具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法、包含由其制造的具有导引器的移植用再生器官原基的组合物和具有导引器的移植用再生器官原基的移植方法

摘要

本发明旨在提供一种移植用再生器官原基的制造方法，所述移植用再生器官可确保移植后与受体的连续性，且使移植操作容易进行。本发明提供了一种具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法，所述方法包括：通过使实质上由间叶细胞所构成的第1细胞集合体与实质上由上皮细胞所构成的第2细胞集合体紧密地接触，并在支持体内部对这些细胞集合体进行培养，以制造再生器官原基的步骤；以及将所述导引器插入所述再生器官原基的步骤。

说明书

技术领域

本发明涉及一种移植用器官原基的制造方法以及含有通过所述方法 所制造的具有导引器的移植用再生器官原基的组合物、和具有导引器的移 植用再生器官原基的移植方法，在使用再生器官原基的器官更换和再生医 疗的技术中，其中，使再生器官原基与受体侧的上皮组织适当地连接而发 挥功能。

背景技术

再生医疗是将因各种疾病或外伤而变得功能不全的脏器或器官更换 为再生的脏器或器官的技术，其有希望作为下一代医疗技术以对移植医疗 进行补充(非专利文献1)。在目前的再生医疗研究中，在干细胞移植疗法 方面已取得进展，该方法是在受伤的组织或部分功能障碍的器官移入干细 胞或前体细胞而恢复其功能。

另外，在由单一种类细胞所构成的二维组织的再生方面，一种组织再 生技术也已接近实际应用阶段，在该技术中通过使用细胞片层技术将细胞 培养成片层形式来对皮肤或角膜上皮细胞、心肌细胞等进行组织化。其中， 通过使作为间叶细胞的成纤维细胞与皮肤表皮细胞分层化以人为地再现组 织学上所适合的层状构造，能够使功能性的皮肤组织再生，该技术已临床 应用于重度烫伤的治疗方面。

另一方面，已知的是，在器官中，多种功能细胞是呈三维配置的，以 表现出独特的功能。几乎全部的器官都是通过胚胎期的上皮细胞与间叶细 胞的相互作用所产生，从而展现特有的形态和器官功能。在目前的再生医 疗技术中，难以将多种细胞以三维的形式进行配置，能够在活体外立即发 挥功能的再生器官构造目前还没被开发出来。

最近，在如牙齿和唾液腺等上皮附属器官、和如毛囊等皮肤附属器官 方面正在进行一种以器官再生为目标的研究，通过使器官原基再生而再现 出发展的过程。这些器官不会直接关系到生命的维持，但已知它们会陷入 器官丧失或功能不全的状况。作为这样的例子可列举由龋齿、损伤或牙胚 发育不全造成的牙齿的丧失、或者随着老龄化而发生的唾液分泌障碍、男 性型脱发症或毛囊发育不良造成毛发的丧失等。这样的器官丧失或功能不 全会对QOL（生活品质）造成很大的影响，因此通过器官再生而进行的功 能恢复受到很高的期待。特别是在牙齿的再生方面，已证实通过移植其中 来自胚胎牙胚的上皮细胞与来自胚胎牙胚的间叶细胞以三维的方式进行适 当的配置的再生牙胚、移植在活体内异位再生的再生牙齿单元和移植包含 牙齿、牙槽骨和牙周膜的功能性单元而再生的功能性牙齿具有牙齿全部的 生理功能(参照例如专利文献1)。进一步，还有文献证实，当将口腔内上 皮细胞或其初代培养细胞用作上皮细胞时(参照例如专利文献2)、当将来 自羊膜的细胞用作间叶细胞时(参照例如专利文献3)、或当将全能性干细 胞分化诱导所得到的细胞用作间叶细胞时(参照例如专利文献4)，能够得 到具有相似特征的细胞配置与方向性的再生牙胚或再生齿单元。

根据这些研究成果，可以说，通过再生器官原基、或由再生器官原基 所再生出的器官的移植所进行的功能性的器官再生有实现的可能性，使用 再生器官原基的器官更换和再生医疗技术现正在寻找其它的上皮附属器 官。

[文献列表]

[专利文献]

[专利文献1]国际公开第2006/129672号小册子

[专利文献2]日本特开2008-29756号公报

[专利文献3]日本特开2008-206500号公报

[专利文献4]日本特开2008-200033号公报

[非专利文献]

[非专利文献1]Sharpe PT,Young CS.Test-tube teeth.Sc.Am.293, 34-41,2005

发明内容

（本发明要解决的技术问题）

众所周知，毛囊或皮脂腺、泪腺、唾液腺等上皮性附属器官，是在胚 胎期的时候通过来自外胚层或来自内胚层的上皮细胞与来自中胚层或神经 嵴的间叶细胞的相互作用而产生。

作为皮肤附属器官，毛囊会在个体的整个生命期重复成长与退化(毛 发周期)。已知在成长期的毛球部位的再生，是由与毛囊器官发生期时的相 似的分子机理所诱导出来。另外还认为在这样的毛周期中，毛球的再生是 通过作为间叶细胞的毛乳头细胞所诱导出来。此外，认为在成长期中，作 为间叶细胞的毛乳头细胞分化诱导毛囊上皮干细胞以再生出毛球。另外由 于在隆突(bulge)区域及下方区域中，存在有来自神经嵴的干细胞的龛 （niche），因此认为毛囊会保持住多个干细胞龛并发挥干细胞库的功能。 关于保持诱导毛囊形成的能力的毛乳头细胞，已有文献报道其培养法。尽 管关于毛囊间叶细胞的干细胞龛，目前还没有明确的报道，但从毛乳头中 含有能够分化成为软骨细胞、血细胞、脂肪细胞的细胞，以及由成体皮肤 真皮组织能够得到使毛囊及皮肤的真皮再生的SKIPs细胞这些现象看来， 表明了毛囊间叶干细胞的存在。综上所述，表明了通过来自成体的细胞来 进行完整器官再生的可能性，而这在其他器官尚未实现，因此有希望对可 临床应用的毛囊再生技术进行实际应用。

为了建立满足临床应用的毛囊再生医疗技术，必须使再生毛囊具有正 常的组织构造且具有适合于移植部位的毛干的毛发形成、伸长。进一步， 期望通过毛囊所特有的干细胞龛进行的干细胞的维持与因为毛发周期而进 行的毛囊的诱导能够发生，以及期望毛囊具有附随的皮脂腺或立毛肌、并 且是功能性的，具有通过交感神经使毛发竖立的反应性。至目前为止，已 进行了一些关于毛囊再生的尝试，如通过取代间叶细胞(毛乳头细胞及真皮 毛根鞘细胞)以进行毛囊可变区域的再生、通过具有毛囊诱导能力的间叶细 胞进行毛囊新生、通过上皮/间叶细胞进行毛囊的再构建等。其中，毛囊的 再构建和毛囊原基的再生被认为是脏器更换和再生医疗的模型，最近证实： 通过本发明的发明人开发出的器官原基法再构建的再生毛囊原基能够模仿 正常的发生以使毛囊与毛发再生。然而，能够再生出在活体内具有完整功 能的毛囊的、可临床应用的毛囊再生模型，目前还没有报道。

作为皮肤附属器官的毛发是由皮肤变化形成的，并且它是由两种大致 划分的细胞群，即上皮细胞与间叶细胞的相互作用所形成的毛囊所产生。 所以基本的策略是将这两种细胞移植至目标皮肤区域，以使毛囊再生。在 已报道的用于实现此基本策略的方法中，通过将培养的毛乳头细胞与大鼠 新生儿表皮细胞混合，并移植至通过将裸小鼠背部皮肤全层除去所形成的 移植伤口的方法(植入物腔室（graft chamber）法)，使包含毛囊的全部皮 肤再生。但是在此方法中，为了使全部皮肤再生，必须形成很大的移植伤 口，侵袭性非常高，因此难以将其作为一种医疗技术而广泛实施。

另外还有文献报道了另一种方法，在该方法中，同样地将上皮细胞与 间叶细胞混合并移植至皮下组织或肾被膜下，以使毛囊再生，然后将异位 再生的毛囊再移植至皮内。在此方法中，根据基于现有的毛发移植技术的 方法，可以将再生的毛囊移植至目标受体的皮肤内，然而需要其它的脏器 或器官作为用于使毛囊再生的场所。另外已知的是，若将上皮细胞移植至 皮下组织等时，会频繁形成胞囊，这些胞囊会压迫周边组织，并随着发炎 会引起疼痛，因此该技术本身含有新的疾病风险。

为了解决上述问题，已有在先专利就器官原基法提出申请(专利文献 1)。此在先专利中提供了一种方法，通过该方法可由人工制造的微小器官 原基来再生器官。在牙齿的再生方面，已显示在口腔内，具有正常功能的 再生牙齿可萌发自移植至颌骨内的再生牙齿原基。认为由于再生牙齿的生 长而自动地进行萌发，再生牙齿的上皮细胞与口腔黏膜上皮没有任何直接 的连接。然而，在如毛囊般必须与皮肤表皮层连结的情况中，需要使毛发 由再生的毛囊长出体表，如果毛发不能从所移植的毛囊生长，就会有形成 胞囊的问题。

毛发、皮脂腺等皮肤附属器官遍布于皮肤，并且大量地存在。尤其是 毛发在特定部位大量存在，因此其具有审美和功能方面的价值。进一步， 作为产生毛发的小器官，毛囊在皮肤内以适当的方向性透过毛孔与表皮层 连接，而发挥使毛发(毛干)由体表生长出来的功能。

另外，在通过例如唾液腺或泪腺等具有导管的外分泌腺的移植而进行 的再生技术中，只有使所移植的唾液腺或泪腺等与受体侧的唾液等通过的 导管进行正确地结合，才能够使其发挥功能。然而，当移植具有导管的唾 液腺等时，会因其无法与受体侧的导管正确地结合，而产生其无法发挥功 能的问题。

换而言之，可以理解为：当进行如毛囊或唾液腺等上皮附属器官的再 生时，使受体侧的上皮组织与再生的器官以适当的方向性及形式进行连接， 对于发挥再生的器官功能而言是极为重要的。

[用于解决问题的方法]

如以上所述，为了使毛囊、皮脂腺、唾液腺、泪腺等上皮附属器官再 生，并且发挥既定功能，必须使多数的移植体与受体适当地连接。为了解 决上述问题，本发明的发明人等经过仔细研究发现了一种上皮组织间连接 形成法(inter-epithelial tissue-connecting plastic method)，在该方 法中，通过器官原基法所再生出的器官原基与受体组织通过导引器进行连 接。本发明的发明人等进一步发现，该方法能够确保再生器官原基的极性 方向和提升移植后与受体侧的粘附性，并且能够使再生的器官适当地与受 体结合以功能性地再生。

亦即，本发明涉及具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法，其 包括：通过使实质上由间叶细胞所构成的第1细胞集合体与实质上由上皮 细胞所构成的第2细胞集合体紧密地接触，并在支持体内部对这些细胞集 合体进行培养，来制造再生器官原基的步骤，以及将所述导引器插入到所 述再生器官原基的步骤。

这里，在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一 个实施方案中，所述方法包括在插入所述导引器之后，进一步对所述再生 器官原基进行多日培养的步骤。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述第1细胞集合体与所述第2细胞集合体中至少一方是来自 作为再生对象的器官。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述第1细胞集合体和所述第2细胞集合体皆来自作为再生对 象的器官。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述再生器官原基为上皮附属器官原基。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，其中所述再生器官原基是选自由再生毛囊原基、再生汗腺原基、 再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再生乳腺原基、再生肾脏肾元原基、 再生泪腺原基、和再生内分泌腺原基所组成的组中的任一种器官原基。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述再生器官原基为再生毛囊原基，所述上皮细胞是隆突区域 上皮细胞或毛母基底部上皮细胞。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述再生器官原基为再生毛囊原基，所述间叶细胞为毛乳头细 胞或真皮毛根鞘细胞。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述再生器官原基为再生唾液腺原基，所述上皮细胞是来自唾 液腺的上皮细胞，所述间叶细胞是来自唾液腺的间叶细胞。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，所述再生器官原基是再生泪腺原基，所述上皮细胞是来自泪腺 的上皮细胞，和所述间叶系细胞是来自泪腺的间叶细胞。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，其中所述导引器是化学纤维。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，其中所述导引器是生物可吸收的。

在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的制造方法的一个实 施方案中，其中所述导引器是尼龙线。

另外，根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及包含具有导引器的 移植用再生器官原基的组合物，其中所述具有导引器的移植用再生器官原 基是由所述制造具有导引器的移植用再生器官原基的方法所制造。

此外，根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及移植用再生器官原 基的移植方法，所述方法包括将具有导引器的移植用再生器官原基移植至 对象的部位的步骤，其中所述具有导引器的移植用再生器官原基是用所述 制造具有导引器的移植用再生器官原基的方法所制造。

这里，在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的移植方法的一 个实施方案中，通过将所述导引器维持在突出于移植部位的状态，使所移 植的再生器官原基的上皮细胞侧的部分与所述对象的上皮细胞沿着导引器 伸长并连接。

另外，在本发明的具有导引器的移植用再生器官原基的移植方法的一 个实施方案中，其中所述再生器官原基是以再生具有导管的器官为目的的 器官原基，在移植所述再生器官原基时，将所述导引器插入存在于所述对 象部位的导管内，使所述再生器官原基的上皮细胞侧的部分与所述导管相 连，使所述再生器官原基的上皮细胞侧的部分沿着导引器伸长，并连接至 所述对象部位的导管。

（发明效果）

本发明能够提供移植用再生器官原基，所述移植用再生器官原基在能 够确保所述再生器官原基的极性方向，以及在移植后相对于受体侧的上皮 组织维持适当的方向性的同时，还能够提升粘附性。另外，由于本发明所 制造出的移植用再生器官原基具有导引器，因此能够简化移植时的操作， 并能够容易地调整移植时的深度和移植的方向等。

另外，由于使再生器官原基的上皮细胞与受体侧的上皮层(上皮细胞) 沿着导引器进行连结，因此特别是在毛囊的形成过程中，能够阻止由再生 器官原基形成胞囊。另外，在如唾液腺等具有导管的外分泌腺等中，由于 上皮细胞沿着所述导引器伸长，因此可提高与受体侧的导管的连接效率。

进一步，根据本发明所制造出的再生器官原基，能够适用于包括毛囊、 汗腺、唾液腺等的上皮附属器官，且并不限于体表的再生，也能够适用于 通过管腔构造连接至口腔内、肠道、或内分泌组织等内腔的器官的再生。 由于本发明也能够应用于这些器官和组织的再生，因此其提供了一种不仅 能够应用于皮肤附属器官，而且还能够应用于其他各种器官和组织的再生 医疗的技术。

附图说明

图1表示本发明的一个实施方案，是使用来自小鼠胚胎上皮的上皮细 胞和来自小鼠胚胎上皮的间叶细胞而制造移植用再生毛囊原基的流程示意 图。

图2表示将由来自小鼠胚胎上皮的上皮细胞与间叶细胞所制造的移植 用再生毛囊原基移植至受体上皮后，在刚移植完的时候、第3天、及第10 天的状态。上排表示的是上皮的照片，下排表示将移植部位的切片进行HE （苏木精-伊红）染色，并用荧光显微镜进行观察的结果。

图3表示本发明的一个实施方案，是使用来自小鼠成体胡须的隆突区 域上皮细胞和来自小鼠成体胡须的培养的乳头细胞而制造移植用再生毛囊 原基的流程示意图。

图4A表示在培养时，向再生毛囊原基插入导引器的状态。图4B表示 再生毛囊原基刚移植完的时候的移植部位(箭头所指示的)。图4C表示移植 后第21天的移植部位。

图5表示通过来自小鼠成体胡须的再生毛囊原基的移植所再生的毛 囊，将其组织切片进行HE染色的结果(上排)、及观察再生毛囊组织切片中 的GFP荧光的结果(下排)。

图6a表示本发明的一个实施方案中，对来自小鼠成体胡须的移植用 再生毛囊进行移植之后，通过光学显微镜拍摄所再生的再生胡须的剖面所 得到的照片。图6b表示通过电子显微镜拍摄再生胡须的毛干表面所得到的 照片。

图7表示本发明的一个实施方案中，通过移植用再生毛囊的移植所生 长成的小鼠再生胡须，在移植后第27天、第31天、第41天、及第46天 的状态。分别追踪各个再生毛发(将有区别的再生毛发以箭头和三角形标志 表示)的生长。

图8表示再生胡须的毛发周期的图形，分别对第一次的毛发生长至第 三次的毛发生长的各个成长期及退化期进行了举例说明。此外，“对照组” 表示将小鼠的天然胡须移植至裸小鼠背部，并使其再生长之后所追踪到的 3次毛周期的平均值。

图9表示本发明的一个实施方案，是使用来自小鼠胚胎颌下腺上皮组 织的上皮细胞和来自小鼠胚胎颌下腺间叶组织的间叶细胞而制造出的移植 用再生唾液腺原基的流程示意图。图9中，将从所摘出的颌下腺原基分离 出的上皮组织显示在上排的照片中，将由颌下腺原基分离出的间叶组织显 示在下排的照片中。图9中，在表示所制造出的再生唾液腺原基的照片中， E表示上皮细胞的细胞集合体，M表示间叶细胞的细胞集合体。此外，如图 9所示，从胎龄13.5天的小鼠胚胎可得到发育阶段不同的颌下腺原基(初 期、中期、后期)。

图10表示在对从小鼠胚胎所摘出的颌下腺与使用来自小鼠胚胎颌下 腺上皮组织的上皮细胞和来自小鼠胚胎颌下腺间叶组织的间叶细胞所制造 出的移植用再生唾液腺原基进行器官培养时，通过光学显微镜拍摄所得到 的描述唾液腺原基和再生唾液腺原基在各个时间(培养开始时、培养12小 时后、培养24小时后、培养36小时后、培养48小时后、培养60小时后、 培养72小时后)的照片。另外还显示了将培养72小时后的再生唾液腺原基 进行HE染色的结果。

图11表示在使用来自小鼠胚胎颌下腺上皮组织的上皮细胞和来自小鼠胚 胎颌下腺间叶组织的间叶细胞所制造出的移植用再生唾液腺原基中插入生 物可吸收性丝线作为导引器，进行60小时器官培养时，通过光学显微镜拍 摄各时间经过时(培养12小时后，培养24小时后，培养36小时后，培养 44小时后，培养60小时后)的再生唾液腺原基的状态所得到的照片。另外， 最下排的照片表示进行器官培养60小时后的再生唾液腺原基。其中，再生 唾液腺原基的上皮细胞侧开始沿着导引器丝线移动、伸长，而呈现导管状 的结构(箭头所标记的部分)。

图12表示将使用来自小鼠胚胎颌下腺上皮组织的上皮细胞和来自小 鼠胚胎颌下腺间叶组织的间叶细胞所制造出具有导引器的移植用再生唾液 腺原基，移植至成体小鼠的耳下腺导管部分时，各步骤(固定、耳下腺导管 部的露出、耳下腺的摘出、胶体的固定、和缝合)的照片。另外，图12中， el表示泪腺，ma表示嚼肌，p表示耳下腺，od表示脂肪组织，pd表示耳 下腺导管，RO表示再生颌下腺。

图13上排表示对于使用来自小鼠胚胎颌下腺上皮组织的上皮细胞和 来自小鼠胚胎颌下腺间叶组织的间叶细胞所制造出的具有导引器的移植用 再生唾液腺原基，通过光学显微镜拍摄的即将要移植之前的状态、及移植 至其耳下腺被除去的成体小鼠的耳下腺导管部之后第34天的状态所得到 的照片。此外，在这些照片中，A表示从所移植的再生唾液腺原基所伸出 的导管，B表示所移植的再生唾液腺原基，pd表示耳下腺。另外，图13 下方表示对于移植34天后的再生颌下腺进行HE染色的结果。此外，图中 的箭头表示浆液性腺泡细胞样的细胞。

图14表示对于移植至成体小鼠之后第30天的再生唾液腺原基，从导 管侧将伊文思蓝注入再生唾液腺原基时所拍摄的照片。另外，图14中的A 表示注入伊文思蓝的部位，B表示再生颌下腺的移植部位。

图15表示将唾液腺全部除去的唾液腺缺损小鼠，与将唾液腺全部除 去之后，将本发明的具有导引器的再生唾液腺原基移植至颌下腺部位的小 鼠之间就体重及生存率变化进行比较的图形。

图16表示本发明的一个实施方案，使用来自小鼠胚胎泪腺上皮组织 的上皮细胞和来自小鼠胚胎泪腺间叶组织的间叶细胞来制造移植用再生泪 腺原基的流程的示意图。此外，左方的照片是在实体显微镜下拍摄的，显 示了从胎龄16.5-17.5天的小鼠胚胎所摘出的泪腺原基。另外在实体显微 镜下拍摄的其它的照片显示了从泪腺原基所分离出的上皮组织(中间栏上 方的照片)、从泪腺原基所分离出的间叶组织(中间栏下方的照片)、与使其 进行再构建的再生泪腺原基(右边的照片)。

图17表示在对从小鼠胚胎所摘出的泪腺原基与使用来自小鼠胚胎泪 腺上皮组织的上皮细胞和来自小鼠胚胎泪腺间叶组织的间叶细胞所制造出 的移植用再生泪腺原基进行器官培养时，通过光学显微镜拍摄各个时间(培 养开始时、培养1天后，培养2天后，培养3天后，培养4天后)的泪腺原 基和再生泪腺原基的状态所得到的照片。

图18表示使用来自小鼠胚胎泪腺上皮组织的上皮细胞和来自小鼠胚 胎泪腺间叶组织的间叶细胞所制造出的具有导引器的移植用再生唾液腺原 基，通过光学显微镜拍摄即将要移植之前的状态、及移植至将泪腺的腺泡 部分除去的成体小鼠的泪腺导管部之后第20天的状态所得到的照片。此 外，图中的A表示所移植的再生唾液泪腺原基所粘附的部分，B表示眼睛 的方向，dt表示泪腺的导管。

具体实施方式

以下针对本发明的实施方案进行详细说明。

根据本发明所述制造方法的第一个实施方案，其是用于移植至哺乳动 物(例如人类)的移植用再生器官原基的制造方法，所述方法包括：在培养 时，将导引器插入通过对间叶细胞与上皮细胞进行器官培养所制造出的再 生器官原基中。

本说明书中，“间叶细胞”是指来自间叶组织的细胞和对这样的来自 间叶组织的细胞进行培养所得到的细胞，“上皮细胞”是指来自上皮组织的 细胞和对这样的来自上皮组织的细胞进行培养所得到的细胞。

另外，在本说明书中，“上皮附属器官”是指通过来自外胚层或来自 内胚层的上皮细胞与来自中胚层或来自神经嵴的间叶细胞的相互作用所形 成的器官，例如来自内胚层性上皮的器官、外胚层附属器官、内分泌腺和 通过导管与其他上皮组织连接的外分泌腺等器官。更具体地，“上皮附属器 官”是指例如毛囊、汗腺、泪腺、和皮脂腺等表皮附属器官，以及通过管 腔构造连接至口腔内、肠道、或内分泌组织等内腔的器官。

另外在本说明书中，“外胚层附属器官”是指“上皮附属器官”中来 自外胚层的器官，如毛囊、汗腺、泪腺、皮脂腺等表皮附属器官等。

接下来针对本发明的方法所使用的再生器官原基进行说明。

所述再生器官原基可以通过一种方法制造出来，该方法包括：使实质 上由间叶细胞所构成的第1细胞集合体与实质上由上皮细胞所构成的第2 细胞集合体紧密地接触，并在支持体内部对这些细胞集合体进行培养的步 骤。

“使实质上由间叶细胞所构成的第1细胞集合体与实质上由上皮细胞 所构成的第2细胞集合体紧密地接触，并在支持体内部对这些细胞集合体 进行培养的步骤”记载在例如专利文献1至4以及特开2008-29757号公报， 将所有这些文献的公开内容的全部以引用的方式并入本说明书中。

此外，在本说明书中，当通过上述方法制造出例如毛囊原基时，将所 制造出的毛囊原基称作“再生毛囊原基”。

所述第1细胞集合体与第2细胞集合体各自实质上仅由间叶细胞，或 仅由上皮细胞所构成。在本发明中，“实质上仅由间叶细胞所构成”是指该 细胞集合体与仅由间叶细胞所构成的细胞集合体发挥相同的功能。更适当 地来说，是指所述细胞集合体除了包含作为间叶细胞的细胞外尽量不包含 其他任何物质的状态。另外，所述细胞集合体可以含有不同种类的细胞， 只要它们是间叶细胞即可。“实质上仅由上皮细胞所构成”的情况也是同样 的。

这里，细胞集合体是指细胞紧密地接触的状态，所述细胞集合体可以 是组织或由分散的细胞所制备的细胞凝集块。使用组织是有利的，因为这 样可以容易地得到细胞配置和形状正确的器官，但能获得的量可能是有限 的。制备细胞凝集块时也可以使用培养的细胞，当使用培养细胞时相对较 容易获得细胞集合体，使得培养细胞至少在这点上是优选的。

优选地，本发明所使用的间叶细胞和上皮细胞，至少一方是来自作为 再生对象的器官(包括属于该器官的组织)。因此，使用已经定位于目标器 官方向的细胞，能够容易形成目标器官。另外，为了更可靠的制造目标器 官，最优选的是，间叶细胞与上皮细胞都来自作为再生对象的器官。

作为本发明的对象的再生器官原基的一个范例可以是上皮附属器官 的器官原基，但本发明并不受其所限定，其它的例子还可以包括再生毛囊 原基、再生汗腺原基、再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再生乳腺原基、 再生肾脏肾元原基、再生泪腺原基和再生内分泌腺原基等。在制造这些再 生器官原基时，可以使用来自对象器官的间叶细胞或上皮细胞，另外还可 使用通过未分化细胞的诱导所得到的间叶细胞或上皮细胞。例如在制造再 生毛囊原基时，间叶细胞可采用毛乳头细胞、真皮毛根鞘细胞、发育期的 皮肤间叶细胞、和由iPS细胞或ES细胞所诱导的毛囊间叶细胞，上皮细胞 可采用隆突区域的外毛根鞘最外层细胞、毛母基底部的上皮细胞、和由iPS 细胞或ES细胞所诱导的毛囊上皮细胞。另外，在制造再生汗腺原基时，间 叶细胞可采用处于发育期的皮肤间叶细胞或毛囊的真皮团块细胞、和由 iPS细胞或ES细胞所诱导的皮肤间叶细胞，上皮细胞可采用处于发育期的 皮肤上皮细胞和由iPS细胞或ES细胞所诱导的汗腺上皮细胞。另外，在制 造再生唾液腺原基时，间叶细胞可采用处于发育期的唾液腺原基的间叶细 胞或由iPS细胞或ES细胞所诱导的唾液腺间叶细胞，上皮细胞可采用唾液 腺闰管部位的上皮细胞和由iPS细胞或ES细胞所诱导的唾液腺上皮细胞。 另外，在制造再生泪腺原基时，间叶细胞可采用处于发育期的泪腺原基的 间叶细胞或由iPS细胞或ES细胞所诱导的泪腺间叶细胞，上皮细胞可采用 处于发育期的泪腺原基的上皮细胞和iPS细胞或ES细胞所诱导的泪腺上皮 细胞。

另外，从细胞分化阶段的幼年性与均质性的观点看来，从中采集间叶 细胞和上皮细胞的器官优选可以在正常的成体内保持再生能力。也可以使 用通过人工手术操作、给药、基因导入而具有再生能力的器官。

作为除了来自再生对象的器官以外其他地方的间叶细胞，也可使用来 自活体内的其他间叶组织的细胞。优选地，这样的细胞为不含血细胞的骨 髓细胞或间叶细胞，进一步优选地，为口腔内的间叶细胞或颌骨内部的骨 髓细胞、来自颅神经嵴细胞的间叶细胞、可分化成这样的间叶细胞的间叶 前体细胞或其干细胞等。间叶细胞采用来自羊膜的细胞的例子被记载于专 利文献3，采用通过全能性干细胞分化诱导所得到的细胞的例子被记载于 专利文献4，将其全部的公开内容以引用方式并入本说明书。

作为除了来自再生对象的器官以外其他地方的上皮细胞，也可使用来 自活体内的其他上皮组织的细胞。优选地，这样的细胞为皮肤或口腔内的 黏膜和齿龈的上皮细胞，进一步优选地，为未成熟的上皮前体细胞，例如 能够分化成角化或角化不全的上皮细胞的非角化上皮细胞或其干细胞，如 皮肤或黏膜等。上皮细胞采用口腔内上皮细胞或其原代培养细胞的例子被 记载于专利文献2，在此将其全部的公开内容以引用方式并入本说明书中。 此外，从利用自体组织的角度来说，优选的是使用来自移植对象的间叶细 胞和上皮细胞或含有这些细胞的组织。

用于制造再生器官原基的间叶细胞和上皮细胞或包含这些细胞的组 织，可以从如灵长类(例如人类、猴子等)、有蹄类(例如猪、牛、马等)、 小型哺乳类如啮齿类(例如小鼠、大鼠、兔子等)等哺乳动物中进行采集、 也可以从犬和猫等各种其它哺乳动物中进行收集。间叶细胞和上皮细胞或 含有这些细胞的组织的收集，可直接使用通常收集组织所使用的条件，在 无菌条件下提取并保存在合适的保存液即可。

再生对象的器官(包括属于该器官的组织)的间叶细胞和上皮细胞的 制备，可通过例如先将由周围的组织分离出的器官(包括属于该器官的组织) 根据形状分离成间叶组织及上皮组织来进行。此时为了促进分离可使用酶。 作为所述酶，例如可以提及分散酶(Dispase)、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等已 知的酶，本领域技术人员可以选择地使用适合的酶。

本发明中的细胞凝集块是指来自间叶组织或上皮组织的细胞凝集所 得之物，其可以通过凝集通过分散间叶组织或上皮组织后所得到的细胞， 或凝集由该细胞的原代或继代培养所得到的细胞来制备。

为了使细胞分散，可以使用如分散酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。 为了得到足够的细胞数，在制备细胞凝集块之前，对分散的细胞进行原代 或继代培养时，培养所使用的培养基可使用通常动物细胞培养所使用的培 养基，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)等。为了促进细胞增殖可 添加血清，或血清替代物，例如FGF、EGF、PDGF等细胞生长因子或转铁蛋 白等已知的血清成分。此外，在添加血清时，可根据添加时的培养状态而 适当地改变浓度，而通常可设定为10%左右。细胞的培养可采用通常的培 养条件，例如在温度约为37℃，CO₂浓度为5%的培养箱内进行培养。进一 步，还可以适当地添加链霉素等抗生素。

为了使细胞凝集，例如可将细胞悬浮液进行离心处理。在间叶细胞与 上皮细胞的细胞凝集块中，为了确保二者在紧密地接触时，细胞彼此确实 发生相互作用，优选所述细胞各自为高密度的状态。高密度的状态是指具 有与构成组织时相同密度的程度，例如为5×10⁷个细胞/ml-1×10⁹个细 胞/ml，优选的是1×10⁸个细胞/ml-1×10⁹个细胞/ml，最优选的是2× 10⁸个细胞/ml-8×10⁸个细胞/ml。获得高密度的细胞凝集块的方法并未 受到特别限定，例如可以通过对细胞进行离心处理，然后使其凝集沉淀的 方法来实现。优选的是进行离心处理，因为它不会损及细胞的活性，并且 能够容易地实现高密度。离心处理可以在提供300×g-1200×g的离心力的 转速下，优选的是在提供500×g-1000×g的离心力的转速下进行3分钟-10 分钟。在低于300×g的离心处理中，会有无法使细胞密度达到足够高的倾 向，另一方面，在高于1200×g的离心处理中，则细胞可能会受到损伤。

通过离心分离制备高密度细胞凝集块时，通常先在用作细胞离心分离 的试管等容器内配制好细胞悬浮液，然后再进行离心。离心分离之后，将 细胞以沉淀物的形式留下，并将上清液尽量除去。此时，优选地，目标细 胞以外的成分(例如培养液、缓冲液等)小于等于细胞的量，最优选的是不 含目标细胞以外的成分。这样的高密度的细胞集合体只要通过后述方法在 支持载体内进行紧密地接触，即可使细胞彼此紧密接触并有效地发挥细胞 间的相互作用。

所述支持载体并未受到特别限定，只要可以在其内部进行所述细胞培 养即可。例如优选的是胶状、纤维状、固体状的支持载体。通过使用该支 持载体，可进一步防止对活体内再生器官原基造成过度的压力。

本发明所使用的支持载体可以是例如胶原蛋白、琼脂糖凝胶、羧甲基 纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cell Matrix(商品名)、Mebiol Gel(商品 名)、Matrigel(商品名)、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、细胞外基质 混合物、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA) 等。其中，优选的是具有适当硬度和保持力的胶原蛋白、琼脂糖凝胶、羧 甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cell Matrix、Mebiol Gel、Matrigel、 细胞外基质混合物、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白。

例如可使用液态的支持载体，于其中配置再生器官原基后再将其硬 化。例如通过在培养皿上制备胶原蛋白凝胶液滴，并将所述再生器官原基 置于所述胶原蛋白液滴内，然后在37℃的CO₂培养箱内进行培养，可使胶 原蛋白凝胶化。

以培养第1和第2细胞集合体为目的所使用的支持载体，优选的是具 有不使细胞分散，而能够保持细胞集合体紧密接触状态的保持力。紧密接 触状态是指上述高密度的间叶细胞和上皮细胞的细胞集合体，即使是在间 叶细胞与上皮细胞的接触面附近也维持相同程度的高密度的状态。能够保 持紧密接触状态的支持载体，可以是例如在使用胶原蛋白时，通过使用最 终浓度为2mg/ml-3mg/ml的胶原蛋白，来提供适当的硬度，亦即通过以 JIS-K6503-1996为基准的方法(用12.7mm直径的柱塞压下4mm所需要的荷 重来进行测定)测得的凝胶强度为120g-250g的浓度。其他种类的支持载 体，只要通过同样的评估方法测得具有相似的强度，也可作为本发明的支 持载体优选使用。另外，通过将1种或多种支持载体混合，也可得到硬度 相当于目标凝胶强度的支持载体。

将第1和第2细胞集合体配置于支持载体内的方法并未受到特别限 定，当细胞集合体为细胞凝集块时，例如可将上述离心分离所得到的沉淀 物用微量注射器等插入支持载体内进行配置。当细胞集合体为组织时，可 使用注射器的针尖等将其配置于支持载体内的任意位置上。

在本发明中，使第1与第2细胞集合体在支持载体内紧密接触地进行 配置的方法并未受到特别限定。例如可通过先将其中一种细胞集合体配置 于支持载体内，然后以对其按压的方式配置另一种细胞集合体，从而使两 者紧密接触（密着）。具体地，在支持载体中，通过适当地改变上述注射器 的针尖位置，可以将其中一种细胞集合体按压至另一种细胞集合体上。此 外，当所述细胞集合体采用上皮组织或间叶组织时，优选地，通过使该组 织在原本的器官(包括属于该器官的组织)中分别与间叶组织或上皮组织接 触的面与另一方细胞集合体接触的方式进行配置。

另外，优选的是，在配置所述细胞集合体后，包括固化支持载体的步 骤。这样能够使细胞进一步凝集而达到更高密度的状态。例如在使用胶原 蛋白凝胶时，可通过在培养温度下静置数分钟至数十分钟进行固化。此时 在细胞集合体内，细胞以外的成分越少，则越能够实现高密度的状态。

培养时间随着配置于支持载体内部的细胞数、细胞集合体的状态、培 养的条件、动物种类等而有所不同，本领域技术人员可适当地进行选择。 另外培养时间还可根据作为再生对象的器官适当地进行调整。

通过延长培养时间，可进一步促进再生器官原基的形成。为了得到所 希望的状态，例如可进行6天以上、30天以上、50天以上、100天以上、 或300天以上的培养，亦可在培养过程改变培养基或培养条件。

例如在移植再生毛囊原基时，为了得到功能性的毛发，对所述再生毛 囊原基，优选地，培养至少1天，更优选地，培养2天以上。

在移植再生唾液腺原基或再生泪腺原基时，为了得到功能性的唾液腺 或泪腺，对再生唾液腺原基或再生泪腺原基，优选地，培养至少1天，更 优选地，培养2天以上。

对于在支持载体内部的培养步骤，可对内部包含第1和第2细胞集合 体的支持载体单独进行培养，也可在其他动物细胞等的存在下进行培养。

当单独培养支持载体时，培养条件可以使用通常用于培养动物细胞的 条件。另外，在培养中还可添加来自哺乳动物的血清，此外还可添加已知 对于这些细胞的增殖或分化为有效的各种细胞因子。这样的细胞因子的例 子包括FGF、BMP等。

从对细胞集合体进行气体交换或营养供给的角度来看，以及不与其它 动物细胞接触或混合、且全部的步骤都能够在活体外进行这样的角度来看， 优选地，器官培养是在支持载体内部进行培养。器官培养一般是使多孔性 的膜浮在适合使动物细胞增殖的培养基上，再将内含第1和第2细胞集合 体的支持载体装载在该膜上进行培养。此处所使用的多孔性的膜优选具有 多个约0.3-5μm的孔，例如可以为Cell Culture Inserts(商品名)或 Isopore Filter(商品名)。

按照上述方式由上皮细胞和间叶细胞构建再生器官原基之后，将导引 器插入再生器官原基。

本发明所使用的“导引器”并未受到特别限制，只要其能够插入通过 器官培养而构建的、培养中的再生器官原基，并在再生器官原基的移植后 能够促进再生器官原基的上皮细胞侧部分与受体侧的上皮细胞的连接即 可。例如可以为由尼龙等聚合物或合成的或天然的生物可吸收的聚合物所 制造出的纤维、不锈钢等金属纤维、碳纤维、玻璃纤维等化学纤维、以及 天然的动物纤维或植物纤维等。更具体地，例如可以为尼龙线或不锈钢线 等。特别是当使用用于再生毛囊原基的导引器时，也可以使用来自活体的 毛发作为导引器。另外，本发明所使用的导引器亦可以具有中空丝线的形 状。导引器的直径和长度可以根据成为再生对象的器官进行适当的设计。 例如对于用于再生毛囊原基的导引器，其直径优选为5-100μm，更优选为 20-50μm。另外对于用于再生毛囊原基的导引器，其长度优选为1-10mm， 更优选为4-6mm。

另外，如果移植时必须将所述导引器插入受体侧的导管时，如在再生 唾液腺原基中的情况，则所述导引器的直径例如优选地为5μm-60μm，更优 选地为20μm-40μm。另外，导引器的长度优选地为1mm-6mm，更优选地为 2mm-3mm。进一步优选地，所述导引器的表面是光滑的从而能够将它容易地 插入导管，以及优选地，所述导引器保持不伤及组织的程度的硬度。作为 这样的导引器，单丝的材料优于如编织物等复丝材料。

所述导引器的插入，是以不破坏成为再生器官原基的细胞集合体的结 构，特别是上皮细胞与间叶细胞的接触面，且以垂直贯穿上皮细胞部分与 间叶细胞部分的方式，从成为再生器官原基的细胞集合体的上皮细胞侧插 入。

另外，导引器可在器官培养开始后立即插入至成为再生器官原基的细 胞块，亦即将上皮细胞与间叶细胞的细胞集合体配置于培养基内之后立刻 插入。另外，由于再生毛囊原基的上皮细胞的强度会因器官培养时的细胞 粘附而增加，因此可以通过使用强度大的材料的导引器(例如使用不锈钢线 等)以及将导引器的前端变锐利等来增加穿透力，可在培养开始后第1-2 天插入。优选地，在制造好器官原基后立即将导引器插入，因为这个时候 能够使用尼龙线等对活体造成的异物应答性低的柔韧材料。

另外，往再生器官原基插入导引器之后，可在插入导引器的状态下培 养再生器官原基。导引器插入后的培养时间，可根据作为再生对象的器官 而适当地进行设定，例如在制造再生毛囊原基时，优选培养1-4天，更优 选培养1.5-2天。此外，在导引器插入后，通过进行2天的培养，导引器 与再生器官原基之间的粘附性变强，从而有助于防止在移植时容易发生的 偏差。另外，优选地，在导引器插入后进行培养，因为这样可以使上皮细 胞侧的再生器官原基沿着导引器伸长。在进行再生器官原基移植后，这样 的伸长能够提高再生器官原基的上皮细胞侧部分与受体的上皮细胞之间的 自主接附的效率和稳定性。

另外根据本发明的另一个实施方案，通过本发明的制造方法所制造出 的具有导引器的移植用再生器官原基，可以被移植至目标部位。

本领域技术人员可以通过已知的方法将插入了导引器的移植用再生 器官原基移植至目标部位。例如在移植再生毛囊原基时，可采用使用 Shapiro毛发移植术或Choi式毛发移植设备的毛发移植，或利用空气压力 的植入机等进行移植。Shapiro毛发移植术是一种在移植部位用微手术刀 等制造出移植伤口之后，使用镊子钳进行移植的方法。在应用这种毛发移 植术时，由于本发明所提供的移植用再生器官原基具有导引器，因此可以 通过将导引器摘除，而不直接接触再生毛囊原基来进行操作，所以能够很 容易地进行所述操作。

再生器官原基的移植深度，可根据作为再生对象的器官而适当地变 更。例如在移植再生毛囊原基时，深度优选地为0.05-5mm，更优选地为 0.1-1mm，最优选地为0.3-0.5mm。特别是在将再生毛囊原基移植至受体时， 优选的是将其移植至真皮层内，更优选的是移植至真皮和皮下组织的交界 面的上方，在该处毛囊的形成以及随后的毛发生长效率更优异。另外，优 选地，调节移植深度以使再生毛囊原基的上皮细胞部分的上端部露出于移 植伤口的上端，因为这样能够提高与受体的上皮细胞的连续性。

另外，例如在进行需要将导引器插入受体侧的导管的器官原基的移植 时，例如在进行再生唾液腺原基的移植时，优选的是长久地保存受体侧的 导管，因为这样可以防止导引器在移植后脱落。另外，从提升营养供给的 角度来看，优选的是移植部位在大静脉附近。这样做时，如果长久地保存 受体侧的导管，则很容易调节移植部位。

此外还可以在移植再生器官原基后，利用皮肤接合用的胶带或带子、 缝合等将导引器固定到移植的对象部位，从而使所述导引器不会脱落。

移植再生器官原基之后，所述导引器在确保受体侧的上皮细胞与来自 再生器官原基的上皮细胞的一侧的连续性一段时间后，可从移植部位抽除。 抽除的时机可根据再生器官原基而进行适当的设定，例如在移植再生毛囊 原基时，优选的是在移植后3天-7天从移植部位抽除。或者，也可以将导 引器留下，从而使它自然地从移植部位脱落。可以将生物可吸收性材料的 导引器留下以自然地从移植部位脱落，或可将其放置至直到其分解或被吸 收。特别是在移植之后，当所述导引器与所述再生器官原基一起被埋入受 体的皮下时，例如在再生唾液腺原基中的情况，优选的是使用生物可吸收 的导引器。

用这样的方式，通过对移植用的再生器官原基配备以导引器，可使来 自再生器官原基的上皮细胞的细胞沿着所述导引器伸长。因此可提高移植 后的受体侧的上皮细胞与再生器官原基的上皮细胞侧之间的连续性。特别 是当所述导引器维持在移植部位的表皮的外侧时，如在毛囊或汗腺中的情 况，可进一步提高连续性，因为受体侧的上皮细胞会沿着所述导引器而伸 长至移植部位的内侧，从而将异物排除。另外，优选的是插入导引器，因 为这样在培养时，在再生器官原基中，还可以提升上皮细胞和间叶细胞的 极性维持。因此，可提高再生器官形成的效率，而且能够促进移植时的方 向的定位。特别是在将导引器用于再生毛囊原基时，在能够确保再生毛囊 原基与受体侧的上皮细胞之间的连续性的前提下，可以向预期的方向促进 毛囊的形成。结果可以提高再生毛囊原基的毛发生长率，而且还可控制毛 发生长的方向。

此外，在本说明书中所使用的述语，是为了说明这里所描述的特定的 实施方案，而并没有试图限制本发明。

另外，在本说明书之中所使用的“包含/包括/含有”这一术语，除了 根据上下文应该作明显不同的理解的情况以外，是指存在所记载的事项(部 件、步骤、要素、数字等)，且不排除存在其它的事项(部件、步骤、要素、 数字等)。

除非提供不同的定义，这里所使用的全部的术语(包括技术术语及科 学术语)都与本发明所属技术领域的技术人员所广泛理解的意思是一样 的。这里所使用的术语，只要没有明示出不同的定义，应解释为与本说明 书及相关技术领域中一致的意思，不应该被理想化，或者解释为过度形式 化的意思。

本发明的实施方案会有参照示意图而同时说明的情形，在这种情况 下，为了能清楚地进行说明，示意图可能会被夸张地描绘。

使用第一、第二等术语是为了描述各种要素，应该理解这些要素并不 被这些术语所限定。使用这些术语仅是为了将一种要素与其他要素区别开， 例如由第一要素标识的要素也可以记作第二要素，同样的，可将第二要素 记作第一要素，这样也未超出本发明的范围。

以下参照实施例对于本发明进行更详细的说明。然而，本发明可以通 过各个方面而具体化，不应被理解为被限定于这里所记载的实施例。

实施例

(1.再生毛囊的制造)

1.材料与方法

(1)实验动物

从7-8周龄的C57BL/6小鼠(日本CLEA)和C57BL/66-TgN(act-EGFP) 小鼠中收集毛囊。另外，从胎龄18.0-18.5天的C57BL/66-TgN(act-EGFP) 小鼠(SLC)收集含有体毛发原基的皮肤。此外，通过下述实验方法，将所制 造出的再生毛囊原基移植至6-8周龄的Balb/c nu/nu小鼠(SLC)。动物的 饲养和实验遵守相关法律、行政法规和规章，在东京理科大学动物实验伦 理委员会的批准下进行实施。

(2)毛乳头细胞的培养

通过颈椎脱臼使C57BL/6的EGFP小鼠安乐死之后，以不伤及毛球部 的方式收集颊部皮肤全层及皮下组织。在除去颊须周围的皮下组织之后， 将毛囊分离。选择成长期为I～IV期的颊须毛囊，使用25G注射针从中去 除胶原蛋白鞘，使毛囊露出。将毛球部分离以摘出毛乳头。将所摘出的毛 囊和毛乳头保存在含有10%牛胎血清与1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养 基(DMEM10)中。将所分离的毛乳头接种至3.5cm塑料培养皿(日本Becton  Dickinson公司)，在5%CO₂、37℃、湿度为95%的环境下，在含有10ng/ml 的FGF2(和光纯药公司)的DMEM10中进行原代培养。在原代培养毛乳头细 胞的第4天和第8天更换培养基，在培养9天之后取用。将原代培养的毛 乳头细胞用PBS(－)洗涤3次之后，用含有0.05%胰蛋白酶的10mM EDTA 溶液(GIBCO)进行剥离，并在DMEM10中以胰蛋白酶中和，在充分洗涤之后， 在冰温下保存至使用时。

(3)毛囊隆突上皮细胞的获得

使用25G注射针将胶原蛋白鞘从所摘出的颊须组织去除，并将所述组 织细分成隆突区域。在37℃使隆突区域组织在最终浓度4.8U/ml的分散酶 II(Becton Dickson)和100U/ml的胶原蛋白酶(Worthington,Lakewood, NJ)溶液中反应4分钟，然后使用25G注射针以外科方式将所述隆突区域组 织分离成隆突区域上皮组织和隆突周围的间叶组织。对于所分离出的隆突 区域上皮组织在培养箱用0.05%胰蛋白酶(Invitrogen,Carlsbad,US)进 行1小时酶处理，并使其通过35μm孔的细胞过滤器，以获得单一化的细胞。 另外，(2)所得到的所培养的毛乳头细胞也用0.05%胰蛋白酶(Invitrogen, Carlsbad,US)进行收集，然后通过35μm孔的细胞过滤器，以获得单一化 的细胞。

(4)再生毛囊原基的制造与器官培养

再生毛囊原基是通过器官原基法而制造。详细的步骤如下：分别将上 述所获得的来自隆突区域上皮组织的单一化的隆突区域细胞和培养的毛乳 头细胞，分别移至各个涂布有硅脂的1.5ml微型离心管(Eppendorf)，然后 通过离心分离以沉淀的形式收集。使用0.5ml-20ml的GELoader Tip (Eppendorf)将离心后的培养液中的上清液完全除去。接下来，通过在涂布 硅脂(Dow Corning Toray)的培养皿上滴入Cellmatrix type I-A(Nitta  gelatin,Osaka,Japan)30ml，来制造胶原蛋白凝胶液滴。使用0.1-10ml 的吸管尖头(Quality Scientific plastics)将约0.2ml的上述制备出的培 养毛乳头细胞注入胶原蛋白凝胶液滴，来制造细胞凝集块。接下来，使用 0.1ml-10ml的微量移液器(Quality Scientific plastics)将约0.2ml的 上述制备出的隆突区域上皮细胞注入到相同的胶体液滴内，从而使其与培 养的毛乳头细胞的凝集块紧密接触，以制造培养的毛乳头细胞和隆突区域 上皮细胞的细胞凝集块。进一步在用实体显微镜进行确认的前提下，从培 养的毛乳头细胞与隆突区域上皮细胞的细胞凝集块的隆突区域上皮细胞 侧，以不破坏细胞凝集块的结构(特别是上皮细胞与间叶细胞的接触面)， 且以垂直贯穿培养毛乳头细胞部分与隆突区域上皮细胞部分的接触面的方 式，插入全长5mm的尼龙线(松田医科工业)，然后将所述凝胶液滴在37℃ 静置5分钟以使其固化，从而使上皮细胞与间叶细胞的结合更加坚固，以 制造具有导引器的再生毛囊原基。

(5)胚胎皮肤上皮细胞和间叶细胞的获得

从胎龄18.0-18.5天的EGFP小鼠胚胎收集背部皮肤，基于Nakao等所 报道的方法(Nakao K et al.,Nat.Methods,4(3),227-30,2007)，对 其进行部分地改变，通过在4℃以55rpm振荡条件进行1小时的分散酶处 理，使上皮层与真皮层分离。进一步在37℃用100单位/ml的胶原蛋白酶 I对真皮层进行两次40分钟的处理，然后进行单一化处理，以获得间叶细 胞。另外，在37℃用100单位/ml的胶原蛋白酶I对上皮层进行两次40 分钟的处理，然后将混入其中的间叶细胞除去，进一步用含有100单位/ml 的胶原蛋白酶I的0.25%胰蛋白酶溶液，在37℃进行处理10分钟，然后进 行单一化处理，以获得上皮细胞。

另外，通过与以上(4)中所记载的相同的方法，来制造具有导引器的 胚胎皮肤间叶细胞和胚胎皮肤上皮细胞的细胞凝集块，在该方法中用胚胎 皮肤间叶细胞代替培养的毛乳头细胞而注入胶原蛋白凝胶液滴中，然后用 胚胎皮肤上皮细胞代替隆突区域细胞注入胶原蛋白凝胶液滴中，从而使其 与胚胎皮肤间叶细胞块紧密接触。

将在胶体中制造出的上皮细胞与间叶细胞的细胞凝集块，连同胶原蛋 白凝胶一起移至0.4ml孔大小的Cell Culture Insert(Becton Dickinson 公司)上，该Cell Culture Insert设置有6孔板(Becton Dickinson公司)， 将1ml DMEM10加入该6孔板中，然后在37℃、5%CO2和95%的湿度条件下 进行2天的器官培养，以制造再生毛囊原基。

(6)再生毛囊原基的裸小鼠皮内移植

将由胚胎皮肤上皮细胞和间叶细胞所制造的再生毛囊原基，以及由来 自成体胡须的隆突区域上皮细胞和培养的毛乳头细胞所制造的再生毛囊原 基，以下述的方式移植至裸小鼠的皮内。

依照常规的方法对裸小鼠进行戊巴比妥麻醉，对背部进行聚碘 （isodine）消毒之后，使其成自然横躺的姿势。使用V字矛型微手术刀(日 本Alcon)对小鼠进行穿刺，以形成由皮肤表皮层至真皮层下层部的移植伤 口。移植伤口在垂直方向从体表面伸至约400μm的深度，在水平方向为约 1mm。从插入了由尼龙线制造的导引器(相当于8-0尼龙缝合线，长度约5mm) 的再生毛囊原基将胶原蛋白凝胶除去，以上皮细胞成分朝向移植伤口的体 表侧的方式，使用锐利的5号小镊子(夏目制作所)将再生毛囊原基插入。 调节移植深度，以使再生毛囊原基的上皮细胞成分的上端部露出移植伤口 上端部，并以使由尼龙线制造的导引器露出体表的方式放置再生毛囊原基。 用以免缝胶带(Steritest Strip;3M)将尼龙线导引器固定在接近移植伤口 的皮肤表面，然后用保护绊创膏(Nurseban)和手术胶带(Surgical  Tape)(3M)保护移植伤口。在移植后5-7天将保护胶带除去，而尼龙线制导 引器被留在移植部位，若尼龙线在1天后还残留着，则将其除去。以肉眼 或荧光实体显微镜确定移植体的植入后，观察移植位点随时间的变化。

(7)毛发生长过程的观察和组织学的分析

用肉眼和荧光实体显微镜观察再生毛囊原基的移植部位，并评估毛发 生长状况。在毛发开始生长后，通过定期拍摄照片，对毛发生长与退化进 行评估。将所摘取到的组织用Mildform10N(和光纯药)固定之后，依照常 规方法通过石蜡包埋块或冻结制成块。制造出连续切片，并通过HE染色或 Hoechst荧光核染色，进行组织学的分析。

2.结果

(1)通过再生毛囊原基的皮内移植而进行的毛发生长

为了分析移植至皮内的再生毛囊原基的移植位置，由胎龄18.5天的 小鼠皮肤细胞制造出再生毛囊原基，并移植至裸小鼠皮肤内。在移植后将 皮肤摘出，制造其石蜡切片并进行HE染色。结果确定了移植位置在皮肤真 皮层内，由体表算起的深度平均为393μm。将刚移植完的、移植后第3天、 和第10天的结果显示于图2中。如图2所示，在将再生毛囊原基移植至皮 肤内时，在导引器突出体表的状态下将导引器进行固定(0天上排的照片， 箭头表示导引器)。另外在移植时，再生毛囊原基与受体上皮并未连接(图 2中，0天下方的HE染色后的切片照片)。到移植后第3天，再生毛囊原基 的上皮成分与受体皮肤表皮层通过导引器而连接(图2中3天下方的HE染 色后的切片照片，箭头表示连接的部分)。到移植后第10天再生出毛囊， 在平均第14天再生的毛发开始从体表生长(图2中，10天)，其毛发生长 频率为90%。

另外，以与上述相同移植深度的方式将来自成体颊须的再生毛囊原基 移植至裸小鼠背部，将结果显示于图4。图4A表示向再生毛囊原基插入导 引器的照片，E表示来自隆突区域上皮细胞的部分，DP表示来自培养的毛 乳头细胞的部分，G表示导引器。图4B表示以荧光实体显微镜追踪移植部 位的照片。在移植来自成体颊须的再生毛囊原基后，在平均第21天再生的 毛发开始从体表生长(图4C)，其毛发生长频率为74%。

(2)再生毛囊的组织分析

摘取再生的毛囊并且进行组织分析。将结果表示于图5。照片中间栏 和右栏是将左方的低倍放大显微镜像中的方形框部分放大的结果。利用 GFP荧光将再生毛囊从周围的裸小鼠毛囊中识别出来(图5左下方的照片)。 将再生出的毛囊的上皮组织连接至受体皮肤表皮层，在连结部分的表皮基 底层主要是来自受体的细胞。另外在再生毛发上部的放大照片中，确认了 皮脂腺的再生(在图5中间栏的上下的照片中标记箭头的部分)。来自再生 毛囊原基的皮脂腺与来自受体细胞的皮脂腺混合存在着，但再生毛囊的皮 脂腺下方的皮脂腺是来自所移植的再生毛囊原基。此外，图5右侧的照片 表示毛球部，而在右下的照片中，由于可确认出在毛乳头(DP)部位的GFP 荧光，因此证明了毛乳头是来自所移植的再生毛囊原基。以这种方式，再 生毛囊表现出了组织学上正常的毛囊结构，另外，来自成体颊须的再生毛 囊明显比体毛大。

(3)再生毛干的分析

来自胚胎体毛的再生毛发100%为黑色毛发，来自成体颊须的再生毛发 95.5%为白色毛发。图6表示通过光学显微镜及扫描式电子显微镜进行观察 所得到的照片。在虚线部内观察到以胡须般的硬毛为特征的螺旋状毛干髓 质(M)(图6a)，并且观察到与正常的颊须相似的表皮构造(图6b)。以这种 方式，再生胡须呈现了与天然毛发同等的毛干髓质和皮质，并且还呈现出 明显的胡须状结构。

(4)再生毛发的毛发周期

追踪再生胡须的毛干成长与退化的结果，毛干随着毛发周期的进行而 退化，并从脱毛的毛孔部位成长出新的毛干(图7)。另外，此毛发周期的 持续时间与天然胡须的毛发周期是同等的，并未观察到显著差异(图8)。 由此结果可知，再生毛发即使经过了毛周期，也会与受体表皮层保持连结， 以重复毛发的成长与退化。

(II.再生唾液腺的制造)

(1)再生唾液腺原基的制造和器官培养

以唾液腺的再生为目的，使用器官原基法进行唾液腺原基的制造。

从胎龄13.5-14.5天的C57BL/6小鼠胚胎，以外科方式将颌下腺原基 摘出。在25℃，使所摘出的颌下腺原基在最终浓度为50U/ml的分散酶 II(Becton Dickson)溶液中反应1.5分钟，然后使用25G注射针将颌下腺 原基分离成颌下腺上皮组织与颌下腺间叶组织。进一步对于间叶组织以最 终浓度50U/ml的胶原蛋白酶(Worthington,Lakewood,NJ)溶液与最终浓 度0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen,Carlsbad,US)溶液在37℃温浴进行10 分钟酶处理，并使其通过22μ孔的细胞过滤器，以获得完全单一化的间叶 细胞。对于上皮组织以最终浓度为100U/ml的胶原蛋白酶(Worthington, Lakewood,NJ)溶液在37℃温浴进行15分钟酶处理两次之后，以最终浓度 0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen,Carlsbad,US)溶液在37℃温浴进行5分 钟酶处理，并使其通过22μ孔的细胞过滤器，以获得完全单一化的上皮细 胞。

使用所得到的上皮细胞和间叶细胞，通过器官原基法，在胶原蛋白凝 胶中制造出再生唾液腺原基(图9)。详细的步骤如下：分别将所取得的单 一化上皮细胞与单一化的间叶细胞，移至各个涂布有硅脂的1.5ml微型离 心管(Eppendorf)，并进行离心分离。使用0.5ml-20ml的GELoader Tip (Eppendorf)将离心分离后的培养液中的上清液完全地除去，以沉淀的形 式，分别收集单一化的上皮细胞和单一化的间叶细胞。接下来，通过在涂 布硅脂(Toray Dow Corning)的培养皿上滴入Cellmatrix type I-A(Nitta  gelatin,Osaka,Japan)30μl，来制造胶原蛋白凝胶液滴，使用0.1-10ml 的吸管尖头(Quality Scientific plastics)注入上述所制备出的单一化间 叶细胞0.3μl左右，而制造出细胞凝集块。接下来，使用0.1ml-10ml的微 量移液器(Quality Scientific plastics)将约0.2μl的上述制备出的单一 化上皮细胞注入到相同的胶体液滴内，从而使其与间叶细胞的凝集块紧密 接触以制造出来自颌下腺原基的上皮细胞与间叶细胞的细胞凝集块。

将在胶体中所制造出的来自颌下腺原基的上皮细胞与间叶细胞的细 胞凝集块，连同胶原蛋白凝胶一起移至0.4ml孔大小的Cell Culture  Insert(Becton Dickinson公司)上，该Cell Culture Insert设置有6孔 板(Becton Dickinson公司)，将1ml DMEM10加入该6孔板中，然后在37 ℃、5%CO₂和95%的湿度条件下进行器官培养，以制造再生唾液腺原基。

在再生唾液腺原基进行器官培养时，从培养开始至24小时后，观察 到上皮细胞开始陷入间叶细胞侧的现象(图10)。此外，图10上方的两排 照片表示以从小鼠胚胎摘出的颌下腺，在直接以摘出之后的状态下进行器 官培养时，在各个经过时间的状态，图10下方的两排照片表示通过用器官 原基法所构建的再生唾液腺原基进行器官培养时，在各个经过时间的状态。 通过苏木精－伊红染色(HE染色)进行分析，在由培养开始72小时后，观 察到陷入的上皮组织前端呈现分支的现象(图10)。

上述的结果证明了，通过使用器官原基法可以制造再生唾液腺原基。

此外，如图9所示，由胎龄13.5天的小鼠胚胎可得到发育阶段不同 的颌下腺原基(参照图9中的所述初期、中期、后期的照片)，通过上述方 法可以由每个发育阶段中的颌下腺原基制造出由上皮细胞和间叶细胞再构 建的再生唾液腺原基。

(2)附有导引器丝线的再生唾液腺原基的制造

在以实体显微镜进行确认的前提之下，对于上述(1)方法所制造出的 再生唾液腺原基，以不破坏再生唾液腺原基的结构(特别是上皮细胞与间叶 细胞的接触面)，并且垂直贯穿上皮细胞部分与间叶细胞部分的接触面的方 式，从上皮细胞侧插入全长约3mm的生物可吸收的丝线(GUNZE公司制造)。 插入导引器之后，对再生唾液腺原基进行60小时器官培养。

结果，从器官培养开始大约经过24小时后，观察到再生唾液腺原基 的上皮细胞侧开始沿着导引器丝线移动、伸长，在由培养开始的60小时后， 观察到呈现导管状的结构的现象(图11；最下方的照片中的箭头表示导管 状的构造)。

(3)再生唾液腺原基向耳下腺导管部的移植

以外科方式将成体小鼠的耳下腺的腺泡部分除去，使连接至耳下腺的 导管部分露出。接下来，将上述(2)方法所制造出的、并进行器官培养2 天的具有导引器的再生唾液腺原基，与胶原蛋白凝胶一起移植至耳下腺导 管部。移植时，调整导引器丝线的位置，以使导管的切断面与再生唾液腺 原基之上皮组织彼此接近，并将导引器插入到受体侧的耳下腺导管。另外， 以8-0尼龙缝合线(Bear Medic公司，千叶，日本)将含有再生唾液腺原基 的胶原蛋白凝胶与嚼肌缝合(图12)，以使所移植的再生唾液腺原基不能移 动。

对移植后第30天的再生唾液腺原基，通过HE染色进行组织学的评估。 从HE染色图片看来，在再生唾液腺原基中，观察到导管细胞或浆液性腺泡 细胞样的细胞与天然的颌下腺中的一样(图13；图13下方的照片中，箭头 表示浆液性腺泡细胞样细胞)。

用这样的方式，可通过再生器官原基法再构建出唾液腺。另外，即使 是来自颌下腺的再生唾液腺原基，也可在另一个唾液腺的耳下腺部位再构 建出颌下腺。

(4)再生唾液腺的唾液分泌路径的评估

为了明确来自颌下腺的再生唾液腺原基与成体小鼠的耳下腺导管结 合，并保留唾液分泌路径，在再生唾液腺原基移植后第30天，通过外科方 法，使移植部位和耳下腺导管露出，通过微注射，从比再生唾液腺原基的 移植部位更向口腔侧的导管，向再生唾液腺原基注入伊文思蓝溶液。

结果，在用实体显微镜进行观察时，观察到所注入的伊文思蓝溶液通 过耳下腺导管而流入所移植的再生唾液腺原基的现象(图14)。由此表明了 再生唾液腺与耳下腺导管的结合并保留了唾液的分泌路径。

另外，将唾液腺全部除去的唾液腺缺损小鼠、与将唾液腺全部除去然 后将具有导引器的再生唾液腺原基移植至颌下腺部位的小鼠(移植小鼠)的 体重和生存率变化进行比较，其结果显示，唾液腺缺损小鼠从唾液腺摘出 日开始体重每天持续地减少，然而移植小鼠在移植后约第3或4天开始， 体重渐渐恢复，在约第6天几乎恢复至正常的体重(图15)。另外，唾液腺 缺损小鼠在从唾液腺摘出日后的第4天以后生存率为20%以下，然而，移 植小鼠在从移植日后的第4天以后表现出约70%的生存率(图15)。

(III.再生泪腺的制造)

(1)再生泪腺原基的制造和器官培养

以泪腺的再生为目的，使用器官原基法，以如下述的方式进行再生泪 腺原基的制造。

从胎龄16.5-17.5天的C57BL/6小鼠胚胎，以外科方式将泪腺原基摘 出。在25℃，使所摘出的泪腺原基在最终浓度为50U/ml的分散酶 II(Becton Dickson)溶液中反应1.5分钟，然后使用25G注射针将泪腺原 基分离成泪腺上皮组织与泪腺间叶组织。进一步将间叶组织以最终浓度 50U/ml的胶原蛋白酶(Worthington,Lakewood,NJ)溶液与最终浓度0.25% 的胰蛋白酶(Invitrogen,Carlsbad,US)溶液，在37℃温浴中进行10分 钟酶处理，并使其通过22μ孔的细胞过滤器，以获得完全单一化的间叶细 胞。对于上皮组织以最终浓度100U/ml的胶原蛋白酶(Worthington, Lakewood,NJ)溶液，在37℃温浴进行15分钟酶处理两次之后，以最终浓 度0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen,Carlsbad,US)溶液在37℃温浴进行5 分钟酶处理，通过22μ孔的细胞过滤器，以取得经过完全单一化的上皮细 胞。

使用所得到的上皮细胞和间叶细胞，通过器官原基法，在胶原蛋白凝 胶中制造出再生泪腺原基。详细的步骤如下：分别将所取得的单一化上皮 细胞与单一化间叶细胞移至各个涂布有硅脂的1.5ml微型离心管 (Eppendorf)，并进行离心分离。使用GELoader Tip0.5-20ml(Eppendorf) 将离心分离后的培养液中的上清液完全除去，以沉淀的形式，分别回收单 一化的上皮细胞和单一化的间叶细胞。接下来，在涂布有硅脂(Toray Dow  Corning)的培养皿上滴入Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin,Osaka, Japan)30μl，来制造胶原蛋白凝胶液滴，使用0.1-10ml的微量移液器 (Quality Scientific plastics)将约0.3μl的上述所制备出的单一化的间 叶细胞注入胶原蛋白凝胶液滴，来制造细胞凝集块。接下来，使用 0.1ml-10ml的微量移液器(Quality Scientific plastics)将约0.2μl的 上述制备出的单一化的上皮细胞注入到相同的胶体液滴内，从而使其与间 叶细胞的凝集块紧密接触，从而制造出来自泪腺原基的上皮细胞和间叶细 胞的细胞凝集块(图16)。

将在胶体中所制造出的来自泪腺原基的上皮细胞与来自泪腺原基的 间叶细胞的细胞凝集块，连同胶原蛋白凝胶一起移至0.4ml孔大小的Cell Culture Insert(Becton Dickinson公司)上，该Cell Culture Insert设 置有6孔板(Becton Dickinson公司)，将1ml DMEM10加入该6孔板中， 然后在37℃、5%CO₂和95%的湿度条件下进行2天的器官培养，以制造再生 泪腺原基。

在再生泪腺原基进行器官培养时，观察到与从胚胎所摘出的泪腺原基 一样，在培养开始24小时后上皮细胞开始陷入间叶细胞侧(图17)。由此 结果证明了可以通过使用器官原基法来制造再生泪腺。

(2)附有导引器丝线的再生泪腺原基的制造与移植

在以实体显微镜进行确认的前提下，对于上述(1)之方法所制造出的 再生泪腺原基，从上皮细胞侧，以不破坏再生生泪腺原基的结构(特别是上 皮细胞与间叶细胞的接触面)，并且垂直贯穿上皮细胞部分与间叶细胞部分 的接触面的方式，插入全长约3mm的生物可吸收性丝线(GUNZE公司制)。 导引器插入后，对再生泪腺原基进行2天的器官培养。

在进行器官培养之后，将成体小鼠泪腺的腺泡部分除去，使导管部分 露出，用与移植再生唾液腺原基时的相同的方法，将再生泪腺原基移植至 泪腺导管部。

结果，对移植20天后的再生泪腺原基进行确认时，观察到其已经粘 附到移植部位，并有明显的生长的现象(图18)。另外，通过目视确认了天 然泪腺导管与再生泪腺原基连接在一起。

如以上进行的详细说明，根据本申请发明所得到的具有导引器的再生 器官原基会与受体侧的上皮细胞进行可靠的连接，在移植后成为具有功能 的再生器官。特别是在再生毛囊原基方面，清楚地表明了能够以高频率从 体表进行毛发生长。在整个毛发周期，再生毛囊始终通过毛孔与受体表皮 层保持连续性，并且观察到在相同位置进行重复的毛发生长。另外，附有 导引器的再生毛囊原基的移植技术极为简便，且具有广泛的应用。另外在 具有导管的再生器官方面，再生器官原基的来自上皮细胞的部分可以在移 植至受体之后，与受体侧的导管彼此进行稳定的结合，并且清楚地表明器 官能够通过导管而发挥功能。

由于能够提供以上的效果，通过本发明所制造出的移植用再生器官原 基能够提供新的器官更换和再生的医疗技术，这些技术能够广泛应用于医 疗行业领域。