口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)中VP1、VP2和VP4三个结构蛋白的表位最小基序肽及其应用

摘要

本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体为一种口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)中VP1、VP2和VP4三个结构蛋白的表位最小基序肽及其应用。本发明提供的5个线性抗原表位最小基序肽可用作研发新的抗O型口蹄疫病毒重组多表位肽疫苗候选表位肽，其氨基酸序列分别为SEQ.ID NO.1～SEQ.ID NO.5。本发明还提供用作研制诊断口蹄疫病毒流行情况的高特异性和高敏感度的重组多表位肽的检测抗原的候选表位，其氨基酸序列如SEQ.ID NO.6～SEQ.ID NO.10所示。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体涉及O型口蹄疫病毒(FMDV)毒株(O/BY/CHA/2010)中结构蛋白VP1、VP2和VP4的表位最小基序肽、扩展肽及其应用。 

背景技术

家畜口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物,国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒有A、O、C、SAT Ⅰ、SAT Ⅱ、SATⅢ及Asia I共7个血清型及65个以上的亚型。 

免疫接种是发展中国家预防口蹄疫爆发的主要途径。传统的灭活苗具有免疫原性高、保护性好等优点，但可能会出现疫苗灭活不彻底或病毒逃逸，从而造成口蹄疫的爆发流行，具有潜在的危险。因此，很多研究者转向对基因工程疫苗和多价肽疫苗的研究。就后者重组多表位肽疫苗而言，理想的疫苗应该同时包含线性B细胞表位(以下简称线性表位)和T细胞表位，前者在B细胞内诱发生成抗体，而后者则能刺激T细胞产生细胞因子，促使B细胞分泌抗体。因此，两者表位的筛选鉴定一直是病毒学和疫苗学研究领域中的重要研究内容，例如，之前就有相关的抗原性肽的研究报道(如Tang H,Liu X S,Fang Y Z,et al.The Epitopes of Foot and Mouth Disease[J].Asian Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,7(12):1261-1265；Blanco E,McCullough K,Summerfield A,et al.Interspecies major histocompatibility complex-restricted Th cell epitope on foot-and-mouth disease virus capsid protein VP4[J].J Virol,2000,74:4902–4907；王加龙等。)。 

但是，尽管这方面的鉴定方法成百上千(吴敬和吴梧桐.B细胞蛋白质抗原表位的研究方法进展.药物生物技术,7(4)：239-242,2000；沈关心等译.抗体技 术实验指南.科学出版社，2002；王洪林等.B细胞表位定位的研究进展.生命科学,21:317-319,2009)，如以上列举文献所示，由于受线性(非构象型)B细胞表位鉴定方法的限制，以往鉴定的都是未经过抗体识别最小基序(通常由3～8个残基组成)鉴定结果多是较长的16聚或更长的抗原性肽(antigenic peptide)，而不是真正的表位肽。另外，在合成肽疫苗呈现向重组多表位肽疫苗发展的背景下(Shi YP,Hasnain,SE,Sacci JB,et al.Immunogenicity and in vitro protective efficacy of a recombinant multistage Plasmodium falciparum candidate vaccine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96,1615–162,1999；He YP,Xu WX,Hong AZ,et al.Immunogenic comparison for two different recombinant chimeric peptides(CP12 and CP22)containing one or two copies of three linear B cell epitopes from β-hCG subunit.J Biotechnol,151:15-21,2011)，为了研制抗体有效的预防性靶病毒多表位肽疫苗，靶蛋白线性表位及其抗体识别最小基序的鉴定就显得尤为重要。 

众所周知，从靶蛋白上鉴定出一段可诱发抗体生成的抗原性肽发明具有新颖性和创造性，因此国内外这样的授权专利比比皆是。从靶蛋白上鉴定出每一个抗体所能识别的精细表位肽，亦或它(们)被包含在一段已公开的抗原性肽序列内，它同样具有新颖性和创造性，因为它同样是实际应用的需要，如在研制基于表位最小基序肽的重组多表位肽的场合，就有可能尽可能多地组合线性表位肽(因为出于为适合如大肠杆菌和/或真核细胞高表达和研制成本考虑，设计的人工抗原肽长度有限，一般在200个氨基酸残基左右，其中为确保所设计多表位肽具有强免疫原性，必须同时组合一般长度10～30个残基的广谱性强辅助性和细胞毒性T细胞表位肽)，也能有助于产生特定所需有效的表位抗体(由于线性B细胞表位由最小3个残基最大8个残基组成，显然长抗原性肽中就可能存在N个表位，就有可能产生N个表位抗体，而选用精细表位肽则能使N个表位数减少到最低，以利目的抗体生成，同时避免可能有害的其他抗体生成)。总之，鉴定发明靶蛋白上精细表位肽的意义和应用益处是显而易见的。 

需要指出的是，因为口蹄疫对国家经济、贸易的重大影响，素有“政治经济病”之称，所以对于口蹄疫病毒疫苗的研究由来已久，也是第一个成功鉴定抗原表位肽并实现基因合成肽疫苗的病毒(ref.)，尤其以对O型FMDV研究居多。Pfaff等人早在1982年就鉴定到FMDV O 1K的VP 1(144-159aa) LRGDLQVLAQKVARTL是一个主要的抗体结合位点(Pfaff E,Mussgay M,HO,Schulz GE,Schaller H.Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus.EMBO J.1982；1(7):869-74.)；在同一年，Bittle等人发现FMDV O型，Kaufbeuren毒株的VP1(25-41aa)(200-213)是主要的B细胞抗原表位(Bittle JL,Houghten RA,Alexander H,Shinnick TM,Sutcliffe JG,Lerner RA,Rowlands DJ,Brown F.Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence.Nature.1982 Jul 1；298(5869):30-3.)。但是由于受到表位鉴定方法的限制，难以开展最小基序鉴定。由于这3个肽段在FMDV各型之间或型内都不具有保守性，加之FMDV毒株变异较快，一旦新疫情发生，必须重新组建针对性疫苗。此后，也有关于Asial I型外壳蛋白抗原表位的鉴定，VP1的(1-12aa),(17-29aa),(194-211aa)；VP2(40-50aa),VP3(26-39aa),VP4(30-41)，但同样未对其进行精细表位鉴定(Zhang ZW¹,Zhang YG,Wang YL,Pan L,Fang YZ,Jiang ST,Lü JL,Zhou P.Screening and identification of B cell epitopes of structural proteins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1.Vet Microbiol.2010 Jan6；140(1-2):25-33.)。以上研究从一个侧面反映靶蛋白表位扫描作图和最小基序鉴定并非易事的同时，也证实本发明5个O型FMDV的表位精细鉴定确是实际应用的需求，能体现创造性。 

发明内容

本发明的目的在于提供口蹄疫病毒(FMDV)O型毒株(O/BY/CHA/2010)中3个结构蛋白的精细抗原表位肽，以及这些表位最小基序肽的扩展肽(8肽)或长于该短肽(8肽)的抗原；还提供所述最小基序肽、最小基序肽的扩展短肽(8肽)或长于该短肽(8肽)的抗原的应用。 

本发明的内容进一步具体描述如下。 

为了实现本发明提供口蹄疫病毒(FMDV)O型毒株3个结构蛋白的精细抗原表位肽的目的，我们通过改良生物合成肽法，利用豚鼠抗FMDV O型标准血清，对流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的3个结构蛋白进行了线性表位扫描作图研究。在覆盖VP1、VP2和VP4三个结构蛋白全长序列的重叠18聚肽中，鉴定能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽；针 对抗原性肽进一步设计重叠8肽序列，通过免疫印迹反应进而确定其精细抗原表位及氨基酸序列。实验结果表明：通过改良生物合成肽法和豚鼠抗FMDV O型标准血清有效地鉴定出了口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)所含有的3个结构蛋白的精细抗原表位肽。 

本发明提供口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)中VP1、VP2和VP4三个结构蛋白的表位最小基序肽，其用豚鼠抗FMDV O型标准血清鉴定，共有5个表位，其氨基酸序列分别为：SEQ.ID NO.1、SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3、SEQ.ID NO.4和SEQ.ID NO.5所示。 

其中，VP1结构蛋白的最小表位基序肽的氨基酸序列为SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示，依次记为FMDV:VP1^142-147、FMDV:VP1^204-208；VP2结构蛋白的最小表位基序肽的氨基酸序列为SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4所示，依次记为FMDV:VP2^8-13、FMDV:VP2^14-18；VP4结构蛋白的最小表位基序肽的氨基酸序列为SEQ.ID NO.5所示，记为FMDV:VP4^22-27。 

本发明还提供上述5个最小表位基序肽的扩展短肽，其氨基酸序列依次为SEQ.ID No.6～SEQ.ID No.10所示，当化学合成或融合表达蛋白使用时，扩展的残基部分可增删或替代。 

本发明还提供所述的最小表位基序肽在重组多表位肽疫苗制备、药物或制备检测抗体方面的应用。 

本发明还提供表位最小基序肽的扩展短肽单独或组合在制备口蹄疫流行病诊断的血清识别表位标志物的应用。 

上述的口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)结构蛋白的精细抗原表位肽，在其他FMDV(O型、A型、Asial I型、C型、SAT I、SAT II、SAT III)流行毒株也存在，即构建这样的重组多表位肽疫苗对其他型口蹄疫病毒毒株也有效。 

附图说明

图1是VP1的21个18肽融合表达的SDS-PAGE分析结果；图1A：泳道1：BL21(DE3)空菌表达的总蛋白，泳道2：pXXGST-1质粒表达的截短GST188蛋白，泳道3～14：表达的覆盖结构蛋白VP1全长度相互重叠10个残基的18聚肽P1～P12融合蛋白，泳道15：蛋白分子量Marker；图1B：泳道1：BL21(DE3)空菌 表达的总蛋白，泳道2：pXXGST-1质粒表达的截短GST188蛋白，泳道3～11：表达的VP1结构蛋白18聚肽P13～P21融合蛋白，泳道12：蛋白分子量Marker。目的条带位于25kDa处对应的位置，截短GST188载体蛋白略小于重组目的蛋白。1B图泳道5中目的条带也是18聚肽，可能氨基酸组成及一级结构差异导致迁移率较低。 

图2是表达VP2结构蛋白26个相互重叠10个残基的18聚肽融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；图2A泳道1：pXXGST-1质粒表达的截短GST188蛋白，泳道2～14：表达的VP2结构蛋白18聚肽P1～P13融合蛋白，泳道15：蛋白分子量Marker；图2B：泳道1：pXXGST-1质粒表达的GST188蛋白，泳道2～14：表达的VP2结构蛋白18聚肽P14～P26融合蛋白，泳道15：蛋白分子量Marker。目的条带位于25kDa处偏下一点的位置，截短GST188载体蛋白略小于重组目的蛋白。 

图3是表达VP4结构蛋白10个18聚肽融合蛋白的SDS-PAGE分析结果：泳道1：pXXGST-1质粒表达的GST188蛋白，泳道2～11：表达VP4结构蛋白18聚肽P1～P10融合蛋白，泳道12：蛋白分子量Marker。目的条带位于25kDa处偏下一点的位置，截短GST188载体蛋白略小于重组目的蛋白。 

图4 FMDV O/BY/CHA/2010毒株3个结构蛋白18聚肽的免疫印迹鉴定；图4A：泳道1为BL21(DE3)空菌总蛋白对照，泳道2为pXXGST-1表达GST188蛋白对照，泳道3～11依次为VP1结构蛋白18聚肽P13～P21融合蛋白，泳道12为蛋白分子量Marker；图4B：泳道1为pXXGST-1质粒表达GST188蛋白对照，泳道2～14依次为VP2结构蛋白P1～P13，泳道15为蛋白分子量Marker；图4C：泳道1为GST188蛋白对照，泳道2～11依次为VP4结构蛋白P1～P10融合蛋白，泳道12为蛋白分子量Marker。 

图5 VP1 141aa-160aa的8肽克隆构建及表达注：1为pXXGST-1对照，2～14依次为重组8肽，15为Marker。目的条带位于25kDa～15kDa之间比较明显的蛋白条带，截短GST188载体蛋白略小于重组目的蛋白。 

图6 VP1-14的8肽克隆构建及表达；其中：1为pXXGST-1对照，2～11依次为VP1-14-1～VP1-14-10，12为Marker。 

图7 VP1-20的8肽克隆构建及表达；其中：1为pXXGST-1对照，2～12依次为VP1-20-1～VP1-20-11，13为Marker。 

图8 VP1-21的8肽克隆构建及表达；其中：1为pXXGST-1对照，2～7依次为VP1-21-1～VP1-21-6，8为Marker。 

图9 VP2-1的8肽克隆构建及表达；其中：1～11依次为VP2-1-1～VP2-1-11，12为Marker。 

图10 VP2-2的8肽克隆构建及表达；其中：1为pXXGST-1对照，2～9依次为VP2-2-1～VP2-2-8，10为Marker。 

图11 VP4-3的8肽克隆构建及表达；其中：1为BL21(DE3)空菌对照，2为pXXGST-1对照，3～13依次为VP4-3-1～VP4-3-11，14为Marker。 

图12 VP1 141-160的8肽免疫印迹鉴定；其中：1为pXXGST-1对照，2～14依次为VP1-N～VP1-Z，15为Marker。 

图13 VP1-14，VP1-20，VP1-21的8肽免疫印迹鉴定；其中：图13A：1为pXXGST-1对照，2～11依次为VP1-14-1～VP1-14-10，12为Marker；图13B：1为pXXGST-1对照，2～12依次为VP1-20-1～VP1-20-11，13为Marker；图13C：1为pXXGST-1对照，2～6依次为VP1-21-2～VP1-21-6，7为Marker。 

图14 VP2-1和VP2-2的8肽免疫印迹鉴定；其中：图14A：1为pXXGST-1对照，2～12依次为VP2-1-1～VP2-1-11，13为Marker；图14B：1为pXXGST-1对照，2～9依次为VP2-2-1～VP2-2-8，10为Marker。 

图15 VP4-3的8肽免疫印迹鉴定；其中：1为pXXGST-1对照，2～13依次为VP4-3-1～VP4-3-11，14为Marker。 

具体实施方式

本发明可进一步通过下列实例描述。列举实例并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。 

实施例1 

本实施例为FMDV O型毒株O/BY/CHA/20104个结构蛋白精细抗原表位的鉴定： 

(1)靶蛋白系列18/8聚肽编码DNA片段设计 

依据GenBank中FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP1、VP2、VP4三个结构蛋白的基因序列(GenBank登录号JN998085.1)，对其进行大肠杆菌密码子优化后，设计覆盖三个蛋白基因全长序列相互重叠10个aa残基的18/8聚肽编码DNA片段，并在其两端分别加上BamH I和TAA-Sal I粘性末端序列，化学合成各短肽编码DNA正负链片段。在完成第一轮18聚肽扫描作图后，就反应性肽段设计系列相互重叠7个残基的8聚肽，同时针对之前发现的抗原表位VP1(21-40)和VP1(141-160)设计系列8聚肽，开展第二轮抗体识别表位最小基序鉴定。 

(2)系列短肽融合蛋白表达质粒的构建、筛选及鉴定 

按分子克隆方法，将合成的18/8聚肽正负链编码DNA片段两两进行退火，然后通过DNA连接酶将它们分别与经BamH I和Sal I双酶切的载体pXXGST-1连接过夜，次日将连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态菌株，涂布在加Amp的LB平板上。挑单菌落接种于3mL加有Amp的LB液体培养基中，220r/min，30℃摇菌16～18h后，将菌液按2％比例转接到新的3mL加有Amp的LB液体培养基中，继续220r/min，30℃培养4h，直至菌体密度OD₆₀₀吸光值达到0.6，然后于42℃诱导表达5h；取1mL菌液离心收集菌体，加入50μL的ddH₂O悬浮菌体后，再加入50μL的2×上样Buffer混匀，沸水中放置5min，14000r/min离心10min，取10μL上清进行SDS-PAGE电泳(15％分离胶)，阴性对照为用载体对照pXXGST-1转化菌。图1-图3为18肽的SDS-PAGE结果；图5-图11为8肽克隆构建及表达。 

取短肽融合蛋白大于载体蛋白对照1～2kDa的重组克隆菌进行DNA测序，验证各化学合成短肽编码片段序列的正确性。 

(3)抗原反应性18/8聚肽的免疫印迹鉴定 

对DNA测序正确的系列18/8聚肽克隆菌进行热诱导表达，收集细菌总蛋白直接进行的免疫印迹鉴定，即，将电泳结束后SDS-PAGE凝胶上的各诱导菌总蛋白电转移到孔径0.2μm的醋酸纤维素膜上，用5％的脱脂牛奶(用PBST配制)封闭2h；加入豚鼠抗FMDV O型标准血清(用5％的脱脂牛奶按其效价进行稀释)孵育1h；用PBST洗3次，5min/次；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠 IgG(用5％的脱脂牛奶按其效价进行稀释)孵育1h；用洗涤液洗3次，5min/次；用曝光仪对实验结果进行检测(用ECL底物发光试剂盒)。图4为18聚肽的免疫印迹鉴定结果；图12-图15为8肽克隆的免疫印迹鉴定结果。 

(4)抗原表位最小基序的确定 

筛选到的反应性8聚肽如表1所示， 

表1 免疫印迹反应筛选到的18聚肽和8聚肽及精细表位的确定 

依据它们的共有序列确定出精细抗原表位VP1 142-147(PNVRGD)，VP1204-208(KIVAP)，VP2 8-13(TLLEDR)，VP2 14-18(ILTTR)，VP4 22-27(INNYYM)。