一种捕食性天敌昆虫绿步甲与绿僵菌组合防治害虫的方法

摘要

本发明涉及生物防治领域，具体地，涉及一种捕食性天敌绿步甲与绿僵菌组合防治害虫的方法，所述方法包括投放经绿僵菌剂接种过的绿步甲的步骤。本发明提出了一种新的生物防治技术，着眼于将生物防治中的“以虫治虫”和“以菌治虫”两者结合起来，探索一种新型的防治途径。发挥捕食性天敌长期捕食防控，绿僵菌各剂型优点和混合防效，防治效果显著提高，随时使用随时配制，效果好，持续时间长。节省人力物力，可利用步甲的穿梭和活动性将微生物农药传播，促进生物多样性，实现害虫可持续控制。

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体地，涉及一种捕食性天敌绿步甲与绿僵菌组合 防治害虫的方法。

背景技术

近几十年来，由于单纯依赖化学农药以及滥用化学农药，以致出现了3R，不仅 杀伤了天敌，干扰了天敌的自然控制作用，而且危及人的安全，生物防治已经越来 越被人们深刻地理解和广泛应用。

生物防治，指利用有益生物及其代谢产物控制有害生物种群的发生或减少危害 的方法。一般是指以虫治虫、以菌治菌、以菌治病，以菌治草、转基因育种、性信 息激素等方法。生物农药是指利用生物活体（真菌，细菌，昆虫病毒，转基因生物， 天敌等）或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。生物农药具有不 污染环境、对人和其他生物安全、防治作用持久、产品无残留、对病虫的杀伤特异 性强，易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点，必将在有害生物综 合防治中发挥着越来越重要的作用。

绿僵菌属于真菌门(Eumycota)子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyren-mycetes) 球壳菌目(Sphaeriales)麦角菌科(Clavisipitetaceae),是一类重要的生防真菌,可寄生多 种昆虫,在生产中已得到广泛的应用,据不完全统计,全世界约有200多种昆虫能被这 种真菌感染致死。该菌致病力强、效果好,对人、畜和农作物无毒害,是当前世界上 研究应用最多的虫生真菌之一。

真菌生防制剂具有触杀性、流行性、对环境安全和不易产生抗药性等特点。利 用虫生真菌防治害虫成为以生物防治为主的综合治理的一个重要方面，虫生真菌是 害虫种群自然调节的重要因子和害虫生物防治的重要材料。目前,国内外研究开发的 绿僵菌制剂约10余种,其中,影响最大且最成功的范例是英国CABI Bio2science蝗 虫生物防治国际合作项目(LUBILOSA)研制的杀蝗绿僵菌生物农药,已在非洲注册登 记、投产,大面积用于沙漠蝗的防治,成为有效的蝗虫生防制剂。

绿步甲Carabus(Coptolabrus)smaragdinus Fischer von Waldheim隶属鞘翅目 Coleoptera，步甲科Carabidae，步甲族Carabini，步甲属Carabus，是一种有重要利 用价值的捕食性天敌昆虫资源，在国内分布于北方大部分省份,在国外分布于西伯利 亚的东南部、俄罗斯远东地区及韩国。该虫营捕食性生活，主要以蚯蚓为食，对维 护生态平衡起着重要的作用。绿步甲是农田的重要捕食性天敌,其成、幼虫捕食能力 强,行动敏捷,特别喜食蜗牛、鳞翅目昆虫,也取食蛴螬、蝗虫等,利用该步甲防治农 田害虫具有广阔的应用前景

但是目前生物防治存在着防效低，资源分散、防治资源单一，防控方式单一等 问题。因此创新资源整合，创新生物防治的作用方式，提高生物防治防效是生物防 治急需解决的问题。绿僵菌有较强的寄生专一性，对捕食性天敌昆虫绿步甲、通缘 步甲、黑广肩步甲等无毒，因此，将活动能力较强的捕食性天敌与虫生真菌组合， 既能够发挥捕食性天敌捕食害虫的功能，又能够利用天敌昆虫携带绿僵菌孢子粉并 大范围传播，节省人力物力，增加害虫感染绿僵菌的几率，造成绿僵菌流行病的发 生。将捕食性天敌和绿僵菌两种生物农药有机结合来控制害虫,发挥两者的联合功效 具有非常广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种捕食性天敌绿步甲与绿僵菌组合防治害虫的方法。

本发明利用捕食性天敌昆虫绿步甲虫生真菌绿僵菌组合，发挥各形态生物农药 的优点，提高防治有害生物的范围及防效，有效控制害虫的安全无污染的生物农药。

根据本发明的捕食性天敌绿步甲与绿僵菌组合防治害虫的方法包括以下步骤：

（1）配制绿僵菌孢子粉；

（2）将绿僵菌与捕食性绿步甲结合；

（3）以粘有孢子粉的步甲侵袭害虫。

根据本发明的方法，配制绿僵菌10⁷～10⁸个孢子/ml、可湿性粉剂绿僵菌100-200 亿孢子/克。

根据本发明的具体实施方式，将绿僵菌与捕食性绿步甲结合，步骤如下：

（1）准备一个可以盛放步甲的1m*0.7左右的塑料盒；

（2）将绿僵菌可湿性粉剂撒在大盒子中，孢子粉厚度0.2cm左右；

（3）将步甲放入其中；

（4）将悬乳剂稀释100倍，用与盒子大小相当，厚度1cm左右的纱布，把纱布 用稀释后的悬乳剂浸湿；

（5）将粘有绿僵菌孢子粉的纱布平铺在盛有步甲的盒子中，使纱布将步甲覆盖， 等待5-10分钟即可将纱布取下，盒子中的粘有孢子粉的步甲即可释放，用于防治害 虫。

本方法依据绿僵菌制剂的不同及绿步甲的食性可以用来防治飞蝗、草原蝗虫、 美国白蛾、蜗牛、蛞蝓、白星花金龟、草地螟、小地老虎、大地老虎、苹梢鹰夜蛾、 苹掌舟蛾、红腹灯蛾、桑螟、桑尺蠖、舞毒蛾等。

目前生物防治存在着防效低，资源分散、防治资源单一，防控方式单一等问题。 因此创新资源整合，创新生物防治的作用方式，提高生物防治防效是生物防治急需 解决的问题。本发明提出了一种新的生物防治技术，着眼于将生物防治中的“以虫治 虫”和“以菌治虫”两者结合起来，探索一种新型的防治途径。

本发明的优点：

1.捕食性步甲具有广谱取食性可控制多种害虫，捕食和活动能力较强，活动范 围较广。

2.微生物农药来源于自然环境，具专一寄生性。

3.对人、畜等生物比较安全，对环境无污染，无公害，绿色，安全。

4.对天敌较安全，它具有对目标害虫毒杀的选择性，不容易产生抗药性。

5.生产工艺比较简单，开发与登记等费用低于化学农药等特性。

6.发挥捕食性天敌长期捕食防控，绿僵菌各剂型优点和混合防效，防治效果显 著提高

7.随时使用随时配制，效果好，持续时间长。

8.节省人力物力，可利用步甲的穿梭和活动性将微生物农药传播，促进生物多 样性，实现害虫可持续控制。

附图说明

图1为校正死亡率曲线图。

图2显示绿僵菌处理对绿步甲成虫死亡率的影响。

图3显示绿僵菌与绿步甲与不同组合处理对东亚飞蝗致死力，其中，I：单独释 放绿步甲；II：单独施用绿僵菌；III：释放绿步甲同时施用绿僵菌；IV：绿步甲接 种绿僵菌后释放。

具体实施方式

实施例1

1.1试验材料

3龄的蝗蝻：采自山东泰安山东农业大学植物保护学院东亚飞蝗繁殖基地。杀蝗 绿僵菌孢子母粉LS20041884：重庆真菌农药研制工程中心提供。用0.2%吐温溶液将 金龟子绿僵菌孢子粉稀释成10⁵个/mL，10⁶个/mL，10⁷个/mL，10⁸个/mL，备用。绿 步甲来源于山东农业大学植保学院环境生物与昆虫资源研究所，用东亚飞蝗饲养的 绿步甲，经过一年的东亚飞蝗捕食饲养驯化。

1.2金龟子绿僵菌对东亚飞蝗毒力测定

采用浸毒法处理试虫，用移液器吸取2uL的绿僵菌孢子液，将蝗蝻背部浸入绿 僵菌孢子液后取出，每笼15头。对照组用2uL的0.2%吐温溶液。各组处理重复3 次。接种后，将试虫放在T=(28±1℃），湿度为50%～70%，24h光照的环境中试养。 每天早上7:30饲喂一次新的玉米叶并清除杂物，同时记录蝗蝻死亡的数量，连续调 查直到各组的校正死亡率达到80%以上。从第3天开始将死的蝗虫取出进行保湿（培 养皿铺上用无菌水浸湿的滤纸或是放浸湿的脱脂棉，各个蝗虫尸体不能有所接触， 最后记录蝗虫的僵虫率）。

接种剂量（个/g）=[接种浓度（个/mL）×接种体积（mL）]/试虫体重

校正死亡率：M=（t﹣c）/（100﹣c）×100%

M:校正死亡率  c：对照死亡率  t：处理死亡率

通过方差分析、邓肯氏新复极差法检测各处理间统计量的回归方程。

生测结果显示，前两天都无蝗蝻死亡，从第三天开始孢子浓度为10×10⁷（个/mL） 和1.0×10⁸（个/mL）都有蝗蝻死亡，校正死亡率分别为4.67%和11.13%。随着天数 的增加，虫体的死亡率也在增加。第10天时，孢子浓度为1.0×10⁸（个/mL）的处 理组，校正死亡率达到100%，而此时，孢子浓度为1.0×1.0⁷个/mL，1.0×10⁶个/mL， 1.0×10⁵个/mL的处理组，校正死亡率分别为93.33%，75.57%，64.46%。第14天时， 所有处理组的校正死亡率都为100%。

从表1金龟子绿僵菌对3龄东亚飞蝗的致病力的结果可以看出，在置信度95% 的显著水平上，孢子浓度为1.0×10⁶个/mL，1.0×10⁵个/mL对3龄东亚飞蝗的致病力 的差异很显著，而1.0×1.0⁷个/mL，1.0×10⁸个/mL对3龄东亚飞蝗的致病力的差异 不明显。总体，看来，LD₅₀的大小顺序为1.0×10⁸个/mL＜1.0×10⁷个/mL＜1.0× 10⁶个/mL＜1.0×10⁵个/mL，其中，效果最佳的孢子浓度为1.0×10⁸个/mL。

表1处理后蝗蝻的校正死亡率(%)

表2金龟子绿僵菌对3龄东亚飞蝗的致病力

注:同列数据后不同字母表示差异显著,Duncans法,P<0.05

1.3.绿僵菌对绿步甲安全性评价

取0.1绿僵菌孢子粉使其四周均匀涂布在1m×0.7m塑料盒，使塑料盒覆盖上一 层菌粉。将50头绿步甲放入盒中用黄粉虫饲料喂养,每天记录绿步甲死亡情况。绿 步甲死亡后对其保湿处理，检验是否有僵虫出现。设不施菌粉为对照，每处理3个 重复。

观察记录经绿僵菌处理和未经绿僵菌处理的绿步甲每天的死亡率和僵虫率，绿步 甲在生活36d后除部分死亡外，第二代幼虫出现并活动良好，其他均进入越冬态,处 理组与对照组存活曲线基本吻合(图2)。对照组在27天时第二代幼虫出现，绿僵菌 处理的绿步甲在33天时也出现第二代幼虫；处理间进行方差分析，概率Pr>F，说 明绿僵菌处理组和对照无显著差异。对死亡的绿僵菌进行保湿处理，10d后均未发 现绿僵菌菌丝的生长,说明绿僵菌对绿步甲成虫安全。

1.4绿僵菌与绿步甲结合对东亚飞蝗的控制作用

田间模拟绿僵菌与绿步甲不同复合组成对东亚飞蝗致死效果，用1m³笼罩田间喂 养3龄东亚飞蝗，试验前将绿步甲饥饿处理1天。处理I（绿步甲对东亚飞蝗致死力）： 选取健康绿步甲雌、雄各一头，放入含有10头3龄东亚飞蝗的笼罩中；处理Ⅱ：用 浓度1×10⁸个/mL绿僵菌菌剂2ul喷洒到笼罩中的飞蝗及其食物上面，观察记录绿僵 菌对东亚飞蝗（3龄的东亚飞蝗）的寄生致死率；处理Ⅲ：投放健康的步甲雌、雄各 一头，同时喷洒绿僵菌菌剂，观察记录绿步甲对东亚飞蝗的捕食率和绿僵菌对东亚 飞蝗（3龄的东亚飞蝗）的寄生致死率；处理Ⅳ：投放经绿僵菌剂接种过的绿步甲， 观察记录虫菌复合后的绿步甲对东亚飞蝗（3龄的东亚飞蝗）的复合致死率。CK：喷 洒2ul无菌水到不放绿步甲和绿僵菌的含有10头东亚飞蝗的笼罩中作为对照，每个 处理重复三次，每天定时更换食料，分别统计每天东亚飞蝗的致死率，并将有绿僵 菌处理的东亚飞蝗取出进行保湿，观察计算僵虫率。

绿僵菌与绿步甲不同组合对东亚飞蝗模拟田间试验表明,绿僵菌与绿步甲的2 种不同组合处理方法(处理III、处理IV)对东亚飞蝗的校正致死率分别达83.33%、 100%,均显著高于绿僵菌单剂处理的66.67%和绿步甲单剂处理组的83.33%;但 2种不同的组合方式之间差异显著性，可能是由于绿步甲和绿僵菌与东亚飞蝗三者之 间的相互作用关系有关，导致单施与复配作用方式与作用功能不同。同时，使用绿 僵菌与绿步甲而不将两者结合的处理III，绿步甲捕食率比处理I和处理IV有所下降。 董辉(2005)证明步甲不取食被绿僵菌寄生的蝗虫，因此这可能由于绿步甲识别了已被 寄生的东亚飞蝗，从而减少对其捕食。而处理III的绿僵菌侵染率比处理I和处理IV 上升，这可能由于被绿步甲捕食惊吓或撕咬过的东亚飞蝗生活力下降，受伤的东亚 飞蝗更容易侵染；同时，绿步甲作为绿僵菌的传播媒介，增加了绿僵菌的传播范围 和几率，也使东亚飞蝗更容易受到到绿僵菌的侵染。

试验还表明,绿步甲对蝗虫的取食成功率随蝗虫的虫龄增大而下降。14d后蝗虫 大部分羽化，蝗虫个体数平均连续4.2天保持不变。综合试验结果，将绿僵菌与绿 步甲复合使用对东亚飞蝗的控制作用效果最好，这种组合复配方式，以绿步甲为传 播媒介既节省了人力、物力、财力，又发挥各形态生物农药的优点和功能，提高防 治有害生物的范围及防效，安全无污染的有效控制害虫的暴发及危害。

表3不同处理东亚飞蝗捕食率、侵染率及致死率间的比较

注:同列数据后不同字母表示差异显著,Duncans法,P<0.05

虽然，现有技术有报道，利用病原真菌防治害虫时,会危害到天敌，然而，本发 明克服了上述问题，只要筛选出适宜的的病原真菌种类,把风险降到最小程度。本发明 将获取的绿僵菌纯化稀释成不同的浓度，然后，将人工饲养的东亚飞蝗和绿步甲及稀释 后的绿僵菌作为试验材料，采用浸泡法将绿僵菌接种到绿步甲身上，进行毒力测定， 证明了绿僵菌对绿步甲是安全的，两种生防方法可以同时使用。然后进行了田间模 拟试验，通过观察绿僵菌对东亚飞蝗的寄生及绿步甲对东亚飞蝗的捕食等活动，研 究了绿僵菌和绿步甲共同防治东亚飞蝗的效果。使用绿步甲同时喷施绿僵菌处理和 投放经绿僵菌剂接种过的绿步甲对东亚飞蝗的控制效果均显著高于绿僵菌单剂侵染 和绿步甲单独捕食，而且绿僵菌剂接种过的绿步甲对东亚飞蝗控制效果最好。

本发明采用的绿僵菌与捕食性步甲组合对于控制鳞翅目害虫如夜蛾、桃小食心 虫、梨小食心虫等也会有很好的作用，通过改变组合所用的绿僵菌制剂及其他大型捕食 性步甲，可以针对更多有害生物的防控与治理。

本发明证明天敌与病原微生物可以协同作用控制有害昆虫并有较大的增效作 用，捕食性绿步甲体型大，有着活动能力强，捕食害虫广等优点，有些步甲能夜间 迁飞，携带孢子方便，散播绿僵菌菌孢子范围和效率高，所以，将活动能力较强的 捕食性天敌与虫生真菌组合，既能够发挥捕食性天敌捕食害虫的功能，又能够利用 天敌昆虫携带绿僵菌孢子粉并大范围传播,节省人力物力，增加害虫感染绿僵菌的几 率,造成绿僵菌流行病的发生。因此,将捕食性天敌绿步甲和绿僵菌两种生物农药 有机结合来控制害虫,发挥两者的联合功效具有非常广阔的应用前景。

实施例2

捕食性步绿步甲大量饲养与繁殖，并选取凶猛活动能力较强的成虫，雌雄比例1： 1。

获取绿僵菌发酵孢子粉，加工成可湿性粉剂：用绿僵菌原药、惰性填料和一定 量的助剂，按比例经充分混合粉碎，达到一定粉粒细度制成可湿性粉剂。经过实验 研究和生物测试，最佳适合的绿僵菌孢子可湿性粉剂符合：

1.含量，绿僵菌有效成分含量100-200亿孢子/g；2.悬浮率93%；3.润湿时间： 润湿性56秒。4.酸碱度（pH值）PH=7.8。5.水分:水分含量小于3%.绿僵菌孢子可 湿性粉剂配方为：按重量计，60%孢子，30%填充剂，8%调配剂，2%湿润剂。

悬乳剂配制：将绿僵菌孢子、色拉油按比例配成乳浊液，并加入抗坏血酸保护 孢子活性，加入SDS作为乳化剂最终制成悬乳剂，经过实验研究和测试，最佳适合 的绿僵菌孢子悬乳剂配比为：孢子/色拉油比例15%，0.2%抗坏血酸，0.1SDS。

将可湿性粉剂直接撒在塑料盒中，厚度达0.1-0.3cm,将步甲大量放入，每大盒 放入步甲150头-200头左右

把厚度约1cm纱布用稀释的悬乳剂浸湿，把纱布铺在盒中的步甲上面，接触步 甲，让步甲背面粘上孢子。

等待5-15分钟，步甲虫体沾有绿僵菌孢子，则可以释放到田间。