一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法

摘要

本发明涉及一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，本方法根据高通量转录组测序筛选得到目标基因，通过PCR反应、PCR产物测序得到多个单核苷酸多态性（SNP）位点。再由所有有效的单核苷酸多态性位点组成单倍体型用于分子标记以达到遗传分型。本发明在一次实验中，即可得到丰富的多态性信息。单核苷酸多态性标记遗传稳定，可用于不同来源的样本，适宜高通量自动化分析。

说明书

技术领域

本发明属于生态工程技术领域，涉及一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的 DNA分子标记方法。

背景技术

外来生物入侵已成为当今环境保护中最为迫切的问题之一，其对世界各国的经 济、生态、社会安全以及国际贸易都有着十分重要的影响。美国每年直接或间接用 于入侵物种管理的费用就高达1370亿美元。中国同样也已成为全球遭受外来物种入 侵危害最严重的国家之一，已发现外来入侵物种488种，其中50余种位列世界自然 保护联盟公布的全球100种最具威胁外来物种，每年造成的直接经济损失达1200 亿元，治理投入更是难以估算。近年来入侵我国的外来生物更是呈现出传入数量增 多、传入频率加快、蔓延范围扩大、发生危害加剧、经济损失加重等趋势。因此， 生物入侵问题越来越受到世人的关注，包括其成因、危害及控制技术等诸多方面。 但目前，大部分的研究主要集中在竞争性排斥、生态位替代、生物学特性、化感、 捕食、寄生等生态过程，缺乏对其种群动态、快速适应与进化模式、快速入侵与扩 张动力等入侵机制方面的理解。

DNA分子标记（DNA molecular markers）本质上是指能反映生物个体或种群间 基因组中某种差异特征的DNA片段，也即基因型在DNA水平上的表现形式。这种DNA 片段是基因组DNA经限制性内切酶切割，或分子杂交后在电泳凝胶上检测得到的。 目前DNA分子标记技术主要包括三类：（1）以分子杂交为基础的，如RFLP、VNTR等； （2）以PCR技术为基础的，如RAPD、AFLP、DAF、STS、SSR、SCAR等；（3）利用 DNA芯片、直接测序等方法检测单核苷酸多态性（SNP）。单核苷酸多态性是指同一 位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子 水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传 物质的差异。

随着分子标记技术的成熟及其在分子生态学中的广泛应用，外来物种入侵机理 日益成为国际上研究的重点。大量的研究表明外来入侵种能在如此短的时间内迅速 地做出适应性的进化，可能与其自身的遗传结构密切相关。因而，在外来入侵物种 上，亟需一种能够有效揭示外来入侵物种遗传本质的方法。

互花米草（Spartina alterniflora）是一种原产北美大西洋沿岸的多年生草本 植物。因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种。1979年，南京大学从 美国东南部的北卡罗莱纳、乔治亚和佛罗里达引种了3种不同生态型互花米草至福 建罗源湾，随后扩大分布至我国海岸潮间带辽宁丹东以南的广大区域，并取得了一 定的生态和经济效益。但作为外来物种，其强大的繁殖能力和高大密集的种群特征， 对我国沿海滩涂地区的生态系统、生物多样性和水产养殖产生了较大的负面影响， 2003年被环保总局列入我国第一批16种外来入侵物种名单。因此，对其入侵过程 和扩张机制的研究已刻不容缓。本发明以列入中国首批外来入侵物种的互花米草为 对象，在整个基因组内批量寻找多态性位点，全面评估外来入侵物种的多样性，并 揭示其遗传本质和入侵机制，为进一步研究和控制外来入侵物种提供有力的技术支 持。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定外来入侵物种互花米草的分子标记方法，能够在 基因组序列信息较少的情况下，获得大量的核苷酸多态性标记，发现引入的不同种 群之间存在的遗传变异，为揭示其遗传本质和入侵机制，进一步研究和控制外来入 侵物种提供有力的技术支持。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，步骤如下：

1)种群调查及取样；

2)DNA提取；

3)测序；

4)筛选目标基因R52；

5)根据目标基因R52设计引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示；反 向引物如序列表中SEQ ID NO：2所示；

6)PCR扩增；

7)测序；

8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点。

进一步地，所述目标基因R52是通过高通量转录组测序后筛选得到。

进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃30s、54℃30s、 72℃1.5min，37个循环，72℃延伸10min。

进一步地，所述目标基因R52在互花米草种群中有8个SNP位点，目标基因R52 基因片段序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，其中8个SNP位点分别位于118、 212、251、305、578、869、934、962。

进一步地，高通量转录组测序的方法：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠 富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp, 在illumina HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行 拼接，从而得到基因序列。

本发明的有益效果：包括互花米草在内的许多外来入侵物种为非模式植物,基 因组庞大，很多物种缺少全基因组数据，在进行传统的各种传统分子标记分析时， 如RAPD、SSR、AFLP，发现实验结果的一致性较差，假阳性率偏高。而且，传统分 子标记一次实验只能找到少量多态性位点信息，如果需要高精度的分辨率，需要多 次实验。本发明在一次实验中，即可得到8个单核苷酸多态性SNP位点，提供丰富 的多态性信息。同时，本发明的实验条件简单，成功率高，可重复性好。在实施过 程中，实验成功率在98%以上，实验结果可重复性更达到100%。本发明采用的8个 SNP位点，单倍体基因型理论上可以达到2的8次方，即256，能够提供非常丰富的 多态性信息，使结果更加准确。SNP标记遗传稳定，可用于不同来源的样本，适宜 高通量自动化分析。

具体实施方式：

下面结合具体样本对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不 是限定。

1.种群调查及取样

最早引入外来入侵物种的地区，福建罗源湾的互花米草是我国的最原始种群， 将其作为采样点。上海崇明岛距离分析点较近，采集后样品保存度高，将其作为采 样点。

选取生长良好、无虫害的叶片，采下后立刻放入事先准备好的装有约半袋硅胶 的自封袋里，混匀使叶片与硅胶充分混合，以便快速脱水。带回实验室后根据实际 情况更换已经变色的硅胶，干燥之后待提取DNA用。每一采样点随机取样30株左右， 个体间的间距不小于50米，以尽可能避免重复采集同一克隆，记录每一样本的编号、 生境、地理参数（经纬度）、样品高度，样品直径等详细信息。

2.DNA提取

使用BioFlux公司的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，具体步 骤稍作调整：

(l)称取0.07-0.1g干叶，用剪刀剪碎；用液氮冷冻研钵、研棒，将材料倒入盛 有液氮的研钵中，用力磨成粉末，在研磨过程中注意不要让材料反复冻融。

(2)将研磨好的粉末用勺小心地转移至预先加入450uL LP Buffer的2.0ml离心 管中，混合均匀。

(3)65℃金属浴中温浴30-60分钟（温浴过程中间隔振荡2-3次），然后移出。

(4)加入150uL DA Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。

(5)于13,000rpm离心10分钟，再将上清液转移至Shredder spin column中， 13,000rpm离心1分钟。

(6)将滤液转移到一个新的1.5ml离心管中。

(7)加入滤液体积1.5倍的P Binding Buffer，轻柔的混合均匀，管中出现絮状 沉淀，13,000rpm离心10分钟。

(8)将上清液转移至Spin column。于7,500rpm离心一分钟，并弃去接液管中 液体。

(9)向Spin column中加入500uL的G Binding Buffer。12,000rpm离心30秒， 并弃去接液管中液体。

(10)向Spin column中加入600uL的Wash Buffer。12,000rpm离心30秒，并弃 去接液管中液体。

(11)重复步骤10，一次。

(12)再次将Spin column于12,000rpm离心1分钟，并将Spin column转移至一 个新的1.5ml离心管。

(13)向Spin column中加入100uL至200uL65℃温浴的去离子水，并于室温温 浴2-3分钟。

(14)于12,000rpm离心1分钟，并弃去Spin column。DNA存在于1.5ml离心管 液体中，-20℃保存备用。

3.高通量转录组测序

包括互花米草在内的许多外来入侵物种为非模式植物,基因组庞大，很多物种 缺少全基因组数据，在进行AFLP分子标记与锚定PCR实验的过程中，发现实验结果 的一致性较差，假阳性率偏高。因此，我们选择使用高通量转录组测序技术，高通 量转录组测序不需要了解物种基因信息，能够对任意物种进行转录组分析，并能测 定每个转录本的片段序列，精确到单核苷酸的分辨率；能够同时鉴定和定量稀有转 录本和正常转录本，以及检测基因家族中相似基因和可变剪接造成的不同转录本的 表达。高通量测序的步骤是：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离 mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，插入片段长度约为500bp,在illumina HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而 得到基因序列。

4.筛选目标基因

对得到的转录组数据进行行筛选，去除多拷贝及重复基因，找到易于扩增的片 段R52。

R52基因片段序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据目标基因设计引物，引物的序列为：

正向引物如SEQ ID NO：1所示：cccaagaagt actgcataga gc

反向引物如SEQ ID NO：2所示：gagtgtggac cattacagga ac

6.PCR扩增

设计50ul PCR扩增体系，具体的组成为：34uldH2O、5ul10×Buffer(Mg²⁺)、 4ul dNTP Mixture(2.5mM)、0.5ul Trans T-Taq(5U/μl)2.5ul Template DNA （20-40ng/μL）2ul正向引物（10μM）、2ul反向引物（10μM）。

PCR反应条件为：94℃3min预变性，94℃30s、54℃30s、72℃1.5min37个循 环，72℃延伸10min。

7.测序

PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测,确定为目的条带且无杂带干扰。使用上海捷 倍思基因技术有限公司的PCR clea-up Kit直接清洁PCR产物，PCR产物浓度达到测序 要求后，进行直接双向测序。

8.序列拼接、比对和分析

所得的序列用Sequencher软件进行拼接并根据峰图进行手工校正，然后利用 Mega软件进行比对排列，经比对，两端切齐后长度1005bp，GC含量为57.6%。R52片 段测序质量很高，峰型清晰，无杂峰。可以通过测序峰形清晰鉴定单核苷酸多态性 位点。

9.对福建罗源湾和上海崇明岛的互花米草种群进行鉴定记录单核苷酸多态性 位点。

表1福建罗源湾和上海崇明岛的互花米草种群单核苷酸多态性位点

注：R、Y、S是国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry， IUPAC)制定的命名规则，R代表A或G，S代表C或G，Y代表C或T

鉴定结果发现，福建罗源湾和上海崇明岛的互花米草种群共16个个体具有很高 的多态性。1005bp长的片段上，共存在8个隔离位点，且在15个体中存在杂合现 象（见表1）。罗源湾的互花米草种群群体的8个个体中，1个个体含有4个单核苷 酸多态性位点，2个个体含有3个单核苷酸多态性位点，2个个体含有2个单核苷酸 多态性位点，2个个体含有1个单核苷酸多态性位点。崇明岛的互花米草种群群体 含有的单核苷酸多态性位点很多，8个个体中，1个个体含有5个单核苷酸多态性位 点，4个个体含有3个单核苷酸多态性位点，3个个体含有2个单核苷酸多态性位点。