用于预防或治疗特应性皮炎的芫花提取物以及含有该提取物的部位或从该提取物分离的化合物作为活性成分的药物组合物

摘要

本发明涉及芫花提取物，并涉及用于预防或治疗特应症的药物组合物，所述药物组合物含有所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物(由式1表示)作为活性成分。更具体而言，本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)可有效增加Th1免疫细胞中细胞因子的分泌，并可阻抑特应症小鼠模型中的特应症，因此，本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物可有价值地用于特应症的预防或治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗特应症(atopy)的药物组合物，所述药 物组合物含有芫花(Daphne genkwa)提取物、所述芫花提取物的部位 (fraction)、或从所述芫花提取物分离的化合物作为活性成分。

背景技术

特应症是伴有严重瘙痒(itch)的慢性复发性皮炎。约10％-15％的儿 童患有特应性皮炎，并且其中90％可能在发病五年内自然康复。当患者 成年后，这种特应性皮炎通常会改善，并且其中约30％-40％至少表面上 不会复发。然而，其余的患者甚至在成年后每当受到刺激物刺激时，仍 患有皮炎，伴随有皮肤干燥、皮肤刺激和家庭主妇湿疹(housewife′s  eczema)等症状。敏感皮肤的特征是低保水、恢复能力弱、角化过度 (hyperkeratinization)和瘙痒，因而容易发展为特应性皮肤。

特应症确切的病理生理学尚未被完全了解，但只是推测其归因于遗 传因素连同免疫机制和非免疫机制。大多数特应症病例是外源性 (extrinsic)特应症，所述外源性特应症由IgE相关免疫机制发展而来。 有许多报道称，对这种外源性特应症负责的是由T细胞功能障碍引起的 迟发型免疫应答、而不是具体过敏原介导的速发型免疫应答。最近报道 了，包括IL-4在内的Th2相关细胞因子(诱导B细胞生成IgE)是特应 症的原因(JS Kang等，Inhibition of atopic dermatitis by topical application  of silymarin in NC/Nga mice.intl immunopharm.(2008)8.1475-1480)。

为了治疗特应症，已经提出了神经酰胺、亚油酸、植物油或矿物油、 包括氢化可的松在内的类固醇、加强了抗菌活性/抗炎活性的物质、DNA 合成抑制剂、细胞过度增殖抑制剂、以及炎症/瘙痒阻抑剂(suppressor)。 然而，上述物质会引起副作用。例如，类固醇可引起表皮生长阻抑、过 氧化尿素可引起皮肤的过度刺激、而包括抗组胺剂在内的抗生素可引起 细菌耐药性和光敏性。此外，此类药物的长期给予可能会带来更严重的 副作用，如毛细血管扩张和/或角质厚。目前经常用于缓解特应症的γ-亚 油酸(韩国专利公开号2000-0046633)很容易氧化(这表明了稳定性问 题)，并且强烈地引起皮肤刺激，因此，它不适合于敏感皮肤。

因此，天然物质目前已成为治疗特应症的焦点，例如艾蒿(Artemisia  vulgaris)提取物(韩国专利号10-0377262)；灵芝(Ganoderma lucidum)、 白榆(Ulmus pumila)、甘草(Licorice)、茯苓(Poria)、芝麻(Sesamum  indicum L.)和梨果仙人掌(Opuntia ficus indica)的提取物(韩国专利号 10-0517465)；月见草(Evening primrose)、芦荟(Aloe)、木醋液 (pyroligneous liquor)、紫罗兰(Violet)、枣(Jujube)、松蕈(pine  mushroom)、龙牙楹木(Aralia elata)、人参(Panax ginseng)、绿茶、杜 仲(Eucommia ulmoides)、插田泡(Rubus coreanus)、五味子(Schisandra  chinensis)、艾蒿、蒲公英(Taraxacum mongolicum)、三白草(Saururus  chinensis)、黄芪(Astragalus membranaceus)、夏枯草(Prunella vulgaris)、 黑松(Pinus thunbergii)、黄芩(Scutellaria baicalensis)和牛膝(Achyranthes  japonica)的提取物(韩国专利号10-0451444)；蓝色紫苏(Perilla  frutescens)和红色紫苏的提取物(韩国专利号10-0454752)；日本栗 (Castanea crenata)、薏苡仁(Coicis semen)、五味子、桔梗(Platycodon  grandiflorum)、萝卜(Raphanus sativus)、阔叶山麦冬(Liriope platyphylla) 和石菖蒲(Acorus gramineus)的提取物(韩国专利号10-0483539)；熏 衣草(lavender)、蓝桉(Eucalyptus globulus)和茶树油的提取物(韩国 专利号10-0597997)等。还已知桑寄生(Loranthus parasiticus)、合欢 (Albizzia julibrissin)、苍耳(Xanthium strumarium)和麦芽对特应症有 效果。然而，这些天然物质的治疗效果较弱，而且，即使它们表现出一 些治疗效果，它们还引起了过敏反应，尤其是对敏感皮肤，这限制了它 们的使用。

因此，高度需要开发出比传统药剂更安全且更有效的物质来改善和 治疗特应症。

在从天然物质中筛选对改善特应症具有优异效果的物质进行研究的 过程中，本发明人发现，芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或 genekwadapnin和芫花酯甲(yuanhuacine)(从所述芫花提取物中分离的 化合物)可通过作用于免疫细胞和上皮细胞来增加细胞因子的分泌(使 由特应性疾病造成的Th1/Th2失衡转变)；并进一步证实了芫花提取物、 所述芫花提取物的部位、或genekwadapnin和芫花酯甲在患有特应性疾 病的小鼠模型中改善特应症的作用，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供用于预防或治疗特应症的药物组合物，所述药 物组合物含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取 物中分离的化合物作为活性成分。

本发明的另一目的是提供用于预防或改善特应症的化妆品组合物， 所述化妆品组合物含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述 芫花提取物中分离的化合物作为活性成分。

本发明的另一目的是提供特应症的治疗方法，所述治疗方法包括如 下步骤：向患有特应症的受试者给予药学上有效剂量的芫花提取物、所 述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

本发明的另一目的是提供特应症的预防方法，所述预防方法包括如 下步骤：向受试者给予药学上有效剂量的芫花提取物、所述芫花提取物 的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

本发明的另一目的是提供芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或 从所述芫花提取物中分离的化合物作为用于预防和治疗特应症的药物组 合物的用途。

本发明的另一目的是提供芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或 从所述芫花提取物中分离的化合物作为用于预防和改善特应症的化妆品 组合物的用途。

为实现上述目的，本发明提供了用于预防或治疗特应症的药物组合 物，所述药物组合物含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或由式1 表示的化合物作为活性成分。

[式1]

其中，R为-C₆H₅或-CH＝CHCH＝CH(CH₂)₄CH₃。

本发明还提供了用于预防或改善特应症的化妆品组合物，所述化妆 品组合物含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或由式1表示的化 合物genekwadapnin(R为-C₆H₅)或芫花酯甲(R为 -CH＝CHCH＝CH(CH₂)₄CH₃)作为活性成分。

本发明还提供了特应症的治疗方法，所述治疗方法包括如下步骤： 对患有特应症的受试者给予药学上有效剂量的芫花提取物、所述芫花提 取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的由式1表示的化合物。

本发明还提供了特应症的预防方法，所述预防方法包括如下步骤： 对受试者给予药学上有效剂量的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、 或从所述芫花提取物中分离的由式1表示的化合物。

本发明还提供了芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫 花提取物中分离的由式1表示的化合物作为用于预防和治疗特应症的药 物组合物的用途。

此外，本发明提供了芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所 述芫花提取物中分离的由式1表示的化合物作为用于预防和改善特应症 的化妆品组合物的用途。

有益效果

如上文所阐释的，本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、 或从所述芫花提取物中分离的式1化合物genekwadapnin或芫花酯甲能 够增加Th1免疫细胞中细胞因子的分泌，并能够在特应症小鼠模型中阻 抑特应症，因此，本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从 所述芫花提取物中分离的式1化合物可有效地用于特应症的预防或治疗。

附图说明

参考附图，可充分理解本发明优选实施方式的应用，其中：

图1是根据本发明的实施例说明部位分布图的图。

图2是根据本发明的实施例说明为了研究I型和II型细胞因子的 mRNA水平变化所进行的RT-PCR的结果的图。

图3是根据本发明的实施例说明在特应症小鼠模型中的特应症治疗 效果的图：

GD：genekwadapnin治疗组；以及

对照：对照组。

图4是根据本发明的实施例说明在特应症诱导小鼠中的特应症治疗 效果的图。

图5是根据本发明的实施例说明在特应症患者中的特应症治疗效果 的图。

图6是根据本发明的实施例说明细胞内机制的图：

GD：genekwadapnin治疗组或芫花酯甲治疗组。

具体实施方式

在下文中对本发明进行详细说明。

本发明提供了用于预防或治疗特应症的药物组合物，所述药物组合 物含有芫花提取物作为活性成分。

为制备本发明的组合物，栽培或购买芫花。

所述芫花提取物可优选从茎、根、叶、花叶(floral leaves)或芽(buds) 得到，更优选从花叶或芽得到。

为制备本发明的组合物，只要能够适合于天然物质的提取，对用于 芫花提取的溶剂没有限制，但所述溶剂优选选自于由如下溶剂所组成的 组：甲醇、甲醇水溶液、乙醇、乙醇水溶液、丁醇、丙酮，或上述溶剂 的混合物，更优选甲醇。

提取溶剂的体积优选为芫花重量的2-200倍，更优选10-30倍，但不 总限于此。

芫花提取的方法优选选自于本领域技术人员所熟知的常规提取方 法，例如，使用提取设备的方法，如热水提取、浸泡(soaking)提取、 超临界提取、亚临界提取、高温提取、高压提取、回流提取和超声提取； 或使用吸附树脂(如XAD和HP-20)的方法。还优选通过伴以升高的温 度的回流提取或室温回流提取进行提取。提取的优选温度为10-30℃；提 取的优选时间为1-20天、更优选5-10天，但不总限于此。

本发明还提供了用于预防或治疗特应症的药物组合物，所述药物组 合物含有芫花提取物的部位作为活性成分。

本发明的部位可通过包括以下步骤的方法获得：

步骤1：通过向芫花中加入水、C₁-C₄低级醇或它们的混合物获得芫 花提取物；以及

步骤2：通过使用己烷、氯仿和乙酸乙酯对步骤1中获得的提取物 进行分级分离(fractionation)获得部位。

在下文中将逐步对上面所提及的制备方法进行更详细的说明。

首先，步骤1是通过使用提取溶剂获得芫花提取物。

所述芫花提取物可通过上述制备方法得到。

接着，步骤2是通过用己烷、氯仿和乙酸乙酯对步骤1中得到的提 取物进行分级分离以获得部位。

具体而言，为获得所述部位，将步骤1中获得的芫花提取物(1.5kg) 悬浮于水中，向其中分步(stepwise)加入己烷、氯仿和乙酸乙酯。将各 层分离后，将氯仿层在减压下进行浓缩，然后干燥，得到氯仿部位(150g) 和乙酸乙酯部位(164g)。

此时，减压浓缩优选可通过使用旋转蒸发器进行，但并不总限于此。 本文的干燥过程优选可通过减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥、 室温干燥或冷冻干燥进行，更优选通过冷冻干燥进行，但并不总限于此。

此外，本发明提供了用于预防或治疗特应症的药物组合物，所述药 物组合物含有由式1表示的化合物作为活性成分：

[式1]

其中，R为-C₆H₅或-CH＝CHCH＝CH(CH₂)₄CH₃。

在式1的化合物中，当R为-C₆H₅时，所述化合物为genekwadapnin。 同时，当R为-CH＝CHCH＝CH(CH₂)₄CH₃时，所述化合物为芫花酯甲。

式1的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)可通过以下步骤获得： 提取芫花提取物；将所述芫花提取物进行分级分离；使用硅胶柱色谱从 芫花氯仿部位中分离和纯化所述化合物。

具体而言，所述硅胶柱色谱优选进行一次或反复数次。优选使用氯 仿∶甲醇(99∶1-1∶1)作为流动相。此时，所述溶剂可通过密度梯度洗脱(从 非极性逐步变成极性)进行洗脱。对所收集的部位的特应症治疗效果进 行测量以选择活性部位。

已证实本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫 花提取物中分离的化合物增加了Th1免疫细胞中细胞因子的分泌(参见 图2)，并阻抑了特应症小鼠模型中的特应症(参见图3和图4)，这表明 本发明的提取物、部位或化合物可有效地用于特应症的预防或治疗。

优选地，本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或由式1 表示的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)可以以0.1wt％-50wt％的量 包含于本发明的药物组合物中，但并不总限于此。

本发明还提供了用于预防或改善特应症的化妆品组合物，所述化妆 品组合物含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取 物中分离的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)作为活性成分。

本发明还提供了用于预防或治疗特应症的皮肤外用制剂，所述皮肤 外用制剂含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取 物中分离的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)作为活性成分。

此外，本发明提供了用于预防或改善特应症的健康功能食品，所述 健康功能食品含有芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花 提取物中分离的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)作为活性成分。

本发明的药物组合物还可另外包含通常用于药物制备的合适的载 体、赋形剂和稀释剂。

可将本发明的药物组合物配制成用于口服给予，例如粉剂、颗粒剂、 片剂、胶囊剂、混悬剂(suspensions)、乳剂、糖浆剂和气溶胶(aerosols)； 以及用于胃肠外给予，例如外用、栓剂和无菌注射液等。所述载体、赋 形剂和稀释剂例如为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖 醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶(acacia rubber)、海藻酸盐/ 酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙 烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸盐/酯、丙基羟基苯甲酸盐/酯、滑石粉、 硬脂酸镁和矿物油。制剂(formulations)可使用通常所用的赋形剂或稀 释剂(如填充剂、增量剂(extenders)、粘结剂、湿润剂、崩解剂和表面 活性剂)来制备。可通过与通常所使用的稀释剂或赋形剂(如填充剂、 增量剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂)混合来将本发明的药 物组合物制备为用于口服或胃肠外给予。用于口服给予的固体制剂为片 剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将本发明的组合 物与一种或多种合适的赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶 等)混合来制备。除了简单的赋形剂外，可使用润滑剂，例如硬脂酸镁、 滑石粉等。用于口服给予的液体制剂为混悬剂、溶液剂、乳剂和糖浆剂； 并且，除了通常所用的简单稀释剂(例如水和液体石蜡)外，上面提到 的制剂可含有各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂(aromatics) 和防腐剂(preservatives)。用于胃肠外给予的制剂为无菌水溶液剂、水 不溶性赋形剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。除了活性化合物外， 水不溶性赋形剂和混悬剂可包含丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、 可注射的酯(如油酸乙酯)等。除了活性化合物外，栓剂可以包含witepsol、 聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可油脂(cacao butter)、甘油三月桂 酸酯(laurin butter)和甘油明胶等。

本发明的药物组合物可口服给予或胃肠外给予(例如，静脉注射、 皮下注射、腹腔注射或局部注射)。所述组合物的有效剂量可根据患者状 况、体重、年龄、性别、饮食、排泄、疾病严重程度、给药方法、给药 途径和给药时间等来确定。本发明的冻干提取物或部位的剂量为每天 0.0001mg/kg-500mg/kg，优选每天0.001mg/kg-100mg/kg；给药频率为每 天一次，或优选每天数次。

本发明的药物组合物可单独给予或与外科手术、激素疗法、化疗和 生物调节剂一同给予。

本发明的化妆品组合物可配制成皮肤润肤液(skin lotion)、皮肤软 化剂、皮肤爽肤液(skin toner)、收敛剂(astringent)、润肤液(lotion)、 乳液、保湿液、营养液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、精华、营 养精华、贴片(pack)、肥皂、洗发水、清洁泡沫、清洁液、清洁霜、身 体润肤液、身体清洁剂、乳液、压粉、散粉和眼影等。

除了本发明的芫花提取物外，本发明的化妆品组合物可包含通常用 于化妆品领域中的补充物(supplement)，例如脂肪物质、有机溶剂、分 解物(resolvent)、浓缩物(concentrate)、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、 助悬剂、稳定剂、发泡剂、香味剂(odorant)、表面活性剂、水、离子型 乳化剂或非离子型乳化剂、填充剂、掩蔽剂(sequestering agent)、螯合 剂(chelating agent)、防腐剂、维生素、阻断剂(blocker)、保湿剂、精 油(essential oil)、染料、色素、亲水性活化剂或疏水性活化剂、脂质囊 泡(lipid vesicle)或通常用于化妆品的其它组分。

可将本发明的芫花提取物配制成皮肤外用制剂。含有本发明的芫花 提取物的皮肤外用制剂还可另外包含通常在皮肤科学领域中使用的补充 物，例如脂肪物质、有机溶剂、分解物、浓缩物、胶凝剂、软化剂、抗 氧化剂、助悬剂、稳定剂、发泡剂、香味剂、表面活性剂、水、离子型 乳化剂或非离子型乳化剂、填充剂、掩蔽剂、螯合剂、防腐剂、维生素、 阻断剂、保湿剂、精油、染料、色素、亲水性活化剂或疏水性活化剂、 脂质囊泡或通常用于皮肤外用制剂的其它组分。可将上述补充物的量确 定为在皮肤科学领域中普遍接受的量。

本发明的芫花提取物可用作健康功能食品。本文的食品不受限定。 例如，可将所述芫花提取物添加至饮品(drinks)、肉类、香肠、面包、 饼干米饼(biscuits rice cakes)、巧克力、糖果、点心(snacks)、曲奇 (cookies)、比萨饼、拉面(ramyuns)、面制品(flour products)、口香糖、 包括冰淇淋在内的乳制品、汤、饮料(beverages)、酒精饮品和复合维生 素等，并且广义上说，可涵盖在健康食品生产中适用的几乎每一种食品。

根据常规方法，可将本发明的芫花提取物本身加入或与其它食品组 分混合加入。可根据使用目的(预防或改善)对活性成分的混合比例进 行调节。通常情况下，为生产健康食品或饮料，优选将本发明的芫花提 取物以总食品重量的0.1-90重量份进行添加。然而，如果为了健康和保 健或调节健康状况而需要长期给予，含量可低于上述值，但由于本发明 的芫花提取物已被证实非常安全，较高含量也可接受。

本发明的用于健康饮料的组合物还可以像其它饮料一样，额外包含 各种香料(flavors)或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物可为单 糖(例如，葡萄糖和果糖)、二糖(例如，麦芽糖和蔗糖)、多糖(例如， 糊精和环糊精)以及糖醇(例如，木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇)中的 一种。此外，可将天然甜味剂(奇甜蛋白(thaumatin)、甜菊(stevia) 提取物，例如莱鲍迪苷A(rebaudioside A)、甘草甜素(glycyrrhizin)等) 和合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)包含在内作为甜味剂。在100mL组 合物中，所述天然碳水化合物的含量优选为1-20g、更优选为5-12g。

除上面提及的成分外，本发明的芫花提取物可包含各种营养素、维 生素、矿物质(电解质)、香料(包括天然香料和合成香料)、着色剂和 增量剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保 护性胶体增粘剂(colloidal viscosifiers)、pH调节剂、稳定剂、防腐剂 (antiseptics)、甘油、醇、用于加入苏打中的碳酸化剂(carbonators)等。 本发明的芫花提取物还可包含可添加至天然果汁、果汁饮料和/或蔬菜饮 料的果肉。所有提及的成分可以单独添加或者一起添加。这些成分的混 合比例实际上并不重要，但通常情况下，每100重量份的本发明的芫花 提取物可加入0.1-20重量份的上述各成分。

本发明还提供了特应症的治疗方法，所述治疗方法包括如下步骤： 向患有特应症的受试者给予药学上有效剂量的芫花提取物、所述芫花提 取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物(genekwadapnin或芫 花酯甲)。

本发明还提供了特应症的预防方法，所述预防方法包括如下步骤： 向受试者给予药学上有效剂量的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、 或从所述芫花提取物中分离的化合物(genekwadapnin或芫花酯甲)。

已经证实本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述 芫花提取物中分离的化合物增加Th1免疫细胞中细胞因子的分泌(参见 图2)，并阻抑了特应症小鼠模型中的特应症(参见图3和图4)，这表明 本发明的提取物、部位或化合物可有效地用于特应症的预防或治疗方法。

本发明还提供了芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫 花提取物中分离的式1化合物作为用于预防和治疗特应症的药物组合物 的用途。

本发明还提供了芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫 花提取物中分离的式1化合物作为用于预防和改善特应症的化妆品组合 物的用途。

已经证实本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述 芫花提取物中分离的化合物增加Th1免疫细胞中细胞因子的分泌(参见 图2)，并阻抑了特应症小鼠模型中的特应症(参见图3和图4)，这表明 本发明的提取物、部位或化合物可有效地用于特应症的预防或治疗方法。

实施例

在以下实施例、实验实施例和制造实施例中所示的本发明的实际且 当前优选的实施方式是说明性的。

然而，应当理解的是，基于本公开，本领域技术人员可在本发明的 精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：genekwadapnin和芫花酯甲的分离

将11.7kg芫花的干燥芽加入20L甲醇中，然后提取三次，得到1.5kg 甲醇提取物。将所得到的甲醇提取物悬浮于10L水中，然后用各为10L 的正己烷、氯仿和乙酸乙酯作为溶剂分步萃取三次。结果得到323g己烷 部位、150g氯仿部位以及164g乙酸乙酯部位。其中，将74g氯仿部位上 样于硅胶柱，接着用氯仿和甲醇(密度梯度为99∶1-1∶1)进行洗脱。结果 造成样品减少(20g)，并将其再次加载于反相硅胶柱。将甲醇和水(7∶3) 的混合溶液用于得到1.1g含有genekwadapnin的部位和1.4g含有芫花酯 甲的部位。将1.1g含有genekwadapnin的部位加载于正相硅胶柱(洗脱 溶剂∶正己烷和乙酸乙酯，15∶1)，得到208.7mg活性部位。将得到的活 性部位通过反相硅胶柱色谱(洗脱溶剂∶甲醇和水，3∶1)进行纯化，得 到125.6mg的genekwadapnin化合物。对1.4g芫花酯甲部位进行正相硅 胶柱色谱(洗脱溶剂∶正己烷和乙酸乙酯，9∶1-0∶100)和甲醇溶剂重结 晶。结果得到74mg芫花酯甲。

实施例2：细胞培养

在5％CO₂的加湿培养箱中于37℃培养人细胞系(A549、NK92、 muDC以及Jurkat)。

具体而言，NK92(人NK淋巴瘤，IL-2依赖的NK细胞系)从ATCC (American Type Culture Collection)购买。将NK92细胞系维持在补充 有20％FCS(HyClone，Logan，UT)、2mM L-谷氨酸盐、100μg/mL青 霉素、100μg/mL链霉素(Life Technologies)和100U/mL IL-2(Chiron， Emeryville，CA)的α-MEM(Life Technologies，Karlsruhe，Germany)中。

实验实施例1：RT-PCR

进行RT-PCR，以对实施例2中所培养的A549、NK92、muDC和Jurkat 细胞中与IFN-γ、IL-2和IL-12的诱导相关的mRNA水平的变化进行研 究。将这些细胞在有2ng genekwadapnin或芫花酯甲存在的情况下培养 12小时。

两步法RT-PCR用oligo-dT引物、逆转录酶、特异性引物组以及Taq 聚合酶(Takara，Shiga，Japan)进行。根据标准方案分离总RNA。使用 Accusript高保真第一链cDNA合成试剂盒(Stratagene)，根据制造商说 明书对cDNA进行合成。将1μL合成的cDNA与20μL反应混合物用于 PCR，所述反应混合物含有0.5U ExTaq DNA聚合酶、1×缓冲液、1mM  dNTP混合物(Takara)和特异性引物组。PCR扩增使用GeneAmp PCR 系统2700(Applied Biosystems，Foster city，CA，USA)按如下程序进 行：在94℃预变性5分钟，在94℃变性45秒，在56℃退火45秒，在 72℃延伸1分钟，从变性至延伸进行25-40个循环后，在72℃终延伸7 分钟。[表1]所示的PCR引物使用Primer3程序进行设计，Primer3程序 购买自Bioneer(Daejeon，Korea)。此时，将GAPDH用作内标。

[表1]

将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，用溴化乙锭(EtBr)进 行染色，然后使用Gel Doc2000UV透射仪(Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA，UV)可视化。用Quantity One软件(Bio-Rad Laboratories) 进行分析。将每个样品至少测试3次，结果显示于图2A和图2B中。

结果如图2A所示，在用genekwadapnin或芫花酯甲治疗后12小时， NK92和A549细胞中的I型细胞因子(IFN-γ、IL-2和IL-12)的转录物 均显著增加，然而并未诱导II型细胞因子(IL-4)转录。同时，IL-15和 IL-18的转录不受控制(图2A)。如图2B所示，genekwadapnin或芫花酯 甲在转录水平上诱导IL-12和IFN-γ的作用在3小时内便已诱发(图2B)。 实验实施例2：在特应症小鼠模型中genekwadapnin或芫花酯甲的特应症 治疗效果

<2-1>在NC小鼠模型中的特应症治疗效果

NC小鼠是当其在常规空间生长时便表现出典型的特应症症状的小 鼠。将genekwadapnin或芫花酯甲局部涂敷于开始显示出特应症症状的 NC小鼠上，然后对特应症症状的变化进行观察。为了使小鼠中的误差最 小化以及确证治疗效果，对每只小鼠进行局部治疗，并对皮肤组织进行 活组织检查，以在实验上证明特应症治疗效果。

结果如图3所示，在涂敷有genekwadapnin或芫花酯甲的背部，特 应症症状显著减少。这些皮肤组织的活组织检查也证实了炎性细胞分布 的显著差异，即，用genekwadapnin或芫花酯甲进行治疗的区域表现出 几乎正常的表型(图3)。

<2-2>在特应症诱导小鼠模型中特应症治疗效果的确证

将DNCB(过敏原之一)涂敷在正常Balb/c小鼠的除毛皮肤上来有 意诱导特应症。特应症症状随DNCB的剂量和处理时间而变化，所述特 应症症状被分为不同评分组(评分4-8的组和评分10-13的组)。在以较 低剂量的DNCB进行处理的小鼠组(评分4-8的组)中，在genekwadapnin 或芫花酯甲治疗24小时内，特应性皮肤恢复到正常皮肤。另一方面，甚 至在评分10-13分的小鼠组(显示出严重的特应症症状)中，恢复的速 度也比对照组快至少两倍(图4)。当时，测试各用10只小鼠以两个平行 实验进行。

因此，确证了本发明的芫花提取物、以及从中分离的化合物 (genekwadapnin和芫花酯甲)在特应症的预防或治疗中有效。

<2-3>在特应症患者中特应症治疗效果的确证

在给特应症患者皮肤上涂敷genekwadapnin或芫花酯甲后，所述化 合物的特应症治疗效果得到了确证。

具体而言，将5μg/mL的genekwadapnin或芫花酯甲涂敷在特应症患 者的皮肤上，然后观察5-20天。治疗效果通过Medream Skin Clinic (Goejeong-dong，Seogu，Daejeon，Korea)进行确证。

结果如图5所示，在涂敷有genekwadapnin或芫花酯甲的特应症患 者中，当症状轻微时，在治疗后5天特应性皮肤恢复到正常；或者，当 症状严重时，在治疗后20天特应性皮肤恢复到正常(图5)。

实验实施例3：genekwadapnin或芫花酯甲的细胞内机制

为了研究genekwadapnin或芫花酯甲的细胞内机制，将实施例2中 所培养的NK92细胞用浓度为500ng/mL的genekwadapnin或芫花酯甲进 行处理。12小时后，使用抗体对PKC同种型(isotype)的磷酸化水平进 行研究。使用GAPDH对本文所用的蛋白质的量进行确证。

具体而言，使用冷的SDS裂解缓冲液[(50mM HEPES、150mM NaCl、 0.2mM EDTA、0.5％NP-40、0.1％SDS、1mM Na₃VO₄、10mM NaF和完 全蛋白酶抑制剂混合试剂(complete Protein Inhibitor Cocktail，Roche)]， 将用genekwadapnin或芫花酯甲处理的细胞在冰上溶解30分钟。将溶解 的细胞溶液在高速旋转机中以13,000rpm的速度旋转30分钟，以使不溶 部分沉淀，然后将水溶性部分分离。对分离的细胞水溶液进行定量，然 后用10-12％的SDS-PAGE进行电泳。将在凝胶上分离的细胞蛋白在100V 转印至PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)2小时。为了确证细 胞中PKC同种型的磷酸化，将多抗兔抗PKD1、多抗兔抗phosphoPKD1 (Ser916)、多抗兔抗phosphoPKD1(Ser744/748)、多抗兔抗 phosphoPKCα/βII、多抗兔抗phosphoPKC5、多抗兔抗phosphoPKCθ和 多抗兔抗phosphoPKCζ/λIgG(Cell Signaling Technology，USA)(1∶1000) 用作第一抗体。作为第二抗体，将辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG (Santa Cruz Biotechnology，USA)(1：3000)在室温下处理60分钟。为 了确保细胞蛋白等量，使用多抗兔抗GAPDH IgG(Santa Cruz  Biotechnology，Pasadena，CA，USA)。免疫反应完成后，使膜与ECL 试剂(Millipore，Billerica，MA，USA)反应，然后将其在X-射线胶片 上进行曝光，以对作为胶片上的条带显示的PKC同种型的磷酸化水平进 行观察。

结果如图6所示，在NK92细胞(用genekwadapnin或芫花酯甲处 理的细胞)中，PKD1水平没有变化，但确证了丝氨酸残基(PKD1蛋白 的第744/748位和第916位)的磷酸化。同时，确证了PKC同种型的其 它类型并未磷酸化(图6)。

下文对本发明组合物的制造实施例进行描述。

制造实施例1：药物制剂的制备

<1-1>粉剂的制备

芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离 的化合物                           20mg

乳糖                        20mg

根据制备粉剂的常规方法，通过将上述所有组分混合而制备粉剂， 所述粉剂填充在气密包装中。

<1-2>片剂的制备

根据制备片剂的常规方法，通过将上述所有组分混合而制备片剂。

<1-3>胶囊剂的制备

根据制备胶囊剂的常规方法，通过将上述所有组分混合而制备胶囊 剂，所述胶囊剂填充在明胶胶囊中。

<1-4>液体制剂的制备

将上述所有组分溶于纯净水中。添加柠檬香料后，通过加入纯净水 将总体积调节至100mL。根据制备液体制剂的常规方法，通过将上述混 合物倒入棕色瓶中并对其进行灭菌而制备液体制剂。

<1-5>可注射溶液剂的制备

芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离 的化合物                 10μg/mL

弱HCl BP          至pH7.6

可注射NaCl BP     至1mL

将乙醇混合物提取物溶于适量的可注射NaCl BP中。使用弱HCl BP 将所制备的溶液的pH调节至7.6。使用可注射NaCl BP对体积进行调节。 将所述溶液充分混合并装入5mL I型透明玻璃安瓿中。通过将开口处的 玻璃熔融对安瓿进行密封，然后在120℃高压灭菌至少15分钟。

制造实施例2：食品的制备

含有本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花 提取物中分离的化合物的食品按照如下进行制备。

<2-1>面制食品的制备

将0.5-5.0重量份的本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、 或从所述芫花提取物中分离的化合物加入面粉中。根据常规方法，用该 面粉混合物制备健康促进食品(Health enhancing foods)，如面包、蛋糕、 曲奇、薄脆饼干(crackers)和面条。

<2-2>乳制品的制备

将5-10重量份的本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或 从所述芫花提取物中分离的化合物加入牛奶中。根据常规方法，用该牛 奶混合物制备健康促进乳制品，如黄油和冰淇淋。

<2-3>Sun-Sik的制备

根据常规方法，将糙米、大麦、糯米和Yulmu(薏仁，Job’s tears) 糊化(gelatinized)，干燥并粉碎，以得到60目粉末。

根据常规方法，将黑豆、黑芝麻和野芝麻蒸熟并干燥，然后进行粉 碎，以得到60目粉末。

将本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提 取物中分离的化合物进行减压浓缩、喷雾干燥并粉碎，以得到60目干燥 粉末。

通过将谷物、种子以及芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从 所述芫花提取物中分离的化合物的干燥粉末以如下比例混合来制备 Sun-Sik。

谷物(糙米：30重量份；Yulmu：15重量份；大麦：20重量份)；

种子(野芝麻：7重量份；黑豆：8重量份；黑芝麻：7重量份)；

本发明的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取 物中分离的化合物的干燥粉末(3重量份)；

灵芝(0.5重量份)；

地黄(Rehmannia glutinosa)(0.5重量份)。

<2-4>健康补充食品的制备

根据对健康食品来说优选的组成比将维生素和矿物质混合。然而， 可对该组成比进行调整。根据制备健康食品(如颗粒剂等)的常规方法， 将组分进混合，然后根据常规方法对用于健康食品的组合物进行制备。

制造实施例3：健康饮料的制备

根据用于制备健康饮料的常规方法将以上成分混合。将混合物在 85℃加热搅拌1小时，然后进行过滤。将滤液装载于1L的灭菌容器中(所 述容器被密封并再次灭菌)，保存在冰箱中，直至被用于制备用于健康饮 料的组合物。

根据优选的混合比例对适合于喜爱的饮料中的成分进行混合，但可 以根据消费者的特征、使用目的、地区和国家偏好等对该组成比例进行 调整。

制造实施例4：化妆品的制备

<4-1>润肤化妆水(emollient toilet water)(皮肤)的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表2]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的润肤化妆水，所述润肤化妆水含有本发明 的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的 化合物。

[表2]

<4-2>营养化妆水(nutritive toilet water)(润肤液)的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表3]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的营养化妆水，所述营养化妆水含有本发明 的芫花提取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的 化合物。

[表3]

<4-3>精华的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表4]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的精华，所述精华含有本发明的芫花提取物、 所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

[表4]

<4-4>清洁剂(清洁泡沫)的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表5]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的清洁剂，所述清洁剂含有本发明的芫花提 取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

[表5]

<4-5>营养霜的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表6]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的营养霜，所述营养霜含有本发明的芫花提 取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

[表6]

<4-6>按摩霜的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表7]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的按摩霜，所述按摩霜含有本发明的芫花提 取物、所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

[表7]

<4-7>贴片的制备

根据用于制备化妆品的常规方法，通过将在[表8]中所示的所有组分 混合而制备用于特应性皮肤的贴片，所述贴片含有本发明的芫花提取物、 所述芫花提取物的部位、或从所述芫花提取物中分离的化合物。

[表8]

本发明并不限于上述说明性实施例，可由本领域技术人员修改或变 更。本发明也可应用于包括彩妆在内的各种类型化妆品，并且可用于根 据效果在人皮肤上少量施用(light application)的药物和软膏的制备。上 述标准全部包含于所附权利要求书中提出的本发明的精神和范围内。

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