能够中和系统发育群1和系统发育群2的A型流感病毒以及B型流感病毒的人结合分子

摘要

本发明涉及结合分子例如人单克隆抗体，其结合系统发育群1和群2的A型流感病毒以及B型流感病毒的血凝素茎区中的表位，并且具有针对此类流感病毒的广泛中和活性。公开内容提供了编码结合分子的核酸分子，其序列和包含结合分子的组合物。结合分子可以用于系统发育群1和2的A型流感病毒以及B型流感病毒的诊断、预防和/或治疗中。

说明书

技术领域

本发明涉及医学。本发明特别涉及能够中和系统发育群1和系统发育 群2的A型流感病毒的人结合分子。特别地，本发明涉及能够中和系统发 育群1和系统发育群2的A型流感病毒以及B型流感病毒的结合分子。本 发明还涉及由系统发育群1和2的A型流感病毒并且还优选通过B型流感 病毒引起的感染的诊断、预防和/或治疗。

背景技术

流感感染（也称为“流感”或“流行性感冒”）是已知针对人类的最常见疾 病之一，每年在全世界引起三到五百万例严重疾病和250,000-500,000例死 亡。流感在季节性流行中快速传播，影响5-15%的人口，并且增加对卫生 保健的费用且引起生产力损失（世界卫生组织（WHO））。

存在引起在人和动物中的传染学的3类流感病毒（A、B和C型）。A 型和B型病毒是负责在人中观察到的流感季节性流行和大流行的因子。

A型流感病毒可以基于两种基因的抗原区中的变异而分类成流感病毒 亚型，所述两种基因编码病毒附着和细胞释放所需的表面糖蛋白血凝素 （HA）和神经氨酸酶（NA）。目前，在A型流感病毒中已知16个HA亚 型（H1-H16）和九个NA（N1-N9）抗原变体。流感病毒亚型还可参考其系 统发育群进行分类。系统发育分析（Fouchier等人，2005）已证实HA可细 分为两个主要群（Air，1981）：系统发育群1（本文也称为“群1”）中的H1、 H2、H5和H9亚型等，和系统发育群2（或“群2”）中的H3、H4和H7亚 型等。A型流感亚型中仅一些（即H1N1、H1N2和H3N2）在人中循环， 但16个HA和9个NA亚型的所有组合都已在动物中，特别是在鸟类物种 中得到鉴定。由A型流感感染的动物通常充当流感病毒的储库，并且某些 亚型已显示跨越对人的物种屏障，例如高致病性A型流感毒株H5N1。

B型流感病毒毒株仅感染人。在B型流感病毒毒株内的HA中的抗原 变异比在A型毒株内观察到的那些更弱。如由B/Yamagata/16/88（也称为 B/Yamagata）和B/Victoria/2/87（B/Victoria）谱系代表的（Ferguson等人， 2003），两个遗传和抗原上不同的B型流感病毒谱系在人中循环。尽管由B 型流感病毒引起的疾病谱一般比由A型流感病毒引起的那种更温和，但对 B型流感感染仍频繁观察到需要住院治疗的严重疾病。

处理每年流感流行的目前方法包括每年疫苗接种，优选生成异型交叉 保护。然而，在人中的循环流感病毒遭受持久的抗原变化，这需要流感疫 苗制剂的每年适应性改变，以确保流感疫苗株和循环流感毒株之间最紧密 的可能匹配。尽管用流感疫苗的每年疫苗接种是预防流感的最佳方法，但 抗病毒药物例如奥司他韦（）对于流感感染的预防和治疗可以是 有效的。然而，显示针对抗病毒药物例如奥司他韦的抗性的流感病毒毒株 数目是渐增的。

可替代方法是开发基于抗体的预防或治疗性处理，以中和多种季节性 和大流行流感病毒。保护不受流感病毒感染的大多数中和抗体的主要靶是 病毒HA蛋白质的球状头部（HA1部分），其含有受体结合位点，但遭受在 抗体结合位点中伴随氨基酸置换的持续遗传进化（抗原漂移）。

近来，已鉴定了识别系统发育群1（包括例如H1和H5流感亚型）的 A型流感病毒的血凝素保守茎区中的表位的广泛交叉中和抗体（参见例如 WO2008/028946），以及识别系统发育群2（包括例如H3和H7亚型）的A 型流感病毒的HA茎区中的高度保守表位的交叉中和抗体（WO 2010/130636）。这些抗体的中和活性受限于群1或群2流感病毒。此外，这 些抗体不能结合且中和B型流感病毒。

此外，WO2010/010466公开了与血凝素结合并且能够结合且中和群1 （包括H1和H5亚型）和群2（包括H3和H7亚型）的A型流感亚型的人 抗体FI6。这种抗体也不结合来自B型流感病毒的HA。

此外，US2009/0092620公开了识别H1和H3亚型的血凝素中以及属 于B/Victoria和B/Yamagata组的B型流感病毒的血凝素上存在的抗原结构 的鼠抗体。该抗体抑制几个H3N2毒株的血凝活性，暗示这种抗体结合HA 的球状头部中的表位。

考虑到由A型流感和B型流感病毒引起的呼吸系统疾病的严重性，以 及季节性流行具有的高经济影响和大流行的持续危险，存在用于预防和治 疗A和B型流感亚型的有效方法的持续需要。因此对结合分子优选广谱中 和性人结合分子仍存在需求，所述结合分子能够交叉中和系统发育群1和 系统发育群2的A型流感病毒，并且还优选交叉中和B型流感病毒。

发明内容

本发明提供了能够特异性结合来自系统发育群1（包括例如包含H1和 H5亚型的HA的流感病毒）的A型流感病毒毒株，和来自系统发育群2（包 括例如包含H3和H7亚型的HA的流感病毒）的A型流感病毒毒株的结合 分子。在一个实施方案中，结合分子还具有针对来自系统发育群1和系统 发育群2的A型流感病毒毒株的中和活性。在一个实施方案中，结合分子 还能够特异性结合B型流感病毒毒株，包括例如B/Yamagata和/或B/Victoria 谱系的B型流感病毒毒株。在一个实施方案中，结合分子还能够中和B型 流感病毒毒株，包括例如B/Yamagata和/或B/Victoria谱系的B型流感病毒 毒株。在一个实施方案中，结合分子能够在体内中和A型流感和/或B型流 感病毒毒株。在一个实施方案中，结合分子结合A和B型流感病毒的HA 蛋白质茎区中的保守表位。在一个实施方案中，结合分子不具有血凝抑制 （HI）活性。

本发明因此提供了结合血凝素蛋白茎区中的表位的结合分子，所述表 位在系统发育群1内的A型流感病毒亚型和系统发育群2内的流感病毒亚 型以及B型流感病毒亚型之间共享，并且因此涉及在群1和群2的A型流 感病毒亚型和B型流感病毒之间交叉反应的结合分子。本发明还涉及编码 人结合分子的至少结合区的核酸分子。

本发明的结合分子和/或核酸分子适合于用作用于A型流感病毒和B型 流感病毒的通用预防、诊断和/或治疗试剂，甚至与成因流感亚型无关。

推测根据本发明的结合分子结合迄今未知且高度保守的表位，所述表 位不倾向于或更少倾向于抗原漂移或转变。特别地，这个表位在属于系统 发育群1和系统发育群2的流感病毒以及B型流感病毒之间共享。还包含 本发明的结合分子鉴定和/或表征这些表位的用途。

本发明还提供了本发明的人结合分子和/或核酸分子在受试者的诊断、 预防和/或治疗中的用途，所述受试者具有流感病毒感染，或处于发展流感 病毒感染的危险中。此外，本发明涉及本发明的人结合分子和/或核酸分子 在此类流感感染的诊断/检测中的用途。

附图说明

图1显示通过CR9114阻断H1、H5、H9、H3和H7HA的构象变化。 （A）CR9114与A/New Caledonia/20/1999（H1）A/Viet Nam/1203/2004（H5）、 A/Hong Kong/1073/1999（H9）、A/Wisconsin/67/2005（H3）和A/Netherlands/ 219/2003（H7）的表面表达的rHA的多种构象–未切割的前体（HA0）； 中性pH，切割的（HA）；融合pH，切割的（融合pH）-的FACS结合。 结合表示为与未经处理的rHA（HA0）的结合百分比。（B）CR9114与如上 的表面表达的HA的FACS结合，除了在使切割的HA暴露于pH4.9前加 入mAb CR9114之外。

图2显示MAb CR9114分别与CR6261和CR8020竞争结合H1和H3。 使用生物层干涉量度法测量的，所示mAb与由100nM CR6261或CR9114 饱和的A/New Caledonia/20/1999（H1N1）的固定HA（小图A和B）、或与 由100nM CR8020或CR9114饱和的A/Wisconsin/67/2005（H3N2）的固定 HA（小图C和D）的另外结合程度。

图3证实CR9114在使用B型流感（B/Florida/04/2006）病毒的小鼠致 死性攻击模型中的预防功效。A.在攻击前的第-1天时，用15mg/kg CR9114 或媒介物对照静脉内处理的小鼠的卡普兰-迈耶生存曲线，随后为在第0天 时25LD B/Florida/04/2006的攻击。B.相对于第0天的平均体重变化（%）。 条代表平均值的95%CI。如果小鼠死亡/在研究过程中实施安乐死，则末次 观察到的体重推进。C.中值临床得分。条代表四分位数间距。临床得分说 明：0=无临床体征；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，在处理过程中较少反应； 3=皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，在处理过程中较少反应；4=皮毛粗糙，蜷 缩，呼吸困难，对操作/处理无活跃反应。

具体实施方式

如本发明中使用的术语定义在下文给出。

如本文使用的术语“包括”视为随后为单词“但不限于”。

如本文使用的，术语“结合分子”指完整免疫球蛋白包括单克隆抗体，例 如嵌合、人源化或人单克隆抗体，或包含免疫球蛋白片段的抗原结合和/或 可变结构域，所述免疫球蛋白片段与完整免疫球蛋白竞争特异性结合免疫 球蛋白的结合配偶体例如HA。与结构无关，抗原结合片段结合由完整免疫 球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可以包含肽或多肽，所述肽或多肽 包含结合分子氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个邻接氨基酸残基的氨 基酸序列。

如本文使用的，术语“结合分子”包括本领域已知的所有免疫球蛋白种类 和亚类。取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，结合分子可以分成完整 抗体的五个主要种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几个还可以 分成亚类（同种型），例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

抗原结合片段尤其包括Fab、F（ab'）、F（ab'）2、Fv、dAb、Fd、互 补决定区（CDR）片段、单链抗体（scFv）、二价单链抗体、单链噬菌体 抗体、双抗体、三抗体、四抗体、含有足以对（多）肽赋予特异性抗原结 合的至少免疫球蛋白片段的（多）肽等。上述片段可以合成产生或通过完 整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生，或他们可以通过重组DNA技术遗传 改造。生产方法是本领域众所周知的，并且例如在Antibodies:A Laboratory  Manual，Edited by:E.Harlow and D，Lane（1988），Cold Spring Harbor  Laboratory，Cold Spring Harbor，New York中描述，所述参考文献引入本文 作为参考。结合分子或其抗原结合片段可以具有一个或多个结合位点。如 果存在超过一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或它们可以是不同的。

结合分子可以是裸露或未缀合的结合分子，但还可以是免疫缀合物的 部分。裸露或未缀合的结合分子意指与效应部分或标签未缀合、可操作地 连接或以其他方式物理或功能结合的结合分子，所述效应部分或标签例如 尤其是毒性物质、放射性物质、脂质体、酶。应当理解裸露或未缀合的结 合分子不排除这样的结合分子，除了通过附着效应部分或标签外，所述结 合分子已进行稳定、多聚化、人源化或以任何其他方式操作。相应地，随 同包括所有翻译后修饰的裸露和未缀合的结合分子，包括其中修饰通过重 组结合分子生产细胞在天然结合分子生产细胞环境中作出，并且在起始结 合分子制备后人工引入。当然，术语裸露或未缀合的结合分子不排除结合 分子在施用于机体后与效应细胞和/或分子形成功能结合的能力，因为此类 相互作用中的一些是必需的，以便发挥生物学效应。结合的效应基团或标 签的缺乏因此在定义中应用于在体外而不是在体内的裸露或未缀合的结合 分子。

如本文使用的，术语“生物学样品”包含多个样品类型，包括血液及其他 生物起源的液体样品、固体组织样品例如活组织检查标本或组织培养，或 由其衍生的细胞及其后代。该术语还包括在其获得后已以任何方式操作的 样品，例如通过用试剂处理、溶解、或富集某些组分例如蛋白质或多核苷 酸。该术语包含得自任何物种的多个种类的临床样品，并且还包括培养中 的细胞、细胞上清液和细胞裂解产物。

如本文使用的术语“互补决定区”（CDR）意指在结合分子例如免疫球 蛋白的可变区内的序列，所述序列通常在很大程度上促成抗原结合位点， 所述抗原结合位点在形状和电荷分布中与抗原上识别的表位互补。CDR区 可以是对于蛋白质或蛋白质片段的线性表位、不连续表位或构象表位特异 性的，如以其天然构象在蛋白质上存在的，或在一些情况下，如例如通过 在SDS中溶解而变性的蛋白质上存在的。表位还可以由蛋白质的翻译后修 饰组成。

如本文使用的，术语“缺失”指示氨基酸或核苷酸序列中的变化，其中与 参考分子通常为天然存在的分子相比较，一个或多个氨基酸或核苷酸残基 分别不存在。

如本文使用的术语“表达调节核酸序列”指在特定宿主生物中可操作地 连接的编码序列表达所需和/或影响可操作地连接的编码序列表达的多核苷 酸序列，例如尤其是合适的转录起始、终止、启动子、增强子序列；阻遏 或激活序列；有效RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质 mRNA的序列；增强翻译效率的序列（例如核糖体结合位点）；增强蛋白 质稳定性的序列；和需要时，增强蛋白质分泌的序列可以是在选择的宿主 生物中显示活性的任何核酸序列，并且可以衍生自编码蛋白质的基因，所 述基因对于宿主生物是同源或异源的。表达调节序列的鉴定和采用对于本 领域技术人员是常规的。

如本文使用的，术语“功能变体”指包含核苷酸和/或氨基酸序列的结合 分子，与参考结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比较，所述结合分子的 核苷酸和/或氨基酸序列通过一个或多个核苷酸和/或氨基酸改变，并且能够 与结合配偶体即流感病毒竞争结合参考结合分子。换言之，参考结合分子 的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由核苷酸序列编码或 含有氨基酸序列的结合分子的结合特征，即结合分子仍能够识别且结合其 靶。功能变体可以具有保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸置换、添加和缺 失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术引入，例如定点诱变和随机 PCR介导的诱变，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基替换为具有相似结构或化学性质 的氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中进行 限定。这些家族包括具有下述侧链的氨基酸：碱性侧链（例如赖氨酸、精 氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电的极性侧 链（例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色 氨酸）、非极性侧链（例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮 氨酸）和芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）。对于技术人员 明确的是，可以采用与上文使用的分类法不同的其他氨基酸残基家族分类 法。此外，变体可以具有非保守氨基酸置换，例如氨基酸由具有不同结构 或化学性质的氨基酸残基的替换。相似的较小变化还可以包括氨基酸缺失 或插入，或两者。确定哪些氨基酸残基可以进行置换、插入或缺失而不取 消免疫活性的指导可以使用本领域众所周知的计算机程序发现。

核苷酸序列中的突变可以是在基因座处作出的单个改变（点突变）， 例如转换或颠换突变，或可替代地，多个核苷酸可以在单个基因座处进行 插入、缺失或改变。此外，一个或多个改变可以在核苷酸序列内的任何数 目的基因座处作出。突变可以通过本领域已知的任何合适方法执行。

如本文与A型流感病毒有关使用的术语“流感病毒亚型”指特征在于血 凝素（H）和神经氨酸酶（N）病毒表面蛋白质的多种组合的A型流感病毒 变体。根据本发明，流感病毒亚型可以通过其H编号提及，例如“包含H1 或H3亚型的HA的流感病毒”、或“H1流感病毒”“H3流感病毒”，或通过H 编号和N编号的组合提及，例如“流感病毒亚型H3N2”或“H3N2”。

术语流感病毒“亚型”特别包括每个亚型内的所有个别流感病毒“毒株”， 其通常由突变产生且显示不同致病概况。此类毒株也可以被称为病毒亚型 的多种“分离物”。相应地，如本文使用的，术语“毒株”和“分离物”可以互换 使用。关于人流感病毒毒株或分离物的目前命名法包括第一次分离的地理 位置、毒株编号和分离年份，通常伴随在圆括号中给出的HA和NA的抗原 描述，例如A/Moscow/10/00（H3N2）。非人毒株还在命名法中包括起源宿 主。

如本文与本发明的结合分子有关使用的术语“中和”指抑制流感病毒复 制性感染靶细胞的结合分子，与通过其实现中和的机制无关。因此，中和 可以例如通过抑制病毒与细胞膜的附着或粘附来实现，或通过在病毒与靶 细胞附着后抑制病毒和细胞膜的融合等来实现。

如本文与本发明的结合分子有关使用的术语“交叉中和”指本发明的结 合分子中和A和/或B型流感病毒的不同亚型的能力。

如本文使用的，术语“宿主”意指载体例如克隆载体或表达载体已引入其 内的生物或细胞。生物或细胞可以是原核或真核的。优选地，宿主是分离 的宿主细胞，例如培养中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅表明细胞被修饰用 于本发明的结合分子的（过）表达，并且包括最初表达这些结合分子的B 细胞，并且所述细胞已通过永生化、扩增、表达增强等进行修饰，以过表 达结合分子。应当理解术语宿主不仅意指特定主题生物或细胞，同样还指 此类生物或细胞的后代。因为某些修饰可以由于突变或环境影响而在后续 代中发生，所以此类后代事实上可能不等同于亲本生物或细胞，但仍包括 在如本文使用的术语“宿主”的范围内。

当应用于如本文定义的结合分子时，术语“人”指直接衍生自人或基于人 种系序列的分子。当结合分子衍生自或基于人序列且随后修饰时，如说明 书自始至终使用的它仍视为人的。换言之，当应用于结合分子时，术语人 意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的结合分子， 或基于在人或人淋巴细胞中出现的可变或恒定区且以一些形式修饰的结合 分子。因此，人结合分子可以包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基 酸残基，包含置换和/或缺失（例如在体外通过例如随机或定点诱变或者在 体内通过体细胞突变引入的突变）。如本文使用的“基于”指这样的情况：核 酸序列可以由模板确切拷贝，或具有较小突变，例如通过易错PCR方法， 或合成制备确切匹配模板或具有较小修饰。

术语“插入”也称为术语“添加”指示氨基酸或核苷酸序列中的变化，导致 与亲本序列相比较分别的一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加。

当应用于如本文定义的结合分子时，术语“分离的”指这样的结合分子， 其基本上不含其他蛋白质或多肽，特别是不含具有不同抗原特异性的其他 结合分子，并且还基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。例如，当结合 分子重组产生时，它们优选基本上不含培养基组分，并且当结合分子通过 化学合成产生时，它们优选基本上不含化学前体或其他化学制品，即它们 与涉及蛋白质合成的化学前体或其他化学制品分离。当应用于如本文定义 的编码结合分子的核酸分子时，术语“分离的”意指这样的核酸分子，其中编 码结合分子的核苷酸序列不含其他核苷酸序列，特别是编码结合其他结合 配偶体的结合分子的核苷酸序列。此外，术语“分离的”指基本上与其他细胞 组分分离的核酸分子，所述细胞组分在其天然宿主中天然伴随天然核酸分 子，例如核酶、聚合酶、或它天然与之结合的基因组序列。此外，“分离的” 核酸分子例如cDNA分子当通过重组技术产生时，可以基本上不含其他细 胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制品。

如本文使用的术语“单克隆抗体”指具有单一特异性的抗体分子的制备。 单克隆抗体展示对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。相应地，术语 “人单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自或基于人种系 免疫球蛋白序列或者衍生自完全合成序列的可变和恒定区。制备单克隆抗 体的方法与结合特异性无关。

如本文应用于物体时使用的术语“天然存在的”指物体或化合物可以在 自然界中找到的事实。例如，可以从自然界中的来源分离的存在于生物中， 并且在实验室中并未有意识地人为修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在 的。

如本发明中使用的术语“核酸分子”指聚合形式的核苷酸，并且包括 RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，以及上述的合成形式和混合 聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型的核苷 酸。该术语还包括单链和双链形式的DNA。此外，多核苷酸可以包括通过 天然存在和/或非天然存在的核苷酸键合连接在一起的任一或两种天然存在 和经修饰的核苷酸。核酸分子可以是化学或生物化学修饰的，或可以含有 非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员容易理解的。此类修饰包 括例如标记、甲基化、天然存在的核苷酸中的一个或多个由类似物的置换、 核苷酸间修饰例如不带电键合（例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、 氨基甲酸酯等）、带电键合（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）、悬垂 部分（例如多肽）、嵌合剂（例如吖啶、补骨脂素等）、螯合剂、烷化剂 和经修饰的键合（例如α异头核酸等）。上述术语还意欲包括任何拓扑构 象，包括单链、双链、部分双链体、三联体、发夹、环状和挂锁状（padlocked） 构象。还包括的是在其经由氢键合和其他化学相互作用结合指定序列的能 力中模拟多核苷酸的合成分子。此类分子是本领域已知的，并且包括例如 其中肽键合代替分子主链中的磷酸酯键合的那些。提及核酸序列包含其互 补体，除非另有说明。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为包含 其互补链，与其互补序列。互补链也是有用的，例如用于反义疗法、杂交 探针和PCR引物等。

术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸序列元件，其通常是物理连接 的并处于彼此的功能关系中。例如，如果启动子能够起始或调节编码序列 的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接，在所述情况下编码序 列应理解为“处于启动子的控制下”。

“药学可接受的赋形剂”意指与活性分子例如药物、试剂或结合分子组合 用于制备适宜或方便剂型的任何惰性物质。“药学可接受的赋形剂”是在使用 的剂量和浓度对于接受者无毒的赋形剂，并且与包含药物、试剂或结合分 子的制剂的其他成分相容。药学可接受的赋形剂是本领域广泛应用且已知 的。

如本文使用的，提及结合分子例如抗体及其结合配偶体例如抗原的相 互作用的术语“特异性结合”意指相互作用取决于结合配偶体上的特定结构 例如抗原决定簇或表位的存在。换言之，即使当结合配偶体存在于其他分 子或生物的混合物中时，抗体也优先结合或识别结合配偶体。结合可以通 过共价或非共价相互作用或两者的组合介导。再换言之，术语“特异性结合” 意指免疫特异性结合抗原决定簇或表位，并且不免疫特异性结合其他抗原 决定簇或表位。如通过例如放射性免疫测定法（RIA）、酶联免疫吸附测定 法（ELISA）、BIACORE或本领域已知的其他测定法测量的，免疫特异性 结合抗原的结合分子可以以更低亲和力结合其他肽或多肽。免疫特异性结 合抗原的结合分子或其片段可以与携带相同表位的有关抗原交叉反应。优 选地，免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段可以不与其他抗原交叉反 应。

如本文使用的，“置换”指示一个或多个氨基酸或核苷酸分别由不同氨基 酸或核苷酸的替换。

术语“治疗有效量”指如本文定义的结合分子的量，其有效预防、改善和 /或治疗由B型流感病毒感染产生的状况。如本文使用的改善可以指可见或 可察觉的疾病症状、病毒血症或流感感染的任何其他可测量表现的减少。

术语“治疗”指治愈或停止或至少延缓疾病进展的治疗性处理以及防护 或预防措施。需要治疗的人包括已遭受由流感病毒感染产生的状况的人， 以及其中待预防由流感病毒感染的人。部分或完全从由流感病毒感染恢复 的受试者也可能需要治疗。预防包含抑制或减少流感病毒的传播或者抑制 或减少与由流感病毒感染相关的一种或多种症状的开始、发展或进展。

术语“载体”指示第二种核酸分子可以插入其内用于引入宿主内的核酸 分子，所述核酸分子在所述宿主内复制且在一些情况下表达。换言之，载 体能够转运它已与之连接的核酸分子。如本文使用的术语“载体”考虑了克隆 以及病毒载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体（BAC） 和酵母人工染色体（YAC）以及衍生自细菌噬菌体或植物或动物（包括人） 病毒的载体。载体包含由提议的宿主识别的复制起点，和在表达载体的情 况下，由宿主识别的启动子及其他调节区。含有第二种核酸分子的载体通 过转化、转染或通过利用病毒进入机制引入细胞内。特定载体能够在它们 引入其内的宿主中自主复制（例如具有细菌复制起点的载体可以在细菌中 复制）。其他载体可以在引入宿主内之后整合到宿主的基因组内，并且因 此连同宿主基因组一起复制。

详述

在第一个方面，本发明包含能够特异性结合系统发育群1的A型流感 病毒亚型和系统发育群2的A型流感病毒亚型的血凝素（HA）的结合分子。 在一个实施方案中，结合分子能够中和系统发育群1和系统发育群2的A 型流感病毒亚型。本发明的结合分子因此是独特的，因为它们能够交叉中 和群1A型流感病毒毒株和群2A型流感病毒毒株。在一个实施方案中，结 合分子能够中和选自H1、H2、H5、H6、H8、H9和H11亚型的至少一个 或多个、优选两个或更多个、优选三个或更多个、优选四个或更多个、甚 至更优选五个或更多个群1A型流感病毒亚型，和选自H3、H4、H7和H10 亚型的至少一个或多个、优选两个或更多个、优选三个或更多个群2A型 流感病毒亚型。在一个实施方案中，结合分子能够特异性结合B型流感病 毒亚型的血凝素（HA）。在另一个实施方案中，结合分子能够中和B型流 感病毒。在一个实施方案中，结合分子能够在体内中和A和/或B型流感病 毒。A和B型流感病毒毒株可以是人和非人流感病毒毒株（即，得自非人 动物，例如鸟）。

优选地，结合分子是人结合分子。在优选实施方案中，结合分子是人 抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，结合分子衍生自VH1-69种系基因。因此，结合分 子都使用相同的VH1-69种系编码的构架。

在一个实施方案中，结合分子优选抗体和HA的结合相互作用排他地 通过重链可变序列介导。

在一个实施方案中，结合分子包括包含SEQ ID NO:133或SEQ ID NO: 139的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:140 或SEQ ID NO:151的氨基酸序列的重链CDR2，和包含选自SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:161 和SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链CDR3。本发明的结合分子的CDR 区显示于表7中。CDR区根据Kabat等人（1991）如Sequences of Proteins of  Immunological Interest中所述。

流感病毒通过下述感染细胞：与靶细胞的细胞表面上的唾液酸残基结 合，并且在转移到胞内体内之后，通过使其膜与胞内体膜融合且将基因组- 转录酶复合物释放到细胞内。受体结合和膜融合过程都由HA糖蛋白介导。 A型流感病毒的HA包含两个结构上不同的区域，即含有负责病毒附着至 靶细胞的受体结合位点并涉及HA的血凝活性的球状头部区，和含有病毒 包膜和细胞的胞内体膜之间的膜融合所需的融合肽的茎区。HA蛋白质是其 中每个单体由两个二硫键连接的糖肽HA1和HA2组成的三聚体，所述HA1 和HA2在感染过程中通过前体（HA0）的蛋白酶解切割产生。切割是病毒 感染力必需的，因为它是使HA准备用于膜融合所需的，以允许构象变化。 准备好的分子的活化在胞内体中以pH5-pH6的低pH发生，并且需要HA 结构中的广泛变化。用于其参与膜融合过程的HA准备和活化阶段各自呈 现用于例如通过单克隆抗体抑制的不同靶。在一个实施方案中，结合分子 能够阻断与膜融合相关的pH诱导的HA中的构象变化。

本发明的结合分子可能能够特异性结合HA蛋白质的HA0、HA1和/ 或HA2亚基。它们可能能够特异性结合HA蛋白质的HA0、HA1和/或HA2 亚基上的线性或结构和/或构象表位。HA分子可以由病毒纯化或重组产生 且任选在使用前分离。可替代地，HA可以在细胞表面上表达。在一个实施 方案中，本发明的结合分子能够特异性结合HA茎区中的表位。在一个实 施方案中，结合分子结合在HA的融合前构象中可接近的表位。

本发明的结合分子可能能够特异性结合流感病毒，所述流感病毒是有 活力的、活的和/或传染性的，或处于灭活/减毒形式。用于灭活/减毒病毒例 如流感病毒的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于用福尔马林、β- 丙内酯（BPL）、硫柳汞和/或紫外线处理。

本发明的结合分子还可能能够特异性结合流感病毒的一个或多个片 段，例如尤其是衍生自A和/或B型流感病毒亚型的一种或多种蛋白质和/ 或（多）肽或者一种或多种重组产生的A和/或B型流感病毒的蛋白质和/ 或多肽的制剂。多种A和B型流感毒株的蛋白质的核苷酸和/或氨基酸序列 可以在GenBank数据库、NCBI流感病毒序列数据库、流感序列数据库 （ISD）、EMBL数据库和/或其他数据库中找到。在各自的数据库中找到此 类序列完全在技术人员的范围内。

在另一个实施方案中，本发明的结合分子能够特异性结合上述蛋白质 和/或多肽的片段，其中所述片段至少包含由本发明的结合分子识别的表位。 如本文使用的“表位”是能够以足够高的亲和力与本发明的结合分子结合以 形成可检测的抗原结合分子复合物的部分。

本发明的结合分子可能能够或不能特异性结合HA的细胞外部分（本 文也称为可溶性HA（sHA））。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子例如多克隆或单克隆 抗体，或者结合分子可以是其抗原结合片段，包括但不限于重和轻链可变 区、Fab、F（ab'）、F（ab'）2、Fv、dAb、Fd、互补决定区（CDR）片段、 单链抗体（scFv）、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三抗体、四 抗体、和含有足以赋予与流感病毒毒株或其片段的特异性抗原结合的至少 免疫球蛋白片段的（多）肽等。在优选实施方案中，本发明的结合分子是 人单克隆抗体和/或其抗原结合片段。结合分子还可以是纳米抗体、α体 （alphabody）、亲和体、FN3-结构域支架及基于（人）重复蛋白质（如 Adnectin、Anticalin、Darpin等）中的结构域的其他支架、或包含表位结合 序列的其他支架。

本发明的结合分子可以以非分离或分离形式使用。此外，本发明的结 合分子可以单独或在包含本发明的至少一种结合分子（或其变体或片段） 的混合物中、和/或与结合流感且具有流感病毒抑制效应的其他结合分子一 起使用。换言之，结合分子可以组合使用，例如作为包含本发明的两种或 更多种结合分子、其变体或片段的药物组合物使用。例如，具有不同但互 补的活性的结合分子可以在单一疗法中组合，以实现所需预防、治疗或诊 断效应，但可替代地，具有相同活性的结合分子也可以在单一疗法中组合， 以实现所需预防、治疗或诊断效应。任选地，混合物还包含至少一种其他 治疗试剂。优选地，治疗试剂例如M2抑制剂（例如金刚烷胺（amantidine）、 金刚乙胺）和/或神经氨酸酶抑制剂（例如扎那米韦、奥司他韦）用于流感 病毒感染的预防和/或治疗中。

一般地，根据本发明的结合分子可以以这样的亲和常数（Kd值）结合 其结合配偶体，即群1的A型流感病毒（例如H1N1）和群2的A型流感 病毒（例如H3N2）、和/或B型流感病毒、和/或其片段，所述亲和常数低 于0.2x10^-4M、1.0x10^-5M、1.0x10^-6M、1.0x10^-7M，优选低于1.0x10^-8M， 更优选低于1.0x10^-9M，更优选低于1.0x10^-10M，甚至更优选低于1.0x10^-11M，并且特别低于1.0x10^-12M。亲和常数可以对于抗体同种型而改变。例如， 关于IgM同种型的亲和结合指至少约1.0x10^-7M的结合亲和力。亲和常数 可以例如使用表面等离振子共振例如使用BIACORE系统（Pharmacia  Biosensor AB，Uppsala，瑞典）进行测量。

本发明的结合分子显示出中和活性。中和活性可以例如如本文描述的 进行测量。测量中和活性的可替代测定法在例如WHO Manual on Animal  Influenza Diagnosis and Surveillance，Geneva:World Health Organisation， 2005，版本2002.5中描述。

一般地，根据本发明的结合分子具有50μg/ml或更少的中和活性，优 选20μg/ml或更少，更优选10μg/ml或更少的中和活性，甚至更优选5μg/ml 或更少，如在如实施例6中所述的体外病毒中和测定法（VNA）中测定的。 根据本发明的结合分子可以结合以可溶形式例如在样品或悬浮液中的流感 病毒或其片段，或可以结合与载体或基底结合或附着的流感病毒或其片段， 所述载体或基底例如微量滴定板、膜和珠等。载体或基底可以由玻璃、塑 料（例如聚苯乙烯）、多糖、尼龙、硝酸纤维素或特氟隆等制成。此类载体 的表面可以是固体或多孔的，并且具有任何方便的形状。此外，结合分子 可以结合以纯化/分离或非纯化/非分离形式的流感病毒。

如上文讨论的，本发明涉及能够识别且结合流感血凝素蛋白（HA）中 的表位的分离的人结合分子，其中所述结合分子具有针对系统发育群1的A 型流感病毒和系统发育群2的A型流感病毒的中和活性。根据本发明，因 此已显示本发明的结合分子交叉中和属于两个系统发育群的流感病毒亚 型。基于本文已公开的内容，技术人员可以确定抗体是否事实上与来自不 同亚型的HA蛋白质交叉反应，并且还可以确定它们是否能够在体外和/或 在体内中和不同亚型的流感病毒。

在一个实施方案中，根据本发明的结合分子选自：

a）包含SEQ ID NO:133的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:135的重链CDR3区的结合分子，

b）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:140的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:141的重链CDR3区的结合分子，

c）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:145的重链CDR3区的结合分子，

d）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:151的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区的结合分子，

e）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区的结合分子，

f）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:151的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:161的重链CDR3区的结合分子，

g）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:151的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:162的重链CDR3区的结合分子，和

h）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:141的重链CDR3区的结合分子。

在优选实施方案中，结合分子包括包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列 的重链CDR1区、包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的重链CDR2区、和 包含SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链CDR3区。

在另一个实施方案中，根据本发明的人结合分子选自：

a）具有SEQ ID NO:133的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:135的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:136的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

b）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:140的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:141的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:142的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:144的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

c）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:145的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:146的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

d）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:145的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:148的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

e）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:151的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:153的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

f）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:148的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

g）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:156的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:158的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

h）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:148的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

i）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:151的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:161的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:142的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:144的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

j）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:151的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:162的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:163的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

k）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:166的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

l）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:169的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

m）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:141的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:163的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

n）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:171的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

o）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:145的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:142的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，和

p）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:142的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:144的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子。

在另一个实施方案中，根据本发明的人结合分子选自：

a）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:145的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:146的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

b）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:171的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，

c）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:145的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:142的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子，和

d）包含SEQ ID NO:139的重链CDR1区、SEQ ID NO:134的重链CDR2 区、和SEQ ID NO:152的重链CDR3区、具有SEQ ID NO:142的氨基酸序 列的轻链CDR1区、具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的轻链CDR2区、 和具有SEQ ID NO:144的氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子。

在另一个实施方案中，根据本发明的结合分子选自：

a）包含SEQ ID NO:2的重链可变区的结合分子，

b）包含SEQ ID NO:6的重链可变区的结合分子，

c）包含SEQ ID NO:10的重链可变区的结合分子，

d）包含SEQ ID NO:14的重链可变区的结合分子，

e）包含SEQ ID NO:18的重链可变区的结合分子，

f）包含SEQ ID NO:22的重链可变区的结合分子，

g）包含SEQ ID NO:26的重链可变区的结合分子，

h）包含SEQ ID NO:30的重链可变区的结合分子，

i）包含SEQ ID NO:34的重链可变区的结合分子，

j）包含SEQ ID NO:38的重链可变区的结合分子，

k）包含SEQ ID NO:42的重链可变区的结合分子，

l）包含SEQ ID NO:46的重链可变区的结合分子，

m）包含SEQ ID NO:50的重链可变区的结合分子，

n）包含SEQ ID NO:54的重链可变区的结合分子，

o）包含SEQ ID NO:58的重链可变区的结合分子，和

p）包含SEQ ID NO:62的重链可变区的结合分子。

在一个实施方案中，根据本发明的结合分子选自包含SEQ ID NO:10 的重链可变区的结合分子，包含SEQ ID NO:54的重链可变区的结合分子， 包含SEQ ID NO:58的重链可变区的结合分子，和包含SEQ ID NO:62的重 链可变区的结合分子。

在进一步的实施方案中，根据本发明的结合分子包括包含选自SEQ ID  NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ  ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:56、SEQ ID  NO:60和SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变区。

在另外一个实施方案中，结合分子选自：

a）包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:4的轻链可变区的 结合分子，

b）包含SEQ ID NO:6的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的 结合分子，

c）包含SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区 的结合分子，

d）包含SEQ ID NO:14的重链可变区和SEQ ID NO:16的轻链可变区 的结合分子，

e）包含SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ ID NO:20的轻链可变区 的结合分子，

f）包含SEQ ID NO:22的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区 的结合分子，

g）包含SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:28的轻链可变区 的结合分子，

h）包含SEQ ID NO:30的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区 的结合分子，

i）包含SEQ ID NO:34的重链可变区和SEQ ID NO:36的轻链可变区 的结合分子，

j）包含SEQ ID NO:38的重链可变区和SEQ ID NO:40的轻链可变区 的结合分子，

k）包含SEQ ID NO:42的重链可变区和SEQ ID NO:44的轻链可变区 的结合分子，

l）包含SEQ ID NO:46的重链可变区和SEQ ID NO:48的轻链可变区 的结合分子，

m）包含SEQ ID NO:50的重链可变区和SEQ ID NO:52的轻链可变区 的结合分子，

n）包含SEQ ID NO:54的重链可变区和SEQ ID NO:56的轻链可变区 的结合分子，

o）包含SEQ ID NO:58的重链可变区和SEQ ID NO:60的轻链可变区 的结合分子，和

p）包含SEQ ID NO:62的重链可变区和SEQ ID NO:64的轻链可变区 的结合分子。

在一个实施方案中，根据本发明的人结合分子选自：包含SEQ ID NO: 10的重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区的结合分子，包含SEQ ID  NO:54的重链可变区和SEQ ID NO:56的轻链可变区的结合分子，包含SEQ  ID NO:58的重链可变区和SEQ ID NO:60的轻链可变区的结合分子，和包 含SEQ ID NO:62的重链可变区和SEQ ID NO:64的轻链可变区的结合分 子。

在优选实施方案中，根据本发明的结合分子用于用作药剂，并且优选 用于在由A和/或B型流感病毒引起的流感感染的诊断、治疗和/或预防处 理中使用。优选地，引起流感感染且可以使用本发明的结合分子治疗的流 感病毒是系统发育群1和/或2的A型流感病毒，和/或B型流感病毒。本 发明还涉及包含根据本发明的至少一种结合分子和药学可接受的赋形剂的 药物组合物。

在另外一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的结合分子在制备用 于流感病毒感染的诊断、预防和/或治疗的药剂中的用途。此类感染可以在 小群体中发生，但还可以在季节性流行或更糟的其中数百万个体处于危险 中的全球大流行中传播到全世界。本发明提供了可以中和引起此类季节性 流行以及潜在的大流行的流感毒株感染的结合分子。重要的是，目前可以 设想使用与多种流感亚型有关的本发明的结合分子的保护和治疗，因为已 公开本发明的结合分子能够交叉中和包含H1、H2、H5、H6、H8、H9和 H11亚型的系统发育群1以及包含亚型H3、H4、H7和H10亚型的系统发 育群2以及B型流感亚型的多个流感亚型。

本发明的另一个方面包括如本文定义的结合分子的功能变体。如果变 体能够与“亲本”或“参考”结合分子竞争特异性结合流感病毒或其片段，则分 子视为根据本发明的结合分子的功能变体。换言之，当功能变体仍能够结 合流感病毒或其片段的相同或重叠表位时，分子视为根据本发明的结合分 子的功能变体。为了本申请，“亲本”和“参考”将作为同义词使用，意指参考 或亲本分子的信息或物理分子自身可以构成用于变异的基础。功能变体包 括但不限于在一级结构序列中基本上相似的衍生物，包括在Fc受体或涉及 效应子功能的其他区域中具有修饰的那些，和/或含有例如在亲本结合分子 中未发现的化学和/或生物化学的体外和/或体内修饰的那些。此类修饰尤其 包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生 物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚 乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。

可替代地，功能变体可以是如本发明中定义的结合分子，其包含与亲 本结合分子的氨基酸序列相比较含有一个或多个氨基酸的置换、插入、缺 失或其组合的氨基酸序列。此外，功能变体可以包含在氨基或羧基末端任 一或两者处的氨基酸序列的平截。与亲本结合分子相比较，根据本发明的 功能变体可以具有相同或不同、更高或更低的结合亲和力，但仍能够结合 流感病毒或其片段。例如，与亲本结合分子相比较，根据本发明的功能变 体可以对于流感病毒或其片段具有增加或降低的结合亲和力。优选地，可 变区包括但不限于构架区、高变区特别是CDR3区的氨基酸序列是经修饰 的。一般地，轻链和重链可变区包含三个高变区，包含三个CDR，和更保 守的区域，所谓的构架区（FR）。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来 自高变环的氨基酸残基。预期属于本发明范围的功能变体与如本文定义的 亲本结合分子具有至少约50%-约99%、优选至少约60%-约99%、更优 选至少约70%-约99%、甚至更优选至少约80%-约99%、最优选至少约 90%-约99%、特别是至少约95%-约99%、且特别是至少约97%-约99% 氨基酸序列同一性和/或同源性。本领域技术人员已知的计算机算法例如尤 其是Gap或Bestfit可以用于最佳比对待比较的氨基酸序列，并且限定相似 或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过经由本领域已知的一般分子生物 学方法改变亲本结合分子或其部分而获得，所述分子生物学方法包括但不 限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变和重和/或轻链改组。在一 个实施方案中，本发明的功能变体具有针对群1和群2的A型流感病毒和/ 或B型流感病毒的中和活性。与亲本结合分子相比较，中和活性可以是相 同的，或者是更高或更低的。自此以后，当使用术语（人）结合分子时， 这还包含（人）结合分子的功能变体。用于确认变体结合分子是否具有中 和活性的测定法是本领域众所周知的（参见WHO Manual on Animal  Influenza Diagnosis and Surveillance，Geneva:World Health Organisation，2005 版本2002.5）。

在再进一步方面，本发明包括免疫缀合物，即包含如本文定义的至少 一种结合分子且还包含至少一种标签的分子，所述标签例如尤其是可检测 部分/试剂。本发明还考虑的是根据本发明的免疫缀合物的混合物或根据本 发明的至少一种免疫缀合物和另一种分子的混合物，所述另一种分子例如 治疗试剂或另一种结合分子或免疫缀合物。在进一步实施方案中，本发明 的免疫缀合物可以包含超过一种标签。这些标签可以彼此相同或不同，并 且可以非共价连接/缀合至结合分子。一种或多种标签还可以通过共价键合 直接连接/缀合至人结合分子。可替代地，一种或多种标签可以借助于一种 或多种连接化合物连接/缀合至结合分子。用于将标签缀合至结合分子的技 术是技术人员众所周知的。

本发明的免疫缀合物的标签可以是治疗试剂，但它们还可以是可检测 部分/试剂。在治疗和/或预防中合适的标签可以是毒素或其功能部分、抗生 素、酶、增强吞噬作用或免疫刺激的其他结合分子。包含可检测试剂的免 疫缀合物可以在诊断上用于例如评估受试者是否已感染流感病毒，或监控 流感病毒感染的发展或进展作为临床测试程序的部分，以例如测定给定治 疗方案的功效。然而，它们还可以用于其他检测和/或分析和/或诊断目的。 可检测部分/试剂包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光 材料、放射性材料、正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。用于标记 结合分子用于检测和/或分析和/或诊断用途的标签取决于使用的具体检测/ 分析/诊断技术和/或方法，例如尤其是（组织）样品的免疫组织化学染色、 流式细胞术检测、扫描激光细胞计数检测、荧光免疫测定法、酶联免疫吸 附测定法（ELISA）、放射性免疫测定法（RIA）、生物测定法（例如吞噬作 用测定法）、蛋白质印迹应用等。本领域已知的用于检测/分析/诊断技术和/ 或方法的合适标记完全在技术人员的范围内。

此外，本发明的人结合分子或免疫缀合物还可以附着至固体载体，所 述固体载体特别用于体外免疫测定法或者流感病毒或其片段的纯化。此类 固体载体可以是多孔或非多孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可 以融合至标记序列例如肽，以促进纯化。例子包括但不限于六组氨酸标签、 血凝素（HA）标签、myc标签或flag标签。可替代地，抗体可以缀合至第 二抗体，以形成抗体异缀合物。在另一个方面，本发明的结合分子可以缀 合/附着至一种或多种抗原。优选地，这些抗原是由结合分子-抗原缀合物施 用于其的受试者的免疫系统识别的抗原。抗原可以彼此相同，但也可以彼 此不同。用于附着抗原和结合分子的缀合方法是本领域众所周知的，并且 包括但不限于交联剂的使用。本发明的结合分子将结合流感病毒HA，并且 附着至结合分子的抗原将起始对缀合物的有力的T细胞攻击，这最终导致 流感病毒的破坏。

接下来为了通过直接或间接经由例如接头缀合以化学方法产生免疫缀 合物，免疫缀合物可以作为包含本发明的结合分子和合适标签的融合蛋白 产生。融合蛋白可以通过本领域已知的方法例如通过构建核酸分子且随后 表达核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含与编码一种或多种合适标签 的核苷酸序列在框内的编码结合分子的核苷酸序列。

本发明的另一个方面提供了编码至少根据本发明的结合分子、功能变 体或免疫缀合物的核酸分子。此类恢复可以用作中间产物用于克隆目的， 例如在如上所述的亲和力成熟的过程中。在优选实施方案中，核酸分子是 分离或纯化的。

技术人员应当理解这些核酸分子的功能变体也预期为本发明的部分。 功能变体是可以使用标准遗传密码直接翻译的核酸序列，以提供与由亲本 核酸分子翻译的那种相同的氨基酸序列。

优选地，核酸分子编码包含如上所述的CDR区的结合分子。在进一步 的实施方案中，核酸分子编码包含本发明的结合分子的两、三、四、五或 甚至所有六个CDR区的结合分子。

在另一个实施方案中，核酸分子编码包含重链的结合分子，所述重链 包含如上所述的可变重链序列。在另一个实施方案中，核酸分子编码包含 轻链的结合分子，所述轻链包含如上所述的可变轻链序列。本发明的结合 分子的重和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列在下文给出。

本发明的另一个方面提供了包含根据本发明的一种或多种核酸分子的 载体，即核酸构建体。载体可以衍生自质粒例如尤其是F、R1、RP1、Col、 pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌体例如λ、Λ、M13、Mu、P1、P22、Qβ、 T-even、T-odd、T2、T4、T7等；植物病毒。载体可以用于克隆和/或表达 本发明的结合分子，并且甚至可以用于基因治疗目的。包含可操作地连接 至一种或多种表达调节核酸分子的根据本发明的一种或多种核酸分子的载 体也由本发明包含。载体的选择取决于遵循的重组程序和使用的宿主。载 体在宿主细胞中的引入可以受尤其是磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-右旋 糖酐介导的转染、阳离子脂质体（lipofectamin）转染或电穿孔影响。载体 可以自主复制或可以连同它们已整合到其内的染色体一起复制。优选地， 载体含有一种或多种选择标记。标记的选择可以取决于选择的宿主细胞， 尽管这对于本发明并不是关键的，如本领域技术人员众所周知的。它们包 括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、博来霉素、来自单纯 疱疹病毒的胸苷激酶基因（HSV-TK）、来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因 （dhfr）。本发明还涵盖了载体，其包含可操作地连接至编码蛋白质或肽的 一种或多种核酸分子的如上所述编码人结合分子的一种或多种核酸分子， 所述蛋白质或肽可以用于分离人结合分子。这些蛋白质或肽包括但不限于 谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合多组氨酸、绿色荧光蛋白、 萤光素酶和β-半乳糖苷酶。

含有上文提及的载体的一个或多个拷贝的宿主是本发明的另外主题。 优选地，宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、 真菌或细菌起源的细胞。细菌细胞包括但不限于来自革兰氏阳性菌或革兰 氏阴性菌的细胞，例如埃希氏杆菌属（Escherichia）的几个物种例如大肠杆 菌（E.coli）和假单胞菌属（Pseudomonas）。在真菌细胞的组中，优选使用 酵母细胞。酵母中的表达可以通过使用酵母菌株例如尤其是巴斯德毕赤酵 母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和多形汉逊酵 母（Hansenula polymorpha）来实现。此外，昆虫细胞例如来自果蝇和Sf9 的细胞可以用作宿主细胞。除此之外，宿主细胞可以是植物细胞例如尤其 是来自作物植物例如林业植物的细胞，或来自提供食物和原材料的植物例 如谷类植物或药用植物的细胞，或来自观赏植物的细胞，或来自球根花卉 作物的细胞。经转化的（转基因）植物或植物细胞通过已知方法产生，所 述已知方法例如土壤杆菌属介导的基因转移、叶盘转化、通过聚乙二醇诱 导的DNA转移的原生质体转化、电穿孔、超声处理、显微注射或生物射弹 基因转移。另外，合适的表达系统可以是杆状病毒系统。使用哺乳动物细 胞例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或 Bowes黑素瘤细胞的表达系统在本发明中是优选的。哺乳动物细胞提供具 有最类似于哺乳动物起源的天然分子的翻译后修饰的表达蛋白质。因为本 发明涉及可以已施用于人的分子，所以完全的人表达系统将是特别优选的。 因此，甚至更优选地，宿主细胞是人细胞。人细胞的例子尤其是HeLa、911、 AT1080、A549、293和HEK293T细胞。在优选实施方案中，人生产者细胞 包含以可表达形式的编码腺病毒E1区的核酸序列的至少功能部分。在甚至 更优选的实施方案中，所述宿主细胞衍生自人视网膜，且用包含腺病毒E1 序列的核酸永生化，例如911细胞或细胞系，所述细胞系于1996年2月29 日在编号96022940下保藏于欧洲细胞培养物收藏中心（European Collection  of Cell Cultures）（ECACC），CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，英国， 并且在商标（PER.C6是Crucell Holland B.V.的注册商标）下销售。 为了本申请的目的，“PER.C6细胞”指在编号96022940下保藏的细胞或祖 先、上游或下游传代以及来自保藏细胞祖先的子代，以及前述任何的衍生 物。重组蛋白质在宿主细胞中的生产可以根据本领域众所周知的方法执行。 在商标下销售的细胞作为用于目的蛋白质的生产平台的用途已在 WO00/63403中描述，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考。

在另外一个实施方案中，本发明的结合分子还可以在转基因、非人哺 乳动物例如尤其是兔、山羊或牛中产生，并且分泌到例如其乳内。

在另外一个可替代实施方案中，根据本发明的结合分子可以通过转基 因非人哺乳动物，例如表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或兔产生。优 选地，转基因非人哺乳动物具有包含编码如上所述的人结合分子的全部或 部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。转基因非人哺乳动物可以 用流感病毒或其片段的纯化或富集制剂进行免疫接种。用于免疫接种非人 哺乳动物的方案是本领域充分确定的。参见Using Antibodies:A Laboratory  Manual，Edited by:E.Harlow，D.Lane（1998），Cold Spring Harbor  Laboratory，Cold Spring Harbor，New York and Current Protocols in  Immunology，Edited by:J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M. Shevach，W.Strober（2001），John Wiley&Sons Inc.，New York，其公开内 容引入本文作为参考。免疫接种方案通常包括多重免疫接种，连同或不连 同佐剂例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，但还可以包括裸露DNA免疫 接种。在另一个实施方案中，人结合分子通过衍生自转基因动物的B细胞、 浆细胞和/或记忆细胞产生。在另外一个实施方案中，人结合分子通过杂交 瘤产生，所述杂交瘤通过得自上述转基因非人哺乳动物的B细胞与永生化 细胞的融合进行制备。如可得自上述转基因非人哺乳动物的B细胞、浆细 胞和杂交瘤以及如可得自上述转基因非人哺乳动物、B细胞、浆细胞和/或 记忆细胞和杂交瘤的人结合分子也是本发明的部分。

在再进一步方面，本发明提供了包含至少根据本发明的结合分子、优 选人单克隆抗体、至少其功能变体、至少根据本发明的免疫缀合物和/或其 组合的组合物。除此之外，组合物可以尤其包含稳定分子例如白蛋白或聚 乙二醇或盐。优选地，使用的盐是保留结合分子的所需生物活性且不赋予 任何不需要的毒理学效应的盐。需要时，本发明的人结合分子可以在材料 中或上包被，以保护其不受酸或可以灭活结合分子的其他天然或非天然状 况。

在再进一步方面，本发明提供了包含至少如本发明中定义的核酸分子 的组合物。组合物可以包含水溶液，例如含有盐（例如NaCl或如上所述的 盐）、去污剂（例如SDS）和/或其他合适组分的水溶液。

此外，本发明涉及包含至少本发明的结合分子例如人单克隆抗体（或 其功能片段或变体）、至少根据本发明的免疫缀合物、至少根据本发明的组 合物或其组合的药物组合物。本发明的药物组合物还包含至少一种药学可 接受的赋形剂。药学可接受的赋形剂是技术人员众所周知的。根据本发明 的药物组合物还可以包含至少一种其他治疗试剂。合适的试剂也是技术人 员众所周知的。

在优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少一种另外的结 合分子，即药物组合物可以是结合分子的混合剂（cocktail）或混合物。药 物组合物可以包含至少两种根据本发明的结合分子、或至少一种根据本发 明的结合分子和至少一种进一步的流感病毒结合和/或中和分子，例如针对 HA蛋白质或针对流感病毒上存在的其他抗原结构的另一种抗体例如M2。 在另一个实施方案中，另外的结合分子可以配制用于同时的分开或顺次施 用。

在一个实施方案中，药物组合物可以包含具有针对A型流感病毒和/或 B型流感病毒的中和活性的两种或更多种结合分子。在一个实施方案中， 当组合使用时，结合分子显示出协同中和活性。如本文使用的，术语“协同 作用”意指当组合使用时，结合分子的组合效应大于其个别使用时的叠加效 应。协同作用的结合分子可以与流感病毒的相同或不同片段上的不同结构 结合。计算协同作用的方法是借助于组合指数。组合指数（CI）的概念已 由Chou和Talalay（1984）描述。组合物可以例如包含具有中和活性的一种 结合分子和一种非中和结合分子。非中和与中和结合分子也可以在中和流 感病毒方面协同作用。

在一个实施方案中，药物组合物可以包含至少一种根据本发明的结合 分子和至少一种进一步的流感病毒中和结合分子。药物组合物中的结合分 子优选能够与不同亚型的流感病毒反应。结合分子应具有高亲和力并且应 具有广泛特异性。优选地，结合分子是交叉中和分子，因为它们各自中和 不同亚型的中和流感病毒。此外，优选地，它们中和与不同流感病毒亚型 各自可能的一样多的毒株。

根据本发明的药物组合物还可以包含至少一种治疗、预防和/或诊断试 剂。优选地，药物组合物包含至少一种其他的预防和/或治疗试剂。优选地， 所述进一步的治疗和/或预防试剂是能够预防和/或治疗流感病毒感染和/或 由此类感染产生的状况的试剂。治疗和/或预防试剂包括但不限于抗病毒剂。 此类试剂可以是结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序 列、抗病毒肽等。目前用于治疗由流感病毒感染的患者的其他试剂是M2 抑制剂（例如金刚烷胺、金刚乙胺）和/或神经氨酸酶抑制剂（例如扎那米 韦、奥司他韦）。这些可以与本发明的结合分子组合使用。“组合”在本文中 意指同时、作为分开制剂、或作为一个单一组合制剂、或根据顺次施用方 案作为分开制剂、以任选次序。处于实验阶段的能够预防和/或治疗由流感 病毒的感染和/或由此类感染产生的状况的试剂也可以用作在本发明中有用 的其他治疗和/或预防试剂。

本发明的结合分子和/或药物组合物可以在人中使用前在合适的动物模 型系统中进行测试。此类动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂和猴。

一般地，药物组合物在制造和贮存条件下必须是无菌和稳定的。本发 明的结合分子、免疫缀合物、核酸分子或组合物可以以粉末形式，用于在 递送前或递送时在合适的药学可接受的赋形剂中重构。在用于制备无菌可 注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥（冻 干），这获得来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外所需成分的 粉末。

可替代地，本发明的结合分子、免疫缀合物、核酸分子或组合物可以 在溶液中，并且合适的药学可接受的赋形剂可以在递送前或递送时加入和/ 或混合，以提供单位剂量可注射形式。优选地，在本发明中使用的药学可 接受的赋形剂适合于高药物浓度，可以维持合适的流动性且在需要时，可 以延迟吸收。

药物组合物的最佳施用途径的选择将受几种因素影响，包括在组合物 内的活性分子的理化性质、临床状况的紧急性和活性成分的血浆浓度与所 需疗效的关系。例如，需要时，本发明的结合分子可以用保护其不受快速 释放的载体进行制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂、经皮贴剂和微胶 囊化递送系统。尤其可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯 乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此外，可能需 要用材料或化合物包被结合分子，或使结合分子与材料或化合物共施用， 所述材料或化合物防止人结合分子的失活。例如，结合分子可以在合适的 载体例如脂质体或稀释剂中施用于受试者。

施用途径可以分成两个主要类别，经口和肠胃外施用。优选施用途径 是静脉内或通过吸入。

经口剂型尤其可以配制为片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可 分散粉末或颗粒剂、乳状液、硬胶囊、软明胶胶囊、糖浆剂或酏剂、丸剂、 糖衣丸、液体、凝胶或浆料。这些制剂可以含有药学赋形剂，包括但不限 于惰性稀释剂、粒化剂和崩解剂、结合剂、润滑剂、防腐剂、着色剂、调 味剂或甜味剂、植物油或矿物油、湿润剂和增稠剂。

本发明的药物组合物还可以配制用于肠胃外施用。用于肠胃外施用的 制剂尤其可以为水性或非水性等渗无菌无毒注射或输注溶液或悬浮液的形 式。溶液或悬浮液可以包含在采用的剂量和浓度对于接受者无毒的试剂， 例如1,3-丁二醇、林格氏溶液、汉克氏溶液、等渗氯化钠溶液、油、脂肪酸、 局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、粘度或溶解度增加试剂、水溶性抗氧化剂、 油溶性抗氧化剂和金属螯合剂。

在进一步方面，本发明的结合分子例如人单克隆抗体（其功能片段和 变体）、免疫缀合物、组合物或药物组合物可以用作药剂。因此，使用本发 明的结合分子、免疫缀合物、组合物或药物组合物诊断、治疗和/或预防流 感病毒感染的方法是本发明另一个部分。上文提及的分子尤其可以用于引 起流感病毒感染的流感病毒的诊断、预防、治疗或其组合中，所述流感病 毒包含H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10和/或H11亚型的 HA。在一个实施方案中，上文提及的分子还可以用于由B型流感病毒引起 的流感病毒感染的诊断、预防、治疗或其组合中。它们适合于治疗患有流 感病毒感染的仍未治疗的患者和具有流感病毒感染或就流感病毒感染进行 治疗的患者。

上文提及的分子或组合物可以与在诊断、预防和/或治疗中有用的其他 分子结合采用。它们可以在体外、离体或在体内使用。例如，本发明的结 合分子例如人单克隆抗体（或其功能变体）、免疫缀合物、组合物或药物组 合物可以与针对流感病毒的疫苗（如果可用）共施用。可替代地，疫苗还 可以在本发明的分子施用前或后施用。代替疫苗，抗病毒剂也可以与本发 明的结合分子结合采用。合适的抗病毒剂在上文提及。

分子一般以治疗或诊断有效量在本发明的组合物和药物组合物中配 制。可替代地，它们可以分开配制且施用。例如，其他分子例如抗病毒剂 可以全身应用，而本发明的结合分子可以静脉内应用。

治疗可以靶向对流感感染敏感的患者组。此类患者组包括但不限于例 如老年（例如≥50岁、≥60岁、且优选≥65岁）、年轻（例如≤5岁、≤1岁）、 住院患者和已感染的患者，所述患者已用抗病毒化合物进行治疗但已显示 不足够的抗病毒应答。

剂量方案可以调整为提供最佳所需应答（例如治疗应答）。合适的剂量 范围可以例如是0.01-100mg/kg体重、优选0.1-50mg/kg体重、优选0.01-15 mg/kg体重。此外，例如，可以施用单次推注，可以随着时间过去施用几个 分份剂量，或可以如由治疗情况的紧迫性指示的按比例减少或增加剂量。 根据本发明的分子和组合物优选是无菌的。致使这些分子和组合物无菌的 方法是本领域众所周知的。在诊断、预防和/或治疗中有用的其他分子可以 在与对于本发明的结合分子提议的相似剂量方案中施用。如果其他分子分 开施用，则它们可以在本发明的人结合分子或药物组合物中的一种或多种 施用之前（例如前2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、 60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、 16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7 天、2周、4周或6周）、同时或之后（例如后2分钟、5分钟、10分钟、 15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、 10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小 时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周）施用于患者。确切 给药方案通常在人患者中的临床试验过程中选出。

人结合分子和包含人结合分子的药物组合物是特别有用的，并且通常 在作为体内治疗试剂施用于人类时是优选的，因为针对施用的抗体的接受 者免疫应答通常基本上小于通过施用单克隆鼠、嵌合或人源化结合分子引 起的那种。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的结合分子例如中和性人单克 隆抗体（其功能片段和变体）、免疫缀合物、核酸分子、组合物或药物组合 物在制备用于流感病毒感染特别是引起流感病毒感染的流感病毒的诊断、 预防、治疗或其组合的药剂中的用途，所述流感病毒包含H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10和/或H11亚型和/或B型流感病毒的HA。

接下来，包含至少根据本发明的结合分子例如中和性人单克隆抗体（其 功能片段和变体）、至少免疫缀合物、至少核酸分子、至少组合物、至少药 物组合物、至少载体、至少宿主或其组合的试剂盒也是本发明的部分。任 选地，本发明的试剂盒的上述组分包装在合适容器中，并且标记用于所示 状况的诊断、预防和/或治疗。上文提及的组分可以作为水、优选无菌溶液 或作为冻干、优选无菌的用于重构的制剂而贮存于单元或多剂量容器中。 容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成，并且可以具有无菌访问口（例 如容器可以是具有可通过皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶）。 试剂盒还可以包括包含药学可接受的缓冲剂的更多容器。它还可以包括从 商业和用户立场期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针、 注射器、用于合适宿主中的一种或多种的培养基、和可能的甚至至少一种 其他的治疗、预防或诊断试剂。与试剂盒结合的可以是照例包括在治疗、 预防或诊断产品的商业包装中的说明书，其含有关于例如关于此类治疗、 预防或诊断产品使用的适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌和/或警告 的信息。

根据本发明的结合分子还可以有利地用作用于检测流感病毒的体外方 法中的诊断试剂。本发明因此还涉及检测样品中的流感病毒系统发育群1 或群2或B型流感病毒的方法，其中所述方法包括步骤（a）使样品与诊断 有效量的根据本发明的结合分子（其功能片段和变体）或免疫缀合物接触， 和（b）测定结合分子或免疫缀合物是否特异性结合样品的分子。样品可以 是生物样品，包括但不限于来自（潜在）受感染受试者的血液、血清、粪 便、唾液、鼻咽抽吸物、支气管灌洗液、尿、组织或其他生物材料，或非 生物样品例如水、饮料等。（潜在）受感染受试者可以是人受试者，但怀疑 作为流感病毒携带者的动物也可以使用本发明的人结合分子或免疫缀合物 就病毒的存在进行测试。样品可以首先进行处理，以使得它更适合于检测 方法。处理方法尤其以这样的方式处理怀疑含有和/或包含病毒的样品，使 得病毒将分解成抗原组分例如蛋白质、（多）肽或其他抗原片段。优选地， 在允许人结合分子和可能存在于样品中的病毒或其抗原组分之间的免疫复 合物形成的条件下，使本发明的人结合分子或免疫缀合物与样品接触。随 后通过合适方法检测且测量指示样品中的病毒存在的免疫复合物（如果存 在的话）形成。此类方法尤其包括同质和异质结合免疫测定法，例如放射 性免疫测定法（RIA）、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS、BIACORE 和蛋白质印迹分析。

尤其是用于患者血清和血液和血液衍生产品的大规模临床筛选的优选 测定法技术是ELISA和蛋白质印迹技术。ELISA测试是特别优选的。对于 在这些测定法中作为试剂的用途，本发明的结合分子或免疫缀合物方便地 与微量滴定孔的内部表面键合。本发明的结合分子或免疫缀合物可以直接 与微量滴定孔键合。然而，可以通过在添加本发明的结合分子或免疫缀合 物之前用聚赖氨酸预处理孔，来实现本发明的结合分子或免疫缀合物与孔 的最大结合。此外，本发明的结合分子或免疫缀合物可以通过已知方法共 价附着至孔。一般地，结合分子或免疫缀合物以0.01-100μg/ml的浓度用 于包被，尽管还可以使用更高以及更低的量。随后将样品加入由本发明的 结合分子或免疫缀合物包被的孔。

此外，本发明的结合分子可以用于鉴定流感病毒的特异性结合结构。 结合结构可以是在蛋白质和/或多肽上的表位。它们可以是线性的，也可以 是结构和/或构象的。在一个实施方案中，结合结构可以借助于PEPSCAN 分析（尤其参见WO84/03564，WO93/09872，Slootstra等人，1996）进行 分析。可替代地，可以在包含来自流感病毒蛋白质的肽的随机肽文库中筛 选能够与本发明的结合分子结合的肽。

本发明还在下述实施例和图中举例说明。实施例并不预期以任何方式 限制本发明的范围。

实施例

实施例1使用从外周血单核细胞中提取的RNA的scFv噬菌体展示文 库的构建

通过在EDTA抗凝样品管中的静脉穿刺（venapuncture）从正常健康供 体中收集外周血。scFv噬菌体展示文库如WO2008/028946中所述获得，所 述专利引入本文作为参考。从外周血单核细胞中分离RNA且制备cDNA。 使用表1和2中所示的引物组应用两轮PCR扩增方法，以从各自的供体储 库中分离免疫球蛋白VH和VL区。

使用表1中提及的引物组对各自cDNA的第一轮扩增获得对于各自的 VH、Vκ和Vλ区约650个碱基对的7、6和9种产物。对于IgM VH区扩 增，使用与OH1至OH7组合的OCM恒定引物。关于第一轮扩增的热循环 程序为：2分钟96℃（变性步骤），30秒96℃/30秒60℃/60秒72℃的30 个循环，10分钟72℃最后延伸和6℃致冷。将产物装载到1%琼脂糖凝胶上， 并且使用凝胶提取柱（Macherey Nagel）从1%琼脂糖凝胶中分离，并且在 50μl5mM Tris-HCl pH8.0中洗脱。对10%的第一轮产物（3-5μl）实施使 用表2中提及的引物的第二轮扩增。这些引物与限制位点一起延伸，允许 将各自的VL和VH区直接克隆到噬菌体展示载体PDV-C06内。关于第二 轮扩增的PCR程序如下：2分钟96℃（变性步骤），30秒96℃/30秒60℃/60 秒72℃的30个循环，10分钟72℃最后延伸和6℃致冷。根据在免疫球蛋 白基因产物中发现的J区段的天然存在，首先合并第二轮产物（～350个碱 基对），导致分别对于VH、Vκ和Vλ可变区的7、6和9个库（参见表3 和4）。为了获得免疫球蛋白序列在免疫文库中的正态分布，根据表3中提 及的百分比将6个Vκ和9个Vλ轻链库混合。这个单一最终VL库（3μg） 用SalI和NotI限制酶消化过夜，装载到1%琼脂糖凝胶上，并且使用 Macherey Nagel凝胶提取柱从1%琼脂糖凝胶中分离（～350个碱基对），并 且如下在SalI-NotI切割的PDV-C06载体中连接（～5000个碱基对）：10μl PDV-C06载体（50ng/μl）、7μl VL插入片段（10ng/μl）、5μl10X连接缓 冲液（NEB）、2.5T4DNA连接酶（400U/μl）（NEB）、25.5μl超纯水（载 体与插入片段比为1:2）。连接在16℃的水浴中执行过夜。接下来，将体积 用水加倍，用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（75:24:1）（Invitrogen）提取，随 后为氯仿（Merck）提取，并且用1μl Pellet Paint（Novogen）、10μl乙酸钠 （3M pH5.0）和100μl异丙醇在-20℃下沉淀2小时。获得的样品随后以 20.000xg在4℃下离心30分钟。将获得的沉淀物用70%乙醇洗涤，并且以 20.000xg在室温下离心10分钟。通过真空抽吸去除乙醇，并且将团块风干 数分钟，并且随后溶解于含有10mM Tris-HCl，pH8.0的50μl缓冲液中。 2μl连接混合物用于转化在冰冷的0.1cm电穿孔杯（Biorad）中的40μl TG-1 电感受态细胞（Agilent），使用设为1.7kV、200Ohm、25μF（时间常数～4,5 毫秒）的Genepulser II仪器（Biorad）。在脉冲后直接用含有5%（w/v）葡 萄糖（Sigma）的1000μl SOC培养基（Invitrogen）在37℃下从杯中冲洗细 菌，并且转移到15ml圆底培养管。另外500μl SOC/葡萄糖用于从杯中冲 洗残留细菌，并且加入培养管中。细菌通过在37℃下在振荡温箱中以220 rpm确切培养一小时进行回收。将经转化的细菌铺平板在含有150ml2TY 琼脂（16g/l细菌用胰蛋白胨、10g/l细菌用酵母提取物、5g/l NaCl、15g/l 琼脂，pH7.0）的大型240mm正方形培养皿（NUNC）上，所述琼脂补充 有50μg/ml氨苄青霉素和5%（w/v）葡萄糖（Sigma）。将1比1000稀释度 在含有相同培养基的15cm培养皿上铺平板用于计数目的。这个转化程序 顺次重复十次，并且完成的每次转化在分开的正方形培养皿上铺平板，并 且在37℃培养炉中生长过夜。一般地，使用上述方案获得约1x10⁷cfu（1x10⁶/ 培养皿）。通过将细菌轻轻刮取到10ml2TY培养基/平板内，由平板收获中 间VL轻链文库。通过OD600测量测定细胞团块，并且两倍500OD的细 菌用于大量质粒DNA制备，根据制造商的说明书使用两个P500maxiprep 柱（Macherey Nagel）。

类似于VL可变区，首先将第二轮VH-JH产物混合在一起，以获得正 态J区段使用分布（参见表4），导致称为PH1至PH7的7个VH亚库。使 用表4中所述的百分比将库混合以获得标准化序列分布，获得用SfiI和XhoI 限制性酶消化且在如上所述获得的SfiI-XhoI切割的PDV-VL中间文库中连 接的一个VH馏分。连接设置、纯化方法、TG1的后续转化和细菌收获基 本上如对于VL中间文库描述的（参见上文），除了使用20次转化和20个 正方形培养皿外。使用侧接插入的VH-VL区的引物组，用菌落PCR就插 入片段频率检查最终文库（约1x10⁷cfu）。90%的菌落显示正确长度的插入 片段。菌落PCR产物用于后续DNA序列分析，以检查序列变异且评估显 示完全ORF的菌落百分比。这是76%。最后，通过使用CT辅助噬菌体（参 见WO02/103012）援救且扩增文库，并且通过如下所述的淘选方法用于噬 菌体抗体选择。

实施例2

携带针对A型流感和B型流感血凝素的单链Fv片段的噬菌体选择

使用基本上如上所述构建的抗体噬菌体展示文库，以及基本上如美国 专利号6,265,150和WO98/15833（两者都引入本文作为参考）中所述的一 般噬菌体展示技术和技术，来选择抗体片段。此外，如WO 02/103012（其引入本文作为参考）中所述的方法和辅助噬菌体用于本发明 中。

针对A型流感亚型H1（A/New Caledonia/20/99）、H3 （A/Wisconsin/67/2005）、H4（A/Duck/Hong Kong/24/1976）、H5 （A/Chicken/Vietnam/28/2003）、H7（A/Netherlands/219/2003）和H9 （A/HongKong/1073/99）的重组血凝素（HA）执行选择。将HA抗原在PBS （5.0μg/ml）中稀释，加入MaxiSorp^TM Nunc-Immuno Tubes（Nunc）中， 并且在转轮上在4℃下温育过夜。将免疫管倒空并且在封闭缓冲液（溶于 PBS中的2%脱脂奶粉（ELK））中洗涤三次。随后，将免疫管完全装满封 闭缓冲液，并且在室温下温育1-2小时。将等分试样的噬菌体展示文库（使 用CT辅助噬菌体（参见WO02/103012）扩增的500-1000μl，0.5x10¹³– 1x10¹³cfu）在封闭缓冲液中在室温下封闭1-2小时，所述封闭缓冲液补充 有10%非热灭活的胎牛血清和2%小鼠血清。将封闭的噬菌体文库加入免疫 管中，在室温下温育2小时，并且用洗涤缓冲液（溶于PBS中的0.05%（v/v） Tween-20）洗涤，以去除未结合的噬菌体。通过与1ml100mM三乙胺（TEA） 一起在室温下温育10分钟，从各自的抗原中洗脱结合的噬菌体。随后，将 洗脱的噬菌体与0.5ml1M Tris-HCl pH7.5混合，以中和pH。这种混合物 用于感染5ml XL1-Blue大肠杆菌培养物，所述大肠杆菌培养物已在37℃下 生长至约0.3的OD600nm。允许噬菌体在37℃下感染XL1-Blue细菌30 分钟。随后，将混合物以3000xg在室温下离心10分钟，并且将细菌团块 重悬浮于0.5ml2-胰蛋白胨酵母提取物（2TY）培养基中。将获得的细菌悬 浮液分开在补充有四环素、氨苄青霉素和葡萄糖的两个2TY琼脂平板上。 平板在37℃下温育过夜后，基本上如由De Kruif等人（1995）和WO 02/103012描述的，从平板中刮取菌落，并且用于制备富集的噬菌体文库。 简言之，将刮取的细菌用于接种含有氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY 培养基，并且在37℃的温度下生长至～0.3的OD600nm。加入CT辅助噬 菌体，并且允许感染细菌，这之后将培养基更换为含有氨苄青霉素、四环 素和卡那霉素的2TY。温育在30℃下继续过夜。第二天，通过离心从2TY 培养基中回收细菌，这之后使用聚乙二醇（PEG）6000/NaCl沉淀培养基中 的噬菌体。最后，将噬菌体溶解于具有1%牛血清白蛋白（BSA）的2ml PBS 中，过滤灭菌并且用于下一轮选择。第二轮选择对相同HA亚型和/或不同 亚型的HA执行。

在个别单链噬菌体抗体分离前执行相继两轮选择。在第二轮选择后， 个别大肠杆菌菌落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上，使个别菌落在96 孔板形式中生长至对数期，并且用VCS-M13辅助噬菌体感染，这之后允许 噬菌体抗体生产进行过夜。噬菌粒进行序列分析，并且所有独特的噬菌粒 用于进一步分析。含有噬菌体抗体的上清液直接用于ELISA中用于与HA 抗原结合。可替代地，噬菌体抗体进行PEG/NaCl沉淀且过滤灭菌用于 ELISA和流式细胞术分析。

实施例3

HA特异性单链噬菌体抗体的确认

在ELISA中就特异性即与不同HA抗原的结合确认在上述筛选中获得 的含有单链噬菌体抗体的所选上清液。为了这个目的，将杆状病毒表达的 重组H1（A/New Caledonia/20/99）、H3（A/Wisconsin/67/2005）、H5 （A/Vietnam/1203/04）H7（A/Netherlands/219/2003）和B（B/Ohio/01/2005） HA（Protein Sciences，CT，USA）包被到Maxisorp^TM ELISA平板上。在包 被后，将平板用含有0.1%v/v Tween-20的PBS洗涤三次，并且在含有3% BSA或2%ELK的PBS中在室温下封闭1小时。所选单链噬菌体抗体在等 体积的含有4%ELK的PBS中温育1小时，以获得封闭的噬菌体抗体。将 平板倒空，用PBS/0.1%Tween-20洗涤三次，并且将封闭的单链噬菌体抗 体加入孔中。允许温育进行一小时，用PBS/0.1%Tween-20洗涤平板，并 且使用缀合至过氧化物酶的抗M13抗体检测（使用OD492nm测量）结合 的噬菌体抗体。作为对照，同时不使用单链噬菌体抗体且使用无关阴性对 照单链噬菌体抗体执行该程序。根据使用噬菌体文库对不同HA抗原的选 择，获得特异性结合重组A型流感H1、H3、H5、H7和B型流感HA的 13个独特的单链噬菌体抗体（SC09-003、SC09-004、SC09-005、SC09-006、 SC09-007、SC09-008、SC09-009、SC09-010、SC09-011、SC09-030、SC09-112、 SC09-113和SC09-114）。参见表5。

可替代地，PEG/NaCl沉淀且过滤灭菌的噬菌体抗体用于通过FACS分 析确认结合和特异性。为了这个目的，在PER.C6细胞表面上表达全长重组 A型流感亚型H1（A/New Caledonia/20/1999）、H3（A/Wisonsin/67/2005） 和H7（A/Netherlands/219/2003）HA。使细胞与单链噬菌体抗体一起温育1 小时，随后为使用PBS+0.1%BSA的三个洗涤步骤。使用FITC缀合的M13 抗体检测结合的噬菌体。根据使用噬菌体文库对不同HA抗原的选择，发 现特异性结合A型流感亚型H1、H3和H7HA的14个单链噬菌体抗体 （SC09-003、SC09-004、SC09-005、SC09-006、SC09-007、SC09-008、SC09-009. SC09-010、SC09-011、SC09-012、SC09-030、SC09-112、SC09-113和 SC09-114）。参见表6。

所有16个噬菌体抗体SC09-003、SC09-004、SC09-005、SC09-006、 SC09-007、SC09-008、SC09-009.SC09-010、SC09-011、SC09-012、SC09-029、 SC09-030、SC09-031、SC09-112、SC09-113和SC09-114用于全人免疫球 蛋白的构建。

实施例4

来自所选单链Fv的全人免疫球蛋白分子（人单克隆抗体）的构建

由所选特异性单链噬菌体抗体（scFv）克隆获得质粒DNA，并且根据 标准技术测定核苷酸和氨基酸序列。通过限制性消化直接克隆scFv的重和 轻链可变区，用于在IgG表达载体pIg-C911-HCγ1（参见SEQ ID N0:175）、 pIG-C909-Cκ（参见SEQ ID NO:176）或pIg-C910-Cλ（参见SEQ ID No:177） 中表达。测定scFv的VH和VL基因同一性（参见Tomlinson IM等人V-BASE  Sequence Directory.Cambridge United Kingdom:MRC Centre for Protein  Engineering（1997））（参见表7）。

根据技术人员已知的标准技术确认关于所有构建体的核苷酸序列。所 得到的编码人IgG1重和轻链的表达构建体在293T细胞中组合瞬时表达， 并且使用标准纯化程序获得并产生含有人IgG1抗体的上清液。

所选免疫球蛋白分子的重和轻链的CDR的氨基酸序列在表7中给出。

所有重和轻链可变结构域的氨基酸差异数目和%同一性在表8中给出。

实施例5

IgG的交叉结合反应性

在ELISA中就结合特异性即与不同HA抗原的结合确认上述五种IgG 抗体的实验对象组，CR9005，CR9030，CR9112，CR9113和CR9114。为 了这个目的，将杆状病毒表达的重组H1（A/New Caledonia/20/1999）、H3 （A/Wisconsin/67/2005）、H5（A/Vietnam/1203/04、H7 （A/Netherlands/219/2003）和H9（A/HongKong/1073/99）HA（Protein  Sciences，CT，USA）包被到Maxisorp^TM ELISA平板。在包被后，将平板 用含有0.1%v/v Tween-20的PBS洗涤三次，并且在含有3%BSA或2%ELK 的PBS中在室温下封闭1小时。将平板倒空，用PBS/0.1%Tween-20洗涤 三次，并且将IgG抗体加入孔中。允许温育进行一小时，用PBS/0.1% Tween-20洗涤平板，并且使用缀合至过氧化物酶的抗人IgG抗体检测结合 的抗体。作为对照，使用无关的IgG CR4098。

CR9005、CR9030、CR9112、CR9113和CR9114显示与测试的所有重 组HA具有异亚型交叉结合活性。参见表9。

另外，所选抗体用于通过FACS分析测试异亚型结合。为了这个目的， 在PER.C6细胞表面上表达全长重组A型流感亚型H1（A/New  Caledonia/20/1999）、H3（A/Wisonsin/67/2005）和H7（A/Netherlands/219/2003） HA。使细胞与IgG抗体一起温育1小时，随后为使用PBS+0.1%BSA的三 个洗涤步骤。使用PE缀合的抗人抗体检测结合的抗体。作为对照，使用未 经转染的PER.C6细胞。CR9005、CR9030、CR9112、CR9113和CR9114 显示与A型流感亚型H1、H3和H7HA的交叉结合活性，而野生型PER.C6 细胞则没有。参见表9。

实施例6

IgG的交叉中和活性

为了测定所选IgG是否能够封闭多重A型流感毒株，执行另外的体外 病毒中和测定法（VNA）。在MDCK细胞（ATCC CCL-34）上执行VNA。 MDCK细胞在MDCK细胞培养基（补充有抗生素、20mM Hepes和0.15% （w/v）碳酸氢钠的MEM培养基（完全MEM培养基，补充有10%（v/v） 胎牛血清）中培养。测定法中使用的H1（A/WSN/33、A/New  Caledonia/20/1999、A/Solomon Islands/IVR-145（A/Solomon Islands/3/2006 的高生长重配株）、A/Brisbane/59/2007、A/NYMC/X-181 （A/California/07/2009的高生长重配株）、H2（A/Env/MPU3156/05）、H3 （A/Hong Kong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2000/1999、 A/Hiroshima/52/2005、A/Wisconsin/67/2005和A/Brisbane/10/2007）、H4 （A/WF/HK/MPA892/06）、H5（PR8-H5N1-HK97（A/Hong Kong/156/97 和A/PR/8/34的6:2重配株）和A/Eurasian Wigeon/MPF461/07）、H6 （A/Eurasian Wigeon/MPD411/07）、H7（NIBRG-60（A/Mallard/Netherlands /12/2000的6:2重配株）和PR8-H7N7-NY（A/New York/107/2003（H7N7） 和A/PR/8/34）的7:1重配株）、H8（A/Eurasian Wigeon/MPH571/08）H9 （A/Hong Kong/1073/99和A/Chick/HK/SSP176/09）、H10（A/Chick/Germany /N/49）和H14（PR8-H14N5（A/mallard/Astrakhan/263/1982（H14N5）和 A/PR/8/34）的6:2重配株）毒株都稀释至5,7x10³TCID50/ml的滴度（50% 组织培养感染剂量/ml），其中滴度根据Spearman和Karber的方法进行计 算。将IgG制剂（200μg/ml）在完全MEM培养基中在一式四份孔中连续2 倍稀释（1:2-1:512）。将25μl各自的IgG稀释物与25μl病毒悬浮液（100 TCID50/25μl）混合，并且在37℃下温育一小时。随后将悬浮液一式四份 地转移到含有在50μl完全MEM培养基中的汇合MDCK培养物的96孔板 上。在使用前，将MDCK细胞以3x10⁴细胞/孔种植到MDCK细胞培养基 中，生长直至细胞已达到汇合，用300-350μl PBS，pH7.4洗涤，并且最后 将50μl完全MEM培养基加入每个孔中。将温育细胞在37℃下培养3-4天， 并且每天观察致细胞病变效应（CPE）的发展。CPE与阳性对照相比较。

CR9005、CR9112、CR9113和CR9114显示与所有测试的A型流感亚 型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9和H10病毒的代表性毒株的 异亚型交叉中和活性。参见表10。

实施例7

泛流感抗体与HA的融合前构象结合

为了测定所选IgG能够结合HA分子的融合前还是融合后构象，执行 体外pH转变实验。为了这个目的，在PER.C6细胞表面上表达全长重组A 型流感亚型H1（A/New Caledonia/20/99）、H3（A/Wisonsin/67/2005）、 H5（A/Vietnam/1203/04）、H7（A/Netherlands/219/03）和H9（A/Hong  Kong/1073/99）HA。为了测量mAb与不同结构HA构象的结合，使用 PBS-EDTA使细胞从塑料载体脱离，并且随后用胰蛋白酶（TrypLE^TMSelect， Gibco）在RT下处理5分钟，洗涤（溶于PBS中的1%BSA）并在柠檬酸- 磷酸钠缓冲液（pH4.9）中温育15分钟。细胞样品在每个处理步骤后留出 （未受胰蛋白酶作用的/HA0；受胰蛋白酶作用的/HA1-HA2；pH4.9/融合 HA），并且使每个处理的馏分与mAb CR9114一起温育1小时。随后使细 胞与溶于1%BSA中的藻红蛋白缀合的抗人IgG（Southern Biotech）一起温 育30分钟。使用FACS Canto与FACS Diva软件（Becton Dickinson）分析 染色细胞。

IgG1与表面表达的HA的FACS结合在用胰蛋白酶和pH4.9缓冲培养 基顺次处理后，并且表示为与未经处理的HA（A）的结合百分比。参见图 1A。

抗体CR9114显示在pH转变后结合中的显著降低，指示对于仅在低pH 诱导的HA分子的构象变化之前存在的表位的特异性。

可替代地，为了测试IgG是否可以封闭低pH诱导的HA的构象变化， 在低pH步骤前加入抗体CR9114。将相继处理的样品分开并且用藻红蛋白 缀合的抗人IgG（Southern Biotech）染色。使用FACS Canto与FACS Diva 软件（Becton Dickinson）分析染色细胞。参见图1B。

抗体CR9114显示在pH转变后与多种HA的高水平的残留结合，指示 当这些抗体与HA分子结合时，低pH诱导的构象变化并未发生。

实施例8

Fab对多种A和B型流感HA的亲和力测量

使用杆状病毒载体在昆虫细胞中产生的A/New Caledonia/20/1999 （H1）、A/Brisbane/59/2007（H1）、A/Wisconsin/67/2005（H3）、 A/Brisbane/10/2007（H3、B/Florida/4/2006（B）、B/Brisbane/60/2008（B） 和B/Malaysia/2506/2004（B）的重组可溶性HA购自Protein Sciences Corp （CT，USA），并且使用EZ-连接磺基-NHS-LC-LC-生物素（Pierce）在室 温下（RT）生物素化40分钟。使用Amicon Ultra0.5ml Centrifugal Filters （Millipore）执行至PBS的缓冲液更换步骤。生物素化的HA与链霉亲和 素传感器在37℃下结合1200秒。通过使传感器暴露于溶于溶于1x动力学 缓冲液（ForteBio）中的100nM抗体，在Octet QK（ForteBio）上在37℃ 下测量CR9005、CR9112、CR9113和CR9114的Fab片段与HA的结合700 秒。通过在37℃下使传感器暴露于溶于1x动力学缓冲液9000秒，评估Fab 片段的解离。CR9005、CR9112、CR9113和CR9114的Fab片段都以微摩 尔至皮摩尔亲和力与H1、H3和B型流感HA结合。

实施例9

与其他茎结合抗体的竞争结合

使用杆状病毒载体在昆虫细胞中产生的A/New Caledonia/20/1999 （H1N1）和A/Wisconsin/67/2005（H3N2）的重组可溶性HA购自Protein  Sciences Corp（CT，USA），并且使用EZ-连接磺基-NHS-LC-LC-生物素 （Pierce）在室温下（RT）生物素化40分钟。使用Amicon Ultra0.5ml  Centrifugal Filters（Millipore）执行至PBS的缓冲液更换步骤。生物素化的 HA与链霉亲和素传感器在37℃下结合1200秒。通过使传感器暴露于溶于 1x动力学缓冲液（ForteBio）中的100nM抗体，在Octet QK（ForteBio） 上在37℃下测量抗体CR9114和CR6261与H1HA的结合700秒，这之后 通过在第一抗体（100nM）的存在下在37℃下使传感器暴露于第二抗体（溶 于1x动力学缓冲液中的100nM）700秒，评估另外的结合程度。作为对照， 一起获得mAb CR9020与H1的球状头部的结合。通过使传感器暴露于溶于 1x动力学缓冲液（ForteBio）中的100nM抗体，在Octet QK（ForteBio） 上在37℃下测量抗体CR9114和CR8020与H3HA的结合900秒，这之后 通过在第一抗体（100nM）的存在下在37℃下使传感器暴露于第二抗体（溶 于1x动力学缓冲液中的100nM）900秒，评估另外的结合程度。作为对照， 一起获得mAb CR8057与H3的球状头部的结合。

CR9114与CR6261竞争结合H1HA，并且与CR8020竞争结合H3HA。 CR9114因此可能结合与HA茎区中的CR6261和CR8020表位重叠的表位。 （参见图2）

实施例10

人IgG单克隆抗体CR9114针对体内致死性B型流感攻击的预防活性

执行研究以测试单克隆抗体CR9114针对在体内用B型流感病毒的致 死性攻击的预防效应。使用小鼠适应性流感B/Florida/04/2006病毒（Central  Veterinary Institute（CVI），Lelystad，荷兰），就在小鼠致死性攻击模型中的 预防功效测试MAb CR9114。B/Florida/04/2006病毒在5次肺至肺传代后适 应小鼠。小鼠适应的B型流感第5次病毒在CVI’s实验室中的含胚鸡蛋中 繁殖。在实验开始前，使所有小鼠（Balb/c，雌性，6-8周龄，n=10只/组） 适应环境且维持至少4天的时期。在攻击前的第-1天时，MAb CR9114以 15mg/kg在尾静脉（静脉尾骨肌（vena coccygeus））中静脉内给药，假定每 只小鼠18g的平均重量和0.2mL的固定剂量体积。对照组一起用媒介物对 照给药。小鼠随后在第0天时通过鼻内接种用25LD₅₀B/Florida/04/2006B 型流感病毒进行攻击。临床特征和体重从攻击前的第-1天测定直到第8天 时。临床特征用评分系统进行评分（0=无临床体征；1=皮毛粗糙；2=皮毛 粗糙，在处理过程中较少反应；3=皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，在处理过 程中较少反应；4=皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，不活跃响应操作/处理）。在 得分4时，对动物实施安乐死。

在环境适应期过程中，所有小鼠都是活跃的并且看起来健康的，并未 显示疾病体征。图3A显示在mAb施用后的小鼠存活率。用15mg/kg mAb  CR9114给药的小鼠显示100%的存活率，而在对照mAb小鼠中，50%存活。

在图3B中，显示了在mAb施用后的8天研究期过程中小鼠的平均体 重变化。在mAb CR9114组中，小鼠经过8天研究期并未减轻重量，而在 媒介物对照组中，观察到体重减轻。小鼠的平均临床得分在图3C中描绘。 在第-1天攻击前时用15mg/kg mAb CR9114处理的小鼠中，全部存活，并 且动物无一在观察期过程中（从感染后第0天到第8天）显示任何临床体 征。这些结果显示如本文公开鉴定且开发的人抗流感抗体CR9114能够提供 抗体内致死剂量的B型流感病毒的保护。当在感染前一天以15mg/kg或更 高的剂量施用时，mAb CR9114能够在小鼠中完全预防B型流感感染的临 床表现。

表1.第一轮Vκ、Vλ和VH扩增

*以1:1:1比混合

#以1:1比混合

X以1:1比混合

+以1:1比混合

表2.第二轮Vκ、Vλ和VH扩增

*以1:1:1比混合

#以1:1比混合

+以1:1比混合

表3.第二轮VL区扩增概述

表4.第二轮VH区扩增概述

表5:如通过ELISA测量的，PEG/NACl沉淀且过滤灭菌的单链噬菌体 抗体与不同亚型的HA的交叉结合活性。+=结合（>4x本底）；+/-=低 结合（2-4x本底）-=无法检测的结合；H1=A型流感H1亚型的HA；H3= A型流感H3亚型的HA；H5=A型流感H5亚型的HA；H7=A型流感H7 亚型的HA；B=B型流感病毒的HA；狂犬病=狂犬病病毒的糖蛋白（阴性 对照）。

表6.PEG/NACl沉淀且过滤灭菌的噬菌体抗体的FACS分析。+=结 合（>4x本底）；+/-=低结合（2-4x本底）-=无法检测的结合；PER.C6= 未经转染的PER.C6细胞（对照）；mH1、mH3、mH7=亚型H1、H3和H7 亚型分别的膜结合的HA。

表9.如通过ELISA和FACS测量的，IgG的交叉结合反应性。H1=可 溶性重组体A/New Caledonia/20/1999H1HA；H3=可溶性重组体 A/Wisconsin/67/2005H3HA；H5=可溶性重组体A/Vietnam/1203/04H5 HA；H7=可溶性重组体A/Netherlands/219/2003H7HA；H9=可溶性重组 体A/Hong Kong/1073/99H9HA；B=可溶性重组体B/Ohio/01/05B型流感 HA；狂犬病=狂犬病糖蛋白；PER.C6=未经转染的PER.C6细胞（对照）； mH1=PER.C6表达的A/New Caledonia/20/1999H1HA；mH3=PER.C6表达 的A/Wisconsin/67/2005H3HA；mH7=PER.C6表达的A/Netherlands/ 219/2003H7HA；ND=未完成。+=结合（>10x本底）；+/-=低结合（2-10x 本底）-=无法检测的结合。

表10.IgG的交叉中和活性；滴度（以μg/ml指示）是如根据Spearman-Karber 方法测定的至少一式两份实验的几何平均IC50值；>100=在最高测试浓度 （100μg/ml）时不中和。

序列表

>SC09-003VH DNA（SEQ ID NO:1）

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGGCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAACAACTTTGGTATCAGCTGGGTACGACAGGCCCCTGGCCAAGGCCTTGAGTGGA TGGGCGGGATCAGCCCAATCTTTGGTTCGACAGTCTACGCACAGAAATTTCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCACACACTGCCTACATGGAGATGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTCTATTT CTGTGCGAGGCACGGAAATTATTATTTCTACTCCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC

>SC09-003VH蛋白质（SEQ ID NO:2）

EVQLVESGAEVKKAGSSVKVSCKSSGGTSNNFGISWVRQAPGQGLEWMGGISPIFGSTVYAQKFQGRVTIS ADIFSHTAYMEMNSLTSEDTAVYFCARHGNYYFYSGMDLWGQGTTVT

>SC09-003VL DNA（SEQ ID NO:3）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCACGATTTCCTGTGGGGG AGACAACGTTGGAAGTAACAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCT ATGATGATCGCGACCGACCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACC CTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGA TCATCGAGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAG

>SC09-003VL蛋白质（SEQ ID NO:4）

SYVLTQPPSVSVAPGQTATISCGGDNVGSNSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPERFSGSNSGNTAT LTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHRVFGTGTKVTVL

>SC09-004VH DNA（SEQ ID NO:5）

CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGCGGCACCTCCAATAACTATGCCATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGGTCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGTCTGACATCTGAGGACACGGCCGTCTATTA TTGTGCGAGACACGGGAATTATTATTACAACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC

>SC09-004VH蛋白质（SEQ ID NO:6）

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGVSPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYNSGMDVWGQGTTVT

>SC09-004VL DNA（SEQ ID NO:7）

CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCGCAGTGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCGTGTTCTGG AAGTGATTCCAACATCGGGAGAAGAAGTGTAAACTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCC TCATCTATAGTAACGATCAGCGGCCCTCAGTGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCCGGCACCTCA GCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAAGATGAGGCCGAATATTACTGTGCAGCATGGGATGACAG CCTGAAGGGGGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-004VL蛋白质（SEQ ID NO:8）

QSVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTS ASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL

>SC09-005VH DNA（SEQ ID NO:9）

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTCAAGAGGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATTAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGTCTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTT CTGTGCGAGGCACGGGAACTATTATTACTACTCCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC

>SC09-005VH蛋白质（SEQ ID NO:10）

QVQLVQSGAEVKRPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTVYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDLWGQGTTVT

>SC09-005VL DNA（SEQ ID NO:11）

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGG AACCAGCAGTGACGTCGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAAC TCCTGATTTTTGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTTTCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGCGGAC ACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGACTCCAGGCTCAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCAGG TAGTGCCAAGGGCGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAG

>SC09-005VL蛋白质（SEQ ID NO:12）

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLLIFDVSDRPSGVSDRFSGSKSAD TASLTISGLQAQDEADYYCCSYAGSAKGVFGTGTKVTVL

>SC09-006VH DNA（SEQ ID NO:13）

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAGGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATTAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGTCTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTT CTGTGCGAGGCACGGGAACTATTATTACTACTCCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC

>SC09-006VH蛋白质（SEQ ID NO:14）

EVQLVESGAEVKRPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTVYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDLWGQGTTVT

>SC09-006VL DNA（SEQ ID NO:15）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGG AAACAACATTGGAAGTAAAACTGTGCATTGGTACCAGCAGAACTCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCT ATGGTGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACC CTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGA TCATCCCGGTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-006VL蛋白质（SEQ ID NO:16）

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQNSGQAPVLVVYGDSDRPSGIPERFSGSNSGTTAT LTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPGAVFGGGTQLTVL

>SC09-007VH DNA（SEQ ID NO:17）

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGAGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGAGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCAGCAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTACC GCGGACATATTTTCGAACACAGTGTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGAGACACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-007VH蛋白质（SEQ ID NO:18）

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSAAYAQKFQGRVTIT ADIFSNTVYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-007VL DNA（SEQ ID NO:19）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGG AAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACTGTAAACTGGTACCAGCAGGTCCCCGGAACGGCCCCCAAACTCC TCATCTATGGTGATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCA GCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAG CCTGAATGGTCATGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-007VL蛋白质（SEQ ID NO:20）

SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQVPGTAPKLLIYGDDQRPSGVPDRFSGSKSGTS ASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLNGHVFGGGTQLTVL

>SC09-008VH DNA（SEQ ID NO:21）

GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAGAGTCTCCTGTAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTT CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-008VH蛋白质（SEQ ID NO:22）

EVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-008VL DNA（SEQ ID NO:23）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGG AAACAACATTGGAAGTAAAACTGTGCATTGGTACCAGCAGAACTCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCT ATGGTGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACC CTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGA TCATCCCGGTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-008VL蛋白质（SEQ ID NO:24）

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQNSGQAPVLVVYGDSDRPSGIPERFSGSNSGTTAT LTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPGAVFGGGTQLTVL

>SC09-009VH DNA（SEQ ID NO:25）

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGGCATCTGAGGACACGGCCGTATATTT CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-009VH蛋白质（SEQ ID NO:26）

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLASEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-009VL DNA（SEQ ID NO:27）

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCG GGCGAGTCAGCATATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGGCCCTCAGCTCCTGA TCTATTCTGCATCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCC CCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC

>SC09-009VL蛋白质（SEQ ID NO:28）

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQHISSWLAWYQQKPGKGPQLLIYSASRLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGPGTKVDIK

>SC09-010VH DNA（SEQ ID NO:29）

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAATTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCCAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTA CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-010VH蛋白质（SEQ ID NO:30）

EVQLVESGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-010VL DNA（SEQ ID NO:31）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGG AAACAACATYGGAAGTAAAACTGTGCATTGGTACCAGCAGAACTCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCT TTGTTGATAGCGACCGTCCCTCAGGGATCCATGAGCGATTCTGTGGCTCCAACTCTGGGTCCACGGCCACC CTGACCATCAGCAGCGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAATAGCGA TCATCCCGGTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-010VL蛋白质（SEQ ID NO:32）

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQNSGQAPVLVVFVDSDRPSGIHERFCGSNSGSTAT LTISSVEAGDEADYYCQVWDSNSDHPGAVFGGGTQLTVL

>SC09-011VH DNA（SEQ ID NO:33）

GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGAGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCAGCAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTACC GCGGACATATTTTCGAACACAGTGTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGAGACACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTACGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-011VH蛋白质（SEQ ID NO:34）

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSAAYAQKFQGRVTIT ADIFSNTVYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGTDVWGQGTTVTVSS

>SC09-011VL DNA（SEQ ID NO:35）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCGCAGTGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCGTGTTCTGG AAGTGATTCCAACATCGGGAGAAGAAGTGTAAACTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCC TCATCTATAGTAACGATCAGCGGCCCTCAGTGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCCGGCACCTCA GCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAAGATGAGGCCGAATATTACTGTGCAGCATGGGATGACAG CCTGAAGGGGGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-011VL蛋白质（SEQ ID NO:36）

SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTS ASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL

>SC09-012VH DNA（SEQ ID NO:37）

GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAATTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGAGGGATCAGCCCTATTTTTGGTTCAGCAGTCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTACC GCGGACATATTTTCGAACACAGTGTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGAGACACGGGACTTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-012VH蛋白质（SEQ ID NO:38）

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSAVYAQKFQGRVTIT ADIFSNTVYMELNSLTSEDTAVYYCARHGTYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-012VL DNA（SEQ ID NO:39）

CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGG GAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGGACAGCCCCCAAAC TCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACC TCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGTTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACCA GAACCTGAGTGAGGGGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG

>SC09-012VL蛋白质（SEQ ID NO:40）

QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGT SASLAITGLQVEDEADYYCQSYDQNLSEGVFGGGTKLTVL

>SC09-029VH DNA（SEQ ID NO:41）

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTA CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-029VH蛋白质（SEQ ID NO:42）

EVQLVESGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-029VL DNA（SEQ ID NO:43）

GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCTGGGGAAAGAGGCACCCTCTCCTGCAG GGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCACTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTC ACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGGAGCTCACC ATTCGCTTTCGGCCCTGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SC09-029VL蛋白质（SEQ ID NO:44）

EIVMTQSPGTLSLSPGERGTLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFTGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPFAFGPGTKVEIK

>SC09-030VH DNA（SEQ ID NO:45）

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTT CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-030VH蛋白质（SEQ ID NO:46）

QMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-030VL DNA（SEQ ID NO:47）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGG AAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCT ATGGTGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACC CTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGA TCATCCCGGTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-030VL蛋白质（SEQ ID NO:48）

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYGDSDRPSGIPERFSGSNSGTTAT LTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPGAVFGGGTQLTVL

>SC09-031VH DNA（SEQ ID NO:49）

CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTCGAGAGGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGCGGCACCTCCAATAACTATGCCATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGTCTGACATCTGAGGACACGGCCGTCTATTA TTGTGCGAGACACGGGAATTATTATTACAACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-031VH蛋白质（SEQ ID NO:50）

QVQLVQSGAEVERPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYNSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-031VL DNA（SEQ ID NO:51）

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGG GAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGAAACAGCCCCCAAAC TCCTCATTTATGATAACAACAATCGTCCCTCAGGGGTTTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACT TCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAG CGGCCTGAGTGCTTCGCCTTATGTCTTCGGAGCTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAG

>SC09-031VL蛋白质（SEQ ID NO:52）

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPETAPKLLIYDNNNRPSGVSDRFSGSKSGT SASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSGLSASPYVFGAGTKVTVL

>SC09-112VH DNA（SEQ ID NO:53）

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTA CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-112VH蛋白质（SEQ ID NO:54）

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYYCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-112VL DNA（SEQ ID NO:55）

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGG GAGCAGCGCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTCCACTGGTACCAGCAGTTTCCAGGAACAGCCCCCAAAC TCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACC TCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAG CAGCCTGAGTGGTGCGTTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG

>SC09-112VL蛋白质（SEQ ID NO:56）

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSANIGAGYDVHWYQQFPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGT SASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGALFGGGTKLTVL

>SC09-113VH DNA（SEQ ID NO:57）

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGGCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGA TGGGCGGGATCAGTCCAATCTTTGGTTCGACAGTCTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCACACACTGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGCATATTT CTGTGCGAGGCACGGAAACTATTATTACTACTCCGGTATGGACCTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-113VH蛋白质（SEQ ID NO:58）

QMQLVQSGAEVKKAGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLEWMGGISPIFGSTVYAQKFQGRVTIS ADIFSHTAYMELNSLTSEDTAAYFCARHGNYYYYSGMDLWGQGTTVTVSS

>SC09-113VL DNA（SEQ ID NO:59）

CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCGCAGTGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCGTGTTCTGG AAGTGATTCCAACATCGGGAGAAGAAGTGTAAACTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCC TCATCTATAGTAACGATCAGCGGCCCTCAGTGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCCGGCACCTCA GCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGCCAG CCTGAGTGGTCCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-113VL蛋白质（SEQ ID NO:60）

QSVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTS ASLAISGLQAEDEADYYCAAWDASLSGPVFGGGTQLTVL

>SC09-114VH DNA（SEQ ID NO:61）

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTCAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTCTCCTGCAAGTC TTCTGGAGGCACCTCCAATAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGACTGGA TGGGCGGGATCAGCCCTATCTTTGGTTCGACAGCCTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACTATTTCC GCGGACATATTTTCGAACACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTATATTT CTGTGCGAGGCACGGGAATTATTATTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG TCTCGAGC

>SC09-114VH蛋白质（SEQ ID NO:62）

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTIS ADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

>SC09-114VL DNA（SEQ ID NO:63）

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCGCAGTGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCGTGTTCTGG AAGTGATTCCAACATCGGGAGAAGAAGTGTAAACTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCC TCATCTATAGTAACGATCAGCGGCCCTCAGTGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCCGGCACCTCA GCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAAGATGAGGCCGAATATTACTGTGCAGCATGGGATGACAG CCTGAAGGGGGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCG

>SC09-114VL蛋白质（SEQ ID NO:64）

SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTS ASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL

载体pIg-C911-HCγ1（SEQ ID NO:175）

载体pIg-C909-Cκ（SEQ ID NO:176）

载体pIg-C910-Cλ（SEQ ID NO:177）

参考文献：

Air MA（1981），Sequence relationships among the hemagglutinin genes of12subtypes  of influenza A virus.Proc Natl Acad Sci USA78（12）:7639-7643.

De Kruif J等人（1995），Rapid selection of cell subpopulation-specific human  monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library.Proc Natl Acad Sci USA 92:3938.

Ferguson等人，（2003），Nature422:428-443.

Fouchier AM等人（2005），Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin  subtype（H16）obtained from black-headed gulls.J Virol79（5）:2814-2822.

The World Health Organization Global Influenza Program Surveillance Network （2005），Evolution of H5N1Avian Influenza Viruses in Asia.Emerg Infect Dis 11:1515-1521.