一种结缔组织病早期肺间质病变诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种结缔组织病早期肺间质病变诊断试剂盒，包括检测人外周血液MMP7、IFN-γ和IP-10的检测组件。本发明提供了一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定量测定人血清中特定蛋白细胞因子、趋化因子水平，有助于早期诊断结缔组织病肺间质病变。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种结缔组织病早期肺间质病变诊断试剂盒。

背景技术

肺间质病变（Interstitial lung disease，ILD）是由多种原因引起的肺间质 炎症性疾病，多缓慢进展，逐渐丧失肺泡-毛细血管功能单位，最终发展为弥 漫性肺纤维化和蜂窝肺，导致呼吸功能衰竭而死亡。临床早期表现为活动后 气促，随着病变进展，表现为呼吸困难，心功能不全及反复肺部感染等一系 列症状，它是一组发病率高预后差的疾病,其中位生存期仅2-3年。导致肺 间质病变的有多种疾病，如特发性间质性肺炎(IIP)，其中结缔组织病（CTD） 是导致肺间质病变的重要病因，结缔组织病肺间质病变（CTD-ILD）患者约 占呼吸科门诊量的15%，50%的初发肺间质病变为结缔组织病肺间质病变。 结缔组织病肺间质病变是导致结缔组织病患者死亡的主要原因。结缔组织病 是一组高发生率、高致残率、高死亡率、高医疗费用的慢性疾病，如发病率 占人口3%的类风湿性关节炎（RA）是结缔组织病中发病率最高、在我国其 致残率高达79.4%的慢性疾病。肺部并发症直接导致RA10％至20％的死亡 率，其与关节外并发症充血性心力衰竭的是RA两个最重要的导致RA患者 过早死亡的原因。然而，如果结缔组织病肺间质病变得到早期诊断，及时治 疗，预后将明显改善。肺间质病变的早期发现和早期治疗对改善患者预后有 重要影响。目前诊断肺间质病变主要依靠高分辨率肺CT(HRCT)和肺部活检、 肺泡支气管灌洗物获得。HRCT检测检测方法太昂贵，且不易反复进行，不 能发现早期ILD，不易对结缔组织病进行普查；肺活检为手术有创检查，患 者不易接受。肺泡支气管灌洗物方法，需要借助支气管镜方法获得，病人不 易接受；因此早期无临床症状肺间质病变患者常因漏诊而耽误治疗时机。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种简便、易行、可靠的、 利用外周血进行检测MMP7，IP-10，IFN-γ以诊断结缔组织病早期肺间质病 变的试剂盒。

本发明的具体技术方案如下：

一种结缔组织病早期肺间质病变诊断试剂盒，包括检测人外周血液 MMP7、IFN-γ和IP-10的检测组件。

在本发明的一个优选实施方案中，所述检测组件为ELISA检测组件或电 化学发光检测组件。

在本发明的一个优选实施方案中，所述ELISA检测组件为双抗体夹心 ELISA检测组件。

在本发明的一个优选实施方案中，包括检测人MMP7的第一ELISA检 测组件、检测IFN-γ的第二ELISA检测组件和检测IP-10的第三ELISA检测 组件。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一ELISA检测组件包括包被有 MMP7一抗的96孔检测板和第一酶标二抗，所述MMP7一抗为鼠抗人 MMP-7-IgG，所述第一酶标二抗为鼠抗人MMP-7-IgG的HRP标记抗体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第二ELISA检测组件包括包被有 IFN-γ一抗的96孔检测板和第二酶标二抗，所述IFN-γ一抗为鼠抗人 IFN-γ-IgG，所述第二酶标二抗为鼠抗人IFN-γ-IgG的HRP标记抗体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第三ELISA检测组件包括包被有 IP-10一抗的96孔检测板和第三酶标二抗，所述IP-10一抗为鼠抗人 IP-10-IgG，所述第二酶标二抗为鼠抗人IP-10-IgG的HRP标记抗体。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括洗涤液、显色液和终止液;

所述洗涤液为2%triton的PBS溶液;

所述显色液包括显色A液和显色B液，显色A液的配方如下：醋酸钠 13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水为溶剂，定容500mL；显色B液的配方如下： 乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，TMB0.15g，蒸馏水为 溶剂，定容500mL；

所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供了一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定量 测定人血清中特定蛋白细胞因子、趋化因子MMP7，IP-10，IFN-r水平，有 助于诊断结缔组织病早期肺间质病变；

2、与传统肺间质病变诊断方法高分辨率肺CT、肺功能检测及肺泡支气 管灌洗物相比较，外周血检测方法具有准确、快速、经济的优点。

附图说明

图1为本发明实施例1初筛阶段MMP7的检测结果图；

图2为本发明实施例1初筛阶段IFN-γ的检测结果图；

图3为本发明实施例1初筛阶段IP-10的检测结果图；

图4为本发明实施例1初筛阶段的Roc曲线分析图；

图5为本发明实施例1再次筛选筛阶段MMP7的检测结果图；

图6为本发明实施例1再次筛选阶段IFN-γ的检测结果图；

图7为本发明实施例1再次筛选阶段IP-10的检测结果图；

图8为本发明实施例1再次筛选阶段的Roc曲线分析图；

图9为本发明实施例1核实实验结果阶段MMP7的检测结果图；

图10为本发明实施例1核实实验结果阶段IP-10的检测结果图；

图11为本发明实施例1核实实验结果阶段的Roc曲线分析图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明 和描述。

实施例1

对135例类风湿性关节炎（RA）患者进行了实际案例检验，证实结缔组 织病肺间质病变患者外周血清的基质金属蛋白酶7（MMP7）,干扰素-γ （IFN-γ）和趋化因子IP-10水平增高。检测患者外周血清的基质金属蛋白酶 7（MMP7）,干扰素-γ（IFN-γ）和趋化因子IP-10水平可以诊断结缔组织 病早期肺间质病变。具体验证过程如下：

135例类风湿性关节炎（RA）患者来自厦门大学附属第一医院风湿免疫 科。均符合美国风湿病学会1982年RA诊断标准。所有入组病人均行高分辨 率肺CT(HRCT)和肺功能（PFTs）检查，及统计临床关节活动指标，实验室 病情活动指标血沉（ESR）,C-反应蛋白（CRP）,抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP）。 依据HRCT异常及肺功能异常将病人分为类风湿性关节炎肺间质病变 (RA-ILD)和类风湿性关节炎无肺间质病变（RA no ILD）组。135例RA患者 中80例确定RA-ILD，54例为RA无肺间质病变（RA no ILD）。

同期，24名健康对照个体。

1.1.指标筛选阶段：

试剂盒Immunoassay Kit（美国）。采用目前国际先进的液相 芯片检测技术。检测37种生物标志物指标，具体为细胞因子/受体：IL1, IL1RA,IL1,IL2,IL2R,IL4,IL5,IL6,IL7,IL8,IL10,IL12,IL13,IL15,IL17, IL22,TNF,IFN,IFN；趋化因子CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL11，CXCL9， CXCL10，CXCL11；重塑蛋白：MMP1,MMP2,MMP3,MMP7,MMP8, MMP9。

1.1.1.初筛（图1至图4）

检测55例RA患者和24例健康对照。结果显示（如图1至图3所示）， RA-ILD组患者（N=38）,MMP7、IFN-γ和IP-10的外周血液中的浓度与RA  no ILD组(N=17)比较，血清中平均值±SEM分别为：1739±292.3vs.761.5± 83.85pg/ml(p=0.0317);9.084±1.502vs.4.419±0.6553pg/ml(p=0.0474); 204.6±34.83vs.95.49±13.75pg/ml(p=0.0449)。Roc曲线分析（如图4所示） 显示MMP7、IFN-γ和IP-10可以区分患者有肺间质病变或无肺间质病变，敏 感性和特异性分别为0.87/0.71/0.95和0.71/0.65/0.47。MMP7、IFN-γ、和 IP-10浓度与肺功能FVC％和DLCO％呈明显负相关。

1.1.2.扩大样本量，再次筛选（图5至图8）

使用同样试剂盒及方法检测另外78例RA患者，其中RA-ILD（N=47）, RA no ILD（N=31）。结果显示（如图5至图7所示），MMP7、IP-10和IFN-γ 的外周血液中的浓度与RA no ILD组(N=17)比较，血清中平均值±SEM分别 为：355.47±226.79vs.213.24±154.84pg/ml(p=0.002)、93.366±53.57vs. 66.88±35.56pg/ml(p=0.02)和0.738±0.643vs.0.446±0.633pg/ml(p=0.02)。 Roc曲线分析（如图8所示）显示MMP7可以区分患者有肺间质病变或无肺 间质病变，敏感性和特异性分别为0.61和0.78。

上述筛选显示外周血MMP7,IFN-γ和IL-10浓度是分辨肺间质病变的有 效指标。

1.2.核实实验结果（图9至图11）

验证上述结果，采用酶联免疫吸附法（ELISA法）,试剂盒 Human CXCL10/IP-10Immunoassay,Human Total MMP-7Immunoassay(R&  D Systems美国)检测同批135例RA患者外周血中MMP7和IP-10表达。结 果显示（如图9和图10所示），RA-ILD组（N=80）患者MMP7和IP-10的 外周血液中的浓度（血清中平均值分别为：4.954pg/ml±0.4605pg/ml和 327.6pg/ml±42.75pg/ml）比RA no ILD组(N=54)（平均值±标准误差分别为： 2.924pg/ml±0.3138pg/ml和168.9pg/ml±14.38pg/ml）明显增高，有显著统 计学差异（分别P=0.0013和P=0.0035）。Roc曲线分析显示（如图11所 示），MMP7和IP-10可以区分RA患者有肺间质病变或无肺间质病变，敏感 性和特异性分别为0.63/0.51和0.64/0.83。

综上所述，类风湿性关节炎患者外周血MMP7、IFN-γ和IP10的过度 表达是RA患者发生早期肺间质病变的生物指标，MMP7、IFN-γ和IP10 水平升高提示出现无症状的早期肺间质病变，反映肺间质病变的进展。由此 可知，简便、易行、可靠的检测外周血清MMP7/IP-10/IFN-γ浓度的试剂盒 可以诊断类风湿性关节炎及其它结缔组织病早期肺间质病变。该试剂盒可以 是应用ELISA法、电化学发光法或其他检测方法的试剂盒。

实施例2

根据上述实施例1的实验结果所制成的一种结缔组织病早期肺间质病变 诊断试剂盒，包括检测结缔组织病患者外周血清MMP7的第一ELISA检测 组件、检测IFN-γ的第二ELISA检测组件和检测IP-10的第三ELISA检测组 件。

上述96孔检测板的制备方法如下：

将200ng/mL的抗体按照每孔100uL包被于96孔板，抗体稀释液为PBS， 将96孔板置于37℃孵育2h；孵育两小时，洗板1次，每孔加封闭液200uL， 37℃封闭2h，封闭结束后洗板1次，将板置于干燥间干燥后备用；封闭液成 分为：1XPBS+0.5%酪蛋白+2%明胶+0.1%防腐剂（proclin-300）。

本试剂盒各组件的检测过程如下：

1、血清标本准备：需要检测的血清或血浆样本使用样品稀释液稀释，稀 释比例为1:3，样品稀释液为20%NBS(PBS稀释)；

2、在检测板的适当孔内加入待检样品，每孔100uL；

3、将检测板放入恒温培养箱，37℃孵育2h；

4、洗板：使用洗涤液洗板5次，并将板内洗液移除；

5、加酶：每孔加入酶标二抗（鼠抗人IgG的HRP标记抗体，1mg/ml， 5000倍稀释）200uL，37℃反应2h；

6、洗板：重复步骤4；

7、显色：每孔加入显色液100uL（显色A液和显色B液各50uL），置 于37℃反应15min；

8、终止显色：每孔加入50uL的终止液，终止反应；

9、酶标仪450nm处检测吸光值。

所述洗涤液为2%triton的PBS溶液;

所述显色液包括显色A液和显色B液，显色A液的配方如下：醋酸钠 13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水为溶剂，定容500mL；显色B液的配方如下： 乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，TMB0.15g，蒸馏水为 溶剂，定容500mL；

所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施 的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍 属本发明涵盖的范围内。