一株爱达尼科尔特氏菌及其应用

摘要

本发明提供了一株爱达尼科尔特氏菌及其应用，爱达尼科尔特氏菌命名为爱达尼科尔特氏菌BC-LY168。经分析测试，得知此菌本身具有水解磷酸、水解有机酸酯、水解多醣类、拮抗病原真菌的生长、促进植物生长的能力活性。本菌的168rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。经分析其酵素活性、碳源利用之特性、种子发芽生物分析、植物病原菌抗性测试以验证其功效，可用于促进植物生长、土圵改良或微生物肥料之用途。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物，尤其涉及一株爱达尼科尔特氏菌及其应用。

背景技术

农田大量使用化学肥料固然可以快速提供作物初期所需养分，但是会导致土圵 酸化、肥力不均与地下水源污染。已知土圵微生物中若具有固氮作用、无效性营养 溶解及分解土圵中有机质的功能，可供为微生物肥料，而微生物肥料可取代部份化 学肥料，以解决长期施用化学肥料所衍生出土圵劣化的问题。植物生长促进根圈细 菌(plant growth promoting rhizobacteria；PGPR)依照其有益的作用机制有四：(1) 生物肥料作用(biofertilization)，(2)生物防治(bio-control)作用、(3)生物复育作用 (biorcmediation)，(4)植物激素作用(phytostimulation)。

目前以微生物做为生物防治或抗植物病害用途申请通过的专利包括有芽孢杆 菌(Bacillus sp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)、假单 孢菌(Pseudomonas sp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter sp.)、酵 母菌株(Pseudozyma)、链霉菌(Streptomycetes sp.)、木霉菌(Trichoderma)、黑曲霉菌 (Aspergillus sp.)等菌属，但未包含本发明菌株的菌属。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株爱达尼科氏菌BC-LY168，其系由台湾污染土圵 中经培养基之培养、分离及纯化后选取之菌株，经菌种鉴定结果显示与科尔特氏 (Kurthia)细菌最相似，因此命名为爱达尼科氏菌(Alterikurthia sp)BC-LY168，该 菌己于2013年4月3日保存于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保存编号为 CCTCC NO：M2013118。

本发明的目的之二是提供一种新颖的爱达尼库特氏菌(Alterikurthia)之制剂， 其主要系具有(1)磷酸水解酶：包括碱性磷酸水解酶(alkaline phosphatase)、酸性磷 酸水解酶(acid phosphatase)和萘酚-AS-B1-磷酸水解酶(naphthol-AS-B1-phosphate  hydrolase)；(2)有机酸酯水解酶：包括丁酸酯酶(butyrate esterase)、辛酸酯酶(caprylate  esterase)；(3)醣类水解酶：包括α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)以及淀粉水解酶 (amylase)；(4)对于病原真菌的生长具有拮抗能力；(5)促进植物生长的能力，至少 5种功能之菌种，可供开发具有有机质分解、促进植物生长和对植物病害具有生物 防治功能之微生物制剂。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种爱达尼科尔特氏菌 (Alterikurthia sp)，命名为爱达尼科尔特氏菌BC-LY168，其保藏编号为CCTCC NO： M2013118。

所述爱达尼科尔特氏菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述爱达尼科尔特氏菌经过纯培养所得到的培养菌液。

上述爱达尼科尔特氏菌经过纯培养及离心或过滤得到的胞外上清液，其包含 菌体外之代谢活性物质。

上述爱达尼科尔特氏菌经过纯培养、离心或过滤所得到的活菌体。

包含由上述爱达尼科尔特氏菌经过纯培养所得到的培养菌液、胞外上清液或 和活菌体的组合物。

上述组合物的应用，是用于防治作物被植物病原真菌感染，或用于促进植物 生长並改良土圵品质。

所述植物病原真菌是指镰胞菌(Fusarium)真菌。

所述用于防治作物被植物病原真菌感染的方法是将所述组合物与植物种子、 果实或根部进行接触。

所述组合物还包含植物生长促进微生物、有机肥料或和农业化学物质。

经分析测试，本发明的爱达尼科尔特氏菌BC-LY168本身具有水解磷酸、水解 有机酸酯、水解多醣类、拮抗病原真菌的生长、促进植物生长的能力活性。经分析 其酵素活性、碳源利用之特性、种子发芽生物分析、植物病原菌抗性测试以验证其 功效，可用于促进植物生长、土圵改良或微生物肥料之用途。

附图说明

图1为利用Kimura-2parameter模式Kimura-双因子分析BC-LY168T(删除)与 其他接近关系的菌种16S rRNA基因序列的亲源树状图。

图2为以马铃薯己糖琼脂培养基(PDA)测试本发明菌株BC-LY168对于植物病 原菌Fusarium oxysporum生长的拮抗作用，其中，(A)植物病原菌Fusarium  oxysporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder & Hanson(FNH0103)；(B)FNH0103 菌株+BC-LY168菌株；(C)Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans(FOC19)；(D)FOC 菌株+BC-LY168菌株。

图3为BC-LY168对于植物病原菌Fusarium oxysporum包括Fusarium  oxysporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder & Hanson(FNH0103)、Fusarium  oxysporum f.sp.conglutinans(FOC19)和Fusarum oxysporum f.sp.cubense race4 (FOC24)菌株的生长抑制百分比。

具体实施方式

本发明菌株BC-LY168的基本特性如下：

1、菌体形态学的特征

本菌株为革兰氏阳性菌，具移动性，为好氧性菌；于胰蛋白酶盐洋菜胶(Tryptic  soy agar，TSA)或营养洋菜胶(Nutrient agar，NA)培养基生长时菌落形状为类根状。

2、细菌培养性质

本发明菌株之生长温度为30-37℃，0-10％NaCl化学异营性，生长pH值为 5.0-10.0，已知于nutrient agar(Hi-Media)、tryptone soy agar(BBL)及R2A(oxoid)培 养基可生长。

3、菌株之生化特性

本发明菌株具有下列酵素活性：过氧化氢酶(catalase)、碱性磷酸水解酶 (alkaline phosphatase)、酸性磷酸水解酶(acid phosphatase)、萘酚-AS-B1-磷水解酶 (naphthol-AS-B1-phosphohydrolase)、丁酸酯酶(butyrate esterase)、辛酸酯酶 (caprylate esterase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)及淀粉水解酶(amylase)。

4、菌株之生理特性

本发明菌株可利用之碳源：2，3-丁二醇(2，3-butanediol)、α-环状糊精(α -cyclodetxrin)、右旋半乳糖醛酸(D-gacturonic acid)、γ-羟丁酸(γ-hydroxybutyric  acid)、苯乙胺(phenylethylamine)、α-酮戊酸(α-keto valeric acid)、左旋-酥胺酸 (L-threonine)、界面活性剂(Tween-40、Tween-80)和右旋-海藻糖(D-trehalose)。可被 本发明菌株利用产酸的醣类：甘油(glycerol)、右旋-核糖(D-ribose)、右旋-山黎醇 (D-sorbitol)、右旋-麦芽糖(D-maltose)、右旋-松二糖(D-turanose)、葡萄糖酸 (Gluconate)、钾-5-酮基葡萄糖酸(potassium-ketogluconate)。

已知植物根分泌物(root exudates)的组成通常包括有醣类(carbohydrate)、胺基 酸(amino acids)、維生素(vitamins)、有机酸(organic acids)和其他各样的化合物，這 些根分泌物有利于微生物的利用，並被认为是根圈中微生物数量及活性增加的主要 理由。因此细菌对各种碳源的利用能力也被认为是细菌成功拓殖化根圈的因素之 一。

本发明之爱达尼科尔特氏菌(Alterikurthia sp)BC-LY168包括有下列特征：

一、本发明菌株为自污染土圵环境分离之天然野生菌种，未经任何人工基因 改造的处理。

二、本发明菌种为一新颖菌株，具备分解有机质、生物肥料以及生物防治之 菌种。

基于上述特征，本菌可开发为微生物制剂。

本发明之菌株可以做以下的应用：(1)微生物肥料，可施用于根圈，促进植 物生长；(2)土圵改良剂，施用于土圵，(3)堆肥或有机质品质改良，施用于未 腐熟或已腐熟的堆肥或有机质、(4)对于土圵中特定真菌病害具有生物防治功能之 根圈微生物接种剂之用途。

根据本发明，可使用爱达尼科尔特氏菌BC-LY168之组成物处理。本发明之 具体实施例为将爱达尼科尔特氏菌BC-LY168菌体培养于固体培养基中证明其活 菌体本身具有抑制Fusarium植物病原菌的功效。

兹以下列实例予以详细说明本发明，唯並不意味本发明仅局限于此等实例所 揭示之内容。

【台湾鞘胺醇单胞之分离筛选】

自采集自台湾省之大豆发酵样品，取1g样品放入10ml无菌水，稀释涂抹于 营养琼脂(nutrient agar)(HIMEDIA)培养基上，于30℃培养，分离及纯化单一菌落之 菌株。

【以多项分类方法分析本发明之BC-LY168菌株】

1.基因型的分类分析

以16S rRNA基因定序鉴定本发明之菌株，其系利用MO BIO公司(USA)所 提供的微生物染色体DNA分离套组(UltraCleanTM Microbial Genomic DNA  Isolation Kit)进行DNA萃取，以大肠杆菌(Escherichia coli)之次单元(small-subunit， SSU)核醣体RNA基因之高度保留序列设计细菌专一性引物(bacterial universal  primer)，正向引物1F(5’-GAG TIT GAT CAT GGC TCA G-3’)及反向引物9R (5’-AAG G AG GTG ATC CAA CCG CA-3’)(如表1所示)进行聚合酶链反应(PCR)， PCR反应液中分别添加细菌染色体DNA約20-50ng做为模版、两股引物各20 pmol、1.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、缓冲溶液使总体积为25μL，反应 条件为95℃5分钟，95℃1分钟、50℃1分30秒、72℃2分钟、共35循 环，72℃7分钟。以聚合酶链反应进行16S rDNA之增殖。再利用QIAquick Gel  Extraction套组回收DNA后，进行欲定序基因片段之热循环反应，选用之定序引 物为高度保留之16S rDNA专一性引物，将经细菌专一性引物放大之片段以定序用 引物进行染剂终止循环定序(dye terminator cycle sequencing)反应。最后以310 PRISM定序仪进行萤光之侦测及序列判读，得到本发明细菌BC-LY168之16S rDNA1,447碱基对(如SEQ IDNO.1所示)，本发明菌株之16S rDNA序列已送存 至美国国家生技资訊中心基因资料库(NCBI Genbank)得到登录号码(accession  number)为JF311905。

表1.以聚合酶链反应(PCR)增量16S rRNA所采用之引物(primers)

＊：核酸位置係指大肠杆菌之16S rRNA核酸序列之位置

将NCBI GeneBank取得的库特氏菌(Kurthia)属的标准菌株(type strains)利用 Clustal_X(1.83)程式进行排比，再以Mega-4软体(Tamura et al.，2007)进行亲缘分析 (phylogenetic analysis)，利用邻近连接方法(neighbour-joining method)(Saitou和Nei， 1987)推论演化树(evolutionary trees)。最后演化树的拓仆学以基于1000次随机分析 (re-sampling)的邻近连接法(neighbour-joining method)的自举分析(bootstrap analyses) 评估(Felsenstein，1985)。图1为此本发明的菌株BC-LY168以邻近结合法 (neighbor-joining method)构筑的树状图，分支以显示数字代表1000次随机分析后 仍归于同一群丛之百分比例，显示本发明菌株BC-LY168与假单胞菌最有相关性。 显示本发明菌株与吉氏库特氏菌(Kurthia gibsonii)NCIMB9758T(97.4％)的相似 度最近；与其他菌种的相似度則低于97％。当16S rDNA的相似度低于97％相当 于DNA-DNA杂合的程度不高于60％(Stackebrandt and Goebel，1994)，可以认定 是新种。本发明菌株BC-LY168和尔特氏菌属(Kurthia)、拉梅尔芽孢杆菌 (Rummeliibacillus)、绿色芽孢杆菌(Viridibacillus)和离胺酸芽孢杆菌(Lysinibacillus) 的标准菌种(type species)之间的演化距离(evolutionary distances)分别是3.2％、3.6％ 和4.0％，均大于标准菌种与属内菌种之演化距离(分别是1.3-2.8％、1.9％和 0.1-2.8％)，证明本发明菌株BC-LY168为一个新种细菌。

【菌体的菌体形态分析】

依Cowan(1974)的修改方法将进行革兰氏(Gram)染色，本发明菌株革兰 氏染色为阳性菌。将本发明菌的菌体于移动性液体培养基(mobility)内在30℃下生 长3天，以显微镜检测其移动性(mobility)。利用穿透式电子显微镜观察本发明菌 株BC-LY168的菌体型态呈现杆状，以本发明细菌无孢子，好气菌，在生长对数期 时之细胞呈杆状，具有鞭毛，故属移动性。于营养琼脂(Nutrient agar；NA)培养基生 长培养2天后菌落形状外观为类根状。

【菌体的生理及培养性质之分析】

将本发明菌株接种于Nutrient broth(Hi-Media)培养基测试下列条件之生长情 形：

生长温度

将新鲜菌株接种于以氢氧化钠或盐酸调整的不同酸碱值(pH)的NB液体培养 基，测试其在30℃振荡培养下可以生长的pH，结果显示其可生长的pH值范围为 5-10。

不同浓度的NaCl下之生长情形，温度在于25-37℃间，化学异营性，在含 0-10.0％NaCl的NB(HIMEDIA)中可生长。

【菌体化学性质分析】

1.细胞脂肪酸组成分析

测试接种爱达尼科尔氏菌BC-LY168与库特氏菌属之其他菌种的细胞壁脂肪 酸之型态(profile)，将菌株于含Nutrient agar培养基的锥形瓶，于30℃培养48小 时后测定其化学分类性质，将菌体依照如Miller(1982)进行皂化、甲基化和萃取， 如Paisley(1996)所述以气体-火焰离子化侦测器(GC-FID)配合微生物鉴定系统 (MIDI)鉴定脂肪酸。细胞脂肪酸分析显示BC-LY168的主要脂肪酸为anteiso-C15:0 (34％)、iso-C15:0(21％)、anteiso-C17:0(10％)、iso-C6:0(7％)、n-C16:0(6％)、 iso-C14:0(6％)以及C15:1ω5c(5％)。科尔特氏菌属(Kurthia)典型的脂肪酸为 iso-C14:0、iso-C15:0、anteiso-C15:0、C15:1ω5c，显示本发明菌株BC-LY168的主 要脂肪酸组成Anteiso-C17:0並非科尔特氏菌属典型菌种的主要脂肪酸，显示 BC-LY168菌株为一新属，並且命名为爱达尼科尔特氏菌(Alterikurthia)。

2.呼吸醌的分析

将本发明菌株爱达尼科尔特氏菌BC-LY168的类异戊二烯(isoprenoid)以 Minnikin等人(1984)的方法进行萃取，以高效液相层析(HPLC)进行分析(Collins， 1985)，结果显示：本发明菌株具有7个isoprene单位的不饱合甲萘醌(menaquinone； MK-7)。

【以BIOLOG分析BC-LY168菌株之碳源利用能力】

将爱达尼科尔特氏菌BC-LY168菌株画线接种至NA培养基培养皿，于30℃ 培养16-24小时，将菌落悬浮于GN/GP-IF接种剂，调整菌液浓度至波长590nm 下之透光度65％，取150μl调整悬浮液注至GN2BIOLOG96孔槽(wells)之微量平 盘，置于30℃培养72小时，以BIOLOG Thermomax判读机测定其波长595nm的 吸光值，经由判读机的判读，会将各培养井内的不同深浅的呈色反应的OD值(λ1＝ 590，λ2＝750)减去A-1培养井(空白试验，不含碳源)的数值，可分为强反应、 弱反应及无反应三种。由BIOLOG分析结果得知，本发明分离之BC-LY168菌株 可利用的碳源有2，3-丁二醇(2，3-butanediol)、α-环状糊精(α-cyclodetxrin)、右旋半 乳糖醛酸(D-gacturonic acid)、γ-羟丁酸(γ-hydroxybutyric acid)、苯乙胺 (phenylethylamine)、α-酮戊酸(α-keto valeric acid)、左旋-酥胺酸(L-threonine)、界 面活性剂(Tween-40、Tween-80)和右旋-海藻糖(D-trehalose)。习知，植物根圈的分 泌物含有多量醣类与羰酸，可預期将本发明菌株施用于植物根圈，其将可有根部拓 殖作用的优势，对于植物可发挥细菌本身具有的生理功效。

【以API20E、API20NE、API-ZYM套组测定BC-LY168菌株之生理性质】

1.氧化酶及触酶活性测试：

依据bioMerieux厂商提供的说明书测试其氧化酶活性，将菌落直接以氧化酶 试剂(OX reagent)滴一滴，呈紫色为正反应(positive reaction)，表示本发明细菌 BC-LY168菌株可分泌氧化酶(oxidase)，以3％过氧化氢(hydrogen peroxide)滴于菌 落上可产生气泡，表示本发明的菌株可分泌触酶(catalase)。

2.API20NE、API ZYM测试

以API20NE测试本发明菌株之生化活性，如套组之操作说明(bioMérieux， France)。其步骤如下所述：将细菌划线于适合生长的固体培养基上，于30℃培养。 将纯菌落加入2ml生理食盐水，混合均匀，将菌体悬浮液吸光值A600调整为0.5。 将无菌水补满于培养盘的凹槽，以保持培养盘的湿气。将API20NE反应条(strip) 置于培养盘中。将菌体悬浮液滴入NO3至PNPG试验孔的tube中。GLU、ADH、 URE试验孔的cupule覆盖无菌矿物油。取200μl之菌体悬浮液加入AUX medium 中，培养基的组成分为：2g/L硫酸铵、10.5ml/L VITAMIN solution、10ml/L微量 元素(trace element)、6.24g/L磷酸鈉(monosodium phosphate)、1.5g/L氯化钾 (potassium chloride)、1.5g/L琼脂(agar)，pH7.0-7.2，均匀混匀。将所调配的菌体 悬浮液加入GLU至PAC12个试验孔的tube及cupule中。将培养盘盖子盖上后， 于30℃培养48小时。加入NIT1和NIT2试剂各一滴至NO3试验孔中，反应5分 钟后判读。加入一滴JAMES试剂于TRP试验孔中，可立即判读。以API-ZYM套 组(bioMerieux，Inc.公司)测试本发明菌株BC-LY168菌株之专一酵素活性。首先以 接种环取培养皿上的菌落后，溶于5ml无菌水中，经调整菌液浓度使透光度接近 50％，取调整好之菌液65μl加入每个反应孔槽内后，将样品置于30℃中反应24 小时，再加入API-ZYM套组A液与B液各一滴，靜置5分钟后观察颜色变化。 由API20NE和API ZYM测试结果，得知BC-LY168菌株具有下列酵素的活性：碱 性磷酸水解酶(alkaline phosphatase)、酸性磷酸水解酶(acid phosphatase)、萘酚 -AS-B1-磷水解酶(naphthol-AS-B1-phosphohydrolase)、丁酸酯酶(butyrate esterase)、 辛酸酯酶(caprylate esterase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)及淀粉水解酶(amylase)。

【以细菌针对植物病原菌的拮抗分析】

选择对于植物具有病原性的三株真菌菌种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 分别为西瓜蔓割病致病菌Fusarium oxysporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder& Hanson(FNH0103)、甘兰黄叶病致病菌Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans (FOC19)，和香蕉黄叶病致病菌Fusarum oxysporum f.sp.cubense race4(FOC24)， 其中FNH0103和FOC19两菌株系由台湾中兴大学植病系黄振文教授所提供， FOC24菌株則是由台湾中兴大学植病系张碧芳副教授所提供。

将本发明的菌株划线接种于于营养琼脂培养基(NA，Hi-Media)上于30℃培养 1天后，将生长的菌落悬浮于无菌水並调整其吸光值A600＝0.5，取100μl菌体悬 浮液至马铃薯己糖琼脂(Potato dextrose agar；PDA)培养基，涂抹均匀后，再从生长 于PDA培养基上切一方块(0.42cm)含真菌菌絲的培养基于上面涂有BC-LY168菌体 的PDA中间。于25℃培养箱(上方以20W日光灯18-英时距离的每日照射12小 时)连续培养6天。观察记录真菌生长的大小。结果如图2和图3所示，显示 BC-LY168菌株可以明显抑制Fusarium oxysporum菌株在PDA培养基的生长。

序列表

<110>上海登茂生物科技研发中心有限公司

<120>一株爱达尼科尔特氏菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1447

<212>DNA

<213>爱达尼科尔特氏菌(Alterikurthia sp)BC-LY168

<400>1

GAGTTTGATC ATGGCTCAGA ACGAACGCTG GCGGCGTGCC TAATACATGC AAGTCGAGCG     60

AATGACGAGA AGGTTGCTTC TCTGATTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA CGTGGGCAAC     120

CTGCCCTGTA GACTGGGATA ACTTCGGGAA ACCGGAGCTA ATACCGGATA ATTCTTTTAG     180

CCTCATGGCT TTAAGCTAAA AGGCGCTTCG GCGTCACTAC AGGATGGGCC CGCGGTGCAT     240

TAGCTAGTTG GTGCGGTAAC GGCCTACCAA GGCAACGATG CATAGCCGAC CTGAGAGGGT     300

GATCGGCCAC ATTGGGACTG AGACACGGCC CAAACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA     360

TCTTCCACAA TGGACGAAAG TCTGATGGAG CAACGCCGCG TGAGTGATGA AGGTTTTCGG     420

ATCGTAAAAC TCTGTTGTAA GGGAAGAACA AGTGCGTTAG GTAATGAACG CACCTTGACG     480

GTACCTTATT AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG     540

CAAGCGTTGT CCGGATTTAT TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG GTGGTTTCTT AAGTCTGATG     600

TGAAAGCCCA CGGCTCAACC GTGGAGGGTC ATTGGAAACT GGGAGACTTG AGTGCAGAAG     660

AGGATAGTGG AATTCCAAGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATTTGGAGG AACACCAGTG     720

GCGAAGGCGA CTGTCTGGTC TGTAACTGAC ACTGAGGCGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA     780

GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAGT GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC     840

CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT AACGCATTAA GCACTCCGCC TGGGGAGTAC GACCGCAAGG     900

TTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG     960

AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCCAAT GACCGTCTTA GAGATAAGAT     1020

TTTCCCTCCG GGGACATTGG TGACAGGTGG TGCATGGTTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG     1080

ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTATTCT TAGTTGCCAT CATTTAGTTG     1140

GGCACTCTAA GGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAATCAT     1200

CATGCCCCTT ATGACCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG ACGGTACAAA GAGCTGCAAG     1260

CCCGCGAGGG TTAGCCAATC TCATAAAACC GTTCTCAGTT CGGATTGTAG TCTGCAACTC     1320

GACTACATGA AGCCGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC     1380

CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ACGAGAGTTT GTAACACCCG AAGCCGGTGG     1440

GGTAACC                                                               1447