一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法，其中该方法包括：植物病毒总RNA的提取，RT-LAMP反应和电泳检测或荧光染料检测，确定植物是否带病。本发明根据CGMMV的外壳蛋白基因保守区域设计了RT-LAMP引物，采用RT-LAMP技术建立了一种快速、灵敏、高度特异性的检测黄瓜、西瓜和葫芦等葫芦科植物植株上CGMMV的检测技术及其在病害诊断上的应用方法。本发明可以利用快速抽提RNA和常规RNA抽提作为RNA模板用于RT-LAMP实验。利用这一方法可以快速鉴定出黄瓜绿斑驳花叶病毒植株样本，进而采取针对性的检疫性保护措施，减少病害带来的损失。

说明书

技术领域

本发明属于农业科学技术领域，涉及西瓜、黄瓜和葫芦等葫芦科植物 上黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用，具 体涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒及检测方法 。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）属番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、烟草花叶病毒属（To bamovirus）成员。该病严重为害葫芦科作物，为我国的检疫性有害生 物。黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期染病幼苗顶尖部的2～3片叶子现亮绿或 暗绿色斑驳，叶片较平，产生暗绿色斑驳的病部隆起，新叶浓绿，后 期叶脉透化，叶片变小，引起植株矮化，叶片斑驳扭曲，呈系统性传 染。瓜条染病现浓绿色花斑，有的也产生瘤状物，致果实成为畸形瓜 ，影响商品价值，严重的减产25%左右。自然界主要侵染甜瓜、西瓜、 黄瓜、南瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物，通过种子和土壤传播，此外也 可通过汁液，农事操作及叶片接触等方式进行传播。带毒种子传播是 该病毒远距离传播的主要途径。

该病自1935年被发现以来，曾先后在英国、德国、丹麦、荷兰、俄罗 斯、印度、日本、韩国以及我国台湾发生并造成严重危害。黄瓜绿斑 驳病毒病以前在我国大陆没有发生记载，2006年国内个别地方发现西 瓜绿斑驳病毒病，2006年12月份中国农业部发布788号公告，将其列为 全国植物检疫性有害生物。

目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有：生物学实验，血清学检 测，电镜观察及分子生物学检测。由于传统的植物病毒监测方法，如 电镜观察、传统的生物学接种鉴定等这些方法很难分别出是否是黄瓜 绿斑驳花叶病毒，因此需要一个快速准确的方法来检测该病毒。环介 导恒温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification ,LAMP），是由Notomi 等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方 法，他是一种高灵敏度的链置换技术，一种新型的PCR替代技术。LAM P特点是针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换D NA聚合酶—Bst DNA polymerase 在恒温的条件下反应60min就可以 完成核酸扩增反应，通过荧光染色后在紫外光下观察可以清晰的观察 到反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪，不需要 繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病 毒、细菌、寄生虫等引起的疾病监测和快速诊断。但是，目前尚没有 将RT-LAMP技术应用在黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的检测上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-L AMP引物组。

本发明的另一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测 试剂盒。

本发明又一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测 方法。该方法用于快速检测西瓜、黄瓜和葫芦等葫芦科上黄瓜绿斑驳 花叶病毒，通过该方法可以快速诊断出疑似病株是否携带黄瓜绿斑驳 花叶病毒。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的RT-LAMP引物组，其在于所述 的RT-LAMP引物组包含一对外引物和一对内引物，所述外引物对F3、B 3的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对F IP、BIP的序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

上述的引物组在制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测试剂盒或检测试 剂中的应用。

一种含有上述的引物组的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒 。

上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其在于所述的试 剂盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反应液、DEPC水和 荧光染料SYBR GreenⅠ检测液组成的检测体系。

上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒，其在于所述植物 病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL（pH8.0）；采用植物 病毒RNA快速提取液提取样品粗提总RNA，将提取的样品粗提总RNA加入 到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系；以反应总体积10μL为例， 所述扩增体系中各组分的含量为：样品粗提总RNA 0.8μL，1×Ther moPol Buffer，4mM MgCl₂，0.8mM dNTP，0.8M Betaine，3.2U  的Bst DNA Polymerase，0.5U 的AMV Polymerase，1μM 的FIP 和1μM 的BIP，0.2μM的F₃和0.2μM的B₃，补充DEPC水至10μL。

一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其在于使用上述的 引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增，利用电泳检测或荧光染料技术鉴 定出待检测样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。

上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，具体包括以下步 骤：

（1）提取样品粗提总RNA；

（2）取步骤（1）提取的样品粗提总RNA加入到RT-LAMP反应液中混合 ，建立扩增 体系；

（3）在63~64℃恒温水浴中反应60~75min；

（4）结果诊断：取荧光染料检测液SYBR GreenⅠ加入到步骤（3）扩 增反应产物中进行诊断，在紫外光下观察，呈阳性即显绿色的表示样 本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒，呈阴性即保持染料橙色的表示样本不 含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。

步骤（1）所述样本粗提总RNA的提取方法为：用刚采集的病叶在0.5M  NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，将研磨液加入到Tris-HCL（pH8. 0）中制成样品粗提总RNA提取液。

所述的病叶和0.5M NaOH溶液的质量体积比g：mL为1：4；所述混合液 和Tris-HCL（pH8.0）的体积比为1：49。

步骤（2）中所述反应总体积10μL为例，扩增体系中各组分的含量为 ：样品粗提总RNA 0.8μL，1×ThermoPol Buffer，4mM MgCl₂，0 .8mM dNTP，0.8M Betaine，3.2U 的Bst DNA Polymerase，0.5 U 的AMV Polymerase，1μM 的FIP和1μM 的BIP，0.2μM的F₃和 0.2μM的B₃，补充DEPC水至10μL。

本发明所提供的快速检测病株上黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，具体包 括以下详细步骤：

1）根据NCBI已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒核苷酸序列，通过软件DNA star分析后找出该病核酸外壳蛋白基因保守区域序列作为模板参考序 列使用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V4 （http://pri merexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计引物；

2）快速提取法提取植株样品粗提总RNA；

3）设置不同Mg²⁺浓度、dNTP浓度、内外引物浓度比例、Betaine浓度、 确定最佳反应体系；分别改变反应时间和温度进行RT-LAMP扩增反应， 确定最佳反应条件。

4）通过紫外光或肉眼判断SYBR GreenⅠ染色对RT-LAMP产物进行可视 化处理。

5）在最佳反应参数条件下，与RT-PCR方法进行比较，验证RT-LAMP的 灵敏度；

6）以CMV和TMV为对照验证这一反应的特异性；

本发明提供的引物序列如下：   

其中，所述检测试剂盒包括以下溶液：

溶液1：植物病毒RNA快速提取液包括：0.5M NaOH和Tris-HCL（pH8. 0）；

RT-LAMP反应液包括溶液2和溶液3：

溶液2：10×ThermoPol Buffer，MgCl₂（25mM），dNTP（10mM eac h)，Betaine（5M），Bst DNA Polymerase（8U/μL），AMV Poly merase（10U/μL）；

溶液3：RT-LAMP引物混合液包括：内引物FIP（20μM）和BIP（20μM ），外引物F₃（10μM）和B₃（10μM）；

溶液4：DEPC水；

溶液5：荧光染料检测液SYBR GreenⅠ。

进一步，所述检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，包括 如下步骤：

1）用刚采集的病叶0.1g，在400μL的0.5M NaOH溶液中研磨，取10μ L研磨液加入到490μL  Tris-HCL（pH8.0）中，直接取0.8μL的液 体作为检测的粗提取总RNA模板；

2）配制RT-LAMP反应液：按总体积10μL建立扩增体系为：5.45μL溶 液2【10×ThermoPol Buffer 1μL，MgCl₂（25mM）1.6μL，dNTP（ 10mM each) 0.8μL，Betaine（5M）1.6μL，Bst DNA Polymera se（8U/μL）0.4μL，AMV Polymerase（10U/μL）0.05μL】，1.4 μL溶液3【FIP（20μM）和BIP（20μM）各0.5μL，外引物F₃（10μ M）和B₃（10μM）各0.2μL】，2.35μL DEPC水；

3）取步骤1）提取的样品粗提总RNA 0.8μL加入到步骤2）配制的RT -LAMP反应液中，混合；

4）在63~64℃恒温水浴中反应60~75min；

5）结果诊断：将1μL溶液5加入到步骤4）扩增反应产物中进行诊断， 在紫外光下观察，呈阳性即绿色的表示样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病 毒，呈阴性即保持染料橙色的表示样本不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。

相比现有技术，本发明具有如下优点：

本发明根据GenBank发布的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的基因序列 ，针对外壳蛋白基因保守区域设计了CGMMV的RT-LAMP检测方法的特异 性引物2对，一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，2对引物序列 如上所示。以快速提取样本总RNA为模板，建立了快速检测CGMMV的RT -LAMP技术。

本发明RT-LAMP检测技术利用特异性引物(4条)，以识别CGMMV病毒靶基 因的几个特定区域，特异性更强。反应在等温条件（63~64℃）下进行 ，不需要昂贵的PCR仪器，扩 增反应极快，一般在60~75min就能完成，扩增产物量大，利用电泳检 测或荧光染料技术鉴定出待测样本是否含有CGMMV病毒；灵敏度高、特 异性强，适合病毒的准确检测。

本发明RT-LAMP技术不需要单独反转录过程和RT-PCR的两次扩增，减少 分子检测的一些环节，减少了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度 比RT-PCR高100倍，使该方法对CGMMV病毒的早期诊断更精确。

本发明具有操作简单、成本低、反应快速、特异性强、灵敏度高的优 点，且用时短，灵敏度比普通RT-PCR高100倍，对病毒早期诊断准确性 更高。可广泛利用本样本快速检测、CGMMV流行监控、检疫检测和病毒 的鉴别。

附图说明

图1为不同Mg²⁺浓度、dNTP浓度、内外引物浓度比例、Betaine浓度的优 化电泳图

A为Mg²⁺浓度优化结果图（1为阴性；2-6为Mg²⁺浓度：2、3、4、5、6mM ；M为Marker）；

B为dNTP浓度优化结果图（1为阴性；2-6为dNTP浓度：0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mM；M为Marker）；

C为外引物F3和B3浓度优化结果图（1为阴性；2-6为F3、B3各：0.05、 0.10、0.15、0.20、0.25μM；M为Marker）；

D为FIP和BIP浓度优化结果图（1为阴性；2-6为FIP、BIP各：0.4、0. 6、0.8、1.0、1.2μM； M为Marker）；

E为Betaine浓度优化结果图（1为阴性；2-6为Betaine浓度：0、0.4、 0.8、1.2、1.6M）

图2为不同反应温度条件下RT-LAMP结果的电泳图

M为Marker；1为61℃阳性，2为61℃阴性，3为62℃阳性，4为62℃阴性 ，5为63℃阳性，6为63℃阴性，7为64℃阳性，8为64℃阴性，9为65℃ 阳性，10为65℃阴性。

图3为不同反应时间条件下RT-LAMP结果的电泳图

1为阴性；2为15min；3为30min；4为45min；5为60min；6为75min；M 为Marker。

图4为RT-LAMP与RT-PCR灵敏度比较图及荧光染料方法检测RT-LAMP扩增 产物图

A为RT-LAMP反应结果图；B为RT-PCR反应结果图；C为SYBR GreenⅠ荧 光染料方 法检测结果图；M为Marker；1为72ng/μL；2为7.2ng/μL；3为7.2× 10^-1ng/μL；4为7.2×10^-2ng/μL；5为7.2×10^-3ng/μL；6为7.2×10^-4ng/μL；7为7.2×10^-5ng/μL；8为7.2×10^-6ng/μL；9为阴性对照。

检测结果：自左到右，第1-4个试管为绿色，5-9为橙色。

图5为利用快速提取植物RNA做为模板进行RT-LAMP反应结果图

1为阴性；2为快速提取健康植物的RNA；3为快速提取带CGMMV病株的R NA；4为阳性。

图6为利用快速提取样检测CGMMV的RT-LAMP特异性的结果图

A为RT-LAMP反应结果图；B为RT-PCR反应结果图；M为Marker；1为阳性 ；2为粗提CGMMV病样；3为粗提CMV病样；4为粗提TMV病样；5为粗提健 康植株；6为阴性。

检测结果：自左到右，第1-2个试管为绿色，3-6为橙色。

具体实施方式

实施例1  黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP反应条件的优化

①黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP引物的设计

根据NCBI已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒

（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001

801.1）完整核苷酸基因组序列，通过软件DNAstar分析后找出该病毒 核苷酸外壳蛋白区域5763~6248bp，利用NP_044580.1上的对应区域57 63~6248bp作为模板参考序列，使用在线LAMP引物设计软件Primer E xplorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html )设计引物。再通过软件提供的引物相对应的3’端或5’端稳定性及引 物二聚体等参数对设计出的多对引物进行比较选择，最终选取一组最 适合的引物，序列如下：

F3  CCGTCAGGACTTTACTTA

B3  GAGCTGAGAAGCGAAACGA

FIP  ACTCGCGGAAAGAATCTCTTCCTTCTAGTTGCTTCACAAGGTAC

BIP  CTGTCGTAGATATTAATTCTAGATTCCAACACAGGACCGTTGAGGAA

②黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的Mg²⁺浓度优化实验

从南京农业大学植物病毒学实验室获得病株，采用RT-PCR筛选出黄瓜 绿斑驳花叶病毒病株用于RT-LAMP检测实验，使用RNA simple Tota l RNA Kit总RNA提取试剂盒提取样品总RNA。RT-LAMP体系为：10× ThermoPol Buffer 1μL，dNTP（10mM each) 0.8μL，内引物FI P（20μM）和BIP（20μM）各0.5μL，外引物F₃（10μM）和B₃（10μ M）各0.2μL， Betaine（5M）1.6μL，Bst DNA Polymerase（8U/μL）0.4μL，A MV Polymerase（10U/μL）0.05μL，MgCl₂（25mM）的终浓度在2~6 mM，以每1mM的量递增，0.8μL总RNA模板，补充DEPC水至10μL。反应 条件63℃ 60min，80℃ 10min。1%的凝胶电泳观察结果。经优化选 取扩增效率最高的最低终浓度4mM（图1 A)，作为反应体系中MgCl₂的 用量。

③黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的dNTP浓度优化实验

采用实施例1②中电泳条带清晰、明亮的反应组对应的MgCl₂用量进一 步作dNTP浓度的优化实验，反应条件不变，dNTP的终浓度在0.2~1mM， 以每0.2mM的量递增，扩增产物用1%凝胶电泳观察结果。经过优化，确 定本发明dNTP的终浓度为0.8mM（图1 B）。

④黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的外引物浓度优化实验

固定优化好的量，外引物F3、B3按1:1的比例混合，F3、B3终浓度以0 .05mM、0.10mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM的量依次递增，反应条件不 变，1%凝胶电泳观察结果。选F3和B3的终浓度各为0.20μM（图1C）。

⑤黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的内引物浓度优化实验

固定以上优化好的量，内引物FIP、BIP按1:1的比例混合，FIP、BIP终 浓度以0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM的量依次递增，反应条件 不变，因此经过重复试验后选择内引物终浓度各为1μM（图1 D）。

⑥黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的Betaine浓度的优化

在以上优化试验的基础上进行Betaine用量的优化，Betaine终浓度以 0M、0.4M、0.8M、1.2M、1.6M的量依次递增，反应条件不变，反应至 少重复三次，1%凝胶电泳观察结果。当Betaine的浓度为0.8M时扩增效 果最好（图1 E）。

⑦黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的温度梯度实验

虽然Bst DNA polymerase 的最适反应温度是65℃，但许多报道已 经证实RT-LAMP适合反应温度在60~65℃之间，同时由于不同引物在设 计时不可能保证所有引物的Tm值完全一致，而且RT-LAMP还要考虑到反 转录酶的适宜温度，鉴于此，本发明对RT-LAMP反应温度进行优化试验 。按实施例①~⑥优化的量添加反应体系，体系在61℃，62℃，63℃， 64℃，65℃五种条件下恒温反应1h，80℃反应10min终止RT-LAMP反应 ，扩增产物上样，在1％琼脂糖凝胶上进行跑电泳，结果显示在同样反 应体系条件下，在61~63℃条带亮度越来越亮，而64~65℃时条带亮度 越来越暗，且各个温度下的阴性对照无扩增产物（图2）。因此本发明 RT-LAMP的反应温度为63~64℃。

⑧黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP的反应时间梯度实验

许多报道已经证实了RT-LAMP反应时间少于1h也能检测到扩增产物。按 已经优化好的RT-LAMP体系加样后置于63℃恒温条件下反应，分别设置 温度反应15min，30min，45min，60min，75min五种处理，完成反应后 电泳检测。结果显示当反应时间为45min时已经有扩增产物，但产物较 少，但是当反应时间为60~75min时，RT-LAMP扩增产物开始增多，此后 当继续增加反应时间时，扩增产物的量变化不大（图3），因此本发明 确定的RT-LAMP的反应时间为60~75min。

⑨RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较

为了确定RT-LAMP和RT-PCR两种检测方法的灵敏度，将提取的总RNA用 NanoDrop1000测定浓度（72ng/μL）后用RNase-free ddH₂O进行10倍 比稀释，-80℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度RNA稀释 液0.8μL作为模板，采用优化好的RT-LAMP反应体系进行反应（63℃反 应60min）。取3μL扩增产物上样，在1％琼脂糖凝胶上跑电泳。同时 ，和RT-LAMP保持相同的RNA比例，取10μL总RNA为模板，1.5μL B3 为反转录引物和1μL dNTP在65℃反应5min，然后冰浴2min，冰浴后 加入4μL 5×M-MLV buffer, 2μL DTT(50mM), 1μL M-MLV  和 0.5μL RRI进行反转录合成cDNA第一链。取1.6μL反转录合成的 cDNA为模板，以F3和B3为引物进行PCR扩增，使用体系为10μL的常规 PCR反应体系进行反应。反应结束后取3μL扩增产物上样，在1％琼脂 糖凝胶上跑电泳。结果显示用RT-LAMP方法可以检测到浓度是7.2×10 ^-2ng/μL的CGMMV的总RNA，而RT-PCR也能检测到浓度是7.2ng/μL的CG MMV的总RNA，即RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高100倍（图4A、B）。

⑩荧光染料方法检测RT-LAMP灵敏度扩增产物

按实施例1⑨中RT-LAMP反应产物电泳检测后，向PCR管中加入SYBR G reen I 0.7μL（1:1000），几分钟后观察结果，在紫外光下阳性扩 增产物会变成绿色，而无扩增产物及阴性对照保持染料的橙色（图4C ）。

实施例2，粗提黄瓜绿斑驳花叶病毒样做RT-LAMP反应的特异性和可视 化试验

①利用快速提取的样品粗提总RNA做RT-LAMP

快速粗提RNA的方法，可以使CGMMV RT-LAMP在检测中快速检测病样， 提高效率。快速提起RNA方法是：用刚采集的病叶0.1g，在400μL的0 .5M NaOH溶液中研磨，取10μL研磨液加入到490μL  Tris-HCL（ pH8.0）中，直接取0.8μL的液体作为粗提取总RNA模板做CGMMV RT- LAMP检测实验（图5）。

②黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP特异性试验

为了验证RT-LAMP方法的特异性，选择可以侵染瓜类的病毒作为对照黄 瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）作为对照。分别用试剂盒 提取的CGMMV总RNA和粗体的CGMMV，CMV，TMV和健康植株的总RNA作为 模板，用实施例1中优化好的RT-LAMP反应体系进行反应。结果显示用 RT-LAMP引物去扩增TMV和CMV的RNA模板时，没有扩增出条带；而扩增 试剂盒扩增粗提取的CGMMV总RNA时能够扩增出目的条带，这表明本发 明建立的RT-LAMP检测方法具有很好的特异性（图6A）。

③荧光染料方法检测RT-LAMP特异性结果

按例2 ②中RT-LAMP反应产物电泳检测后，向PCR管中加入SYBR Gre en I 0.7μL（1:1000），几分钟后观察结果，在紫外光下阳性扩增 产物会变成绿色，而无扩增产物及阴性对照保持染料的橙色（图6B） 。

这种检测植株上黄瓜绿斑驳花叶病毒方法的应用包括：在甜瓜、西瓜 、黄瓜、南瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物疑似病植株的快速诊断与鉴别 。

上述实施不以任何形式限定本发明。