pH敏感性载体及其制造方法、以及含有该载体的pH敏感性药物、pH敏感性药物组合物及使用其的培养方法

摘要

本发明提供可成为生理活性物质的介载体的、应答于弱酸性环境而表现膜破坏功能促进效果的pH敏感性载体及其制造方法、以及含有该载体的pH敏感性药物、pH敏感性药物组合物、及使用其的培养方法。所述pH敏感性载体表现膜破坏功能促进效果，包含：选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少一种pH敏感性化合物；和选自碳原子数10～12的磷脂酰胆碱、碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α－生育酚中的至少一种两亲性物质。

说明书

技术领域

本发明涉及pH敏感性载体及其制造方法、以及含有该载体的pH 敏感性药物、pH敏感性药物组合物及使用其的培养方法。更详细而 言，本发明涉及作为DDS(药物递送系统，Drug Delivery System)有 用的、应答于弱酸性环境而表现膜破坏功能促进效果的pH敏感性载 体及其制造方法、以及含有该载体的pH敏感性药物、pH敏感性药物 组合物及使用其的培养方法。

背景技术

近年来，用于将生理活性物质以必需量送达到必需部位的DDS 介载体(载体)的研究盛行。从积聚性的提高、对送达部位的选择的 观点出发，刺激应答性介载体备受瞩目，报道了大量利用热或磁力等 外部刺激、分子识别、pH变化、酶反应等生物体内的刺激的研究等。 其中，对弱酸性的pH具有敏感性的介载体长期以来备受瞩目。

例如，作为应答于弱酸性环境的pH敏感性载体，在含有PE(磷 脂酰乙醇胺，Phosphatidylethanolamine)的脂质体中加入PHC(棕榈 酰同型半胱氨酸，Palmitoyl Homocyseine)、油酸、CHEMS(胆固醇 琥珀酸单酯，Cholesteryl Hemisuccinate)等各种pH敏感性材料而得 到的pH敏感性脂质体(S.Simoes et al.Adv.Drug Deli.Rev.2004 56  947-965等)是广为人知的。最近，为了提高功能，报道了PEAA(聚 (2-乙基丙烯酸)，Poly(2-ethylacrylic Acid))、SucPG(Succinylated  Poly(glycidol))等新型合成材料，GALA、pHLIP(pH Low Insertion  Peptide)等合成肽，PLGA(Poly(Lactic-co-glycolic Acid))等生 物降解性的材料，使用了pH敏感性的病毒成分的VLP(病毒样颗粒， Virus Like Particle)、病毒颗粒(Virosome)等的研究。

另外，对于pH敏感性的介载体，也期待生理活性物质被高效地 送达至肿瘤、炎症等生物体内pH下降的部位(Reshetnyak et al.PNAC 2007vol，104，19，7893-7898)，或者利用被细胞摄取后的小泡的 酸性化而向细胞质基质送达等。

作为利用小泡的酸性化而向细胞质基质的送达，发现通过在被送 达至核内体时介载体的膜融合被促进，这可促进药物向细胞质基质的 迁移，已报道了具有应答于pH而改变结构的pH敏感性部位、膜融 合的部位和膜贯通部位的肽衍生物的DDS介载体(日本特开 2006-34211号公报)。

如上所述的生理活性物质向细胞质基质的送达可应用于各种领 域，因此是极其希望实现的技术。例如，向RNA或DNA的细胞质基 质的送达能够进行基因治疗，期待通过将抗原送达细胞质基质从而诱 导CTL(细胞毒性T淋巴细胞，Cytotoxic T Lymphocyte)。另外， 有报道称低分子抗癌剂的细胞质基质送达具有提高活性的效果，也研 究了对于将细胞内作为药物靶标的新型药剂的应用。生理活性物质向 细胞质基质的送达是这些领域的主要课题，是实现上述目标的关键性 技术。

而且，因为利用在pH6以下具有敏感性的pHLIP的向酸中毒 (acidosis)部位送达已有成功事例(Reshetnyak et al.PNAC 2007vol， 104，19，7893-7898)，以及因为核内体内的到达pH为4左右(S.Simoes  et al.Adv.Drug Deli.Rev.2004 56 947-965)，因此要求pH敏感性的载 体在从中性至pH4之间具有高敏感性。关于这一点正如在很多文献中 已被指出。此外，考虑到实用的情况，由安全的材料形成也很重要。

发明内容

许多pH敏感性脂质体和一部分生物降解性材料等存在下述问 题：在比较低的pH条件下具有敏感性、仅具有不充分的功能。另外， 直接修饰pH敏感性物质的方法有可能降低生理活性物质的活性。此 外，从安全性的观点考虑，使用新型的合成材料、使用病毒成分尚存 悬念。

因此，本发明鉴于上述情况而完成，目的在于提供能够成为生理 活性物质的介载体的、应答于弱酸性环境而表现膜破坏功能促进效果 的pH敏感性载体及其制造方法、以及含有该载体的pH敏感性药物、 pH敏感性药物组合物及使用其的培养方法。

为了达成上述目的的本发明为(1)一种pH敏感性载体，其表现 膜破坏功能促进效果，包含：选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅 脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草 亭酸及它们的盐中的至少一种pH敏感性化合物；和选自碳原子数 10～12的磷脂酰胆碱、碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪 酸酯、碳原子数16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二 月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及 α-生育酚中的至少一种两亲性物质。

此外，为了达成上述目的的本发明为(2)如上述(1)所述的pH 敏感性载体，其中，上述pH敏感性化合物和上述两亲性物质形成胶 束状的粒子。

进而，为了达成上述目的的本发明为(3)如上述(2)所述的pH 敏感性载体，其中，粒径为10～200nm。

此外，为了达成上述目的的本发明为(4)如上述(1)～(3)中 任一项所述的pH敏感性载体，其中，上述pH敏感性化合物相对于 上述两亲性化合物100摩尔以10摩尔以上的比例被含有。

进而，为了达成上述目的的本发明为(5)如上述(1)～(4)中 任一项所述的pH敏感性载体，其中，将溶出性试验中的pH敏感性 化合物单独的溶出率作为La，将两亲性物质单独的溶出率作为Lb， 将pH敏感性载体的溶出率作为Lc，将pH7.4的溶出率分别表示为 Lc_7.4、La_7.4、Lb_7.4，将pH5.0或4.5的溶出率分别表示为Lc_x、La_x、 Lb_x时，下述式(1)表示的Δ为5以上，下述式(2)表示的Δ’为5 以上。

式(1) Δ＝(Lc_x-Lc_7.4)-(La_x-La_7.4)

式(2) Δ'＝Lc_x-(La_x+Lb_x)

另外，为了达成上述目的的本发明为(6)一种pH敏感性药物， 其中，是上述(1)～(5)中任一项所述的pH敏感性载体载带生理活 性物质而形成的。

进而，为了达成上述目的的本发明为(7)如上述(6)所述的pH 敏感性药物，其中，上述生理活性物质为蛋白质或肽。

另外，为了达成上述目的的本发明为(8)一种pH敏感性药物组 合物，包含上述(1)～(5)中任一项所述的pH敏感性载体及生理活 性物质。

进而，为了达成上述目的的本发明为(9)如上述(8)所述的pH 敏感性药物组合物，其中，上述生理活性物质为蛋白质或肽。

另外，为了达成上述目的的本发明为(10)一种pH敏感性载体 的制造方法，所述pH敏感性载体表现膜破坏功能促进效果，所述方 法包括使pH敏感性化合物与两亲性物质缔合的步骤，所述pH敏感 性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧 胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中 的至少一种，所述两亲性物质为选自碳原子数10～12的磷脂酰胆碱、 碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16～18 的失水山梨糖醇脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂 酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少一 种。

进而，为了达成上述目的的本发明为(11)一种培养方法，包括 在下述培养基中培养细胞的步骤，所述培养基含有上述(6)或(7) 所述的pH敏感性药物及/或上述(8)或(9)所述的pH敏感性药 物组合物。

附图说明

[图1A]图1A为本发明的pH敏感性载体及该载体载带生理活性 物质而成的药物的示意图。

[图1B]图1B为在使用pH敏感性药物的情况，pH敏感性载体 表现膜破坏功能促进作用，由此将pH敏感性载体所载带的生理活性 物质递送到细胞质基质中的示意图。

[图1C]图1C为使用pH敏感性药物组合物的情况，pH敏感性 载体表现膜破坏功能促进作用，由此将与pH敏感性载体混合的生理 活性物质递送到细胞质基质中的示意图。

[图2A]图2A为以各种浓度含有脱氧胆酸的、含有EYPC(蛋黄 磷脂酰胆碱，Egg Yolk Phosphatidylcholine)和脱氧胆酸的分散液的 照片。

[图2B]图2B为以各种浓度含有脱氧胆酸的、含有DLPC(二月 桂酰基卵磷脂，Dilauroyl Phosphatidylcholine)和脱氧胆酸的分散液 的照片。

[图2C]图2C为表示含有EYPC和脱氧胆酸的分散液的透过度 的图表。

[图2D]图2D为表示含有DLPC和脱氧胆酸的分散液的透过度 的图表。

[图3]图3为表示含有EYPC和脱氧胆酸的分散液的ζ电势相对 于脱氧胆酸量的图表。

[图4]图4为表示各种pH条件下的EYPC单独、DLPC单独、 脱氧胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸复合体及DLPC-脱氧胆酸复合体的 溶出率的图表。

[图5]图5(A)为表示与经双重荧光标记的脂质体进行孵育时， 各种pH条件下的EYPC单独、DLPC单独、脱氧胆酸单独、EYPC- 脱氧胆酸复合体及DLPC-脱氧胆酸复合体的荧光强度比的图表，图5 (B)为表示脱氧胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸复合体及DLPC-脱氧胆 酸复合体的融合率的图表。

[图6]图6为表示DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺，Dioleoyl  Phosphatidyletanolamine)-Chems脂质体、DOPE-油酸脂质体、及 DLPC-脱氧胆酸复合体的溶出率相对于各种pH的图表。

[图7]图7(A)及(B)为表示脱氧胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸 复合体及DLPC-脱氧胆酸复合体的融合率相对于脱氧胆酸量的图表。

[图8]图8(A)为表示脱氧胆酸单独、DSPC(二硬脂酰磷脂酰 胆碱，Distearoyl Phosphatidylcholine)-脱氧胆酸复合体、DPPC(二 棕榈酰磷脂酰胆碱，Dipalmitoyl Phosphatidylcholine)-脱氧胆酸复合 体、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，Dimyristoyl Phosphatidylcholine) -脱氧胆酸复合体、DLPC-脱氧胆酸复合体、及DDPC(二癸酰磷脂 酰胆碱，Didecanoyl Phosphatidylcholine)-脱氧胆酸复合体的融合率 的图。图8(B)为表示脱氧胆酸单独、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱， Hydrogeneted Soybean Phosphatidylcholine)-脱氧胆酸复合体、DOPC (二油酰磷脂酰胆碱，Dioleoyl Phosphatidylcholine)-脱氧胆酸复合 体及POPC(1-棕榈酰基2-油酰基磷脂酰胆碱，1-Palmitoyl 2-Oleoyl  Phosphatidylcholine)-脱氧胆酸复合体的融合率的图表。

[图9]图9(A)为表示脱氧胆酸单独、DLPE(二月桂酰磷脂酰 乙醇胺，Dilauroyl Phosphatidyletanolamine)单独、DMPE(二肉豆蔻 酰磷脂酰乙醇胺，Dimyristoyl Phosphatidyletanolamine)单独、DSPE (二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，Distearoyl Phosphatidyletanolamine)单独、 及DOPE单独的溶出率的图表。图9(B)为表示脱氧胆酸单独、DLPE- 脱氧胆酸复合体、DMPE-脱氧胆酸复合体、DSPE-脱氧胆酸复合体、 及DOPE-脱氧胆酸复合体的溶出率的图表。

[图10]图10为表示pH5.0条件下的脱氧胆酸与高分子材料的复 合体的溶出率的图表。

[图11]图11为表示EYPC与脱氧胆酸与DLPC或SPAN85的复 合体在(A)pH7.4、(B)pH5.0条件下的溶出率的图表。

[图12]图12为表示DLPC与各种备选化合物的复合体在(A) pH7.4、(B)pH5.0条件下的溶出率的图表。

[图13]图13为表示各种pH条件下的DLPC与各种备选化合物 的复合体的溶出率的图表。

[图14]图14为表示(A)各种pH敏感性化合物单独、(B)DLPC 与各种pH敏感性化合物的复合体的融合率的图表。

[图15]图15为在(A)pH7.4、(B)pH5.3的介质中孵育经荧 光标记的DLPC-脱氧胆酸复合体与HeLa细胞时的显微镜照片。另外， (C)为使用流式细胞仪进行了评价的细胞的荧光强度。

[图16]图16为表示pH7.4及pH5.0条件下掺入了(A)肽、(B) 蛋白质的载体的溶出率的图表。

[图17]图17为表示pH7.4及pH5.0条件下掺入了肽及蛋白质的 (A)DLPC-脱氧胆酸复合体、(B)DLPC-熊脱氧胆酸复合体的融 合率的图表。

[图18]图18为(A)荧光标记肽单独的溶液、(B)含荧光标 记肽的DLPC单独的溶液、(C)含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复 合体的溶液、及(D)含荧光标记肽的DLPC-熊脱氧胆酸复合体的溶 液的照片。

[图19]图19为摄取了(A)荧光标记肽单独、(B)含荧光标 记肽的DLPC单独、(C)含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体的 细胞的荧光显微镜照片。

[图20]图20为摄取了含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体的 细胞的(A)显微镜照片及(B)荧光显微镜照片、以及摄取了含荧 光标记肽的DLPC-熊脱氧胆酸复合体的细胞的(C)显微镜照片及(D) 荧光显微镜照片。

[图21]图21为对β-gal向细胞质基质的递送的评价结果，其为 (A)β-gal单独、(B)含β-gal的DLPC-脱氧胆酸复合体、及(C) 含β-gal的DLPC-熊脱氧胆酸复合体的评价结果。

[图22A]图22A为对分别独立地使用pH敏感性载体及生理活性 物质时向细胞质基质递送的研究结果，其为(A)荧光标记肽-FITC 单独、(B)荧光标记OVA-FITC单独、(C)荧光标记肽-FITC及 EYPC-脱氧胆酸复合体的并用、(D)荧光标记OVA-FITC及EYPC- 脱氧胆酸复合体的并用、(E)荧光标记肽-FITC及DLPC-脱氧胆酸 复合体的并用、(F)荧光标记OVA-FITC及DLPC-脱氧胆酸复合体 的并用、(G)荧光标记肽-FITC及SPAN80-脱氧胆酸复合体的并用、 (H)荧光标记OVA-FITC及SPAN80-脱氧胆酸复合体的并用、(I) 荧光标记肽-FITC及DDPC-脱氧胆酸复合体的并用、(J)荧光标记 OVA-FITC及DDPC-脱氧胆酸复合体的并用的细胞培养环境下得到 的、将显微镜照片与荧光显微镜照片重合的图像。

[图22B]图22B为对分别独立地使用pH敏感性载体及生理活性 物质时向细胞质基质递送的研究结果，其为(K)荧光标记肽-FITC 及PEG10蓖麻油-脱氧胆酸复合体的并用、(L)荧光标记OVA-FITC 及PEG10蓖麻油-脱氧胆酸复合体的并用、(M)荧光标记肽-FITC 及Tween20-脱氧胆酸复合体的并用、(N)荧光标记OVA-FITC及 Tween20-脱氧胆酸复合体的并用、(O)荧光标记肽-FITC及 Tween80-脱氧胆酸复合体的并用、(P)荧光标记OVA-FITC及 Tween80-脱氧胆酸复合体的并用、(Q)荧光标记肽-FITC及α-生育 酚-脱氧胆酸复合体的并用、(R)荧光标记OVA-FITC及α-生育酚 -脱氧胆酸复合体的并用、(S)荧光标记肽-FITC及DLPC-熊脱氧 胆酸复合体的并用、(T)荧光标记OVA-FITC及DLPC-熊脱氧胆 酸复合体的并用的细胞培养环境下得到的、将显微镜照片与荧光显微 镜照片重合的图像。

[图22C]图22C为对分别独立地使用pH敏感性载体及生理活性 物质时向细胞质基质递送的研究结果，其为(U)荧光标记肽-FITC 及DLPC-甘草酸复合体的并用、(V)荧光标记OVA-FITC及DLPC- 甘草酸复合体的并用、(W)荧光标记肽-FITC及DLPC-鹅脱氧胆酸 复合体的并用、(X)荧光标记OVA-FITC及DLPC-鹅脱氧胆酸复 合体的并用、(Y)荧光标记肽-FITC及DLPC-猪脱氧胆酸复合体的 并用、(Z)荧光标记OVA-FITC及DLPC-猪脱氧胆酸复合体的并 用、(AA)荧光标记肽-FITC及DLPC-甘氨脱氧胆酸复合体的并用、 以及(AB)荧光标记OVA-FITC及DLPC-甘氨脱氧胆酸复合体的并 用的细胞培养环境下得到的、将显微镜照片与荧光显微镜照片重合的 图像。

具体实施方式

本发明涉及一种表现膜破坏功能促进效果的pH敏感性载体，其 包含：选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、 高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少 一种pH敏感性化合物；和选自碳原子数10～12的磷脂酰胆碱、碳原 子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16～18的失 水山梨糖醇脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘 油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少一种两 亲性物质。以下，将pH敏感性载体也简称为“载体”、“缔合体”或“复 合体”。需要说明的是，本说明书中，两亲性物质中的“碳原子数”， 是指构成两亲性物质的疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。

根据本发明，可以提供安全性高、具有对pH的高敏感性的pH 敏感性载体。

需要说明的是，本发明中，所谓“膜破坏功能”，是指在溶出性试 验中引起溶出的功能。此处，本说明书中的溶出性试验是如下进行的 试验：将包封有含消光物质和荧光物质的水溶液的脂质体(分散液)、 和pH敏感性载体或者pH敏感性化合物单独或两亲性化合物单独等 的评价样品分散液添加到调制为具有规定的pH的水溶液中，将该水 溶液在37℃下孵育90分钟或30分钟，然后测定该水溶液的荧光。利 用该方法，能够测定从脂质体溶出的荧光物质的量，能够确认pH敏 感性载体的脂质体的膜破坏功能。需要说明的是，关于溶出性试验， 在后述的实施例中详细说明。

此外，所谓“表现膜破坏功能促进效果”，是指满足以下两者：(1) 在溶出性试验中，与生理pH条件下的溶出率相比，在低于生理pH 的规定pH条件下的溶出率上升，并且其上升幅度大于使用pH敏感 性化合物单独进行实验时的上升幅度，及(2)在低于该生理pH的规 定pH的溶出性试验中，pH敏感性化合物与两亲性物质形成复合体 (pH敏感性载体)时的溶出率大于pH敏感性化合物单独的溶出率与 两亲性物质单独的溶出率之和。更具体而言，所谓表现膜破坏功能促 进效果，是指在pH7.4、以及pH5.0或pH4.5的溶出性试验中，pH敏 感性载体(pH敏感性化合物和两亲性物质的复合体)的溶出率Lc、 与pH敏感性化合物单独的溶出率La和两亲性物质单独的溶出率L， 满足下述两种关系。即，上述(1)用下述式(1)表示，上述(2) 用下述式(2)表示。需要说明的是，下述式中，将pH7.4的溶出率 分别表示为Lc_7.4、La_7.4、Lb_7.4，将pH5.0或4.5的溶出率分别表示为 Lc_x、La_x、Lb_x。

式(1)Δ＝(Lc_x-Lc_7.4)-(La_x-La_7.4)>0

式(2)Δ’＝Lc_x-(La_x+Lb_x)>0

上述式(1)中，Δ只要大于0即可，但优选为5以上，更优选 为10以上，进一步优选为30以上。另外，上述式(2)中，Δ’只要 大于0即可，但优选为5以上，更优选为10以上，进一步优选为15 以上。

优选地，上述式(1)及上述式(2)中Δ及Δ’分别为5以上的 pH敏感性载体，且该载体含有胆汁酸和脂质。还优选地，上述式(1) 及上述式(2)中Δ及Δ’分别为5以上、且含有甘草酸或甘草亭酸和 脂质的pH敏感性载体。

本说明书中，所谓“生理pH”，是指正常组织、正常体液中的pH。 生理pH通常为7.4，根据正常组织、正常体液的不同稍微(±0.1)不 同。另外，所谓“低于生理pH的规定pH”，只要低于pH7.4即可，优 选pH3.0以上、低于pH7.4，更优选pH4.0以上、低于pH7.3，进一 步优选pH4.5以上、低于pH7.0。

本发明的pH敏感性载体表现膜破坏功能促进效果的机制尚不明 确，但推测如下。需要说明的是，本发明并不受下述推测的限定。

认为本发明的pH敏感性载体是在水性溶液中、在生理pH以上， 由pH敏感性化合物和两亲性物质缔合而形成的。

图1A表示本发明的pH敏感性载体及该pH敏感性载体载带生理 活性物质而成的pH敏感性药物的示意图。如图1A所示，认为本发 明的pH敏感性载体是pH敏感性化合物缔合至构成两亲性物质的疏 水性部分而形成的。另外，本发明的pH敏感性载体可以在载体的内 部包封生理活性物质。需要说明的是，pH敏感性载体的该缔合形式 是推测的，本发明的pH敏感性载体并不限定于该缔合形式。另外， pH敏感性载体的该载带形式也是推测的，本发明的pH敏感性载体并 不限定于该载带形式。

认为：周边环境变为低于生理pH的情况下，pH敏感性化合物与 两亲性物质的缔合形态发生变化，其结果，pH敏感性载体具有膜破 坏功能促进效果。推测如下：例如，在存在pH敏感性载体和生物膜 (例如细胞膜、小泡膜等)的体系中，pH低于生理pH时，pH敏感 性载体的缔合形态发生变化，与生物膜接触后，由该变化诱发生物膜 的膜结构也发生变化。即，pH敏感性载体诱发生物膜的膜结构变化。 认为这是因为：由于pH变为弱酸性，pH敏感性载体中的pH敏感性 化合物在该载体的结构中变得不稳定，其结果，pH敏感性载体与体 系内存在的生物膜进行重排，表现出膜破坏功能促进效果。另外，换 言之，认为pH敏感性化合物为下述分子：pH变为弱酸性时，由于质 子化而使得其向疏水缔合中的溶解性改变。即，可以认为，含有pH 敏感性化合物的疏水缔合能够应答于弱酸性环境而表现功能。需要说 明的是，所谓“膜破坏”，是称呼如上所述膜结构的变化的用语，膜构 成成分可以不全部进行分离或分解。通过产生这样的“膜破坏”，可被 含有于生物膜(例如核内体)膜内部的成分溶出到生物膜的外部(例 如细胞质基质)等。

对于本发明的pH敏感性载体，优选地，溶出性试验中的溶出率 在pH7.4时小于20％，并且在pH4.0时大于20％。另外，更优选地， 溶出性试验中的溶出率在pH6.5时小于20％，并且在pH4.0时大于 20％。另外，上述中，pH7.4或pH6.5时的溶出率更优选为15％以下， 进一步优选为10％以下。另外，pH4.0时的溶出率更优选为40％以上， 进一步优选为50％以上。通过使pH敏感性载体的溶出率为上述范围， 可进一步发挥表现在弱酸性pH条件下的膜破坏功能促进效果的作 用。

另外，除表现膜破坏功能促进效果外，本发明的pH敏感性载体 还能够表现膜融合功能促进效果。

本发明中，所谓“膜融合功能”，是指膜融合试验中引起膜融合的 功能。此处，本说明书中的膜融合试验如下所述：在调制成规定pH 的水溶液中添加将2种荧光物质掺入到双分子膜而得到的脂质体(分 散液)、以及pH敏感性载体或者pH敏感性化合物单独或两亲性化 合物单独等的评价样品分散液，将该水溶液在37℃下孵育60分钟， 然后测定该水溶液的荧光。通过该方法，能够测定掺入到脂质体中的 2种荧光物质的能量共振转移的变化，能够确认pH敏感性载体的膜 融合功能。需要说明的是，对于膜融合试验，在后述的实施例中详细 说明。

另外，所谓“表现膜融合功能促进效果”，是指在膜融合试验中， 与生理pH条件下的融合率相比，在低于生理pH的规定的pH条件下 的融合率上升，并且其上升幅度大于pH敏感性化合物单独实验时的 上升幅度。更具体而言，表现膜融合功能促进效果是指：在pH7.4和 pH5.0的膜融合试验中，pH敏感性载体(pH敏感性化合物和两亲性 物质的复合体)的融合率Rc(％)与pH敏感性化合物单独的融合率 Ra(％)满足下述式(3)的关系。需要说明的是，下述式中，将pH7.4 的融合率分别表示为Rc_7.4、Ra_7.4，将pH5.0的融合率分别表示为Rc_x、 Ra_x。

式(3) ΔR＝(Rc_x–Rc_7.4)–(Ra_x–Ra_7.4)>0

上述式(3)中，ΔR大于0即可，但优选为2以上，更优选为5 以上，进一步优选为10以上。

上述式(3)中ΔR为2以上、且含有胆汁酸和脂质的pH敏感性 载体是优选的。

本发明的pH敏感性载体在弱酸性pH(低于生理pH的规定pH) 条件下表现膜融合功能促进效果，但其机制尚不明确，可以认为是与 上述膜破坏功能促进效果为同样的机制。需要说明的是，本发明并不 受该推测的限定。

即推测：在周边环境低于生理pH时，本发明的pH敏感性载体 中，pH敏感性化合物和两亲性物质的缔合形态发生变化，与体系内 存在的生物膜进行重排，由此膜融合。此时，膜融合是在相互间具有 亲和性的成分之间进行重排，因此，与生物膜没有亲和性、或亲和性 低的成分(例如生理活性物质)从被重排的膜中被排除、释放。

通常，细胞外分子被作为生物膜之一的核内体(endosome)包围 而被摄取进细胞。之后，由于质子泵的作用，核内体内部的pH下降。 进而，核内体与含有水解酶的溶酶体融合，细胞外分子被分解。因此， 细胞外分子基本不被递送到细胞质基质内。

相对于此，本发明中，如图1B、图1C所示，pH敏感性载体(pH 敏感性药物或pH敏感性药物组合物)被核内体包围而被摄取进细胞 时，同样地被导入pH降低后的环境。从而，伴随pH的降低(酸性 化)，pH敏感性化合物使pH敏感性载体不稳定，在核内体与pH敏 感性载体之间发生膜的重排。其结果，产生由pH敏感性载体引起的 膜破坏功能(根据情况，与膜融合功能一并表现的膜破坏功能)。

如图1B、图1C中所示例那样，通过利用本发明所述的pH敏感 性载体，可以将生理活性物质等递送到细胞质基质内。具体而言，在 使用pH敏感性药物的情况下，使用在pH敏感性载体内部包封的生 理活性物质(图1B)或pH敏感性药物组合物的情况下，与pH敏感 性载体一并使用的生理活性物质(图1C)与pH敏感性载体一同被核 内体包围，被摄取进细胞。若核内体内部的pH降低，则pH敏感性 化合物使pH敏感性载体不稳定，在核内体和pH敏感性载体之间发 生膜的重排。其结果，产生由pH敏感性载体引起的核内体的膜破坏。 由此，生理活性物质被释放进胞质基质。即，能够在不使生理活性物 质分解的情况下递送到细胞质基质内。

另外，本发明的pH敏感性载体优选在水性介质中形成含有pH 敏感性化合物和两亲性物质的复合体。这些复合体的形态没有特别限 制，既可以是pH敏感性化合物和两亲性物质形成膜，也可以是pH 敏感性化合物的一部分或全部通过缔合等被埋入两亲性物质形成的 结构中。另外，本发明的pH敏感性载体中，pH敏感性化合物和两亲 性物质优选形成胶束状的粒子，但也可以形成脂质体等粒子状的载 体。另外，考虑到EPR效果(Enhanced Permeation and Retention  Effect)、基于内吞作用的细胞摄取时，胶束状的粒子优选粒径为 10～200nm，更优选为10～100nm。需要说明的是，本说明书中，所谓 胶束状的粒子，是指pH敏感性化合物和两亲性物质通过疏水性相互 作用缔合成粒状的粒子，典型地为单分子膜结构的粒子，不包括形成 脂质双分子膜结构(例如脂质体)的粒子。另外，本说明书中，pH 敏感性载体的粒径可以利用动态光散射法(MALVERN Instruments 公司制，NanoZS90)进行测定。

需要说明的是，在含有本发明的pH敏感性载体的水性溶液中， 只要存在有pH敏感性载体，pH敏感性化合物或两亲性物质不形成缔 合体而以游离的状态存在也是可以的。

以下，说明构成本发明的pH敏感性载体的各成分。

＜pH敏感性载体的构成成分＞

(pH敏感性化合物)

作为本发明中使用的pH敏感性化合物，为选自脱氧胆酸、胆酸、 熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、 甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少一种。作为pH敏感性化合物 的盐，没有特别限定，可以举出锂、钠、钾等碱金属盐，镁、钙、钡 等碱土金属盐，铵盐等。这些pH敏感性化合物可以单独使用，也可 以并用2种以上使用。

作为pH敏感性化合物，优选脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆 酸、猪脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘草亭酸或它们的盐，较优选脱氧 胆酸、熊脱氧胆酸、甘草亭酸或它们的盐。

本发明中优选使用的脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、 猪脱氧胆酸、高级胆汁酸及甘氨脱氧胆酸统称为胆汁酸。胆汁酸作为 代表性的甾族化合物衍生物，从1920年代以前就为人们已知，其被 利用于细菌学的领域中。胆汁酸在人的机体内与胆固醇、脂质、脂溶 性维生素形成复合体，具有辅助它们的吸收的作用。另外，胆汁酸因 其具有的物理化学性质而可以与脂质、蛋白质、疏水的材料形成复合 体，因此长期以来用于蛋白质的分离纯化，以及用作增溶剂、乳化剂。 最近，其在疫苗的制造工序的用途、作为借助胆汁酸转运蛋白的药剂 的吸收促进剂也受到瞩目。特别地，脱氧胆酸钠(别名去氧胆酸钠) 和熊脱氧胆酸(别名熊去氧胆酸)作为能够注射给人的药品添加物具 有实际成果，确认到优异的安全性。因此，作为本发明的pH敏感性 化合物，更优选使用脱氧胆酸、熊脱氧胆酸或其盐(例如钠盐)。

优选地，pH敏感性化合物相对于100摩尔两亲性物质而言以10 摩尔以上的比例被含有。更优选地，相对于100摩尔两亲性物质而言， 为10～640摩尔，进一步优选为20～320摩尔，特别优选为20～160摩 尔。

(两亲性物质)

作为本发明中使用的两亲性物质，为选自碳原子数10～12的磷脂 酰胆碱、碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子 数16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、 二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的 至少一种。这些两亲性物质可以单独使用，也可以并用2种以上。需 要说明的是，本说明书中，两亲性物质中的“碳原子数”，是指构成两 亲性物质的疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。

作为碳原子数10～12的磷脂酰胆碱，优选具有饱和酰基的二酰基 磷脂酰胆碱，例如可以举出二癸酰基磷脂酰胆碱(DDPC；1，2-二癸 酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC； 1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱)。作为磷脂酰胆碱，可 以为天然来源或利用已知的方法合成的物质，还可以使用市售的物 质。

作为碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯，可以举 出聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitan  monolaurate)、聚氧乙烯山梨糖醇酐肉豆蔻酸酯(聚氧乙烯山梨糖醇 酐单肉豆蔻酸酯)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯(聚氧乙烯山梨 糖醇酐棕榈酸酯)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯(polyoxyethylene  sorbitan monostearate)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monooleate)等。作为聚氧乙烯的聚合度， 没有特别限制，与失水山梨糖醇加成了的聚氧乙烯链的总计的聚合度 优选为10～200，更优选为15～100，进一步优选为20～50。聚氧乙烯 山梨糖醇酐单脂肪酸酯可以使用合成品，也可以使用市售品。作为聚 氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯的市售品，可以优选使用例如作为 Tween20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween40(聚氧乙烯 山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween60(聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸 酯)、Tween80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)出售的物质。其中， 优选碳原子数16～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯(Tween40、 Tween60、Tween80)。

作为碳原子数16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯，可以举出失水山 梨糖醇单棕榈酸酯(sorbitan monopalmitate)、失水山梨糖醇单硬脂 酸酯(sorbitan monostearate)、失水山梨糖醇单油酸酯(sorbitan  monooleate)等失水山梨糖醇单脂肪酸酯，失水山梨糖醇三棕榈酸酯 (sorbitan tripalmitate)、失水山梨糖醇三硬脂酸酯(sorbitan tristearate)、 失水山梨糖醇三油酸酯(sorbitan trioleate)等失水山梨糖醇三脂肪酸 酯等。失水山梨糖醇脂肪酸酯既可以使用合成品，也可以使用市售品。 作为失水山梨糖醇脂肪酸酯的市售品，可以优选使用例如作为 SPAN40(失水山梨糖醇棕榈酸酯)、SPAN60(失水山梨糖醇硬脂酸 酯)、SPAN80(失水山梨糖醇油酸酯)、SPAN65(失水山梨糖醇三 硬脂酸酯)、SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)出售的物质。其中， 优选SPAN80，SPAN65、SPAN85。

作为本发明中使用的单油酸甘油酯(glyceryl monooleate)、二月 桂酸甘油酯(glyceryl dilaurate)、二硬脂酸甘油酯(glyceryl distearate)、 二油酸甘油酯(glyceryl dioleate)，为在甘油上通过酯键连接有1或 2分子的脂肪酸的酰基甘油，脂肪酸键合的部位没有特别限定。例如， 如果为作为单酰基甘油的单油酸甘油酯，则可以在甘油的C1位或C2 位通过酯键连接脂肪酸。另外，如果为作为二酰基甘油的二月桂酸甘 油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯，则只要在甘油的C1位及C2 位、或C1位及C3位通过酯键连接脂肪酸即可。例如，作为二月桂 酸甘油酯，优选C1位及C3位被取代的α,α’-二月桂酸酯。作为二硬 脂酸甘油酯、二油酸甘油酯，优选C1位及C2位被取代的二酰基甘 油。作为上述甘油衍生物，既可以使用合成品，也可以使用市售品。

作为聚氧乙烯蓖麻油，为在蓖麻油中加成了聚氧乙烯而得到的物 质。作为聚氧乙烯的聚合度，没有特别限制，优选为3～200，更优选 为5～100，进一步优选为10～50。聚氧乙烯蓖麻油既可以使用合成品， 也可以使用市售品。

作为α-生育酚，可以为天然来源或利用已知的方法合成的物质， 还可以使用市售的物质。

作为所述两亲性物质，优选碳原子数10～12的磷脂酰胆碱。其中， 特别优选碳原子数12的二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)。

(pH敏感性化合物及两亲性物质的组合)

本发明的pH敏感性载体通过pH敏感性化合物和两亲性物质的 组合，可以在期望的pH条件下表现膜破坏功能促进效果。此时，根 据pH敏感性化合物和两亲性物质的组合的不同，使得能够开始表现 出pH敏感性载体的膜破坏功能促进效果的pH不同。认为其原因在 于：根据pH敏感性化合物的不同pKa不同，并且与两亲性物质形成 缔合的形式根据pH敏感性化合物和两亲性物质的组合的不同而不 同。因此可以说，通过适当改变pH敏感性化合物和两亲性物质的组 合，能够对表现功能的pH进行选择，能够详细设定生物体内的递送、 及细胞内的递送。

本发明的pH敏感性载体中，作为pH敏感性化合物和两亲性物 质的组合，优选为：脱氧胆酸及DDPC、脱氧胆酸及DLPC、脱氧胆 酸及Tween20、脱氧胆酸及Tween40、脱氧胆酸及Tween60、脱氧胆 酸及Tween80、脱氧胆酸及SPAN40、脱氧胆酸及SPAN60、脱氧胆 酸及SPAN80、脱氧胆酸及SPAN65、脱氧胆酸及SPAN85、脱氧胆 酸及α-生育酚、脱氧胆酸及单油酸甘油酯、脱氧胆酸及二硬脂酸甘 油酯、脱氧胆酸及二油酸甘油酯、脱氧胆酸及二月桂酸甘油酯(α、α’- 二月桂酸酯)、脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、熊脱氧胆酸及DDPC、 熊脱氧胆酸及DLPC、熊脱氧胆酸及Tween20、熊脱氧胆酸及 Tween40、熊脱氧胆酸及Tween60、熊脱氧胆酸及Tween80、熊脱氧 胆酸及SPAN40、熊脱氧胆酸及SPAN60、熊脱氧胆酸及SPAN80、 熊脱氧胆酸及SPAN65、熊脱氧胆酸及SPAN85、熊脱氧胆酸及α-生 育酚、熊脱氧胆酸及单油酸甘油酯、熊脱氧胆酸及二硬脂酸甘油酯、 熊脱氧胆酸及二油酸甘油酯、熊脱氧胆酸及二月桂酸甘油酯(α、α’- 二月桂酸酯)、熊脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、甘草酸及DDPC、甘 草酸及DLPC、甘草酸及Tween20、甘草酸及Tween40、甘草酸及 Tween60、甘草酸及Tween80、甘草酸及SPAN40、甘草酸及SPAN60、 甘草酸及SPAN80、甘草酸及SPAN65、甘草酸及SPAN85、甘草酸 及α-生育酚、甘草酸及单油酸甘油酯、甘草酸及二硬脂酸甘油酯、 甘草酸及二油酸甘油酯、甘草酸及二月桂酸甘油酯(α、α’-二月桂酸 酯)、甘草酸及聚氧乙烯蓖麻油。

更优选为：脱氧胆酸及DDPC、脱氧胆酸及DLPC、脱氧胆酸及 Tween40、脱氧胆酸及Tween60、脱氧胆酸及Tween80、脱氧胆酸及 SPAN40、脱氧胆酸及SPAN65、脱氧胆酸及SPAN85、脱氧胆酸及α ‐生育酚、脱氧胆酸及单油酸甘油酯、脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、 熊脱氧胆酸及DDPC、熊脱氧胆酸及DLPC、熊脱氧胆酸及Tween40、 熊脱氧胆酸及Tween60、熊脱氧胆酸及Tween80、熊脱氧胆酸及 SPAN40、熊脱氧胆酸及SPAN65、熊脱氧胆酸及SPAN85、熊脱氧胆 酸及α‐生育酚、熊脱氧胆酸及单油酸甘油酯、熊脱氧胆酸及聚氧乙 烯蓖麻油、甘草酸及DDPC、甘草酸及DLPC、甘草酸及Tween40、 甘草酸及Tween60、甘草酸及Tween80、甘草酸及SPAN40、甘草酸 及SPAN65、甘草酸及SPAN85、甘草酸及α-生育酚、甘草酸及单油 酸甘油酯、甘草酸及聚氧乙烯蓖麻油。

(水性溶剂)

本发明的pH敏感性载体可以含在水性溶液中。需要说明的是， 以下，将含有pH敏感性载体的水溶液也称作“载体分散液”。

作为含有本发明的pH敏感性载体的水性溶液的溶剂，优选为含 有缓冲剂、NaCl、葡萄糖、蔗糖等糖类的水溶液。

作为缓冲剂，只要将含有pH敏感性载体的水性溶液的pH维持 在生理pH以上即可，可以合适地使用已知的缓冲剂，没有特别限定。 作为缓冲剂，可以使用例如磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷 酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲剂(Tris盐酸缓冲剂)、MES 缓冲剂(2-吗啉基乙磺酸缓冲剂)、TES缓冲剂(N-三(羟甲基) 甲基-2-氨基乙磺酸缓冲剂)、乙酸缓冲剂、MOPS缓冲剂(3-吗啉 基丙磺酸缓冲剂)、MOPS-NaOH缓冲剂、HEPES缓冲剂(4-(2- 羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲剂)、HEPES-NaOH缓冲剂等GOOD 缓冲剂、甘氨酸-盐酸缓冲剂、甘氨酸-NaOH缓冲剂、甘氨酰基甘氨 酸-NaOH缓冲剂、甘氨酰基甘氨酸-KOH缓冲剂等氨基酸系缓冲剂、 Tris-硼酸缓冲剂(Tris-borate buffer)、硼酸-NaOH缓冲剂、硼酸缓 冲剂等硼酸系缓冲剂、或咪唑缓冲剂等。其中，优选磷酸缓冲剂、柠 檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、Tris盐酸缓冲剂、MES缓冲剂、 乙酸缓冲剂、HEPES-NaOH缓冲剂。作为缓冲剂的浓度，没有特别 限制，优选0.1～200mM，更优选1～100mM。需要说明的是，本发明 中，所谓缓冲剂的浓度，是指水性溶液中含有的缓冲剂的浓度(mM)。

作为NaCl、葡萄糖、蔗糖等糖类的浓度，没有特别限制，优选 0.1～200mM，更优选1～150mM。

作为水性溶液中的pH敏感性载体的浓度，没有特别限制，pH敏 感性化合物和两亲性物质的总摩尔浓度优选为0.73μmol/L～7.4mmol /L，更优选为7.3μmol/L～6.5mmol/L，进一步优选为8.0μmol/ L～4.2mmol/L。

(其他成分)

对于本发明的pH敏感性载体而言，可以在pH敏感性载体中或 含有pH敏感性载体的水性溶液中包含稳定剂等其他成分。作为这些 成分的含量，只要不破坏pH敏感性载体即可，没有特别限制，相对 于两亲性物质100摩尔，优选为150摩尔以下，更优选为66.4摩尔以 下。

作为稳定剂，只要不破坏pH敏感性载体即可，没有特别限定， 可以使用例如1-辛醇、1-十二烷醇、1-十六烷醇(1-hexadodecanol)、 1-二十烷醇等饱和及不饱和的碳原子数4～20的醇；月桂酸、肉豆蔻 酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等饱和及不饱和的碳原子数12～18的脂肪 酸；辛酸甲酯(methyl octanoate)、辛酸乙酯(ethyl octanoate)、月 桂酸甲酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯、 油酸甲酯、油酸乙酯等饱和及不饱和的碳原子数8～18的脂肪酸烷基 酯(碳原子数1～3的烷基)；D(L)-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、 缬氨酸、苯丙氨酸等D(L)-氨基酸；甘油三己酸酯(tricaproin)、 甘油三辛酸酯(tricaprylin)等甘油三氨基酸酯(amino acid  triglycerides)；聚氧乙烯山梨糖醇酐三棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇 酐三油酸酯等碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐三脂肪酸酯(例 如，Tween65、Tween85)；聚氧乙烯月桂酸酯、聚氧乙烯肉豆蔻酸 酯、聚氧乙烯棕榈酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯等碳原子数12～18的聚氧 乙烯烷基酯(例如PEG20硬脂基醚、PEG23月桂基醚)；聚氧化烯 氢化蓖麻油(例如PEG10氢化蓖麻油、PEG40氢化蓖麻油、PEG60 氢化蓖麻油)；辛酸甘油酯(glycerol octenoate)、单癸酸甘油酯、 单月桂酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘 油酯、单油酸甘油酯等饱和及不饱和的碳原子数8～18的单脂肪酸甘 油酯；二辛酸甘油酯、二癸酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二肉豆蔻酸 甘油酯、二棕榈酸甘油酯等碳原子数8～16的二脂肪酸甘油酯；α-生 育酚乙酸酯、蓖麻油、大豆油、胆固醇、角鲨烯、角鲨烷、乳糖、抗 坏血酸棕榈酸酯、苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙 酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等已知的稳定剂。需要说 明的是，所谓“碳原子数”，是指构成疏水部的脂肪酸成分(酰基)的 碳原子数。

＜pH敏感性载体的制造方法＞

根据本发明，还可提供表现膜破坏功能促进效果的pH敏感性载 体的制造方法，所述方法包括使pH敏感性化合物与两亲性物质缔合 的步骤，所述pH敏感性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、 鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘 草亭酸及它们的盐中的至少一种，所述两亲性物质为选自碳原子数 10～12的磷脂酰胆碱、碳原子数12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪 酸酯、碳原子数16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二 月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及 α-生育酚中的至少一种。

作为使pH敏感性化合物与两亲性物质缔合的方法，只要pH敏 感性化合物和两亲性物质在水性溶液中接触即可。因此，本发明的pH 敏感性载体可以通过使pH敏感性化合物与两亲性物质在水性溶液中 接触而制造。具体而言，制作含有pH敏感性化合物和两亲性物质的 水性溶液，使用乳化器、漩涡混合器、超声波等剧烈搅拌该溶液并分 散，由此可以得到pH敏感性化合物和两亲性物质缔合而成的pH敏 感性载体。

作为制备含有pH敏感性化合物和两亲性物质的水性溶液的方 法，只要pH敏感性化合物与两亲性物质形成缔合体即可，没有特别 限制。例如，可以举出以下方法：(1)分别制备含有pH敏感性化合 物的水性溶液、及含有两亲性物质的水性溶液，将这些水性溶液混合， 使用乳化器、漩涡混合器、超声波等剧烈搅拌该溶液并使其分散，得 到pH敏感性载体的方法；(2)利用作为脂质体的制造法已知的薄膜 分散法(Bangham法)进行制备的方法。作为薄膜分散法，具体而言， 在玻璃容器中，将pH敏感性化合物及两亲性物质等pH敏感性载体 的构成成分溶解在有机溶剂(例如甲醇、氯仿)中，利用旋转蒸发仪 等除去有机溶剂，在玻璃容器的壁上形成薄膜。接着，将水性溶液加 入到形成了薄膜的玻璃容器中，在常温(5～35℃)下使薄膜膨润后， 在常温(5～35℃)下振荡玻璃容器。此时，使用乳化器、漩涡混合器、 超声波剧烈搅拌，可以使薄膜充分地分散在水性溶液中。另外，上述 的(1)制造方法中，可以在含有两亲性物质的水性溶液中混合pH敏 感性化合物。需要说明的是，作为水性溶液的溶剂，可以使用上述水 性溶液的溶剂。

需要说明的是，关于薄膜分散法的方法的详细说明，可以参考已 知的脂质体制造方法，《脂质体)(野岛庄七、砂本顺三、井上圭三 编，南江堂)及《生命科学中的脂质体)(ライフサイエンスにおけ るリポソーム)(寺田弘、吉村哲郎编、施普林格出版社东京)中对 其已有记载。

另外，作为pH敏感性载体中或含有pH敏感性载体的水性溶液 中可以含有的稳定剂等其他成分的添加方法，没有特别限制。例如， 既可以添加在含有pH敏感性化合物的水性溶液、或含有两亲性物质 的水性溶液中，也可以在制备薄膜时使其与pH敏感性载体的构成成 分一起溶解、使用含有这些成分的薄膜得到含有pH敏感性载体的水 性溶液。

如上所述得到的pH敏感性载体可以表现如上所述的膜破坏功能 促进效果，可适合用于DDS。

＜pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物＞

根据本发明的一个实施方式，还提供一种pH敏感性药物，是pH 敏感性载体载带至少一种生理活性物质而成的。

需要说明的是，本发明中，所谓载带，是指生理活性物质被载体 包封的形态、被插入载体的膜内的形态、或者直接结合或经由介质结 合在载体的表面的形态。此处，所谓结合，可以为共价键或离子键等 化学键，范德华结合或疏水结合等物理结合中的任一种。生理活性物 质可以为亲水性物质及疏水性物质中的任一种。生理活性物质为疏水 性物质时，优选以被pH敏感性载体包封或被插入pH敏感性载体的 膜内的形态载带，生理活性物质为亲水性物质时，优选以直接结合或 经由介质结合在载体的表面的形态载带。

本发明的pH敏感性载体可以载带生理活性物质，在低于生理pH 的环境下，通过表现pH敏感性载体的膜破坏功能促进效果，可以将 载带的生理活性物质递送到期望的部位。其机制尚不明确，但推测如 下(参见图1B)。需要说明的是，本发明不限定于下述推测。

本发明的pH敏感性载体载带生理活性物质而得到的pH敏感性 药物，由于细胞的内吞作用，被摄取到细胞内，形成含有pH敏感性 药物的核内体。然后，将核内体内引导为酸性环境。此时，在周围环 境达到低于生理pH(例如pH6.5)时，本发明的pH敏感性药物表现 出pH敏感性载体的膜破坏功能促进效果。即，pH敏感性载体的构成 成分和构成核内体的膜构成成分发生重排，存在于核内体内部的pH 敏感性载体载带的生理活性物质向细胞质基质内迁移。可以认为，由 此可以将生理活性物质直接递送至期望的细胞质基质，因此能够发挥 药理作用高的效果。

根据本发明的另一实施方式，提供一种含有pH敏感性载体及至 少一种生理活性物质的pH敏感性药物组合物。这种情况下，上述生 理活性物质与前文所述的实施方式中的pH敏感性药物不同，其(分 开)存在于pH敏感性载体的外部，而且生理活性物质与pH敏感性 载体不直接结合，也不经由介质结合。即，本实施方式的pH敏感性 药物组合物是pH敏感性载体及生理活性物质分别独立混合而成的。

本发明的pH敏感性载体及生理活性物质分别独立地混合的pH 敏感性药物组合物也能够通过在低于生理pH的环境下表现pH敏感 性载体的膜破坏功能促进效果，将生理活性物质递送期望的部位。其 机制尚不明确，但推测是基于与上述的pH敏感性载体载带生理活性 物质而成的pH敏感性药物同样的机制(参见图1C)。需要说明的是， 本发明并不限定于下述推测。

即，本实施方式的pH敏感性药物组合物，通过细胞内吞pH敏 感性载体而被摄取到细胞内。此时，关于生理活性物质，其也与pH 敏感性载体一同通过内吞作用被摄取到细胞内。其结果，在同一核内 体内形成分别独立地含有pH敏感性载体及生理活性物质的核内体。 之后，将核内体内引导为酸性环境，当周围环境达到低于生理pH(例 如pH6.5)时，表现出pH敏感性载体的膜破坏功能促进效果。然后， 核内体内部存在的生理活性物质向细胞质基质内迁移。由此，可以将 生理活性物质直接递送到期望的细胞质基质。

另外，本发明的pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物也可以 将生理活性物质效率良好地递送到肿瘤、炎症等生物体内pH降低的 部位。即，本发明的pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物在pH降 低的部位表现膜破坏功能促进效果，因而可以将生理活性物质选择性 地递送到炎症等的治疗部位。

pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物中使用的生理活性物质 的种类没有特别限定。例如，作为生理活性物质，可以举出核酸、低 分子化合物、蛋白质、肽。

作为上述核酸，可以举出siRNA、ODN(寡脱氧核苷酸)、DNA 等具有治疗效果的核酸。

作为上述低分子化合物，可以举出丝裂霉素、多西他赛、甲氨蝶 呤等细胞毒性剂；5-氨基乙酰丙酸、原卟啉IX等前体药物；更昔洛 韦、地塞米松、病毒唑、阿糖腺苷等抗炎剂；DOTA(1,4,7,10-四氮 杂环十四烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸， 1,4,7,10-tetraazacyclotetradecane-N,N’,N”,N”’-tetraaceticacid)、DTPA (1,4,7,10-四氮杂环癸烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸， 1,4,7,10-tetraazacyclodecane-N,N’,N”,N”’-tetraaceticacid)等造影剂； 依达拉奉(edaravone)等神经保护剂。

作为上述蛋白质，可以举出SOD(超氧化物歧化酶，Superoxide  dismutase)、靛酚氧化酶(indophenoloxidase)等氧化还原酶；IL-10 等细胞因子、b-FGF等生长因子、t-PA等的血栓溶解药、红细胞生 成素等激素、PSD(突触后密度蛋白，Postsynaptic density protein)、 FNK(抗细胞死亡因子，Anti cell death Factor)等细胞死亡抑制蛋白 质；Fab(Fragment)、IgG、IgE等抗体。

作为上述肽，可以举出环孢菌素A、JIP-1(JNK-互作蛋白1， JNK-interracting protein1)等肽药物。

关于上述知识，可适宜地参照在提出本申请时的技术常识。

另外，生理活性物质的量没有特别限定，可根据生理活性物质的 种类等适当选择。

作为使pH敏感性载体载带生理活性物质的方法，可以根据生理 活性物质的种类使用已知的方法。作为该方法，没有限定，例如作为 得到被载体包封的形态及被插入载体内的形态的方法，可以举出以下 方法：按照上述pH敏感性载体的制造方法形成pH敏感性载体后， 在含有生理活性物质的溶液中浸渍该pH敏感性载体，将生理活性物 质摄取到pH敏感性载体的内部的方法；在上述pH敏感性载体的制 造方法中形成有薄膜的容器内，投入含有生理活性物质的溶液，然后 形成缔合体，将生理活性物质封入内部的方法等。另外，作为获得直 接或介由介质结合在载体的表面的形态的方法，可以举出以下方法： 在作为载体的构成成分的pH敏感性化合物或两亲性物质中导入能与 期望的生理活性物质反应的官能团，然后，使其与生理活性物质反应， 由此得到结合有生理活性物质的pH敏感性载体的方法等。需要说明 的是，与所述生理活性物质的结合，可以在制备pH敏感性载体之前， 也可以在制备之后。

另外，作为混合pH敏感性载体及生理活性物质的方法，根据生 理活性物质的种类可以使用已知的方法。作为该方法，没有特别限制， 例如可以举出将载体及生理活性物质混合在水性溶剂、赋形剂等介质 中的方法等。

本发明的pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物可以含有其他 药物添加剂。pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物可以为片剂、粉 末、胶囊等固体制剂的形态，但优选注射制剂那样的液体制剂的形态。 该液体制剂可以以干燥制品(其在使用时用水或其他适当的赋形剂进 行再生)的形式提供。

关于上述片剂及胶囊，利用通常的方法实施肠溶包衣是令人期望 的。作为肠溶包衣，可以利用该领域中通常使用的物质。另外，胶囊 也可以含有粉末或液体中的任一者。

上述的pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物为液体制剂时， 药物添加剂可以含有溶剂(例如生理盐水、灭菌水、缓冲液等)、膜 稳定剂(例如胆固醇等)、等渗剂(例如氯化钠、葡萄糖、甘油等)、 抗氧化剂(例如生育酚、抗坏血酸、谷胱甘肽等)、防腐剂(例如氯 丁醇、对羟基苯甲酸酯(paraben)等)等。上述溶剂可以为在制造 pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物时使用的溶剂。

pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物为固体制剂时，药物添加 剂可以含有赋形剂(例如乳糖、蔗糖之类的糖类、玉米淀粉之类的淀 粉类、结晶纤维素之类的纤维素类、阿拉伯胶、硅铝酸镁、磷酸钙等)、 润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等)、粘合剂(例如甘露糖 醇、蔗糖之类的糖类、结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤 维素等)、崩解剂(例如马铃薯淀粉之类的淀粉类、羧基甲基纤维素 之类的纤维素类、交联聚乙烯吡咯烷酮等)、着色剂、矫味矫臭剂等。

pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物可通过直接或冻干后与 上述药物添加剂混合来制造。将pH敏感性药物及pH敏感性药物组 合物冻干时，可以在冻干前事先添加适当的赋形剂。

将本发明的pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物用于受试者 的治疗时的给予形态没有特别限定，例如可以举出口服给予、及静脉 内注射、动脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射、椎管内注 射、透皮给予或透皮吸收等非口服给予等。例如，使用肽及蛋白质作 为生理活性物质时，优选非口服途径，特别优选采用皮下注射、皮内 注射、肌肉内注射、静脉注射的给予。需要说明的是，对于pH敏感 性载体及生理活性物质分别独立地混合而成的pH敏感性药物组合 物，优选局部给予，具体而言，优选以皮下给予、皮内给予、肌肉内 给予的形态给予。

将本发明的pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物给予至受试 者，当pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物的外部环境变得低于 生理pH(例如pH6.5)时，本发明的pH敏感性药物及pH敏感性药 物组合物能够表现出膜破坏功能促进效果、或膜破坏功能促进效果及 膜融合功能促进效果，特异性且高效地释放生理活性物质。

因此，根据本发明，可以提供疾病的治疗或预防方法，包括对需 要治疗或预防的受试者口服或非口服给予有效量的上述pH敏感性药 物及pH敏感性药物组合物。

上述受试者优选为哺乳动物，特别优选为人。

作为上述疾病，例如可以举出前列腺癌、肺癌、大肠癌、肾癌、 胃癌、脑肿瘤、乳腺癌等癌；HIV(Human Immunodeficiency Virus)、 丙型肝炎、乙型肝炎等感染症疾病；阿尔茨海默氏病、帕金森病等中 枢神经疾病。

即，根据本发明的优选的一个实施方式，提供疾病的治疗或预防 方法。关于上述知识，可适宜地参照在提出本申请时的技术常识。

另外，本发明的一个实施方式中，pH敏感性药物及pH敏感性药 物组合物也可以通过培养、向细胞直接输送生理活性物质。即，根据 本发明的一个方式，提供一种用于向细胞输送生理活性物质的培养方 法。

上述培养方法包括在含有pH敏感性药物及/或pH敏感性药物 组合物的培养基中培养细胞的步骤。

作为上述pH敏感性药物及pH敏感性药物组合物，可以举出如 上所述的物质，即，pH敏感性载体载带至少一种生理活性物质而成 的pH敏感性药物，分别独立地含有pH敏感性载体及至少一种生理 活性物质的pH敏感性药物组合物。它们可以单独使用，也可以组合 2种以上使用。

作为上述培养基，没有特别限制，可以使用已知的培养基。具体 可以举出MEM、DMEM、RPMI等。

作为pH敏感性药物、pH敏感性药物组合物向上述培养基中的添 加量，没有特别限制，pH敏感性化合物和两亲性物质的总摩尔浓度 优选为0.73μmol/L～7.4mmol/L，更优选为7.3μmol/L～6.5mmol/ L，进一步优选为8.0μmol/L～4.2mmol/L。

另外，上述培养基的pH优选为7.0以上，更优选为7.2～7.8。培 养基的pH为7.0以上时，能够防止培养基中的构成pH敏感性载体的 pH敏感性化合物的不稳定，故优选。

作为上述细胞，没有特别限制，可以举出从受试者采集的细胞、 经细胞株化的培养细胞等。

此时，作为从上述受试者采集的细胞或经细胞株化的培养细胞的 具体例，可以举出树枝状细胞、NK(自然杀伤细胞，Natural Killer) 细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、淋巴细胞等。

上述细胞中，优选使用从受试者采集的细胞，更优选使用从受试 者采集的树枝状细胞、NK细胞、T细胞、淋巴细胞等。

使用从受试者采集的细胞时，可以通过采血、活组织检查等从受 试者采集该细胞。即，在一个实施方式中，上述培养方法可以包括从 受试者采集细胞的步骤。

需要说明的是，也可将培养的细胞给予受试者。由此，可以治疗 或预防受试者的疾病。即，本发明的一个实施方式中，提供疾病的治 疗或预防方法。

在优选的一个实施方式中，上述治疗或预防方法包括：从受试者 采集细胞的步骤；在含有pH敏感性药物及/或pH敏感性药物组合 物的培养基中对上述采集的细胞进行培养的步骤；和将上述经培养的 细胞给予上述受试者的步骤。

由此，可以治疗或预防疾病。需要说明的是，上述疾病如上所述。

实施例

以下，举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实 施例的任何限定。

＜原料＞

实施例中，使用下述化合物。试剂名和产品名相同的情况下产品 名省略。

·EYPC(非氢化蛋黄磷脂酰胆碱：日油公司制、COATSOME  NC-50)

·HSPC(大豆磷脂酰胆碱：日油公司制、COATSOME NC-21)

·DDPC(1，2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油公司 制、COATSOME MC-1010)

·DLPC(1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油公 司制、COATSOME MC-1212)

·DMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油 公司制、COATSOME MC-4040)

·DPPC(1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油公司 制、COATSOME MC-6060)

·DSPC(1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油公司 制、COATSOME MC-8080)

·DOPC(1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油公司制、 COATSOME MC8181)

·POPC(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱：日油公 司制、COATSOME MC6081)

·DLPE(1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公 司制、COATSOME ME-2020)

·DMPE(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油 公司制、COATSOME ME4040)

·DSPE(1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公司 制、COATSOME ME8080)

·DOPE(1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公司制、 COATSOME ME-8181)

·Chems(胆固醇琥珀酸单酯：Nacalai Tesque公司制)

·NBD-PE(1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N(7-硝 基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)铵：Avanti polar lipids公司制)

·Rh-PE(1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺 碱性蕊香红B磺酰氯)铵：Avanti polar lipids公司制)

·脱氧胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·熊脱氧胆酸钠(东京化成工业公司制)

·鹅脱氧胆酸(东京化成工业公司制)

·猪脱氧胆酸(东京化成工业公司制)

·胆酸甲酯(东京化成工业公司制)

·脱氢胆酸钠(东京化成工业公司制)

·石胆酸(Nacalai Tesque公司制)

·甘氨胆酸钠(东京化成工业公司制)

·牛磺胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·甘氨脱氧胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·牛磺脱氧胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·甘氨熊脱氧胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·牛磺熊脱氧胆酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·高级胆汁酸(3α，7α，12α-三羟基胆甾烷酸(3α,7α, 12α-Trihydroxycholestanoic acid)：Avanti polar lipids公司制)

·5β-胆烷酸(Sigma-Aldrich公司制)

·甘草酸单铵(东京化成工业公司制)

·甘草亭酸(Nagara Science公司制)

·糖精钠(和光纯药工业公司制)

·甲醇(Nacalai Tesque公司制)

·氯仿(和光纯药工业公司制)

·乙酸(和光纯药工业公司制)

·乙酸钠(关东化学公司制)

·MES-Na(Merck公司制)

·Hepes-Na(Nacalai Tesque公司制)

·氯化钠(关东化学公司制)

·Pyranine(东京化成工业公司制)

·DPX(对二甲苯双吡啶氢溴酸盐，p-xylene-bis-pyridinium  bromide：Molecular probes公司制)

·PBS(磷酸缓冲盐：Takara Bio公司制、PBS Tablets)

·聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯(Tween20、40、60、80、65、 85：东京化成工业公司制)

·PEG20-硬脂基醚(聚氧乙烯20-硬脂基醚：和光纯药工业公司 制)

·PEG23-月桂基醚(聚氧乙烯23-月桂基醚：和光纯药工业公司 制)

·失水山梨糖醇脂肪酸酯(SPAN20：Nacalai Tesque公司制-失 水山梨糖醇单月桂酸酯、SPAN40、60：东京化成工业公司制、 SPAN80：Nacalai Tesque公司制-失水山梨糖醇单油酸酯、65：和光 纯药工业公司制、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、SPAN85：东京化成工 业公司制)

·单癸酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monocaprin)

·单辛酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monocaprylin)

·单月桂酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monolaurin)

·单肉豆蔻酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monomyristin)

·单棕榈酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monopalmitin)

·单硬脂酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monostearin)

·单油酸甘油酯(东京化成工业公司制、Monoolein)

·二月桂酸甘油酯(东京化成工业公司制、αα二月桂酸酯)

·二硬脂酸甘油酯(和光纯药工业公司制)

·二油酸甘油酯(和光纯药工业公司制)

·聚氧乙烯蓖麻油(和光纯药工业公司制、聚氧乙烯10蓖麻油)

·聚氧乙烯氢化蓖麻油(10：和光纯药工业公司制、聚氧乙烯10 氢化蓖麻油、40：日油公司制、Uniox HC-40、60：日油公司制、Uniox  HC-60)

·1-丁醇(Nacalai Tesque公司制)

·1-辛醇(Nacalai Tesque公司制)

·1-十二烷醇(东京化成工业公司制)

·1-十六烷醇(Nacalai Tesque公司制)

·1-二十烷醇(东京化成工业公司制)

·月桂酸(Nacalai Tesque公司制)

·油酸钠(Nacalai Tesque公司制)

·辛酸乙酯(Nacalai Tesque公司制)

·月桂酸乙酯(东京化成工业公司制)

·油酸乙酯(Nacalai Tesque公司制)

·乳糖(Nacalai Tesque公司制)

·L-亮氨酸(Nacalai Tesque公司制)

·L-组氨酸(Nacalai Tesque公司制)

·大豆油(Nacalai Tesque公司制、大豆油)

·角鲨烷(Nacalai Tesque公司制)

·角鲨烯(Nacalai Tesque公司制)

·α-生育酚(Nacalai Tesque公司制、DL-α-生育酚)

·生育酚乙酸酯(Nacalai Tesque公司制、乙酸DL-α-生育酚)

·苯甲酸苄酯(Nacalai Tesque公司制)

·对羟基苯甲酸苄酯(东京化成工业公司制)

·棕榈酸抗坏血酸酯(LKT Laboratories公司制)

·阿拉伯胶(Nacalai Tesque公司制、阿拉伯胶粉末)

·明胶(Nacalai Tesque公司制、明胶精制粉末)

·环糊精(Nacalai Tesque公司制)

·甲基纤维素(Nacalai Tesque公司制)

·矿物油(Nacalai Tesque公司制)

·石蜡(Nacalai Tesque公司制)

·氢氧化钠水溶液(0.1mol/L：Nacalai Tesque公司制)

·盐酸(0.1mol/L、1mol/L：Nacalai Tesque公司制)

·Triton-X100(和光纯药工业公司制、Triton X100)

·模型肽：OVA257-264(SIINFEKL，PH Japan委托合成)

·荧光标记肽：OVA257-264-Rh(PH Japan委托合成)

·模型蛋白：OVA(Sigma-Aldrich公司制)

·胰蛋白酶(Life technologies公司制)

·EDTA(乙二胺四乙酸：Nacalai Tesque公司制)

·β-gal(和光纯药工业公司制、β-D-半乳糖苷酶)

·FBS(胎牛血清：国产化学公司制)

·MEM(极限必需培养基：Nacalai Tesque公司制，Eagle’s MEM、 含L‐谷氨酰胺的液体)

·没有酚红的DMEM(Nacalai Tesque公司制、Dulbecco改良Eagle 培养基4.5g/l，不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸及酚红的液体)

·DMEM(Nacalai Tesque公司制、Dulbecco改良Eagle培养基)

·磷酸氯喹(Nacalai Tesque公司制)

·IsoFlow(Beckman Coulter公司制)

＜试样的制作＞

(pH敏感性载体的制备)

将溶解在甲醇(或氯仿)中的1000nmol两亲性物质、和溶解在 甲醇(或氯仿)中的pH敏感性化合物或备选化合物在10mL茄形瓶 中混合，利用旋转蒸发仪(BuCHI)制成薄膜。需要说明的是，对两 亲性物质与pH敏感性化合物或备选化合物的比率进行了调整，使其 成为所期望的比率(摩尔比100：10、100：20、100：640等)。另 外，使用多种两亲性物质时，对两亲性物质的总量进行了调整，使得 成为期望的摩尔数(1000nmol)。

向制作的薄膜中添加MES缓冲液(MES：25mM、NaCl：125mM pH7.4)1mL，使用超声波照射装置(USC-J)在常温下照射超声波1 分钟使其分散，得到含有作为目标的pH敏感性载体的水性溶液(载 体的分散液)。

(比较例的载体的制备)

(EYPC单独及DLPC单独)

将溶解在氯仿中的1000nmol的EYPC或DLPC装入10mL茄形 瓶中，利用旋转蒸发仪(BuCHI)制成薄膜。

向制作的薄膜中添加MES缓冲液(MES：25mM、NaCl：125mM  pH7.4)1mL，使用超声波照射装置(USC-J)在常温下照射超声波1 分钟，使其分散，得到EYPC单独或DLPC单独的分散液。

(含有高分子材料的载体)

与pH敏感性载体的制备法同样地，制备了pH敏感性化合物和 高分子材料的薄膜，并制备了载体。对于阿拉伯胶、明胶、甲基纤维 素、矿物油、或石蜡的高分子材料来说，使用1600nmol的pH敏感性 化合物的1/5倍、1倍、5倍的质量。

(pH敏感性脂质体)

与pH敏感性载体的制备法同样地，制备了DOPE和Chems或油 酸的薄膜，并制备了脂质体。需要说明的是，对于作为pH敏感性脂 质体的DOPE-Chems(DOPE：Chems＝3：2(摩尔比))、及DOPE- 油酸(DOPE：油酸＝7：3(摩尔比))来说，使用1000nmol的DOPE、 期望量的Chems或油酸、和1mL的MES缓冲液(MES：25mM、NaCl： 125mM pH7.4)进行制备。

(含肽载体及含蛋白质载体的制备)

相对于两亲性物质1000nmol，量取0～1536μg的模型肽的 OVA257-264(SIINFEKL)或模型蛋白的OVA，使其溶解在MES缓 冲液(MES：25mM、NaCl：125mM pH7.4)1mL中。通过使用所述 溶液制备载体，得到含有肽或蛋白质的载体的分散液。

在使用荧光标记肽的OVA257-264-Rh的情况下，相对于两亲性 物质1000nmol，使用140μg/mL的荧光标记肽进行制备，在使用β-gal 的情况下，相对于两亲性物质1000nmol，使用1.4mg的β-gal进行制 备。

＜测定方法＞

(透过度的测定)

向MES缓冲液(MES：25mM、NaCl：125mM pH7.4)250μL中 加入载体的分散液250μL，制成测定溶液。使用UV-2450，在常温下 测定500nm处的透过度。

(ζ电势及粒径的测定)

ζ电势的测定如下进行，向调节为pH7.4的1.0mL的Hepes缓冲 液(Hepes：1.0mM)中加入载体的分散液20～50μL，制成测定溶液。 使用NanoZS90实施多次测定，对得到的ζ电势的值进行平均，作为 载体粒子的ζ电势。

(粒径及多分散指数的测定)

粒径及多分散指数(PDI：Polydispersity Index)的测定如下进行， 向MES缓冲液(MES：25mM、NaCl：125mM pH7.4)中加入适当量 的载体的分散液，作为测定溶液。使用NanoZS90实施多次测定，将 利用动态光散射测定得到的Z-average(半径)的值进行平均，将其2 倍的值作为Diameter(直径、粒径)。对于PDI的值，通过将多次测 定得到的PDI的值进行平均而求出。

(溶出性试验：Leakage(溶出率)的测定)

关于Leakage(溶出率)，根据K.Kono等，Bioconjugate Chem.2008  19 1040-1048中记载的方法，使用包封有作为荧光物质的Pyranine和 作为消光剂的DPX的EYPC脂质体进行评价。

称量溶解在氯仿中的3000nmol的EYPC，将其放入10mL茄形瓶， 使用旋转蒸发仪(BuCHI)制成薄膜。加入Pyranine溶液(Pyraine： 35mM、DPX：50mM、MES：25mM、pH7.4)500μL，使用超声波照 射装置(USC-J)使其分散，然后，使用挤出机通过孔径100nm的聚 碳酸酯膜，使粒径一致。使用MES缓冲液(MES：25mM、NaCl： 125mM pH7.4)和G100柱进行外水层的置换，得到包封有荧光物质 的EYPC脂质体分散液。使用磷脂C-Test Wako求出磷脂胆碱基的浓 度，使用MES缓冲液(MES：25mM、NaCl：125mM pH7.4)调整浓 度，使得磷脂为1.0mmol/L。

将浓度经调整的EYPC脂质体分散液20μL、和载体或者pH敏感 性化合物单独或两亲性化合物单独等评价样品分散液20μL投入到调 整为各种pH的MES缓冲液(MES：25mM、NaCl：125mM)2960μL 中，在37℃下孵育90或30分钟后(实施例中，只要没有特别记载， 均为90分钟的结果)、使用分光光度计FP-6500观察Ex416、Em512nm 的荧光，由此监测Leakage。DOPE-Chems、及DOPE-油酸在乙酸缓 冲液(乙酸：25mM、NaCl：125mM)中进行测定。另外，在其他样 品中，pH4.0～pH3.0的测定也使用乙酸缓冲液实施。

需要说明的是，将仅EYPC脂质体分散液的情况作为0％，将加 入了30μL稀释了10倍的Triton-X100的情况的值作为100％，算出 溶出率。

具体而言，溶出率根据下式进行计算。需要说明的是，在下式中， 将测定的荧光强度表示为L，将仅使用包封有荧光物质的EYPC脂质 体分散液时的荧光强度表示为L₀，将加入了Triton-X100时的荧光强 度表示为L₁₀₀。

溶出率(％)＝(L-L₀)/(L₁₀₀–L₀)×100

(膜融合试验：Fusion(膜融合)的测定)

关于Fusion(膜融合)，根据K.Kono等，Biomaterials 2008 29  4029-4036中记载的方法，利用FRET(荧光共振能量转移， Fluorescence Resonance Energy Transfer)进行评价。荧光标记使用 NBD-PE、Rh-PE。

制作相对于EYPC含有0.6mol％的NBD-PE、及Rh-PE的EYPC (EYPC 1000nmol)的薄膜，加入1mL的MES缓冲液(MES：25mM、 NaCl：125mM pH7.4)，使用超声波照射装置(USC-J)使其分散， 然后使用挤出机通过孔径100nm的聚碳酸酯膜，得到经双重荧光标记 的EYPC脂质体分散液。将经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液 20μL、和载体、或pH敏感性化合物单独、两亲性化合物单独等评价 样品分散液20μL投入到调制成各种pH的MES缓冲液(MES：25mM、 NaCl：125mM)2960μL中，在37℃下孵育60分钟，然后使用分光 光度计(FP-6500)测定基于450nm的激发光的500nm～620nm的荧 光光谱，求出520nm和580nm的荧光强度比。

融合率如下计算：将孵育上述得到的经双重荧光标记的EYPC脂 质体分散液和两亲性物质时的荧光强度比作为0％，将经双重荧光标 记的EYPC脂质体分散液和pH敏感性载体或两亲性物质的分散液用 甲醇处理时的荧光强度比作为100％。甲醇处理如下实施：将经双重 荧光标记的EYPC脂质体分散液、和pH敏感性载体或者pH敏感性 化合物单独或两亲性化合物单独等评价样品分散液这两者溶解于甲 醇，然后使用旋转蒸发仪(BuCHI)制成薄膜，使用3.0mL的MES 缓冲液(25mM：MES、125mM：NaCl)和超声波照射装置(USC-J) 使其分散。

具体而言，融合率根据下式计算。需要说明的是，在下式中，将 测定得到的荧光强度比表示为R，孵育经双重荧光标记的EYPC脂质 体分散液和两亲性物质时的荧光强度比表示为R₀，经双重荧光标记的 EYPC脂质体分散液和载体或pH敏感性化合物单独、两亲性化合物 单独等评价样品分散液进行甲醇处理而得到的荧光强度比表示为 R₁₀₀。

融出率(％)＝(R-R₀)/(R₁₀₀-R₀)×100

(对于细胞膜的膜融合的确认)

pH敏感载体对于实际的细胞膜也诱发膜融合，使用HeLa细胞进 行了确认。

在给予pH敏感性载体的前一天，将HeLa细胞接种在松浪玻璃 底皿上，在含有10％FBS的DMEM中培养。此时，使用5％CO₂、设 定为37℃的恒温箱(MCO20AIC)来实施培养。孵育后，使用含有 10％FBS的DMEM洗涤细胞。接着，将使用氢氧化钠水溶液或盐酸 将pH调节为7.4的、含有25mM的Hepes及50μM的磷酸氯喹的2.0mL  DMEM添加到细胞中，进行1小时预孵育。

需要说明的是，在pH5.3下进行实验时，将使用氢氧化钠水溶液 或盐酸将pH调节为5.3的、含有25mM的MES及50μM的磷酸氯喹 的2.0mL DMEM添加到细胞中，进行1小时预孵育。

预孵育后，在具有规定pH的介质中添加相对于两亲性物质为 0.6mol％的用Rh-PE进行了荧光标记的pH敏感性载体的分散液 100μL，进行2小时孵育。将细胞在未添加酚红的DMEM中至少洗涤 3次，然后使用荧光显微镜(Axiovert200M-软件：Axio vision 3.0-光 源：Fluo Arc)进行观察。需要说明的是，细胞的荧光强度如下评价， 对于洗涤后的细胞，使用含有0.025wt％的胰蛋白酶及0.01wt％的 EDTA的PBS剥离细胞，使用流式细胞仪(Cytomics FC500，软件： CXP ver2)进行评价。

(使用了荧光标记肽的细胞质基质递送的评价)

选择OVA257-264-Rh作为模型肽。使用通过了0.22μm的滤膜 的PBS制备140μg/mL的荧光标记肽溶液，用于载体的制备。细胞 使用RAW细胞，培养使用5％CO₂、设定为37℃的恒温箱 (MCO20AIC)来实施。在给予载体的前一天，将RAW细胞接种在 松浪玻璃底皿上，在含有10％FBS的MEM介质中进行培养。用PBS 洗涤细胞后，置换为新的1900μL的含有10％FBS的MEM介质，分 别给予100μL的样品。进行16～20小时孵育，将细胞用PBS至少清 洗3次。然后，添加新的含有10％FBS的MEM介质2mL，进行3 小时后孵育。用PBS洗涤细胞，置换为不添加酚红的DMEM介质后， 使用荧光显微镜(Axiovert200M-软件：Axio vision 3.0-光源：Fluo  Arc)观察细胞。

(β-gal的细胞质基质递送)

使用通过了0.22μm的滤膜的PBS，制备1.4mg/mL的β-gal溶 液。在由1000nmol的DLPC和1600nmol的脱氧胆酸或熊脱氧胆酸形 成的混合薄膜中，使用制备的β-gal溶液使其分散，制备含β-gal的 载体。在给予前一天将RAW细胞接种在松浪玻璃底皿上进行培养， 在即将给予之前用PBS洗涤细胞。培养使用5％CO₂、设定为37℃的 恒温箱(MCO20AIC)、及含有10％FBS的MEM介质来实施。置换 为新的1900μL的含有10％FBS的MEM介质，分别给予100μL的样 品，进行16～20h孵育。将细胞用PBS至少洗涤3次，然后添加新的 含有10％FBS的MEM介质2mL，进行3小时后孵育。用PBS洗涤 细胞，使用β-Galactosidase Staining Kit(从Takara Bio购入)将细胞 染色，使用显微镜(Axiovert200M-软件：Axio vision 3.0)观察细胞。 染色根据试剂盒的推荐实施。

(分别独立使用pH敏感性载体及生理活性物质时的向细胞质基 质的递送评价)

在前一天将RAW细胞接种在松浪玻璃底皿上，在含有10％FBS 的MEM中进行培养。用PBS洗涤后，添加MEM，进行1小时孵育。 制备以30μg/mL的浓度含有荧光标记肽-FITC、或荧光标记 OVA-FITC的1900μL的MEM，与培养介质进行置换。进而，添加 100μL的pH敏感性载体的制备溶液，在培养介质中以两者混合的状 态进行16～20小时孵育。确认了荧光标记肽-FITC及荧光标记 OVA-FITC在与含有pH敏感性载体的溶液的混合状态下，不被载带 于pH敏感性载体上。用PBS洗涤，用2mL的新的MEM进行3小时 的后孵育后，用PBS洗涤细胞，置换为未添加酚红的DMEM，使用 荧光显微镜观察细胞。培养使用5％CO₂、设定为37℃的恒温箱 (MCO20AIC)来实施，使用荧光显微镜(Axiovert200M-软件：Axio  vision 3.0-光源：Fluo Arc)来实施细胞的观察。

(1)关于脱氧胆酸的复合化

首先，评价脱氧胆酸和两亲性物质的复合化。

根据上述pH敏感性载体的制备，制作1000nmol的EYPC或DLPC 与各种量(0～6400nmol)的脱氧胆酸的混合薄膜，加入1mL的pH7.4 MES缓冲液，照射超声波，分别制备脱氧胆酸经复合化的分散液。以 各种浓度含有脱氧胆酸的、含有EYPC和脱氧胆酸的分散液的照片示 于图2A，将以各种浓度含有脱氧胆酸的、含有DLPC和脱氧胆酸的 分散液的照片示于图2B。需要说明的是，图2A、图2B从左边开始 依次为含有0nmol、50nmol、100nmol、200nmol、400nmol、800nmol、 1600nmol、3200nmol、6400nmol的脱氧胆酸的、1000nmol脂质的分 散液。对于EYPC、DLPC中的任一种脂质也同样，脂质单独的分散 液发生白浊，相对于此，与脱氧胆酸复合化的产物依赖于复合化量而 形成澄清溶液。

另外，测定各分散液的500nm处的透过度，结果得到与目视同样 的倾向。图2C为测定含有EYPC和脱氧胆酸的分散液的透过度的结 果，图2D为测定含有DLPC和脱氧胆酸的分散液的透过度的结果。 这些结果表示脱氧胆酸和脂质形成了复合体(缔合体)。以下，将脱 氧胆酸和脂质的复合体也称作“脂质-脱氧胆酸复合体”。

接下来，研究了这些分散液的ζ电势。图3为相对于脱氧胆酸量 的、含有EYPC和脱氧胆酸的分散液(图中，EYPC-脱氧胆酸复合体)、 及含有DLPC和脱氧胆酸的分散液(图中，DLPC-脱氧胆酸复合体) 的ζ电势测定结果。需要说明的是，图3的结果为5次不同的测定的 平均值，±为SD。

伴随脱氧胆酸的复合化，两分散液的值降为负值。这意味着具有 负电荷的脱氧胆酸与脂质进行复合化，显示形成了脱氧胆酸和脂质混 合存在的复合体。使用任一种脂质时，脱氧胆酸为1600nmol的复合 化量时，ζ电势显示约-30mV的值，复合化量为这以上时，ζ电势的 值没有大幅降低。因此，认为在该复合化量时，脱氧胆酸充分覆盖形 成的复合体的表面而进行复合化。

(2)关于复合体的结构

根据上述pH敏感性载体的制备，相对于1000nmol的DLPC使 用1600nmol的脱氧胆酸来制备复合体，进行该复合体的荧光物质保 持实验(使用Pyranine溶液使薄膜分散的实验)，结果该复合体中未 保持荧光物质。由于复合体无法保持荧光物质，所以表明该复合体不 是中空结构，而是胶束的形状(data not shown)。

接着，测定根据上述pH敏感性载体的制备得到的各种复合体的 粒径。基于动态光散射测定的粒径测定的结果，可知EYPC-脱氧胆 酸复合体(EYPC：脱氧胆酸＝1000nmol：1600nmol)的粒径(Diameter) 约为73nm，DLPC-脱氧胆酸复合体(DLPC：脱氧胆酸＝1000nmol： 1600nmol)的粒径(Diameter)约为43nm大小的粒子(表1)。另 外，它们的多分散指数(PDI)为0.26和0.07这样小的值，明确了脱 氧胆酸和脂质的复合体为小且均匀的粒子。

表1.粒径和PDIs

值为5次不同的测定结果的平均值，±表示SD.

仅EYPC:EYPC单独

仅DLPC:DLPC单独

EYPC-脱氧胆酸:EYPC-脱氧胆酸复合体

DLPC-脱氧胆酸:DLPC-脱氧胆酸复合体

(3)关于pH敏感性

(溶出性试验)

考察EYPC单独、DLPC单独、EYPC-脱氧胆酸复合体及DLPC- 脱氧胆酸复合体的pH敏感性。需要说明的是，实验中，根据上述载 体的制备方法，使用1000nmol的脂质(EYPC或DLPC)和1600nmol 的脱氧胆酸制备复合体，根据上述溶出性试验的方法，通过与生物膜 模型的脂质体(EYPC脂质体)进行孵育进行考察(以下，只要没有 特别记载，溶出性试验均为实施了90分钟孵育的结果)。图4为pH7.4、 pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0及pH4.5条件下的EYPC单独、DLPC 单独、脱氧胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸复合体及DLPC-脱氧胆酸复 合体的溶出性试验的结果。另外，图4的曲线为3次不同测定的平均， ±为SD。

EYPC单独、DLPC单独、及EYPC-脱氧胆酸复合体在从pH7.4 至pH4.5中的任意pH条件下均不引起荧光物质的溶出，不显示pH 敏感性，相对于此，DLPC-脱氧胆酸复合体在pH6.5以下时引起比脱 氧胆酸单独的情况下更显著的溶出。明确了DLPC-脱氧胆酸复合体 表现pH敏感性的膜破坏功能促进效果。

由该实验表明，通过脱氧胆酸与适当的两亲性物质的组合，可得 到应答于弱酸性环境而表现功能的复合体。表现效果的pH为6.5以 下，为适合实用的pH范围。另外，由于在生理环境的pH条件下完 全不引起溶出，因而是功能开启-关闭(on-off)被良好控制的pH敏 感性。

(膜融合试验)

为了将生理活性物质送达到细胞质基质，期望具有弱酸性环境下 的膜融合的功能。因此，根据上述膜融合试验的方法，将经双重荧光 标记的EYPC脂质体和使用1000nmol的脂质(EYPC或DLPC)及 1600nmol的脱氧胆酸制备的载体(复合体)，在各种pH条件下于37℃ 下孵育60分钟，考察两者的融合。图5(A)为表示pH7.4、pH6.5、 pH6.0、pH5.5、pH5.0及pH4.5条件下的EYPC单独、DLPC单独、 脱氧胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸复合体及DLPC-脱氧胆酸复合体的 荧光强度比的图表。图5(B)为表示与上述同样的pH条件下的脱氧 胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸复合体、DLPC-脱氧胆酸复合体的融合率 的图表。融合率的0％为双重荧光标记脂质体中添加了DLPC单独、 或EYPC单独时的荧光强度比，100％为用甲醇处理各个样品所得的 值。脱氧胆酸单独的值以双重荧光标记脂质体单独为0％、EYPC-脱 氧胆酸复合体经甲醇处理所得的值为100％而算出。需要说明的是， 图5(A)及(B)的曲线为3次不同测定的平均，±为SD。

由图5(A)的结果可知，对于DLPC-脱氧胆酸复合体来说，伴 随pH下降而荧光强度比增大，引起了与经双重荧光标记的EYPC脂 质体的融合。另外，评价它们的融合率，结果可知，DLPC-脱氧胆酸 复合体在弱酸性环境下表现膜融合功能促进效果(图5(B))。DLPC- 脱氧胆酸复合体表现膜破坏功能促进效果和膜融合功能促进效果这 两者。由此认为，两种效果来自同一现象，表现膜破坏功能促进效果 的载体也可能一并表现膜融合功能促进效果。

需要说明的是，pH5.0的荧光强度比与甲醇处理的样品相比为8 成左右的值(图5(A))。经甲醇处理的样品是指双重荧光标记脂 质体与载体完全融合的状态，该结果表明生物膜模型的EYPC脂质体 与制作的载体以高效率融合。期待生理活性物质的效率良好的递送。

(4)与一般的pH-敏感性脂质体的比较

为了确认对于pH的敏感性、及溶出的强度，通过溶出性试验实 施作为pH-敏感性脂质体已知的DOPE-Chems脂质体(DOPE：Chems ＝3：2(摩尔比))、及DOPE-油酸脂质体(DOPE：油酸＝7：3(摩 尔比))的比较。使用含有相当于20nmol的DOPE的DOPE-Chems 脂质体或DOPE-油酸脂质体的分散液来实施测定。图6为表示 DOPE-Chems脂质体、DOPE-油酸脂质体、及DLPC-脱氧胆酸复合 体相对于各种pH的溶出率的图表。图6的曲线为3次不同测定的平 均，±为SD。

DOPE-Chems脂质体、DOPE-油酸脂质体在pH6.0以下的pH条 件下开始溶出，在pH3.5的条件下显示最大值即20～30％的溶出。另 一方面，pH敏感性载体(DLPC-脱氧胆酸复合体)从pH6.5开始引 起溶出，最大形成超过60％的溶出。

与现有的pH-敏感性脂质体相比，DLPC-脱氧胆酸复合体为高溶 出率，因此表明本发明的pH敏感性载体(DLPC-脱氧胆酸复合体) 具有强烈的使膜不稳定、破坏膜的效果。另外，还表明表现效果的pH 与一般的pH-敏感性脂质体的pH相比更接近中性，相对于弱酸性环 境为高敏感性。

(5)脱氧胆酸的复合化量的研究

为了考察表现效果所需的脱氧胆酸的复合化量，使用各种量的脱 氧胆酸制作pH敏感性载体，基于膜融合试验评价膜融合功能促进效 果的表现。测定进行3次，算出平均值和SD。脱氧胆酸单独的值使 用EYPC-脱氧胆酸复合体经甲醇处理的值来计算。

图7(A)及(B)为脱氧胆酸单独、EYPC-脱氧胆酸复合体及 DLPC-脱氧胆酸复合体相对于脱氧胆酸量的融合率。

由图7(A)及(B)表明，制作的载体在100nmol以上的复合化 量时成为大于脱氧胆酸单独的值，表现膜融合功能促进效果。因此可 知，通过相对于1000nmol的脂质将100～6400nmol的脱氧胆酸进行复 合，能获得膜融合功能促进效果的表现。

需要说明的是，EYPC-脱氧胆酸复合体的融合率为与脱氧胆酸单 独时大致一致的值，表明EYPC-脱氧胆酸复合体完全不能获得由pH 敏感性化合物的复合化产生的膜融合功能促进效果。

(6)脂质结构的影响

由以上的研究可知，通过脱氧胆酸与适当的脂质(两亲性物质) 的组合，能得到应答于弱酸性环境而表现膜破坏功能促进效果、及膜 融合功能促进效果的载体。为了阐明给予这些性质的脂质，使用各种 结构的脂质制作载体，实施溶出性试验或膜融合试验。

作为脂质结构，考察(A)二酰基磷脂酰胆碱的酰基的长度的影 响(碳原子数10～18)、(B)二酰基磷脂酰胆碱的酰基的不饱和键 的影响。各个载体使用脂质1000nmol和脱氧胆酸1600nmol进行制备。 测定进行3次，算出平均值和SD。需要说明的是，“碳原子数”是指 构成疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。

图8(A)为脱氧胆酸单独、DSPC-脱氧胆酸复合体、DPPC-脱 氧胆酸复合体、DMPC-脱氧胆酸复合体、DLPC-脱氧胆酸复合体、 及DDPC-脱氧胆酸复合体的融合率。图8(B)为脱氧胆酸单独、HSPC- 脱氧胆酸复合体、DOPC-脱氧胆酸复合体、及POPC-脱氧胆酸复合 体的融合率。

由图8(A)可知，使用DSPC、DPPC、DMPC的载体为与脱氧 胆酸单独同等的值，未显示效果，相对于此，DLPC、DDPC显示效 果。认为使用的脂质的碳链长度有影响，采用短碳链的脂质，可获得 效果的表现。认为碳链短的脂质容易发生膜中的分子的运动倒置 (inversion motion)即翻转(flip flop)，该性质影响效果。

另外，关于不饱和键的影响，碳原子数18中具有1个不饱和的 POPC、具有2个不饱和的DOPC的载体未表现效果(图8(B))。 表明不饱和键对效果的表现没有明显影响。

接着，考察脂质的头结构对效果的表现的影响。分别使用 1000nmol脂质和1600nmol脱氧胆酸制备载体。进行3次测定，算出 平均值和SD。

图9(A)为表示脱氧胆酸单独、DLPE单独、DMPE单独、DSPE 单独及DOPE单独的溶出率的图表，图9(B)为表示脱氧胆酸单独、 DLPE-脱氧胆酸复合体、DMPE-脱氧胆酸复合体、DSPE-脱氧胆酸 复合体及DOPE-脱氧胆酸复合体的溶出率的图表。

具有PE的脂质均没有表现出效果，表明头结构优选为胆碱基(图 9(A)及(B))。

由以上结果明确了，作为使效果表现的两亲性物质，优选在头结 构中具有胆碱基、碳链10～12的不饱和脂质及饱和脂质。

(7)对其他两亲性物质的研究

脂质以外的材料也被利用于生理活性物质的递送。进而，已知脱 氧胆酸与脂质以外的疏水性材料也形成复合体，与各种物质联合有可 能得到具有功能的载体。因此，使各种物质与脱氧胆酸进行复合化而 制作载体，采用溶出性试验进行了评价。对于脱氧胆酸单独的情况来 说，由于表面活性作用也带来溶出率的增大，因此，将满足以下两者 的情况规定为使效果表现的物质，进行筛选：(1)溶出性试验中， 与生理pH条件下的溶出率相比，低于生理pH的规定的pH条件下的 溶出率上升，并且其上升幅度大于pH敏感性化合物单独实验时的上 升幅度，及(2)低于该生理pH的规定pH条件下的溶出性试验中， pH敏感性化合物与两亲性物质形成复合体(pH敏感性载体)时的溶 出率大于pH敏感性化合物单独的溶出率和两亲性物质单独的溶出率 之和。

需要说明的是，上述(1)及(2)是指溶出性试验中，pH敏感 性载体(pH敏感性化合物和两亲性物质的复合体)的溶出率Lc、与 pH敏感性化合物单体的溶出率La及两亲性物质单体的溶出率Lb满 足下述关系双方。即，上述(1)用下式(1)表示，上述(2)用下 式(2)表示。需要说明的是，下式中，将pH7.4的溶出率分别表示 为Lc_7.4、La_7.4、Lb_7.4，将pH5.0或4.5的溶出率分别表示为Lc_x、La_x、 Lb_x。

式(1)Δ＝(Lc_x-Lc_7.4)-(La_x–La_7.4)>0

式(2)Δ’＝Lc_x-(La_x+Lb_x)>0

将结果示于表2～7。需要说明的是，表2～7的各个值为3次不同 测定的平均值，±为SD。

另外，相对于脱氧胆酸1600nmol(663μg)，使用各种质量的高 分子材料制备粒子，评价pH5.0时的溶出的产生。图10表示pH5.0 时的脱氧胆酸和高分子材料的复合体的溶出性的结果。需要说明的 是，图10的值为1次测定的值。

研究的结果表明，下述物质为合适的物质：作为碳原子数12～18 的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯的Tween20、Tween40、Tween60 及Tween80；作为碳原子数16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯的SPAN40、 SPAN60、SPAN80、SPAN65及SPAN85；作为甘油衍生物的单油酸 甘油酯(表中，单油酸甘油酯)、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯及 二月桂酸甘油酯(αα二月桂酸酯)；作为聚氧乙烯蓖麻油的PEG10- 蓖麻油；α-生育酚。需要说明的是，两亲性物质中的“碳原子数”，是 指构成两亲性物质的疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。

(8)对两亲性物质的比例的研究

通过上述(7)的研究，明确了带来效果表现的两亲性物质和没 有带来效果表现的物质。接着，考察了带来效果表现的物质以何种程 度的比例含有时能够实现效果表现。作为没有带来效果表现的物质， 选择EYPC，在EYPC中以各种比例混合DLPC、或SPAN85，使总 计为1000nmol，制备由多种两亲性物质形成的载体。

在EYPC中以各种比例混合DLPC或SPAN85，使得总计为 1000nmol，进而使1600nmol的脱氧胆酸复合化，制备载体。进行各 个载体在pH7.4、pH5.0条件下的溶出性试验，考察效果表现。

图11为EYPC、脱氧胆酸和DLPC或SPAN85的复合体在(A) pH7.4、(B)pH5.0条件下的溶出率。图11(A)及(B)的各个值 为3次不同测定的平均值，±为SD。

DLPC或SPAN85：EYPC(mol：mol)的比例在100：150～100： 0的范围内确认到pH敏感性的溶出(图11(A)及(B))。可知为 了得到基于与脱氧胆酸的复合化应答于弱酸性环境而表现效果的pH 敏感性载体，适当的两亲性物质的比例需要在上述范围内。

(9)对脱氧胆酸以外的pH敏感性化合物的探索

由以上结果可知，脱氧胆酸在弱酸性环境中能够对疏水的缔合状 态产生影响。期待具有与脱氧胆酸类似的结构的分子同样提供pH敏 感性载体。因此，作为脱氧胆酸的类似分子，选定各种胆汁酸、甘草 酸、及甘草亭酸，进行该酸与DLPC的复合体的溶出性试验及膜融合 试验，考察是否能用作pH敏感性化合物。

使用1000nmol的DLPC和1600nmol的各种酸(以下，备选化合 物)制备载体。

图12为DLPC和各种备选化合物的复合体在(A)pH7.4、(B) pH5.0条件下的溶出率。图12的各个值为3次不同测定的平均值，± 为SD。

另外，图13表示各种pH条件下的DLPC和各种备选化合物的复 合体的溶出率的图表。图13的各个值为3次不同测定的平均值，±为 SD。

图14为(A)各种pH敏感性化合物单独、(B)DLPC和各种 pH敏感性化合物的复合体在pH7.4及pH5.0条件下的融合率。各个 值为3次不同测定的平均值，±为SD。

pH7.4时，使用任一备选化合物制备的载体均未引起溶出，相对 于此，pH5.0时，使用脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、 猪脱氧胆酸、高级胆汁酸(三羟基胆甾烷酸)、甘氨脱氧胆酸、甘草 酸、甘草亭酸制备的载体与添加了备选化合物单独的情况相比引起显 著性的大的溶出，显示膜破坏功能促进效果(图12(A)及(B))。 也同时确认了这些载体具有pH敏感性的膜融合功能促进效果(图14 (A)及(B))。继图5(A)及(B)中的结果，本实施例的pH敏 感性载体一并表现膜破坏功能促进效果和膜融合功能促进效果。

另外，考察这些载体的pH变化模式(pH-profile)，结果开始引 起溶出的pH根据所使用的分子的不同而不同(图13)。认为这是因 为：根据分子的不同pKa不同，及与两亲性物质的缔合形成的形式不 同。该结果表明能够详细选择表现效果的pH，期待能够详细设定生 物体内的递送、及细胞内的递送。通过本实验可知，所述pH敏感性 载体在pH7～3条件下具有效果。

(10)pH敏感性化合物和两亲性物质的组合的研究

对于在图12(A)及(B)、图13、图14(A)及(B)中具有 与脱氧胆酸类似的结构且判明了带来表现效果的化合物(pH敏感性 化合物)、与表2～7及图10的筛选中判明带来效果表现的两亲性物 质的各种组合，确认研究了有无效果表现。

使用1000nmol的两亲性物质、100nmol的pH敏感性化合物、或 1000nmol的两亲性物质和6400nmol的pH敏感性化合物制备载体。 表8及9给出了各种pH敏感性化合物和两亲性物质的复合体的溶出 试验的结果。

表8.由pH敏感性化合物(100nmol)和两亲性物质(1000nmol)的组合得到的功能性载体的 评价(溶出性试验)(实验为n＝1)

Δ＝(Lc_4.5–Lc_7.4)–(La_4.5–La_7.4)

Δ’＝Lc_4.5–(La_4.5+Lb_4.5)

Lc_pH：规定pH条件下的pH敏感性化合物和两亲性物质的复合体的溶出率

La_pH：规定pH条件下的pH敏感性化合物单独的溶出率

Lb_pH：规定pH条件下的两亲性物质单独的溶出率

表9.由pH敏感性化合物(6400nmol)和两亲性物质(1000nmol)的组合得到的功能性载体的 评价(溶出性试验)(实验为n＝1)

Δ＝(Lc_4.5–Lc_7.4)–(La_4.5–La_7.4)

Δ’＝Lc_4.5–(La_4.5+Lb_4.5)

Lc_pH：规定pH条件下的pH敏感性化合物和两亲性物质的复合体的溶出率

La_pH：规定pH条件下的pH敏感性化合物单独的溶出率

Lb_pH：规定pH条件下的两亲性物质单独的溶出率

显示*的组合为基于30分钟的孵育的研究结果

由表8及表9明确了，在任一组合中，作为判断具有效果的指标 的Δ和Δ’显示正值，通过表8及表9的组合得到的载体具有pH敏感 性的功能。

(11)对针对细胞膜的膜融合的确认

由上述(3)、(5)、(6)、(9)等的结果表明，pH敏感性 载体应答于弱酸性环境而表现膜破坏功能促进效果、及膜融合功能促 进效果。因此，实际上确认了pH敏感性载体和细胞膜的膜融合。更 详细而言，在调整为pH7.4及pH5.3的介质中，短时间孵育经荧光标 记的pH敏感性载体和HeLa细胞，考察对于细胞表面的膜的染色， 确认了pH敏感性载体和细胞膜的膜融合。

其结果，在pH7.4条件下观察到荧光为起点状、或在核附近的区 域(图15(A))。这表明pH敏感性载体被摄取到细胞中，存在于 核内体、溶酶体中。需要说明的是，在经荧光标记的两亲性物质单独 的情况下也观察到了同样的图像(数据未示出)。

另一方面，在pH5.3条件下观察到整个视野内荧光的形状和细胞 的形状一致的图像(图15(B))。认为经荧光标记的pH敏感性载 体在细胞的表面与细胞膜进行了膜融合，因此荧光扩散成细胞的形 状。

由以上的结果可知，pH敏感性载体应答于介质中的弱酸性环境 而表现膜融合功能促进效果，与细胞表面的细胞膜进行了膜融合。

另外，使用流式细胞仪评价细胞的荧光强度，结果pH5.3条件下 经孵育的细胞显示较大的荧光强度(图15(C))。认为该结果是因 为经荧光标记的pH敏感性载体大量地发生了膜融合而导致的。因此 表明，pH敏感性载体也能与实际的细胞膜效率良好地进行膜融合。

(12)肽及蛋白质的掺入对效果表现的影响

对于将具有生理活性的肽或蛋白质掺入到疏水的缔合中并在 DDS中使用，进行了认真研究。这是本载体有前景的利用方法。因此， 作为模型肽使用OVA257-264(SIINFEKL、从PH Japan购入)，作 为模型蛋白使用OVA(从Sigma-Aldrich购入)，对于生理活性物质 的掺入对载体的效果表现的影响进行了考察。

首先，为了评价生理活性物质的掺入，测定了在DLPC-脱氧胆 酸复合体(1000nmol：1600nmol)中掺入肽或蛋白质(192μg)得到 的载体的粒径及多分散指数(PDI)(表10)。

接着，考察了相对于DLPC1000nmol及脱氧胆酸1600nmol掺入 各种量的肽(A)或蛋白质(B)而得的载体的溶出性。图16表示pH7.4 及pH5.0条件下的含有(A)肽、(B)蛋白质的载体的溶出率的结 果。图16的值为3次不同测定的平均值，±为SD。

进而，考察了相对于DLPC1000nmol及脱氧胆酸(A)或熊脱氧 胆酸(B)1600nmol掺入768μg的肽或蛋白质而得的载体的融合率。 图17表示pH7.4及pH5.0条件下的含有(A)脱氧胆酸、(B)熊脱 氧胆酸的载体的融合率的结果。图17(A)及(B)的值为3次不同 测定的平均值，±为SD。

表10.粒径和PDIs.

值为5次不同测定结果的平均值，±表示SD。

胶束单独：DLPC-脱氧胆酸复合体单独

肽：含肽的DLPC-脱氧胆酸复合体

OVA-蛋白：含OVA的DLPC-脱氧胆酸复合体

载体掺入肽或蛋白质，由此载体的粒径有稍微变大的倾向(表 10)。显示所述物质被掺入进载体。另一方面，所引起的溶出与肽或 蛋白质没有以任何量掺入的情况为相同的值(图16(A)及(B))。 表明肽或蛋白质向载体的掺入未引起效果的下降。

另外，融合性试验的结果中也得到了同样的结果(图17(A)及 (B))。由所述结果可知，掺入生理活性物质对载体的效果表现没 有明显影响。

(13)向细胞质基质的递送-1

已大量报道了在弱酸性环境中具有促进膜融合及膜破坏的性质 的载体经由核内体将包封或掺入的物质递送至细胞质基质。使用构筑 的pH敏感性载体尝试了生理活性物质向细胞质基质的递送。

相对于DLPC1000nmol和脱氧胆酸或熊脱氧胆酸1600nmol，使 用140μg/mL的荧光标记肽溶液制备载体。另外，作为对照，相对 于DLPC1000nmol，使用140μg/mL的荧光标记肽制备载体。

图18表示(A)荧光标记肽单独的溶液、(B)含荧光标记肽的 DLPC单独的溶液、(C)含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体的 溶液、及(D)含荧光标记肽的DLPC-熊脱氧胆酸复合体的溶液的照 片。

与荧光标记肽单独的溶液(A)相比，含荧光标记肽的DLPC单 独的溶液(B)、含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体的溶液(C)、 及含荧光标记肽的DLPC-熊脱氧胆酸复合体的溶液(D)形成较弱的 荧光。认为其原因是荧光标记肽被固定在载体的疏水区域，暗示荧光 标记肽被掺入载体。

接着，尝试荧光标记肽向细胞质基质的递送。具体而言，向在 1900μL的含有10％FBS的MEM介质中培养的RAW细胞给予上述 (A)～(D)的含有荧光标记肽的样品100μL(14μg荧光标记肽/孔)， 摄取1夜。洗涤细胞，进行3小时后孵育，使用荧光显微镜观察细胞。

图19表示(A)荧光标记肽单独、(B)含荧光标记肽的DLPC 单独、及(C)含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体的荧光显微镜 照片。另外，图20表示含荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体的(A) 显微镜照片及(B)荧光显微镜照片、以及含荧光标记肽的DLPC-熊 脱氧胆酸复合体的(C)显微镜照片及(D)荧光显微镜照片。

荧光标记肽单独(A)、或含荧光标记肽的DLPC单独(B)的 情况，观察到荧光的多数为起点状，表示荧光标记肽留在核内体内(图 19(A)及(B))。

另一方面，对于掺入了荧光标记肽的DLPC-脱氧胆酸复合体 (C)，基本在全部细胞中整个细胞质基质观察到了荧光，表明荧光 标记肽从核内体脱离，迁移到细胞质基质(图19(C))。由于载体 带负电、及实施3小时后孵育，所以难以认为该荧光是通过载体吸附 在整个细胞表面而得到的图像，而认为荧光标记肽经由核内体被递送 到细胞质基质。

另外，使用熊脱氧胆酸制备的载体中也与脱氧胆酸的情况同样 地，在整个细胞质基质观察到荧光，确认了效率良好的细胞质基质递 送(图20(C)及(D))。

由以上表明，通过本发明的pH敏感性载体，能够进行生理活性 物质的效率良好的细胞质基质递送。

(14)向细胞质基质的递送-2

接着，尝试了蛋白质向细胞质基质的递送。选择β-gal作为模型 蛋白质，掺入pH敏感性载体。向细胞质基质的递送如下进行评价： 将应用于RAW细胞后的酶活性可视化，比较其情况。

相对于DLPC1000nmol和脱氧胆酸或熊脱氧胆酸1600nmol，使 用1.4mg/mL的β-gal溶液制备载体。

图21表示(A)β-gal单独、(B)含β-gal的DLPC-脱氧胆酸 复合体、及(C)含β-gal的DLPC-熊脱氧胆酸复合体的显微镜照片。

添加了β-gal单独的细胞未被染色(图21(A))。这是因为β-gal 在核内体中被分解，表明未迁移到细胞质基质。另一方面，掺入pH 敏感性载体的情况下确认到由β-gal产生的蓝色的染色(图21(B) 及(C))。表明β-gal从核内体脱离，在维持酶活性的状态下迁移 到细胞质基质。在Vincent M.Rotello et al.J.Am.Chem.Soc.2010132(8) 2642-2645中，实施了以β-gal向细胞质基质的递送为目的的同样的 实验，可得到与该文献同样的结果，因此支持了上述讨论。

(15)向细胞质基质的递送-3

上述(13)及(14)中，确认了使生理活性物质载带于pH敏感 性载体向细胞质基质的递送。因此，接下来，尝试了分别独立地使用 pH敏感性载体及生理活性物质时向细胞质基质的递送。pH敏感性载 体及生理活性物质被摄取到同一核内体内时，由于pH敏感性载体的 膜破坏功能促进效果产生核内体的膜破坏，此时，认为在核内体内混 合存在的生理活性物质从核内体溶出，由此能够将生理活性物质递送 到细胞质基质。

首先，向RAW细胞添加荧光标记肽-FITC的情况、及向RAW 细胞添加荧光标记OVA-FITC的情况，均确认到在细胞内的荧光为 起点状，表明荧光标记肽-FITC及荧光标记OVA-FITC留在核内体 内(图22A(A)及(B))。

接着，将通过上述(3)及(5)未观察到膜破坏促进功能及膜融 合促进功能的EYPC-脱氧胆酸复合体与荧光标记肽-FITC或荧光标 记OVA-FITC并用。具体而言，在含有荧光标记肽-FITC的RAW细 胞的培养溶液中进一步添加EYPC-脱氧胆酸复合体。另外，在含有 荧光标记OVA-FITC的RAW细胞的培养溶液中进一步添加EYPC- 脱氧胆酸复合体。这些情况也与上述同样地，确认到细胞内的荧光为 起点状，表明荧光标记肽-FITC及荧光标记OVA-FITC留在核内体 内(图22A(C)及(D))。

然后，将pH敏感性载体与荧光标记肽-FITC或荧光标记 OVA-FITC并用。具体而言，在含有荧光标记肽-FITC的RAW细胞 的培养溶液中进一步添加具有膜破坏功能促进效果的pH敏感性载体 的制备溶液。另外，在含有荧光标记OVA-FITC的RAW细胞的培养 溶液中进一步添加具有膜破坏功能促进效果的pH敏感性载体的制备 溶液。需要说明的是，作为上述pH敏感性载体，使用DLPC-脱氧胆 酸复合体、SPAN80-脱氧胆酸复合体、DDPC-脱氧胆酸复合体、聚氧 乙烯蓖麻油(PEG10蓖麻油)-脱氧胆酸复合体、Tween20-脱氧胆酸 复合体、Tween80-脱氧胆酸复合体、α-生育酚-脱氧胆酸复合体、 DLPC-熊脱氧胆酸复合体、DLPC-甘草酸复合体、DLPC-鹅脱氧胆酸 复合体、DLPC-猪脱氧胆酸复合体、及DLPC-甘氨脱氧胆酸复合体。 此时，pH敏感性载体使用160nmol的pH敏感性化合物和100nmol 两亲性物质制备。所述情况中，在整个细胞质基质确认到荧光(图22A (E)～(J)、图22B(K)～(T)、图22C(U)～(AB))。因此 表明，生理活性物质即使在以独立于具有膜破坏功能促进效果的pH 敏感性载体的形式使用的情况(未被载带的情况)下，也能被递送到 细胞质基质。