涉及miR-155对于错配修复和基因组稳定性的调节的材料和方法

摘要

本发明提供了涉及miR-155对于错配和基因组稳定性的调节的材料和方法。

说明书

发明人：Carlo M.Croce，Nicola Valeri

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年3月26日提交的美国临时申请号61/318,042的 权益，其全部公开内容明确通过引用方式并入本文。

关于联邦支持研究的声明

本发明不是在国立卫生研究院授予的基金号GM080176、 CA067007、CA124541和CA135030的政府支持下完成的。政府可享有 本发明的某些权利。

序列表

本申请包含序列表，其通过EFS-web提交并通过引用方式全文并 入本文。于2011年3月21日创建的ASCII拷贝命名为 604_51754_SEQ_LIST_OSU-10126.txt，大小为5,627字节。

技术领域

本发明大体上涉及分子生物学领域。更具体地，其涉及癌症相关的 技术。本发明的某些方面包括与miR-155相关的病症的诊断、治疗和预 后中的应用。

背景技术

错配的核苷酸可来源于聚合酶误掺入差错，异等位基因亲代染色体 之间的重组，或DNA的化学和物理损伤。MutS同源物(MSH)和MutL 同源物(MLH/PMS)是高度保守的蛋白并且对于MMR切除反应是必不 可少的。在人类细胞中，hMSH2和hMLH1是MMR的基础成分。hMSH2 蛋白与hMSH3或hMSH6形成异二聚体，并且是错配/损伤识别所需的， 而hMLH1蛋白与hMLH3或hPMS2形成异二聚体，并与MSH异二聚 体形成三重复合物以完成切除修复反应。人类细胞含有比 hMSH2-hMSH3/hMLH1-hMLH3复合物(其主要修复大的IDL错配)至 少多10倍的hMSH2-hMSH6/hMLH1-hPMS2复合物(其修复单核苷酸 和小的插入删除环(IDL)错配)。除了MMR，已经表明 hMSH2-hMSH6/hMLH1-hPMS2成分独特地识别DNA中的损伤和单细 胞周期阻抑和细胞凋亡。

已证明hMSH2,hMSH6,hMLH1和hPMS2核心MMR基因中的突 变与LS/HNPCC相关。这些发现已经为突变子假说(Mutator Hypothesis) 提供了相当大的支持，因为MSH和MLH/PMS基因中的缺陷显著增加 细胞突变率，然后后者可驱动癌症中发现的多个癌基因的进化和肿瘤阻 抑子基因突变。突变子表型的一个标志是简单重复序列或微卫星DNA 的不稳定性(微卫星不稳定性或MSI)。几乎所有的LS/HNPCC肿瘤都显 示出MSI，其为核心MMR基因的突变的或遗传性表观遗传失活的结果。 10%-40%的显示出MSI的散发性结肠直肠癌(sporadic CRC)、子宫内 膜、卵巢、胃和泌尿道上皮肿瘤中多数是获得性hMLH1启动子甲基化 的结果。大约95%的MSI肿瘤可以至少部分由核心MMR成分的突变 和/或表观遗传失活来解释。剩余的5%以及很大比例的双等位基因 MMR失活机制仍然知之甚少。

微小RNA(miR)是非编码RNA，其在超过30%的控制关键生物学 过程(包括发育、细胞分化、细胞凋亡和增殖)的人类基因的转录后调节 中发挥作用。已经在CRC中观察到miR-155的过表达，并且相对于微 卫星稳定(MSS)肿瘤显示出更经常的MSI CRC。

本部分中公开的背景参考文献不是被承认在法律上构成现有技术。

虽然在与MMR功能失调相关的疾病中进行了可观的研究，但是它 们仍然是难以诊断和有效治疗的，患者中观察到的死亡率表明需要这些 疾病的诊断、治疗和预防方面的改进。

发明内容

本发明是基于下列信息和发现：错配修复(MMR)的失活是常见的癌 症易感病症Lynch综合征(LS；或;遗传性非息肉性结肠直肠癌， HNPCC)以及10%-40%的散发性结肠直肠癌、子宫内膜、卵巢、胃和 泌尿道上皮癌症的诱因。升高的突变率(突变子表型)(包括简单重复不稳 定性)(微卫星不稳定性或MSI)是MMR缺陷的标志。微小RNA(miR) 已被指参与涉及发育和癌症的关键细胞途径的控制。在本文中，本发明 人显示：miR-155的过表达显著下调核心MMR蛋白，hMSH2、hMSH6 和hMLH1，诱导突变子表型和MSI。在人结肠直肠癌(CRC)中发现 miR-155的表达与MLH1或MSH2蛋白表达之间具有相反关系。最后， 多种具有未知起因的MMR失活的MSI肿瘤显示出miR-155过表达。 这些数据为“miR-155调节MMR作为癌症病理发生的新机制”提供了支 持。

通过阅读优选实施方式的下列具体描述和附图，本发明的多个方面 和优点将对于本领域技术人员变得明显。

本发明提供了物质组合物，其包含至少一种反义miRNA和至少一 种另外的成分，其中所述反义miRNA对于能够下调至少一种核心MMR 蛋白的miRNA是反义的，并且其中所述至少一种另外的成分对于治疗 MMR相关的疾病是有用的。优选地，所述至少一种另外的成分选自： 化疗药物；干细胞；AG1478；吉非替尼埃罗替尼 西妥昔单抗；帕木单抗；zalutumamab；尼妥珠单抗；马 妥珠单抗；和拉帕替尼。优选地，所述反义miRNA是miRNA-155，和 /或其中所述至少一种核心MMR蛋白选自：hMSH1；hMSH6；和 hMLH1。

还提供了鉴定测试样品中的MMR功能失调细胞的方法，包括将测 试样品中的miRNA-155水平与对照的miRNA-155水平进行比较，其中 差别表达的miRNA-155水平指示测试样品包含MMR功能失调细胞。

还提供了诊断受试者是否具有或处于产生MMR突变体细胞的风险 的方法，包括将测试样品中的miRNA-155水平与对照的miRNA-155水 平进行比较，其中差别表达的miRNA-155水平诊断该受试者具有或处 于产生MMR突变体细胞的风险。

还提供了诊断受试者是否具有或处于患Lynch综合征的风险的方 法，包括将测试样品中的miRNA-155水平与对照的miRNA-155水平进 行比较，其中差别表达的miRNA-155水平诊断该受试者具有或处于患 Lynch综合征的风险。

还提供了诊断受试者是否具有或处于患遗传性非息肉性结肠直肠 癌的方法，包括将测试样品中的miRNA-155水平与对照的miRNA-155 水平进行比较，其中差别表达的miRNA-155水平诊断该受试者具有或 处于患遗传性非息肉性结肠直肠癌的风险。

还提供了诊断受试者是否具有或处于患癌症的方法，包括将测试样 品中的miRNA-155水平与对照的miRNA-155水平进行比较，其中差别 表达的miRNA-155水平诊断该受试者具有或处于患癌症的风险，其中 所述癌症选自结肠直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌和泌尿道上皮癌。

还提供了提供患者的预后的方法，包括将测试样品中的miRNA-155 水平与对照的miRNA-155水平进行比较，其中下调的miRNA-155水平 指示差的预后。

还提供了在有治疗需要的患者中治疗MMR功能失调的方法，包括 施用药学有效量的本文的组合物。优选的是这样的方法：其中所述MMR 功能失调选自：成神经细胞瘤；肺癌；胆管癌；非小细胞肺癌；肝细胞 癌；淋巴瘤；鼻咽癌；卵巢癌；头颈鳞状细胞癌；鳞状细胞子宫颈癌； 胃癌；结肠癌；子宫颈癌；胆囊癌；前列腺癌；乳腺癌；睾丸生殖细胞 肿瘤；大细胞淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；结肠直肠癌；恶性胸膜间皮瘤； 神经胶质瘤；甲状腺癌；基底细胞癌；T细胞淋巴瘤；t(8;17)-幼淋巴细 胞白血病；骨髓增生异常综合征；胰腺癌；t(5;14)(q35.l;q32.2)白血病； 恶性纤维组织细胞瘤；胃肠间质肿瘤；和肝母细胞瘤；另外优选的是这 样的方法：其中所述癌症选自结肠直肠癌；子宫内膜癌；卵巢癌；胃癌； 和泌尿道上皮癌。

还提供了在有治疗需要的MMR功能失调患者中治疗癌症的方法， 包括施用药学有效量的反义miRNA，其中所述反义miRNA对于 miRNA-155是反义的。优选的是这样的方法，其中被治疗的癌症选自： 结肠直肠癌；子宫内膜癌；卵巢癌；胃癌；和泌尿道上皮癌。另外优选 的是这样的方法，其进一步包括施用佐剂。更优选的是这样的方法，其 进一步包括施用选自下列的化合物：化疗药物；干细胞；AG1478；吉 非替尼埃罗替尼西妥昔单抗；帕木单抗； zalutumamab；尼妥珠单抗；马妥珠单抗；和拉帕替尼。

还提供了用于诱导MMR功能失调细胞的凋亡的方法，包括导入凋 亡有效量的本文描述的组合物。

还提供了用于诱导MMR功能失调细胞的凋亡的方法，包括导入凋 亡有效量的反义miRNA，其中所述反义miRNA对于miR-155是反义 的。优选的是这样的方法，其中所述细胞由于至少一种下调的核心MMR 蛋白而功能失调，所述蛋白选自hMSH2；hMSH6；和hMLH1。另外 优选所是这样的方法，其中所述细胞由于微卫星不稳定性而功能失调。 另外优选的是这样的方法，其进一步包括导入选自下列的化合物：化疗 药物；干细胞；AG1478；吉非替尼埃罗替尼西妥昔单抗；帕木单抗；zalutumamab；尼妥珠单抗；马妥珠单抗；和 拉帕替尼。

还提供了鉴定药学上有用的组合物的方法，包括：将反义 miRNA-155导MMR功能失调细胞培养物中；将测试组合物导入 MMR功能失调细胞培养物中；和将诱导细胞凋亡的测试组合物鉴定为 药学上有用的组合物。

还提供了预测患有MMR功能失调疾病的患者的临床结果的方法， 包括检测获自患者的MMR功能失调疾病细胞样品中的miR-155的表达 水平，其中相对于对照，miR-155水平1.5倍或更高的增加并联合MMR 功能失调状态预测了存活的减少。

还提供了鉴定用于治疗MMR功能失调疾病的治疗剂的方法，包括 在体外筛选候选试剂以选择降低miR-155的表达的试剂，从而鉴定用于 治疗MMR功能失调疾病的试剂。

还提供了用于鉴定MMR功能失调疾病中的差别表达的miR-155 的试剂盒，包含miR-155的至少一种分子鉴别物。

还提供了用于鉴定肺癌中的差别表达的miR-155的试剂盒，包含 miR-155的至少一种分子鉴别物，其中所述分子鉴别物选自探针、引物、 抗体或小分子。

附图说明

专利或专利申请文件可包含彩色的一幅或多幅附图和/或一张或多 张照片。本专利或专利申请公开文本的具有彩色附图和/或照片的拷贝可 从专利局依申请并缴纳必要费用之后获得。

图1A-1B。hMLH1，hMSH2和hMSH6是miR-155的直接靶标。

图1A显示了所示基因的3’UTR和/或CDS中的miR-155的靶位点 的位置(另见图6)。碱基位置从CDS中的第一个核苷酸开始数。

图1B：以phRL-SV40构建体(作为对照)和萤光素酶构建体WT或 MUT-155和以pre-miR-155或pre-miR对照转染的Colo-320DM细胞。 24小时后，进行双萤光素酶测定。^*p<0.005：相对于pre-miR对照。

图2A-2C：miR-155的过表达降低了CRC细胞中MLH1、MSH2 和MSH6的表达。以针对所选基因的pre-miR-155、pre-miR对照或 siRNA转染Colo-320DM细胞48小时。

图2A：通过实时PCR确认转染效率。将miR-155表达针对RNU44 进行归一化。误差条表示S.E.M.^*p<0.001(N=3)。

图2B：miR-155对于MMR核心蛋白具有转录后效应。将所示基 因的mRNA表达针对纽蛋白(vinculin)的表达进行归一化。误差条表示 S.E.M.^*p<0.05，相对于对照pre-miR(N=3)。

图2C显示了western印迹分析的代表性印迹以及3次独立实验的 平均值和S.E.M.。^*p<0.005，相对于对照pre-miR。

图3A-3D。具有miR-155过表达的稳定克隆。miR-155过表达对于 结肠癌细胞系的功能效应。以过表达miR-155的慢病毒载体(Colo-155) 或空载体(Colo空)稳定感染MMR活性Colo-320DM细胞。

图3A：代表性的Western分析以及3次独立实验的平均值和 S.E.M.。^*p<0.05，相对于对照。

图3B：通过实时PCR测定的所选基因的mRNA表达(针对纽蛋白 进行归一化)。误差条表示S.E.M.^*p<0.05(N=3)。

图3C：通过Northern分析测定miR-155表达(MV-411细胞用作阳 性对照)。

图3D：使用BAT-26和BAT 25(单核苷酸重复)和D17S250(二核苷 酸重复)标志物进行的Colo-155和Colo-空细胞的微卫星分析。上面显示 了大小标志物。

图4A-4B：miR-155表达与CRC组织中的MLH1和MSH2反相关。

图4A：石蜡包埋的、福尔马林固定的CRC组织与LNA探针抗 -miR-155或乱序探针和针对MSH2和MLH1的IHC抗体温育。显示了 使用Nuance系统软件捕获的代表性照片，对于miR-155和MSH2或 MLH1是阳性染色。蓝色和红色染色分别鉴定出miR-155和靶蛋白。未 观察到miR-155和MLH1或MSH2在相同细胞巢中的共定位。

图4B：从新鲜冷冻的人结肠直肠组织提取的RNA和蛋白质。通过 实时PCR测定miR-155的表达，通过Western分析测定MMR蛋白表 达。显示了具有上调(大于2倍)的miR-155表达和下调的MMR蛋白表 达的CRC。观察到相对于邻近的正常组织，肿瘤中的“hMLH1和hMSH2 表达丧失”与“miRNA-155表达增加3倍以上”之间的强烈关联(红线)。 miR-155癌症/正常组织比例小于3倍的样品显示出对于MMR表达的不 确定的效应。

图5A-5B：hMLH1阴性肿瘤中的miR-155表达。通过原位杂交在 石蜡包埋的组织上测定了miRNA-155表达。

图5A：CR-78癌症组织(具有起因未知的MLH1丧失)显示出强烈 的miR-155表达(大箭头)，而间质(小箭头)对于miR-155表达是阴性的。

图5B：CR-79组织(由于启动子甲基化而丧失MLH1)仅在炎性细胞 中显示出微弱的miR-155表达(大箭头)。在癌症组织中未检测到信号(小 箭头)。

图6A-6C：miR-155的预测的结合位点。显示了miR-155在下列基 因中的预测的结合位点：MLH1(分别是SEQ ID NOS 21-22,23和22， 按照出现次序)(图6A)、MSH2(分别是SEQ ID NOS 24和22，按照出 现次序(图6B)和MSH6(分别是SEQ ID NOS 25和22，按照出现次序) (图6C)。

图7：CRC组织中的miR-155和MMR蛋白表达。miR-155调节 MLH1和MSH6的异源表达。以编码MLH1或MSH6蛋白的质粒和表 达miRNA-155的载体或乱序载体共转染分别缺乏MLH1和MSH6的 HCT-116和DLD-1细胞系。以miR-155进行的共转染诱导了MLH1和 MSH6蛋白表达的降低。MLH1和MSH6的CDS中的结合位点的破坏 导致表达截短的蛋白(分别是73KD和150KD)。使用针对MLH1和 MSH6的N末端抗体来检测WT和截短的蛋白。在MSH6的情况下， 蛋白大小上的偏移不太可检出，这是由于较高的分子量和使用了4-20 梯度凝胶。即使在存在截短的蛋白MLH1的情况下，仍然存在失调， 这是由于保守性的3’UTR结合位点。两个MLH1种子区的破坏导致 miR-155活性的丧失。显示了代表性的印迹，3个不同实验归一化。误 差条代表平均值和S.E.M.^*p<0.005，相对于空载体。

图8A-8C：miR-155的抑制增加了MMR蛋白的表达。以抗-miR-155 或抗-miR对照转染MV4-11细胞48小时(图8A)，通过实时PCR测定 miR-155的表达(针对RNU6进行归一化)。误差条代表一式三份的平均 值和S.E.M.。^*P:0.003。

图8B：通过northern印迹分析测定miR-155。

图8C：在转染48小时后获得细胞裂解物，并以所示的抗体进行免 疫印迹。显示了代表性印迹以及3次实验的定量。^*p<0.005

图9A-9C：CRC组织中的miR-155和MMR蛋白表达。

图9A：使用对于miR-155具有阳性染色的炎性肝硬化组织作为阳 性对照。

图9B：石蜡包埋的、福尔马林固定的CRC组织与LNA探针抗 -miR-155或乱序探针和针对MSH2和MLH1的IHC抗体温育。基于具 有可检测的表达的细胞百分率对miR-155表达进行评分。以LNA、抗 -miR-155或LNA乱序探针染色的3个不同核心蛋白的代表。当分别在> 15%和>5%的细胞中检测到阳性时，对miR-155和MMR蛋白进行评分。

图9C：显示了具有对于miR-155和MLH1或MSH2的阳性或阴性 染色的情况的比例的总结数据和代表性图示。

详细描述

本发明提供了涉及这些新发现的材料和方法。特别地，用于治疗如 本文描述的以及如本领域技术人员已知的这些病症的组合物。还提供了 用于鉴定对治疗有用的另外的组合物的方法，诊断方法，提供预后的方 法，诱导凋亡的方法等。还提供了与这些发现相关的研究工具，特别是 试剂盒等。

定义

DNA：脱氧核糖核酸

mRNA：信使RNA

PCR：聚合酶链式反应

pre-miRNA：前体微小RNA

qRT-PCR：定量逆转录酶聚合酶链式反应

RNA：核糖核酸

应该理解，上述一般性定义和下述详细描述仅是示例性的，不是意 在限制本教导的范围。在本申请中，单数的使用包括复数，除非另有明 确指明。

当与术语“包含”在权利要求和/或说明书中联合使用时，词语“一种” 的使用可以表示“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或 多于一个”的意思相一致。

同样，“包含”、“含有”和“包括”或这些词语的变体不是意在限制。 术语“和/或”意思是之前和之后的术语可以联合或分开。举例而言，但不 是限制，“X和/或Y”可以表示“X或Y”或“X和Y”。

应该理解，miRNA源自基因组序列或基因。在该方面，术语“基因” 用于简便地指编码前体miRNA(对于给定的miRNA)的基因组序列。然 而，本发明的实施方式可包括涉及其表达的miRNA的基因组序列，例 如启动子或其它调节序列。

术语“miRNA”一般是指单链分子，但是在具体实施方式中，本发明 中使用的分子包括与相同的单链分子的另一区域或与另一核酸分子部 分互补(在整条连的长度上具有10%-50%的互补性)、实质上互补(在整 条链的长度上大于50%但是小于100%互补)或完全互补的区域或另外 的链。因此，核酸可包括这样的分子，其包含一个或多个互补或自我互 补链或包含分子的特定序列的“互补物”。例如，前体miRNA可具有自 我互补区域，其与本发明的miRNA探针至多100%互补，可以与它们 的靶标至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% 互补。

如本文使用的术语“其组合”是指术语前所列项目的所有排列和组 合。例如“A、B、C或其组合”意思包括至少下列之一：A,B,C,AB,AC, BC或ABC，如果顺序在特定的情境下具有重要意义，则还包括BA,CA, CB,ACB,CBA,BCA,BAC或CAB。

除非另有指明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常 见的术语的定义可以见Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford  University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al.(eds.),The  Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(ed.),Molecular  Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了促进阅读本公开的各个实施方式，提供了特定术语的下列解 释：

辅助治疗：用于与主要治疗组合以改善主要治疗的效果的治疗。

临床结果：是指患者在接受针对疾病或病症的治疗之后或不进行治 疗的情况下的健康状况。临床结果包括但不限于：生存时间的增加，生 存时间的减少，生存机会的增加，死亡风险的增加，生存，无疾病生存， 慢性疾病，转移，晚期或攻击性疾病，疾病复发，死亡，以及对于治疗 的有利或差的应答。

对照：“对照”是指用于与实验样品例如获自患者的肿瘤样品比较的 样品或标准物。

细胞因子：由多种造血和非造血细胞产生的影响其它细胞的行为的 蛋白。细胞因子对于先天性和获得性免疫应答都具有重要意义。

存活的减少：如本文使用的“存活的减少”是指患者生存时间的减 少，或患者死亡风险的增加。

检测表达水平：例如，“检测miR或miRNA表达的水平”是指定量 样品中存在的miR或miRNA的量。检测特定miR或任何微小RNA的 表达可通过使用本领域已知的或本文描述的任何方法来进行，例如 qRT-PCR。检测miR的表达包括检测成熟形式的miRNA或与miRNA 表达相关的前体形式的表达。通常而言，miRNA检测方法包括序列特 异性检测，例如通过RT-PCR。miR特异性引物和探针可使用前体和成 熟miR核酸序列来设计，其是本领域已知的并在本文中以SEQ ID NO 提供。

微小RNA(miRNA)：调节基因表达的单链RNA分子。微小RNA 一般长度是21-23个核苷酸。微小RNA是从被称作pri-miRNA的初级 转录物加工为被称作前体(pre)-miRNA的短的茎环结构，最后加工为功 能性的成熟的微小RNA。成熟的微小RNA分子是与一个或多个信使 RNA分子部分互补的，它们的主要功能是下调基因表达。微小RNA通 过RNAi途径调节基因表达。

miR表达：如本文使用的“低miR表达”和“高miR表达”是相关的 术语，是指样品中的miRNA的水平。在一些实施方式中，通过比较一 组对照样品和测试样品中的miRNA水平来确定低和高miR表达。然后 可以基于样品中的miR的表达是高于(高)还是低于(低)平均或中值miR 表达水平而为各个样品分配低和高表达。对于个体样品，可通过将样品 与对照或已知具有高或低表达的参考样品进行比较或与标准值进行比 较来确定高或低miR表达。低和高miR表达可包括前体或成熟形式 miRNA或二者的表达。

患者：如本文使用的术语“患者”包括人和非人动物。用于治疗的优 选患者是人。“患者”和“受试者”在本文中可相互替换地使用。

药学上可接受的载体：用于本公开中的药学上可接受的载体(介质) 是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin, Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)描述了适合于药 学递送一种或多种治疗化合物、分子或试剂的组合物和制剂。

一般地，载体的性质将取决于所采用的具体施用途径。例如，胃肠 外制剂通常包括可注射液体，其包括药学和生理上可接受的液体，例如 水、生理盐水、缓冲的盐溶液，水性葡萄糖，甘油等，作为介质。对于 固体组合物(例如，粉末、丸、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载 体可包括例如，药物级别的甘露糖、甘油、淀粉或硬脂酸镁。除了生物 中性载体之外，待施用的药物组合物可包含少量的非毒性辅佐性物质， 例如润湿剂或乳化剂，防腐剂，和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖 醇酐单月桂酸酯。

预防、治疗或缓解疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发生。“治 疗”是指，在疾病或病理状况的迹象或症状开始出现之后，缓解其的治 疗性干预。“缓解”是指减少疾病的迹象或症状的次数或严重性。

筛选：如本文使用的“筛选”是指用于评价和鉴定影响疾病的候选试 剂的过程。微小RNA的表达可使用本领域已知的和本文描述的多种技 术来定量，例如通过微阵列分析或通过qRT-PCR。

小分子：这样的分子，通常具有小于大约1000道尔顿的分子量， 或在一些实施方式中，具有小于大约500道尔顿的分子量，其中该分子 能够改变(在某种可测程度上)靶分子的活性。

治疗：包括诊断和治疗的一般性术语。

治疗剂：当正确地施用至受试者时，能够诱导期望的治疗或预防效 应的化学化合物、小分子或其它组合物，例如反义化合物，抗体，蛋白 酶抑制剂，激素，趋化因子或细胞因子。

如本文使用的“候选试剂”是所选择的用于筛选以确定其是否作为 治疗剂发挥作用的化合物。“温育”包括使试剂与细胞或组织接触足够的 时间。“接触”包括将固体或液体形式的试剂与细胞或组织温育。使用试 剂“处理”细胞或组织包括将该试剂与细胞或组织接触。

治疗有效量：足以在以试剂进行处理的受试者或细胞中实现期望效 应的制定的药物或治疗剂的量。试剂的有效量将取决于多个因素，包括 但不限于被治疗的受试者，和治疗成分的施用方式。

在本发明方法的一些实施方式中，使用对照是理想的。在该方面， 对照可以是获自相同患者的非癌性组织样品，或获自健康受试者例如健 康组织供体的组织样品。在另一例子中，对照是从历史值计算而来的标 准物。肿瘤样品和非癌性组织样品可根据本领域已知的任何方法来获 得。例如，肿瘤和非癌性样品可获自经历了切除的癌症患者，或者可使 用皮下注射针头通过提取获得，通过微解剖，或通过激光捕获来获得。 对照(非癌性)样品可获自例如尸体供者或来自健康供体。

在一些实施方式中，筛选包括将候选试剂与细胞接触。细胞可以是 获自患者的原代细胞，或者细胞可以是永生化细胞或转化的细胞。

候选试剂可以是任何类型的试剂，例如蛋白、肽、小分子、抗体或 核酸。在一些实施方式中，候选试剂是细胞因子。在一些实施方式中， 候选试剂是小分子。筛选包括高通量筛选和筛选单个或一小组候选试 剂。

微小RNA检测

在本文的一些方法中，理想的是鉴定样品中存在的miRNA。

前体微小RNA(pre-miRNA)和成熟miRNA的序列是公众可获得 的，例如通过miRBase数据库，可通过Sanger Institute(see  Griffiths-Jones et al.,Nucleic Acids Res.36:D154-D158,2008; Griffiths-Jones et al.,Nucleic Acids Res.34:D140-D144,2006;and  Griffiths-Jones,Nucleic Acids Res.32:D109-D111,2004)在线获得。本文 提供了目前公开的优选的家族成员的前体和成熟形式的序列。

RNA表达的检测和定量可通过本领域熟知的多种方法中的任一种 来进行(见，例如美国专利申请公开号2006/0211000和2007/0299030， 通过引用方式并入本文)，并且如下文所描述。使用RNA家族成员的已 知序列，可以视情况设计用于下文描述的检测方法的特定探针和引物。

在一些情况下，RNA检测方法需要从样品、例如细胞或组织样品 分离核酸。核酸，包括RNA、具体为miRNA，可使用本领域已知的任 何合适的技术来分离。例如，基于苯酚的提取是用于分离RNA的常用 方法。基于苯酚的试剂包含变性剂和RNase抑制剂的组合，用于细胞和 组织破坏和随后从污染物中分离RNA。基于苯酚的分离程序可以回收 10-200个核苷酸范围内的RNA种类(例如前体和成熟miRNA，5S和5.8S 核糖体RNA(rRNA)，和U1小细胞核RNA(snRNA)。另外，提取程序 例如使用TRIZOL^TM或TRI REAGENT^TM的程序将纯化所有的RNA， 包括大的和小的，其是用于从包含miRNA和小干扰RNA(siRNA)的生 物样品中分离总RNA的有效方法。

在一些实施方式中，使用微阵列是理想的。微阵列是核酸、蛋白质、 小分子、细胞或其它能够平行分析复杂生物样品的物质的微观的、有序 的阵列。DNA阵列由不同的核酸探针组成，所述核酸探针被称作捕获 探针，其化学地附着于固体基质，所述基质可以是微芯片、载玻片或微 球体大小的珠子。微阵列可用于例如同时测定大量的信使RNA(mRNA) 和/或miRNA的表达水平。

微阵列可使用多种技术来制造，包括使用细琢笔印至载玻片上，使 用预制的掩膜板（mask）进行的照相平版印刷术，使用动态微镜装置进 行的照相平版印刷术，喷墨打印或在微电极阵列上进行的电化学。

miRNA的微阵列分析，可根据例如本领域已知的任何方法来进行 (虽然这些程序可以以修改的形式用于任何RNA分析)(见，例如，PCT 公开号WO 2008/054828;Ye et al.,Nat.Med.9(4):416-423,2003;Calin et al.,N.Engl.J.Med.353(17):1793-1801,2005；各自通过引用方式并入 本文)。在一个实例中，从细胞或组织样品中提取RNA，使用变性的聚 丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA中对于小RNA(18-26个核苷酸的RNA)进 行大小选择。将寡核苷酸接头连接于小RNA的5’和3’末端，得到的连 接产物用作RT-PCR反应的模板，进行10个扩增循环。正义链PCR引 物具有连接至其5’末端的荧光团，从而荧光地标记PCR产物的正义链。 使PCR产物变性，然后与微阵列杂交。PCR产物被称作靶核酸，其与 阵列上的对应的miRNA捕获探针序列互补，将通过碱基配对与斑点杂 交，在所述斑点处固定了捕获探针。当使用微阵列激光扫描仪激发时， 斑点将发荧光。然后就特定miRNA的拷贝数，使用多个阳性和阴性对 照和阵列数据归一化方法来测评每个斑点的荧光强度，这将产生特定 miRNA的表达水平的测定。

在替代性方法中，直接使用从细胞或组织样品提取的包含小RNA 级份(包括miRNA)的总RNA，不对小RNA进行大小选择，使用T4RNA 连接酶或荧光标记的短RNA接头对3’末端进行标记。通过在30°C温 育2小时来标记RNA样品，然后在80°C热灭活T4RNA连接酶5分 钟。互补于阵列上的对应miRNA捕获探针序列的荧光标记的miRNA 将通过碱基配对与斑点杂交，在所述斑点处固定了捕获探针。如上文所 述进行微阵列扫描和数据处理。

有几种类型的微阵列可以利用，包括斑点化的寡核苷酸微阵列，预 制的寡核苷酸微阵列和斑点化的长寡核苷酸阵列。在斑点化的寡核苷酸 微阵列中，捕获探针是互补于miRNA序列的寡核苷酸。这种类型的阵 列通常与经两种不同的荧光团标记的、来自待比较的两个样品(例如非癌 性组织和癌性或样品组织)的经大小选择的小RNA的扩增的PCR产物 杂交。或者，从两个样品中提取包含小RNA级份(包括miRNA)的总 RNA，不对小RNA进行大小选择，使用T4RNA连接酶和以两种不同 的荧光团标记的短RNA接头对3’末端进行标记。然后将样品混合并与 单一微阵列进行杂交，虽然扫描该微阵列，使得在一个阵列中可视化上 调和下调的miRNA基因。

在预制的寡核苷酸微阵列或单通道微阵列中，将探针设计为与已知 或预测的miRNA的序列相匹配。有覆盖完整基因组的商业上可获得的 设计(例如，来自Affymetrix或Agilent)。这些微阵列提供基因表达的 绝对值的估算，所以，两种条件下的比较需要使用两个单独的微阵列。

斑点化的寡核苷酸阵列由50-mer至70-mer的寡核苷酸捕获探针组 成，通过喷墨或或自动化打印产生。短的寡核苷酸阵列由20-mer至 25-mer的寡核苷酸探针组成，通过照相平版印刷术合成(Affymetrix)或 通过自动化打印来产生。

在一些实施方式中，使用定量RT-PCR是理想的。定量RT-PCR 是聚合酶链式反应的改进，其用于迅速测定聚合酶链式反应的产物的 量。qRT-PCR普遍用于测定基因序列、例如miR是否存在于样品中， 如果存在，测定其在样品中的拷贝数。任何能够测定核酸分子、包括 miRNA表达的PCR方法，都落在本公开内容的范围内。本领域已知有 qRT-PCR方法的几种变体，以下描述其中三种。

用于定量聚合酶链式反应的方法包括但不限于，通过琼脂糖凝胶电 泳，使用SYBR Green(双链DNA染料)，和使用荧光报告探针。后两 种可以实时分析。

使用琼脂糖凝胶电泳，制备未知样品和已知浓度的靶DNA的类似 大小的部分的已知样品，以用于扩增。在相同的条件下(优选使用相同的 引物，或至少相似退火温度的引物)进行两个反应，持续相同的时间。琼 脂糖凝胶电泳用于将反应产物与其原始DNA和过量引物分离。测定已 知和未知样品的相对量以确定未知的量。

SYBR Green染料的使用相对于琼脂糖凝胶方法更精确，并且可以 实时给出结果。DNA结合染料结合所有新合成的双链DNA，荧光强度 的增加被测定，由此允许测定最初的浓度。然而，SYBR Green将标记 所有的双链DNA，包括任何未预期的PCR产物以及引物二聚体，导致 潜在的复杂性和假象。常规地制备反应，加入荧光双链DNA染料。进 行反应，监测荧光的水平(染料仅当与双链DNA结合时才发荧光)。通过 参考标准样品或标准曲线，可以测定PCR中的双链DNA浓度。

荧光报告探针方法使用序列特异性的基于核酸的探针，以便仅定量 探针序列而不是所有的双链DNA。通常使用基于DNA的探针进行，荧 光报告分子和猝灭剂处于邻近位置(所谓的双标记探针)。报告分子与猝 灭剂的紧密靠近阻止其发荧光；仅当探针断裂时荧光被检测到。该过程 依赖于涉及的聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性。

通过加入双标记探针制备实时定量PCR反应。在双链DNA模板变 性之后，探针能够结合于模板DNA的目标区域中的它的互补序列。当 PCR反应混合物被加热以激活聚合酶时，聚合酶开始合成引发的单链模 板DNA的互补链。随着聚合的持续，其到达结合于其互补序列的探针， 然后，由于聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性而使探针被水解，从而分离 荧光报告分子和猝灭剂分子。这引起荧光的增强，该增强被检出。在实 时PCR反应的热循环中，荧光的增加(从每个PCR循环中水解的双标 记的探针释放)被监测，这允许精确测定最终DNA的量，并由此测定最 初DNA的量。

在一些实施方式中，原位杂交的使用是理想的。原位杂交(ISH)使 用核酸杂交技术并外推至单细胞水平，与细胞化学、免疫细胞化学和免 疫组织化学联合，允许维持待维持和待鉴定的细胞标志物的形态和鉴 定，并允许定位序列至群体例如组织和血液样品中的特定细胞。ISH是 一种使用互补核酸的杂交，其定位组织的部分或区段中的一种或多种特 异性核酸序列(原位)，或者，如果组织足够小，则定位整个组织中的一 种或多种特异性核酸序列(全标本包埋ISH)。RNA ISH可用于测定组 织中的表达样式，例如miRNA的表达。

处理样品细胞或组织以增加它们的通透性以允许探针，例如 miRNA特异性探针进入细胞。将探针加入至经处理的细胞中，允许在 适当温度杂交，将多余的探针洗掉。使用放射活性、荧光或抗原性标签 标记互补探针，从而可以使用放射自显影、荧光显微镜或免疫测定法测 定组织中的探针的位置和量。样品可以是本文描述的任何样品，例如非 癌性或癌性组织样品。由于miR-155家族成员的序列是已知的，所以可 以相应地设计miR-155探针，使得探针特异性结合miR-155。

在一些实施方式中，使用原位PCR是理想的。原位PCR是在ISH 之前的基于PCR的靶核酸序列的扩增。为了检测RNA，引入细胞内逆 转录步骤以从RNA模板产生互补性DNA，然后进行原位PCR。这使 得能够检测低拷贝数的RNA序列。

在原位PCR之前，将细胞或组织样品固定并通透化以保持形状并 允许PCR试剂的可靠近细胞内的待扩增的序列。然后在置于悬浮液中 的完整细胞内，或直接在细胞离心制备物或载玻片上的组织切片中进行 靶序列的PCR扩增。在前一种方法中，使用常规的热循环仪使悬浮于 PCR反应混合物中的固定的细胞进行热循环。在PCR之后，将细胞离 心至载玻片上，通过ISH或免疫组织化学使细胞内的PCR产物可视化。 载玻片上的原位PCR这样进行：在盖玻片下，以PCR混合物覆盖样品， 然后将其封闭以防止反应混合物蒸发。通过将载玻片直接置于常规加热 块顶部或特别设计的热循环仪上或通过使用热循环烤箱来进行热循环。

细胞内PCR产物的检测一般是通过两种不同技术之一来进行：使 用PCR产物特异性探针通过ISH的间接原位PCR，或通过直接检测标 记的核苷酸(例如地高辛-11-dUTP、荧光素-dUTP、3H-CTP或生物素 -16-dUTP)(其在热循环中已经被掺入PCR产物中)、不进行ISH的直接 原位PCR。

使用差别化表达的miR和miRNA作为预后的预测性标志物和用于 鉴定治疗剂。本文公开了miR-155的某些表达样式联同状态指示物是某 些患者的生存预后的预测物。如本文使用的“差的预后”一般是指生存的 减少，或换言之，死亡风险的增加或存活时间的减少。差的预后也可以 指疾病的严重性的增加，例如癌症向其它器官的扩散(转移)的增加。在 一个实施方式中，各自的标志物显示出表达相对于对照至少1.5倍增加 或减少。在其它实施方式中，差的预后由相对于野生型肿瘤对照图的标 志物的至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍或至少4倍的增 加或降低来指示。

筛选候选试剂以鉴定用于治疗疾病的治疗剂的方法是本领域熟知 的。检测RNA和蛋白质表达水平的方法是本领域已知的，并且在本文 中公开，例如但不限于，微阵列分析，RT-PCR(包括qRT-PCR)，原位 杂交，原位PCR，和Northern印迹分析。在一个实施方式中，筛选包 括高通量筛选。在另一实施方式中，单个地筛选候选试剂。

候选试剂可以是任何类型的分子，例如但不限于核酸分子、蛋白质、 肽、抗体、脂质、小分子、化学物质、细胞因子、趋化因子、激素或可 以直接或间接改变癌症疾病状态的任何其它类型的分子。

通常而言，细胞内的内源基因，miRNA或mRNA被调节。在具体 实施方式中，核酸序列包括在核酸序列上与表1所列的一种或多种 miRNA序列至少70,75,80,85,90,95或100%同一的至少一个区段。内 源基因，miRNA或mRNA的表达或加工的调节可通过mRNA的加工 的调节来进行，此类加工包括细胞内的转录、转运和/或翻译。调节也可 通过抑制或加强细胞、组织或器官内的miRNA活性来进行。此类加工 可以影响编码的产物的表达或mRNA的稳定性。在其它实施方式中， 核酸序列可以包括修饰的核酸序列。在一些方面，一种或多种miRNA 序列可包括或包含修饰的核碱基或核酸序列。

应理解：在本发明的方法中，可以向细胞或其它生物材料例如生物 体(包括患者)提供miRNA或对应于特定miRNA的miRNA分子，其是 通过向细胞或生物体施用一旦处于细胞内时则以对应的miRNA发挥作 用的核酸分子。向细胞提供的分子的形式可以不是一旦处于细胞内时则 以miRNA发挥作用的形式。因此，在一些实施方式中考虑到向生物材 料提供合成的miRNA或非合成的miRNA，例如，在靠近细胞miRNA 加工机构后被加工成成熟和活性的miRNA的那些。在一些实施方式中， 特别考虑到向生物材料提供的miRNA分子不是成熟的miRNA分子， 而是在靠近miRNA加工机构之后可以被加工为成熟miRNA的核酸分 子。在miRNA的上下文中，术语“非合成的”意思是miRNA不是合成 的，如本文所定义。此外，考虑到在本发明的涉及使用合成的miRNA 的实施方式中，对应的非合成的miRNA的使用也被认为是本发明的方 面，反之亦然。应理解：术语“提供”试剂包括将试剂“施用”至患者。

在一些实施方式中，方法还包括靶向细胞或生物体中的miRNA以 调节。术语“靶向miRNA以调节”意思是利用本发明的核酸以调节所选 择的miRNA。在一些实施方式中，通过使用合成的或非合成的对应于 被靶向的miRNA的miRNA来进行调节，其有效地向细胞或生物体提 供靶向的miRNA(正调节)。在其它实施方式中，使用miRNA抑制剂来 进行调节，其有效地抑制细胞或生物体内的靶向的miRNA(负调节)。

在一些实施方式中，被靶向以调节的miRNA是影响疾病、病况或 路径的miRNA。在一些实施方式中，miRNA被靶向是因为可通过负调 节所述被靶向的miRNA来提供治疗。在其它实施方式中，miRNA被靶 向是因为可通过所述被靶向的miRNA的正调节来提供治疗。

在本发明的一些方法中，还有另外的步骤：将所选择的miRNA调 节剂施用至需要治疗(与靶向的miRNA的调节有关)或需要本文讨论的 生理或生物结果(例如就特定的细胞路径或结果而言，例如细胞存活性的 降低)的细胞、组织、器官或生物体(合成“生物材料”)。因此，在本发明 的一些方法中，有鉴定可被提供miRNA调节剂的需要治疗的患者的步 骤。考虑到在一些实施方式中可使用有效量的miRNA调节剂。在具体 的实施方式中，对于生物材料有被赋予的的治疗上的益处，其中“治疗 上的益处”是指一种或多种病况或与疾病或病况相关的症状的改善，或 疾病的预后、持续性或状态的改善。考虑到治疗上的益处包括但不限于： 疼痛的减少，发病率的降低，症状的减少。例如，就癌症而言，考虑到 治疗上的益处可以是肿瘤生长的抑制、转移的预防、转移数目的减少、 癌细胞增殖的抑制、癌细胞中癌细胞死亡的诱导、靠近癌细胞的血管生 成的抑制、癌细胞的细胞凋亡的诱导、疼痛的减少、复发风险的降低、 癌细胞中化学或放射敏感性的诱导、生命的延长、和/或与癌症直接或间 接相关的死亡的延迟。

此外，考虑到可以作为治疗法的一部分向患者提供miRNA组合物， 与传统的治疗法或预防剂联合。此外，考虑到治疗法上下文中讨论的任 何方法可以预防性地应用，特别是在被鉴定为潜在地需要治疗法或处于 需要该治疗法的病况或疾病的风险的患者中。

另外，本发明的方法涉及使用对应于miRNA的一种或多种核酸和 治疗药物。所述核酸可增强所述药物的效用或功效，减少任何副作用或 毒性，改变其生物可获得性，和/或减少所需的剂量或频率。在一些实施 方式中，治疗药物是癌症治疗剂。因此，在一些实施方式中，提供了治 疗患者中的癌症的方法，包括向该患者施用癌症治疗剂和有效量的至少 一种改善该癌症治疗剂的功效或保护非癌细胞的miRNA分子。癌症治 疗法还包括与基于化学和放射的多种组合治疗法。组合化疗包括但不限 于，例如，贝伐珠单抗、顺铂(CDDP)、卡铂、EGFR抑制剂(吉非替尼 和西妥昔单抗)、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、COX-2抑制剂 (例如塞来考昔)异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、硝基脲、 更生霉素、柔红霉素、多柔比星(亚德里亚霉素)、博来霉素、光辉霉素、 丝裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、 泰素、泰索帝、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂、 5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤，或前述项的任何类似物或 衍生物变体。

一般地，可以给予miRNA的抑制剂以实现与给予对应于成熟 miRNA的核酸分子时相反的效应。类似地，可以给予对应于成熟miRNA 的核酸分子以实现与给予miRNA的抑制剂时相反的效应。例如，可以 向细胞提供增加细胞增殖的miRNA分子以增加增殖，或者，可以向细 胞提供此类分子的抑制剂以减少细胞增殖。在使用本文公开的不同 miRNA分子和miRNA抑制剂观察到的不同生理效应的情境中，本发明 涉及这些实施方式。这些包括但不限于下列生理效应：增加和减少细胞 增殖，增加或减少细胞凋亡，增加转化，增加或减少细胞存活性，减少 或增加活细胞的数目，和增加或减少处于细胞周期的特定阶段的细胞的 数目。本发明的方法一般被考虑到包括提供或导入对应于一种或多种不 同的miRNA分子的一种或多种不同的核酸分子。考虑到可以提供或导 入下列数目，至少下列数目，或至多下列数目的不同的核酸分子：1，2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65, 66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85, 86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100，或其中任意范围。 这也适用于可以向细胞提供或导入的不同的miRNA分子的数目。

miRNA-155

由于MMR功能失调而造成的突变子表型诱导另外的促进癌症进展 的基因突变的获得。除了种系突变以外，还有多种导致核心MMR蛋白 的减少或缺失的表达的病理性事件，包括启动子甲基化和减少的组蛋白 乙酰化，以及微环境因素例如炎症和低氧。本发明的结果提供了下列发 现：miR-155在这种多因素调节中发挥作用，其是通过引起核心MMR 异二聚体蛋白MSH2-MSH6和MLH1-PMS2的下调。miR-155对于这 些基本MMR成分的同时抑制导致突变子表型。

不希望被任何特定理论所限制，miR-155对于整个MMR系统所显 示出的非凡的效应可能是两个不同现象的结果。第一，MMR蛋白稳定 性与它们形成异二聚体的能力相关；因此，hMSH2和hMLH1蛋白的 丧失导致它们各自的异二聚体复合物蛋白的去稳定化。第二，miR-155 似乎靶向核心MMR蛋白的下调。综合起来，这些调节性和稳定性改变 导致突变率的显著增大。本发明人不能排除下列可能性：miR-155影响 其它相关的DNA修复蛋白，通过不相关的基因组过程增强MMR缺陷 的表型效应。

miR-155造成的MMR蛋白的不完整抑制不是癌症中的肿瘤抑制基 因所特有的。已经表明结肠腺瘤性息肉(APC)基因的一个等位基因的表 达的部分(50%)减少与结肠直肠癌的产生相关。此外，已经表明转化生 长因子β受体1(TGFBR1)基因的单一等位基因的减少的表达与CRC相 关。最近提出微小RNA作为涉及等位基因和基因表达调节的反式作用 元件。本发明人的结果强烈支持miRNA在MMR基因的非孟德尔调节 中的作用。

组织特异性和靶序列中的可能的多态性使得miRNA的调节的复杂 性增加。例如，已经表明hMLH1的3’UTR中的获得的突变与患有急 性骨髓性白血病的患者中的疾病复发相关。本发明人不能排除下列可能 性：miR-155的过表达与MMR靶基因的3’UTR中的获得的突变二者 联合起来进一步贡献于这些所选择的患者中的MSI的发展。此外，在 MSI肿瘤的特定子集例如与炎性肠病相关的CRC和与HIV感染相关的 非霍奇金淋巴瘤中，MMR基因的良好确定的突变和/或表观遗传学失活 较不常见。本发明人的研究显示了核心MMR基因的下调，这提示了这 些癌症的潜在的替代性病理发生机制可能是miR-155的过表达。

虽然本发明人观察到miR-155与CRC中MMR蛋白的表达之间的 相反关系，但是，并不是所有的具有增加的miR-155表达的肿瘤都具有 MSI的特征。在人类细胞中，有多种因素可能解释miR-155对于核心 MMR蛋白的不同调节，包括涉及miRNA和基因表达的精细调控的阈 值表达效应或原始环(savage loop)。

具有MMR缺陷性肿瘤的患者很大程度上具有良好预后的特征，但 是与具有MMR活性的肿瘤的患者相比，在5-氟尿嘧啶辅助化疗之后具 有较低的生存优势。miR-155在下调核心MMR蛋白中的贡献提示 miR-155可能是癌症患者的预后和治疗中的重要的分层因素。miR-155 的表达可以是MSI肿瘤的病因学的另外分析测试，其中标准测试不提 供结论性的诊断。

在本公开内容的通篇，通过辨别引用的方式引用了多篇公开物、专 利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开 内容在此通过引用方式并入本公开内容，以更加完整地描述本发明所属 技术领域的现状。

本发明通过下列实施方式进一步确定，其中所有的分数和百分率是 按重量，温度是摄氏度，除非另有指明。应理解，这些实施例指明了本 发明的优选实施方式，但是仅是通过举例来给出。从以上讨论和这些实 施方式，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，不脱离本发明的 精神和范围，本领域技术人员能够进行本发明的多种改变和修饰，以使 其适用于多种用途和条件。

实施例

实施例1

所用的材料和方法

细胞培养和转染

Colo-320DM、HCT-116和DLD-1结肠直肠癌(CRC)细胞(美国典 型培养物保藏中心ATCC Manassas,VA)培养于RPMI 1640(Gibco, Carlsbad,CA)中，MV4-11B骨髓单核细胞白血病细胞(ATCC Manassas, VA)和装配细胞293TN(System Biosciences,Mountain View,CA)生长 于DMEM(Gibco,Carlsbad,CA)。所有的细胞均补充10%胎牛血清 (Sigma,St.Louis,MO)和抗生素。定期检查并在功能性实验之前检查细 胞的支原体污染情况，总是为阴性。根据生产商的说明书，使用 Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)在6孔板中转染细胞。对 于过表达研究，从Ambion(Austin,TX)购买特异性miRNA或对照前体 寡核苷酸，以100nM使用。对于沉默实验，使用100nM的miRCURY  LNA^TM抗-miR-155或对照miRCURY敲低探针(Exiqon,Vedbaek, Denmark)。在48小时后，通过如下文描述的定量实时PCR验证miRNA 的表达。编码全长MLH1和MSH6cDNA的质粒购自Origene。使用 QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene,San Diego,CA)制备针对 miR-155种子区的MLH1和MSH6突变体。将0.3x 10⁶个细胞接种于6 孔板，在24小时后使用1ug编码WT或突变体cDNA的编码质粒和1ug miR-155编码载体或空载体转染细胞，36小时后收获细胞并裂解，通过 Western印迹分析。

萤光素酶测定

将hMLH1、hMSH2和hMSH6的3’-UTR和/或CDS中的预测的 miRNA结合位点克隆于萤火虫萤光素酶基因的下游，如下所述。使用 特异性引物(下表2)通过PCR扩增来自SW-480细胞的互补性DNA (cDNA)。

然后使用SpeI和SacII(New England Biolabs Ipswich,MA)消化产 物并插入pGL3对照载体(Promega,Madison,WI)，所述载体之前经过 修饰以使其在萤火虫萤光素酶基因的终止密码子的紧临下游携带SpeI 和SacII位点。对于每个单独基因构建了具有突变的miRNA识别序列 的报告子构建体(MUT-155)。对于hMSH23’UTR和hMLH13’UTR结 合位点，使用QuikChange定点诱变试剂盒删除互补于miR-155的种子 的序列。对于所有其它的miR-155种子区，使用定位于预测的miRNA 结合位点的上游或下游的引物获得突变体构建体，以排除种子区互补性 位点。引物序列见表2。

在12孔板中使用1μgpGL3萤火虫萤光素酶报告子对照载体、0.1 μg phRL-SV40对照载体(Promega,Madison,WI)和100nM miRNA或 对照前体共转染Colo-320DM细胞。在转染后24小时使用Dual  Luciferase Assay(Promega)连续测定萤火虫和海肾萤光素酶活性。

Western印迹

对于免疫印迹分析，使用冰冷的细胞裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂 (Cell Signaling Technology Inc.Danvers,MA)裂解细胞。溶解等量的蛋 白并与4X SDS-PAGE样品缓冲液混合，在4%–20%和7.5%线性梯度 Tris-HCL Criterion Precast Gels(Bio-Rad)中跑电泳，并转移至硝酸纤 维素或PVDF膜(Bio-Rad)。使用Tris缓冲的盐水(pH 7.4，含有0.05% Tween 20)中的5%的脱脂牛奶封闭该膜，根据生产商的说明书使用一抗 和二抗温育。使用下列一抗：小鼠单克隆抗-MSH2(1:200,Invitrogen)， 小鼠单克隆抗-MSH6(1:500,BD Biosciences San Jose,CA)，小鼠单克隆 抗-MLH1(1:200,Invitrogen)，兔子多克隆抗-MLH1(1:200，用于小鼠 实验SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)，小鼠单克隆抗-肌动蛋 白(1:5000,Sigma)，小鼠单克隆抗-GAPDH(1:1000,SantaCruz  Biotechnology)。针对MLH1和MSH6的N末端一抗(1/500Sigma)。

用于成熟miRNA和基因的实时PCR

使用Trizol(Invitrogen)分离总RNA。通过单管TaqMan  MicroRNA Assay测定成熟miRNA，通过Gene Expression Assay，使 用下列探针测定目标mRNA的表达：hMLH1=Hs00979923m1, hMSH2=Hs00953523_m1,hMSH6=Hs00943001_m1(Applied  Biosystems,Foster City,CA)。将miRNA的表达针对人中的RNU44和 RNU48以及针对小鼠细胞中的snoR-135进行归一化。基因表达针对纽 蛋白(vinculin)进行归一化。在GeneAmp PCR 9700Thermocycler (Applied Biosystems)中进行所有的逆转录酶(RT)反应，包括无模板对照 和RT负对照。除非另有指明，否则每个样品按照一式三份进行测定。

Northern印迹

对于成熟miRNA的检测，按照之前的描述进行丙烯酰胺Northern 印迹。

过表达miR-155的稳定克隆的产生

使用含有在两个不同启动子(System Biosciences,Mountain View, CA)控制下的全长miR-155和GFP基因的 pCDH-CMV-MCS-EF1-miRNA表达质粒稳定感染Colo-320DM细胞。 空载体用作对照。使用pPACKH1Lentivector Packaging Plasmid Mix (System Biosciences)在293-TN装配细胞系中装配pre-miR-155表达和 对照构建体。使用PEG-it^TM Virus Precipitation Solution浓缩病毒，使 用UltraRapid Lentiviral Titer Kit(System Biosciences)分析效价。通过 FACS分析(FACSC alibur,Becton Dickinson Immunocytometry  Systems)选择感染的细胞。通过荧光显微镜确认感染效率大于90%，并 进一步通过针对miR-155表达的实时PCR进行验证。

组织学测定

根据WHO的标准确定肿瘤类型(腺癌和粘蛋白腺癌)和分化的级 别。具有主要为固体生长模式和轻度或中度核多形性的癌被分类为髓样 腺癌3。

免疫组化分析

根据之前描述的分析程序进行MLH1和PMS2表达的免疫组织化 学分析。显示完全丧失细胞核MLH1或MSH2表达的肿瘤被分类为 MLH1阴性或MSH2阴性。正常上皮细胞、淋巴细胞和间质细胞的细 胞核免疫染色作为每个病例中的内部阳性对照。所有的肿瘤由两位病理 学家独立测评，他们不知晓临床数据和MSI状态。

组织收集

经伦理委员会批准之后，从Istituto Scientifico Romagnolo per lo  Studio e la Cura dei Tumori,Meldola,Italy的83例连续CRC病例收集 肿瘤和正常邻近组织的新鲜冷冻组织。根据上文描述提取细胞裂解物进 行蛋白和RNA提取。

激光捕获显微解剖(LCM)

在OSU Laser Capture Microdissection and Image Analysis Core  Facility进行LCM。

MLH1和PMS2测序

扩增并测序来自CRC患者的DNA。使用3730DNA Analyzer和 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(3.1版本)进行测序 分析。使用数据收集软件v3.0和测序分析软件v5.2。经过机构伦理委员 会批准之后收集患者信息和组织。

实施例2

转染

通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)转染 Colo-320DM、HCT-116和DLD1细胞，根据生产商的说明书，由System  Biosciences(Mountain View,CA)产生用于miR-155过表达的MV4-11 慢病毒载体和空载体。使用诊断引物通过基因分型分析测定微卫星不稳 定性。测序来自MSI患者的基因组DNA。统计学分析：结果表达为平 均值±标准误差(S.E.M)，除非另有指明。使用双尾Student’s t检验进行 组间比较。当p小于0.05时认为有显著性。使用Graphpad Prism v5.0 (Graphpad Software Inc.)分析用于Pearson校正。

实施例3

hMLH1、hMSH2和hMSH6是miR-155的靶标

本发明人使用计算机预测模型来鉴定核心MMR基因的mRNA中 的miR-155的潜在结合位点。使用RNAhybrid(BiBiServ,Germany; NCBI NM_000249.2)发现hMLH1中的2个推测的位点：1个在3’-UTR 中，另一个在(NCBI NM_000249.2)的编码序列(CDS)中；使用 TargetScan(Whitehead Institute,MIT;NCBI NM_000251.1)发现 hMSH2的3’-UTR中的1个位点；使用RNAhybrid(BiBiServ,Germany; NCBI NM_000179.2)发现hMSH6的CDS中的1个位点(图1A；图6)。

作为功能筛选，本发明人将编码区和3’-区(包括预测的MLH1、 MSH2或MSH6的miR-155种子区)亚克隆至萤光素酶基因的下游并记 录了萤光素酶蛋白活性。本发明人使用MMR活性的colo-320DM CRC 细胞用于这些研究，因为它们含有低的基础miR-155水平。使用萤光素 酶报告子构建体和使用miR-155前体(pre-miR-155)或对照前体 (pre-miR对照)转染Colo-320DM细胞。

本发明人观察到：在存在pre-miRNA-155的情况下，以含有MLH1、 MSH2或MSH6的miR-155种子区的构建体分别观察到37%、38%和 24%的萤光素酶活性降低(p<0.001；图1Bb；见每一个的WT)。当构 建体含有miR-155种子区的删除时，未观察到萤光素酶活性的变化(图 1B；对于每个构建体，见MUT-155)。有趣的是，hMLH1基因中的单 个miR-155结合位点的效应显示是加和性的(图1B；将hMLH1MUT155 3’-UTR和MUT-155CDS与WT进行比较)。

核糖体从CDS靶位点置换miRNA-RISC复合物

该过程导致微小RNA调节靶蛋白的失能。MLH1和MSH6都包含 CDS种子区(图1；图6)。

为了测定miRNA-155-RISC置换的可能性，本发明人使用含有相应 的全长cDNA(含有或不含miR-155前体)的哺乳动物表达载体共转染缺 乏MLH1的细胞系(HCT116)或缺乏MSH6的细胞系(DLD1)，并检测蛋 白表达(图7)。

本发明人删除了hMLH1和hMSH6cDNA中的CDS miR-155靶位 点，以测定表达是否受到miRNA-RISC核糖体置换的影响。CDS miR-155种子区的框内删除导致产生截短的hMLH1和hMSH6蛋白(图 7；160kD hMSH6的大小上的减小仅可在较长的凝胶运行中被检出)。 以miR-155表达载体共转染MMR cDNA导致hMLH1和hMSH6蛋白 的下调(图7；见hMLH1WT和hMSH6WT)。从cDNA删除CDS miR-155种子序列引起hMLH1的表达部分恢复(图7；见hMLH1MUT CDS)和hMSH6的表达完全恢复(图7；见hMSH6MUT)。hMLH1CDS 和3’-UTR种子序列的突变引起hMLH1蛋白表达完全恢复(图7；见 hMLH1双突变体)。这些结果定性地类似于含有来自hMLH1和hMSH6 的miR-155种子序列的基于萤光素酶的系统(图1B)，并且显示： miRNA-RISC核糖体置换在miR-155对于MMR蛋白的调节中不可能 是个问题。

在colo-320DM细胞中测定了miR-155对于内源MMR基因和蛋白 表达的影响(图2)。通过定量PCR(qPCR)，对于转染的colo-320DM细 胞测定出与乱序pre-miR对照相比的pre-miR-155的一致性增加(图 2A)。

本发明人发现：hMLH1、hMSH2和hMSH6的mRNA表达不受 pre-miR-155过表达的影响(图2B，比较白色和蓝色条柱)。相反，在以 pre-miR-155转染的细胞中，hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白分别减 少53±14%(p=0.02)、37±10%(p=0.01)和32±7.4%(p=0.004)(图 2C；左侧图板，比较右侧图板中的白色和蓝色条柱)。

为了确保本发明人能够检测mRNA表达的变化，本发明人在 colo-320DM细胞中进行了siRNA敲低研究(图2B和2C)。本发明人发 现了mRNA表达的siRNA MMR基因特异性降低，如所预期的那样(图 2B；左侧阴影、浅蓝色，右侧阴影条柱)。mRNA的减少翻译为对应的 MMR蛋白的减少(图2C；左侧阴影，浅蓝色，右侧阴影条柱)。此外， 本发明人发现hMSH6蛋白的稳定性与hMSH2蛋白的表达相关。这些 结果表明miR-155是通过翻译后抑制而发挥其对于MMR蛋白的最大影 响。

为了确认miR-155对于MMR蛋白的调节，本发明人检测了过表达 miR-155的MV4-11细胞(图8)。在这些研究中，使用序列特异性锁核酸 (LNA)修饰的寡核苷酸(其靶向miR-155敲低)(抗-miR-155；Ambion)以 及对照LNA抗-miRNA转染MV4-11细胞。通过qPCR观察到，当以 LNA抗-miR-155寡核苷酸转染时，相对于非特异性LNA抗-miR对照， miR-155降低至1/6.7(图1A)，通过Northern印迹分析确认(图6B)。

本发明人通过Western分析还观察到：在以LNA抗-miR-155转染 的MV4-11细胞中，相对于LNA抗-miR对照转染，hMLH1、hMSH2 和hMSH6蛋白的增加(图8)。与colo-320DM miR-155过表达数据结合 起来，这些结果说明细胞miRNA-155水平对于核心MMR蛋白的表达 具有直接影响。

实施例4

miR-155的过表达诱导突变子表型

为了测定miRA-155对于MMR调节的生物作用，本发明人使用了 慢病毒载体系统产生了过表达miR-155的Colo-320DM CRC细胞的稳 定克隆(图3)。本发明人发现：相对于表达空载体的细胞(Colo-空；图3B)， 在过表达miR-155的Colo-155DM细胞中(Colo-155)，MLH1、MSH2 和MSH6蛋白表达分别降低72%、42%和69%。本发明人还观察到 MSH6mRNA的减少(图3C)。由于不可能对于转录有直接效应，所以 这些结果显示：miR-155可能靶向影响从MSH6启动子的转录的其它调 节因子。

简单重复序列的长度变化(微卫星不稳定性或MSI)是MMR缺陷的 诊断指征。本发明人检测了过表达miR-155的Colo-320DM细胞中的 MSI(图3D)。检测了所有三个诊断(图3D)。这些结果显示miR-155过 表达诱导复制差错，这与减少的或缺失的核心MMR功能是一致的。

实施例5

miR-155表达与CRC组织中的hMLH1和hMSH2反相关

本发明人检测了含有70例非选择的CRC和5例良性肠损伤的组织 微阵列中的miR-155、MLH1和MSH2的表达。使用了共标记方法，其 中将LNA抗-miR-155或非特异性LNA抗-miR对照与针对hMLH1或 hMSH2的免疫组织化学(IHC)抗体组合。当分别在>15%或>5%的细胞 中检出时，miR-155和MMR蛋白表达被评为阳性(图9A和图9B)。

超过50%的CRC显示出miR-155的升高的表达(图9C)。分别在 28%和22%的CRC中观察到hMSH2和hMLH1表达的降低(图9C)。 miR-155与MSH2或MLH1的共表达显示出反相关，对于MSH2，r 值是-0.74(p<0.001)；对于MLH1，r值是-0.6(p<0.001)。在67%的CRC 组织中，miR-155不与hMSH2共表达；在50%的CRC组织中，miR-155 不与hMLH1共表达。当仅使用miR-155阳性CRC组织进行分析时， 对于hMLH1(p=0.0003)和hMSH2(p=0.001)仍然可见显著的反相关。在 具有大于50%的miR-155表达的组织的亚组中，仍然具有反相关，对 于MSH2，r值是-0.7(p<0.0002)；对于MLH1，r值是-0.55(p<0.005)。 有趣的是，在miRNA-155和“hMSH2或hMLH1之一”阳性的CRC组 织中，在同一癌巢中从未观察到共表达(图9A)。

本发明人检测了83例新鲜冷冻肿瘤队列(可获得其癌症和正常邻近 组织)中的miR-155和MMR蛋白的表达(图9B)。本发明人通过qPCR 分析检测了肿瘤和相关的正常组织，并且发现在18例样品中(22%)， miR-155的表达升高2倍以上。通过Western印迹测定了这18例样品 的肿瘤和相关正常组织中的hMLH1和MSH2蛋白的表达。在12例样 品中(67%)观察到hMLH1表达的明显下降，而在11例样品中(61%)观 察到hMSH2表达的明显下降(图9B)。

当miR-155的表达水平相对于相关的正常组织为小于3倍的增加 时，似乎发生对于MMR表达的不确定的影响的阈值(图9B；红色的线)。 一般地，miR-155表达高于该阈值时，显示出下调hMLH1和hMSH2 的表达。与组织阵列研究综合起来，这些结果强烈表明miR-155在人类 肿瘤中的过表达导致核心MMR蛋白hMLH1和hMSH2的下调。

实施例6

miR-155表达是MSI肿瘤中MMR失调的诱因

在核心MMR基因之一的两个等位基因都失活之后，获得MSI。在 LS/HNPCC携带者中，大多数突变被发现于hMSH2和hMLH1基因中。 导致LS/HNPCC患者中的MSI肿瘤的“第二命中”很大程度上是丧失异 质性(LOH)或未受影响的等位基因的体细胞突变的结果。在CRC中， LS/HNPCC导致2-5%的MSI肿瘤。大约10-15%的散发性CRC肿瘤 显示出很大程度上(90%)由于hMLH1启动子的双等位基因失活而造成 的MSI。在1066例CRC患者的非选择系列中，有135例(12.7%)被发 现显示MSI。在这些之中，23例(5.9%)被确定具有核心MMR基因之 一的种系突变，有106例(78.5%)被发现具有hMLH1启动子的甲基化。 大约5%的这些MSI肿瘤显示出至少一个核心MMR蛋白的表达丧失， 无明显的遗传或表观遗传诱因。

本发明人回顾性地检测了40例显示出MSI和至少hMLH1和 hPMS2的IHC表达丧失的CRC肿瘤。发现其中34例CRC肿瘤具有 hMLH1基因序列中的突变或hMLH1启动子的甲基化。在激光捕获显 微解剖肿瘤和邻近的正常组织之后，本发明人通过qPCR检测了6例样 本，其保留了足够用于miR-155表达分析的样品(表1)。

由于一份样本含有极少的组织，所以本发明人在原位和IHC分析 中检测了miR-155和hMLH1的表达(图5)。所有6例剩余的MSI肿瘤 显示出至少2倍的miR-155表达增加(相对于邻近的正常组织)(表1)。

miR-155在这些样品中的过表达不与肿瘤级别或阶段相关。3例样 品具有超过所述3倍阈值的miR-155的增加，其一般性地导致减少的 hMLH1和/或hMSH2表达。另外，CR78显示出在大于50%的肿瘤组 织中的miR-155的升高的表达和对应的hMLH1的表达丧失(图5A和 5B)。这些结果与下列结论一致：具有未知的MMR缺陷的MSI肿瘤可 能源于miR-155的过表达。

表1：MSI-H、MLH1/PMS2突变阴性和MLH1启动子甲基化阴性CRC的特征。临床病理学特 征：Adeno=腺癌NAS；tub-muc=粘蛋白成分<50%的腺癌；Muc=粘蛋白成分>50%的粘蛋白性腺 癌；medullary=髓样腺癌。miR-155倍数变化计算为：通过激光捕获显微解剖后的物质收集中的肿瘤 中的miR-155表达/邻近正常组织中的miR-155表达。

实施例7

治疗/预防方法和组合物

本发明提供了治疗和预防方法，其是通过向受试者施用有效量的本 发明的治疗剂，即单克隆(或多克隆)抗体、病毒载体、Tcl1模拟物或Tcl1 拮抗剂。在优选方面，治疗剂是实质上纯化的。受试者优选为动物，包 括但不限于动物例如牛、猪、鸡等，优选为不如，最优选为人。

多种递送系统是已知的并被用于施用本发明的治疗剂，例如封装于 脂质体、微颗粒、微胶囊、通过重组细胞表达、受体介导的内吞、构建 治疗性核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分等。导入方法包括但不 限于：真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和口服途径。化 合物通过任何常规途径施用，例如通过输注或浓注，经由上皮或粘膜皮 肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)以及可以与其它生物活性试剂 一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可能希望通过任何合 适的途径将本发明的药物组合物导入中枢神经系统，包括心室内和鞘内 注射；心室内注射可以通过心室内导管辅助，例如，连接于贮库例如 Ommaya贮库。

在具体的实施方式中，可能希望局部施用本发明的药物组合物至需 要治疗的区域；这可通过例如但不限于下列方法来进行：在手术中局部 输注，表面施用例如与手术后的创伤贴剂联合，通过注射，通过导管， 通过栓剂，或通过植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的或凝胶材料， 包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。在一个实施方式中，施用是直接在恶性 肿瘤或成瘤或成瘤前组织的位点(或从前的位点)注射。

在治疗剂为编码蛋白治疗剂的核酸的具体实施方式中，在体内施用 核酸以促进其编码的蛋白的表达，这是通过将其构建为合适的核酸表达 载体的一部分并施用它，从而其变为细胞内的，或以脂质或细胞表面受 体或转染试剂包被，或通过将其与同源框样肽(已知其进入细胞核)连接 来施用。或者，可以通过同源重组细胞内地导入核酸治疗剂并掺入宿主 细胞DNA中用于表达。

本发明还提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的治疗剂 和药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体包括但不限于：盐水、缓冲 盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或其组合。载体和组合物可以是无菌的。 制剂将适合于施用途径。

如果需要，组合物还可以包含微量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。 组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊、缓释制剂或粉 末。组合物可以配制为栓剂，使用常规粘合剂和载体例如甘油三酯。口 服制剂可以包括标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸 镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在优选实施方式中，根据常规程序配制组合物，作为适用于向人静 脉内施用的药物组合物。通常而言，用于静脉内施用的组合物是无菌等 渗水性缓冲液中的溶液。当需要时，组合物还包括增溶剂和局部麻醉剂， 例如利诺卡因，以缓解注射位点的疼痛。一般地，单独地或以单元剂量 形式混合在一起来提供成分，例如，作为密封的容器例如安瓿或sachette 中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物，标明活性试剂的量。当组合物通过 输注来施用时，使用包含无菌药物级水或盐水的输注瓶来分配。当组合 物通过注射来施用时，提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，从而在施 用前混合成分。

本发明的治疗剂配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游 离氨基形成的盐，例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等，以及 与游离羧基形成的盐，例如源自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧 化钙、氢氧化铁，异丙胺、三乙基胺、2-乙基氨基遗传、组氨酸、普鲁 卡因等。

治疗特定病症或病况的本发明的治疗剂的量将取决于病症或病况 的性质，并且由标准临床技术来确定。另外，可以任选地使用体外测定 来辅助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途 径，以及疾病或病症的严重性，并且根据医生的判断和每位患者的情况 来决定。然而，用于静脉内施用的合适剂量范围一般是大约20-500微 克活性化合物/千克体重。用于鼻内施用的合适的剂量范围一般是约0.01 pg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量将根据体内或动物模型测试系统 的剂量应答曲线来外推。

本发明还提供了药物包或试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多 种本发明的药物组合物的成分的容器。与此类容器任选结合的是由管理 药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的介绍单， 该介绍单表明经过该机构批准用于人类施用的制造、使用或销售。

实施例8

治疗癌症患者的方法

本实施例描述了选择和治疗可能对于使用本文的组合物的治疗具 有好的应答的患者的方法。

被诊断患有癌症的患者通常首先进行组织切除，目的是治愈。从患 者移除的组织的部分中获得肿瘤样品。使用本领域熟知的任何适当的用 于提取小RNA的方法从组织样品中分离RNA，例如使用TRIZOLTM。 然后，使用特异于miR21或其它所公开的差别表达的miRNA的引物， 使RNA进行RT-PCR，任选与遗传分析相结合。进行这些测定是为了 确定肿瘤中的有关的RNA的表达水平。如果差别表达的miR表达样式 被确定，特别是如果突变状态被确定，则患者是使用本文公开的组合物 进行治疗的候选者。

因此，使用治疗有效量的组合物根据本领域已知的方法治疗这样的 患者。组合物的剂量和给药方案将取决于不同的因子，例如患者的健康 状态和癌症的阶段。通常而言，在一段时间内以多次给药进行治疗。

实施例9

诊断癌症患者的方法

在一个具体方面，本文提供了诊断患者是否患有或处于患癌症风险 的方法。该方法一般包括测定相对于对照的miR-155的差异miR表达 样式。如果差别表达样式被确定，则结果指示该受试者患有或处于患癌 症的风险。在一些实施方式中，使用Northern印迹分析测定至少一种 基因产物的水平。同样，在一些实施方式中，测试样品中的至少一种基 因产物的水平小于对照样品中相应的miR基因产物的水平，和/或测试 样品中的至少一种基因产物的水平大于对照样品中相应的miR基因产 物的水平。

实施例10

测定miR基因产物

至少一种miR基因产物的水平可通过逆转录从受试者的测试样品 获得的RNA来测定，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将靶寡脱氧核苷酸 与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂 交谱；和，将测试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱进行比较。 至少一种miRNA的信号的改变指示受试者患有或处于患肺癌、特别是 EGFR突变体肺癌的风险。

实施例11

诊断和治疗应用

在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，其中至少 一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号而言是失调的（例如， 下调和/或上调的）。

本文还提供了诊断受试者是否患有或处于患癌症的方法，所述癌症 与受试者中的一种或多种不利预后标志物相关，所述方法是通过逆转录 来自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将靶寡脱 氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试 样品的杂交谱；和，将测试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱进 行比较。信号的改变指示受试者患有或处于患癌症的风险。

实施例12

试剂盒

本文描述的组合物可以包含于试剂盒中。在非限制性实例中，用于 分离miRNA、标记miRNA和/或测定miRNA群体(使用阵列)的实际包 括于试剂盒中。试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。 因此试剂盒将在合适的容器装置中包含：用于标记miRNA(通过掺入标 记的核苷酸或随后被标记的非标记的核苷酸)的酶。其还可以包含一种或 多种缓冲液，例如反应缓冲液，标记缓冲液，洗涤缓冲液或杂交缓冲液， 用于制备miRNA探针的化合物，和用于分离miRNA的成分。其它试 剂盒可以包括用于制备核酸阵列的成分，所述核酸阵列包括互补于 miRNA的寡核苷酸，因此，可以包括例如固体支持物。

对于任何试剂盒实施方式，包括阵列，可以存在其包含与本文的任 意序列的全部或一部分相同或互补的核酸分子。

试剂盒的成分可以装在含水介质中或者为冻干的形式。试剂盒的容 器装置一般包括至少一个小瓶，试管，烧瓶，瓶子，注射器或其它容器 装置，其中可以放置有成分，优选为等份分装的。当试剂盒中有一种以 上的成分时(标记试剂和标记物可以装在一起)，试剂盒一般还可包括第 二种、第三种或其它另外的容器，其中可以单独放置另外的成分。然而， 成分的多种组合可以包含于小瓶中。本发明的试剂盒通常将包括用于盛 放核酸的装置，和任何紧密封闭的其它试剂容器，用于商业售卖。此类 容器可以包括注射或吹模塑料容器，其中保存需要的小瓶。

当试剂盒的成分在一种或多种液体溶液中提供时，液体溶液是水溶 液，无菌水溶液是一种优选溶液。其它可包括在试剂盒中的溶液是涉及 从混合样品分离和/或富集miRNA的那些溶液。

然而，试剂盒的成分可以以干燥粉末来提供。当以干燥粉末来提供 试剂和/或成分时，可以通过加入适当的溶剂来重构粉末。设想到溶剂也 可以在另一个容器装置中提供。试剂盒还可以包括促进分离标记的 miRNA的成分。其也可以包括保存或维持miRNA或保护其免于降解的 成分。所述成分可以是无RNAse的或提供针对RNAse的保护。

同样，试剂盒一般可以在适当的装置中包含用于各个试剂或溶液的 容器。试剂盒还可以包含使用试剂盒成分以及使用试剂盒中不包含的任 何其它试剂的说明书。说明书可以包括可以被应用的变量。还考虑到此 类试剂是本发明的试剂盒的实施方式。同样，试剂盒不限于上述特定项 目，可以包括用于操作或表征miRNA的任何试剂。

还考虑到在miRNA阵列的上下文中讨论的任何实施方式可更一般 地用于本发明的筛选或表征方法或试剂盒。换言之，描述何种物质可包 含于特定阵列中的任何实施方式可以在miRNA表征的上下文中更一般 地使用，并且无需涉及阵列本身。

还考虑到，任何试剂盒、阵列或其它检测技术或工具，或任何方法 可以涉及表征任何这些miRNA。同样，考虑到在miRNA阵列的上下文 中讨论的任何实施方式可以使用或不使用本发明的方法的阵列形式来 实施；换言之，可以根据本领域技术人员已知的任何技术在本发明的任 何方法中筛选或测定miRNA阵列中的任何miRNA。阵列形式不是待实 施的筛选和诊断方法所需的。

用于治疗、预后或诊断应用的的miRNA阵列的试剂盒和此类用途 由本发明人设想到。试剂盒可以包括miRNA阵列，以及关于阵列上的 miRNA的标准或校正的miRNA谱的信息。同样，在一些实施方式中， 对照RNA或DNA可以包括在试剂盒中。对照RNA可以是那些用于标 记和/或阵列分析的阳性对照的miRNA。

本文已经宽泛和一般性地描述了本教导的方法和试剂盒。落在一般 性公开内的各个较窄的种类和亚属的组也构成本教导的一部分。这包括 本教导的一般性描述，具有从一般属中除掉任何主题的条件或否定式限 制，不论所除去的物质是否在本文中具体提及。

实施例13

阵列制备和筛选

本文还提供了miRNA阵列的制备和用途，其是与多个miRNA分 子或前体miRNA分子完全或几乎互补或相同、并且被置于空间上间隔 的组织架构上的支持物材料上的有序的大阵列或微阵列。大阵列通常是 硝酸纤维素的片，其上点染了探针。微阵列将核酸更紧密地放置，使得 达到10,000个核酸分子可以放置于通常1-4平方厘米的区域内。

微阵列可以这样制造：将核酸分子例如基因、寡核苷酸等点染至基 底上，或将寡核苷酸序列原位制造于基底上。点染或制造的核酸分子可 以达到约30个不同的核酸分子/平方厘米或更高，例如达到大约100或 甚至1000个/平方厘米的高密度基质式样应用。微阵列通常使用涂覆的 玻璃作为固体支持物，与过滤阵列的基于硝酸纤维素的材料不同。通过 提供miRNA互补性核酸样品的有序阵列，每个样品的位置可以被追踪 并与原始样品关联。

多种不同的阵列装置是本领域技术人员已知的，其中多个不同的核 酸探针稳定结合于固体支持物的表面。用于阵列的有用的基底包括尼 龙、玻璃和硅。阵列可以在多个不同方面变化，包括平均探针长度、序 列或探针类型，探针与阵列表面直接的键的性质，例如共价还是非共价 的等等。本文描述的标记和筛选方法和阵列不限于其关于任何参数的应 用，除了探针检测miRNA之外；因此，方法和组合物可以与多种不同 类型的miRNA阵列一起使用。

鉴于本发明的原理可应用于多种可能的实施方式，应该认识到，例 示的实施方式仅是本发明的优选实例，不应作为本发明范围的限制。相 反，本发明的范围由下列权利要求限定。因此，本发明人要求保护这些 权利要求的范围和精神内的本发明的内容。

虽然已经参考多个和优选实施方式描述了本发明，但是本领域技术 人员应该理解，可以不脱离本发明的基本范围对其进行多种改变和置换 等同物。另外，可以不脱离本发明的基本范围而对本发明的教导进行多 种修饰以适应特定的情况或材料。因此，本发明不被限定为本文公开考 虑用于实施本发明的特定实施方式，而是本发明应该包括落在本发明范 围内的所有实施方式。