基(在α-螺旋情况下，在位置i+4和i-4)，则催化活性可获得很大的提高。

相对于位置i的组氨酸残基，酰基化作用也可在位置i-3进行(但在位置i-4、i-1、i+2和i+3不能进行)。

可作为i+4酰基化作用基团的实例，除了上述的鸟氨酸外，还有赖氨酸和1,3-二氨基丁酸，i-3酰基化作用可以用赖氨酸举例说明。

而且，还存在可在位置i+4和位置i-3进行酰基化的官能团，例如，赖氨酸有这类官能团。

采用在位置i、j、k等具有多于一个咪唑基官能团的结构单元也是可行的，这些官能团接着在其一个或两个侧面上连接官能团，优选是分别在位置i+4、j+4、k+4等，和i-3、j-3、k-3等连接。

采用如由简单的过渡态联接原理所设计的经官能化的螺旋-环-螺旋基元，来催化酰基转移反应也是可行的，优选的配合物稳定化作用是通过引入如：带正电荷的氢键供体，它可与带负电荷的底物以预定的方法进行反应。在上述的情况下，在过渡态中主要的键合作用是酯基官能团中的氧离子的形成。这可由对乙酸硝基苯基酯看出，它有不带负电荷的官能团，却具有与单富马酸对硝基苯基酯几乎相同的催化效果，在下述的实验中将作详细的说明。

体现本发明的设计多肽，如上所述的那些多肽，可由重组DNA技术(遗传工程)制备。这种技术对本领域的技术人员来说是公知的，在此不作详细的描述。(例如，可参见EP-B1-282042中所公开的采用重组技术制备含有相邻His残基的融合蛋白。)

上述的反应中心的选择性，可用来在折叠多肽中引入新的官能度。在分子间的相互作用中，该稳定化的侧面基团当然不是经酰基转移而官能化的基团，但可能是位于合适位置的其它的官能团。

位点选择官能化作用的一个重要方面是向蛋白质和肽中引入位点选择的碳水化合物。它是通过修饰所述的碳水化合物以含酯基官能团而实现的。碳水化合物在免疫、炎症和其它过程的识别中有重要的作用。它也可保护蛋白质以防蛋白降解，并影响蛋白质折叠。因而，碳水化合物的位点选择引入，可用来系统地研究碳水化合物的作用。它也可用来保护药物以防降解。

本发明的方法可用来制备疫苗，模拟免疫系统的组成，并用于构造针对免疫系统组分的拮抗剂和激动剂。

如果侧链具有不同的反应活性，则本发明的方法也可用来在不同的位置上逐步引入不同的官能度。我们知道，这类反应在位点选择固定化作用和构造官能化的多肽中，有非常大的潜力，如新颖的催化剂，辅因子的引入等。

一个位点选择性固定化实施例如下图所示，其中如上所述的螺旋-环-螺旋型设计多肽，它有一个与侧面连接的氨基烷基链处于稳定的关系的具有催化性能的组氨酸残基，它是经氨基官能团而固定到固态载体的酯基官能团(R₁OCO)上的。反应是在这样的pH条件下进行的，所有的氨基官能团几乎全部被质子化，因而不能直接与酯基官能团发生反应。

在固态载体上的固定，是采用将组氨酸残基和氨基官能团固定到固态载体，并将酯基官能团固定到肽上的方法而实现的，当然，采用其它的方法也是可行的。

该反应也可用来引入一类残基，它在合成肽的反应条件下不能存活，或者由于空间位阻没有足够的活性。如果能够引入氨基酸残基或肽，则新的支链多肽结构也是可以的。由于组氨酸可以再生，可设计一种有组氨酸参与活性位点的工程催化剂。其它可能的应用包括：为特异性结合的底物或受体构造具有二级或三级结构的肽的肽库；为血液循环中特定的内源性物质的非共价键合构造多肽；在变态反应诊断(和临床)和免疫学中的应用；为抗体的制备构造拓扑分子；和疫苗的制备。

下面采用一些特定设计多肽的实验，对本发明作更详细的描述。实施例合成具有催化性能的多肽SA-42、RA-42、PA-42、LA-42和KO-42

多肽SA-42、RA-42、PA-42、LA-42和KO-42的氨基酸序列，示于说明书结束部分的序列表。其下粗体加线表示的RA-42、PA-42和KO-42的残基是为构造具有催化性能的结合位点而设计的。采用表示氨基酸的单字母码，其中A为Ala,D为Asp,E为Glu,F为Phe,G为Gly,H为His,I为Ile,K为Lys,L为Leu,N为Asn,P为Pro,Q为Gln,R为Arg,V为Val。Aib为α-氨基异丁酸，Nle为正亮氨酸。

就象从图1A和1B和序列表中可以看出，该多肽为螺旋-环-螺旋基序。在溶液中肽二聚形成四螺旋束，但是为了简洁起见，仅仅给出单体。

LA-42(图中未画出)除了用Lys-15替代Orn-15之外，与RA-42相同。

SA-42的合成，是采用Stewart,J.M.和Young,J.D.在SolidPhase Peptide Synthesis,Pierce Chem.Co.Rockford,Ill.1984中所述的方法制备的。多肽RA-42、PA-42、LA-42和KO-42是采用同样的方法进行制备的，不同之处在于所用的氨基酸衍生物是位于所修饰的位置上。鸟氨酸的侧链保护基团是2-Cl-CBZ(2-氯-苄氧羰基)。

多肽在一个自动肽合成仪(Biosearch 9600)中进行合成，采用t-BOC保护基团和苯基乙酰氨基甲基-(PAM)连接的树脂。它们可在特氟隆真空管中用无水HF从树脂中分离出来(肽研究公司)，并用尺寸排阻层析和反相和离子交换HPLC进行纯化。采用电喷射质谱(VGAnalytical,ZabSpec)和氨基酸分析来确定肽的特性，用HPLC来检验纯度。合成富马酸单对硝基酯

新鲜经蒸馏的富马酰氯(0.9g,5.9mmol)溶于100ml的丙酮中，并与溶剂中的痕量的水反应30分钟。将一小部分(0.2ml)转移到一个干燥的国底烧瓶中，蒸发溶剂。将残留混合物溶于CDCl₃，并转移到一个NMR管中。¹H NMR光谱表明，混合物中含有富马酰氯(7.10ppm,s)和部分水解的富马酰氯(6.998和7.07ppm,dd,J=16Hz)。富马酸仅少量溶于氯仿。然后，将水加入到丙酮溶液中，并重复NMR分析。将总量为54μl(3mmol)用注射器少量多次地加入，在每次加入后，用NMR光谱分析反应进行的程度。当溶液中不再含有富马酰氯时，蒸发丙酮，所余下的油溶于50ml不含乙醇的氯仿中，并离心分离除去富马酸。将上层清液转移到一个圆底烧瓶，并加入1.8g新制备的在真空下加热干燥直到变为亮橙色的对硝基苯酚酸钠。浆料在搅拌下反应过夜，接着离心分离。固体物质用3×50ml的水萃取，该混合水相用0.3M的乙酸滴定至pH为6，并用5×30ml的CH₂Cl₂萃取，以除去对硝基苯酚。水相用0.3M的乙酸滴定至pH为4.3，并用5×30ml的CH₂Cl₂萃取。混合有机相在255K下放置过夜。收集到少量的晶体(40mg)，在干燥的氮气流中蒸发部分溶剂后，收集到含有期望产物富马酸单对硝基苯基酯的第二批产量(60mg)。产率没有作进一步的优化。该产物由NMR光谱和质谱测定。测量富马酸单对硝基苯酯知其它底物酰基转移反应的二阶速率常数

富马酸单对硝基苯基的酰基转移反应的二阶速率常数，是对于下述物质进行测定的：多肽SA-42、RA-42、PA-42、LA-42和KO-42，以及4-甲基咪唑。

动力学测量是在290.2K下，在10％(v/v)四氟乙醇(TFE)和90％100mM的Bis-Tris缓冲剂中进行的，也可以是在缓冲水溶液中进行的，用配置有Cary温度控制仪的Cary4分光光度计，依次在pH为4.1、5.1或5.85时320nm的吸收增加之后测量。将待测量的底物溶于300μl的缓冲溶液中，用0.1M NaOH的10％TFE溶液滴定至相应的pH，并离心分离。将300μl澄清的物质溶液转移到1mm的UV试管中，并放置在UV分光计的自动调温器中。底物经称重后溶于缓冲溶液，用移液管移取20μl到试管中，开始反应。用定量氨基酸分析测定肽的浓度，每个速率常数取二次测量的平均值。每个动力学测量至少测定两个半衰期，并将数据拟合为一个指数函数A+A1*e^-kt。在肽过量的条件下，每种肽溶液测量两次，然后向试管中添加第二份20μl开始第二步反应。对于RA-42，如果一经与基质反应，过量速率促进作用消失，则在第二步反应中要校正肽的浓度，以补充反应中消耗的肽。基质的总浓度为0.13mM，二级速率常数的校正是很小的，低于10％。同样的校正也适用于PA-42的速率常数。下列表1是在10％的TFE和pH为5.85条件下获得的速率常数和相对速率，同时给出了富马酸单对硝基苯基酯和三氟乙醇间双分子反应的相应数据。

                    表1

        催化剂   速率常数    s^-1M^-1 相对速率SA-42RA-42PA-42KO-42LA-424-甲基咪唑富马酸单对硝基苯基酯和TFE   5.3*10^-3   2.8*10^-2   3.1*10^-2   2.6*10^-1   5.6*10^-2   3.4*10^-3   1.6*10^-5    331   1750   1937  16250   3500    211     1

如表所示，肽RA-42、PA-42和KO-42的速率常数有相当大的提高，即这些肽与4-甲基咪唑和肽SA-42相比，表现出催化活性的显著提高。催化活性的提高是由于前述的转移配合物的稳定化作用所引起的。这三种肽都具有带正电荷的氢键给体，其所在几何位置可稳定在His官能团和酰基或者由酰基所形成的氧离子之间的配合物。这样，RA-42在位置11有一个具有催化活性的His，在位置15有一个稳定的Orn。PA-42在位置15有一个His，在位置11有一个稳定的Orn。KO-42在位置11、15、19、26、30和34具有His残基。另一方面，SA-42有一个His-15残基，但不含有稳定化官能团。如下所述，在RA-42催化的反应中，反应产物是在Orn-15的侧链上形成的(酰胺化作用)的酰胺。在4-甲基咪唑催化的反应中，反应产物为TFE酯(酯交换作用)。

根据上述的研究方法，对分别由多肽KO-42和4-甲基咪唑(4-MeIm)所催化的富马酸单对硝基苯基酯的酰基转移反应与富马酸单对硝基苯基酯和三氟乙醇(TFE)的反应进行比较。反应是在290K和pH为4.1下，在10％(v/v)的三氟乙醇和90％浓度为100mM的乙酸钠缓冲溶液中进行的，反应产物为TFE酯(酯交换作用)。反应结果(速率常数和相对速率)如下述的表2所示。

                 表2

         底物  速率常数   s^-1M^-1  相对速率KO-424-MeIm富马酸单对硝基苯基酯和TFE  5.0*10^-2  7.90*10^-5  3.2*10^-7  156250    247     1

采用一种类似方法，研究了分别由多肽KO-42和4-甲基咪唑(4-MeIm)所催化的酰基转移到氢氧根离子之上的反应(水解作用)，在290K下，pH为5.1的浓度为100mM的乙酸钠缓冲溶液中，对下列物质进行研究：富马酸单对硝基苯基酯、乙酸对硝基苯基酯、环戊烷二羧酸单对硝基苯基酯和D-和L-色氨酸对硝基苯基酯。反应结果如下述的表3所示。

                   表3

            底物  KO-42  s^-1M^-1   4-MeIm   s^-1M^-1 相对速率富马酸单对硝基苯基酯乙酸对硝基苯基酯环戊烷-1,2-二羧酸单对硝基苯基酯色氨酸对硝基苯基酯(D-和L-)   0.31   0.29   0.86   3.7   7.4*10^-4   7.2*10^-4   1.5*10^-3   5.5*10^-3    419    402    573    540多肽RA-42和LA-42的自催化位点选择性官能化作用

将上述制备的多肽RA-42(参见序列表)在溶液中折叠形成发夹螺旋-环-螺旋基序。NMR光谱和CD光谱表明，它具有一个设计反应中心，包括His-11、Orn-15和Orn-34。RA-42与富马酸单对硝基苯基酯反应。电喷射质谱和NMR光谱表明，最终的反应产物是位于Orn-15侧链的酰胺。

研究浓度为0.5-1mM的肽的反应。研究表明，在自官能化反应中，His-11催化Orn-15侧链的酰基化作用，而其它的氨基则没有进行官能化。如下所述，反应机理包括与His-11形成一种酰基中间体，随后位点选择的酰基由His-11转移到Orn-15上。

在一种类似的方法中，采用上述的技术，使N-甲基烟酸的对硝基苯基酯与RA-42反应，生成相应的烟酰胺。

在一种类似的方法中，分子式如下式所示的半乳糖衍生的对硝基苯基酯，采用上述的技术，在pH为5.85的水溶液中，与多肽LA-42反应，生成相应的酰胺。用电喷射质谱仪(ES-MS)检测反应产物(四乙酰基衍生物)。在水溶液中水解除去乙酰基。反应中所用的对硝基苯基酯，是由标准的二环己基碳二亚胺偶联相应的羧酸和对硝基苯酚所制备的。反应机理的研究

如上述表1所示，在pH为5.85的10vol％的TFE中，RA-42的二级速率常数为2.8*10^-2M^-1s^-1，它比相应的乙胺与乙酸对硝基苯基酯的反应速率高出1000多倍(Knowles,J.R.，等人，J Chem.Soc.Commun.,1967,755-757)。从表1还可看出，由His-11所催化的RA-42反应，是相同条件下由4-甲基咪唑所催化的反应的8.3倍。在水溶液中，RA-42的二级速率常数为5.07*10^-2M^-1s^-1，而4-甲基咪唑的为1.05*10^-2M^-1s^-1，即观察到的速率提高了约5倍，几乎与在10vol％的TFE中相同。

在290.2K下50mM的Bis-Tris溶液中，测定酰基转移反应二级速率常数与pH的关系。图2所示，为二级速率常数的对数与pH的关系曲线。反应对肽的浓度是一级反应。由图2可知，随着pH值的增大，二级速率常数也增大，这表明该反应取决于去质子形式的氨基酸残基。如果产物是由Orn-15与富马酸对硝基苯基酯直接反应而制得的，则二级速率常数的对数与pH在5-8范围内有线性的对应关系，而鸟氨酸残基的侧链的pKa可能在10-11之间(Tanford,C.,Adv.Protein Chem.1962,17,69-165)。不过，观察到的pH值证实该反应机理，并表明反应取决于pKa接近6.5的氨基酸残基。

RA-42的氨基酸序列中含有可离子化的残基Asp、Glu、Arg、Orn、Lys和His，以及肽骨架的C端的羧酸和N端的氨基。常用较小肽中可离子化的氨基酸残基的pKa已经测定出来(Tanford,C.,1962，如上所述)，在RA-42中pKa值接近6.5的氨基酸只有His，其pKa为6.4。His-11侧链的相应酸的pKa用¹H NMR光谱进行测定(在290K下，采用不同单位的500NMR光谱，测定组氨酸芳烃中质子化学位移随pH的变化关系)，研究发现，水溶液中pKa为6.55。因而，可以得出结论，由His-11的最初进攻而引起的富马酸对硝基苯基酯的起始酰基转移反应，可生成一种酰基中间体，并形成一种有反应活性的咪唑烷(imidazolide)。观察到的pH依赖关系也表明第一步骤为限速步骤。

4-甲基咪唑鎓离子的pKa已有测定，发现在水溶液303K下为7.95。在不依赖pH的范围内，二级速率常数可由pH值为5.85时所测得的数据计算而得，结果为1.33M^-1s^-1。在不依赖pH的范围内，RA-42的二级速率常数可由pKa为6.55测得的数据通过计算而得，在pH为5.85时，二级速率常数为0.305。因而，在不依赖pH的范围内，4-甲基咪唑的二级速率常数为RA-42速率常数的4.4倍。

但是，根据布朗斯特关系式(1)

logk₂=β*pKa+A   (1)(对于乙酸对硝基苯基酯的咪唑催化水解来说，β为0.8；Bruice,T.C.，等人，J.Am.Chem.Soc.1958,80,2265-2267)和如上所述的pKa值，4-甲基咪唑的二级速率常数预期为RA-42速率常数的13.2倍。因而，肽RA-42可3倍地催化His-11酰基化作用，可能主要是由于Orn-15侧链稳定过渡态中所形成的氧离子而引起的。

如上所述，在pH为5.85时，观察到的RA-42的速率试剂约为4-甲基咪唑的5倍。额外提高的速率是由于较强的亲核试剂4-甲基咪唑，比His-11侧链的质子化程度更高。在pH为5.85时，如果总浓度相同，则未质子化的His-11的浓度为未质子化4-甲基咪唑的21倍。这样，如果速率提高仅仅只受浓度的影响，则在pH为5.85时，RA-42应该是一种更为有效的催化剂，只提高1.6倍(21/13.2)。因而，观察到的速率提高应该归因于过渡态的稳定化作用和pKa的降低，这两种因素通常用来解释自然存在的催化剂。

由于最终产物为在Orn-15侧链上的酰胺，第二步反应是一种快速的分子间反应，酰基从His-11转移到去质子化型的Orn-15之上。分子间反应的速率提高是很高的，由于在反应条件下，在¹H NMR光谱中没有检测到中间体，但不能对它进行测定，因为His-11的酰基化为限速步骤。快速分子间反应且中间体没有发生聚集，与观察到的RA-42的一级动力学也是一致的。

如上所述，在一个高度选择的反应中，RA-42的组氨酸残基在Orn-15的侧链引入一个官能团，反应后又重新释放出游离组氨酸。而另一种鸟氨酸，Orn-34，则不能形成酰胺，也没有相邻的组氨酸残基。His-11与Lys-10邻近，从而占据了空间，在反应条件下，它也不能形成酰胺。

当然，本发明并不局限于上述特定的实施方案，但可以有不远离本发明主要思想的许多改进和变化，如下列的权利要求书如述。

                     序列表N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-K-A-L-A-E-H-Nle-Aib-A-K1                                          19

                                  G-P-V-D

                                  20   23G-Aib-R-A-F-A-E-F-A-K-A-L-Q-E-A-Nle-Q-A-Aib42                                       24

              SA-42N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-K-H-L-A-E-Orn-Nle-Aib-A-K1                                            19

                                    G-P-V-D

                                    20   23G-Aib-R-A-F-A-E-F-Orn-K-A-L-Q-E-A-Nle-Q-A-Aib42                                        24

              RA-42N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-A-Orn-L-A-E-H-Nle-Aib-A-K1                                            19

                                    G-P-V-D

                                    20   23G-Aib-R-A-F-A-E-F-Orn-A-A-L-Orn-E-A-Nle-Q-A-Aib42                                          24

              PA-42N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-K-H-L-A-E-H-Nle-Aib-A-H1                                          19

                                  G-P-V-D

                                  20   23G-Aib-R-A-F-A-E-F-H-K-A-L-H-E-A-Nle-H-A-Aib42                                      24

              KO-42