哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的包含融合蛋白的病毒颗粒及其应用

摘要

本发明涉及哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒颗粒，其中a)所述颗粒被其中内嵌病毒糖蛋白的脂膜围绕，b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽，且其中所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨基酸序列的氨基酸位点W175或A534处。

说明书

本发明涉及哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病 毒颗粒，其中

a)所述颗粒被其中内嵌有病毒糖蛋白的脂膜围绕，

b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且

c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一 个或多个部分以及至少一种异源肽；

且还涉及所述病毒颗粒或多个所述病毒颗粒的应用。

受到人巨细胞病毒(HCMV)的感染是在实体器官或造血干细胞移植后 患者中疾病的主要原因[1-9]。此外，该病毒在怀孕过程中的传递是西半球 新生儿中持久后遗症的最常见原因之一[10；11]。因此，开发HCMV疫苗 已经被确定为高优先级目标[12]。

这样的疫苗的一个目的应该是预防母体中感染或，至少预防跨胎盘传 递。认为中和抗体的诱导对于实现该目的是必要的。相反，防止移植接受 者中感染的再激活和控制被认为是通过，特别地由CD8T细胞介导的细胞 应答提供[13-15]。移植接受者的治疗性疫苗接种，其引起淋巴细胞应答， 可能与过继T细胞转移组合，将对于改善移植后时期内HCMV病毒再激 活结果是理想的[16]。

尽管存在开发HCMV疫苗的有前景的方法，但是仍然不存在许可的制 剂可用[10；17-19]。由众多关于提供保护的免疫效应器的研究，似乎证明了 针对HCMV的理想疫苗应该诱导抗病毒中和抗体和T淋巴细胞二者 [10；17；18；38]。然而，存在这样的担忧，即究竟是否可以构建这样的通用 HCMV疫苗。近期临床研究显示：表达HCMV蛋白的α病毒复制子是被 充分耐受的并诱导持续的细胞和体液应答[19]。另一项研究使用纯化的gB 作为疫苗并提供鼓舞人心的结果，因为可以诱导显著水平的HCMV中和 抗体[18]。这些疫苗有希望用于预防先天性HCMV感染。

在以前小鼠中的研究中，所谓的密体，其在本文中也称为DB，被证 实具有出人意料的免疫原性[20]。如本领域中一般理解地和如本文中也使 用地，密体是哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒 颗粒，其中

a)所述颗粒被其中内嵌有病毒糖蛋白的脂膜围绕，

b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体。

优选地，这样的密体还包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原 pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽。密体及其制备也记述在国际 专利申请WO 00/53729中。

由于它们出人意料的免疫原性，所以努力开发DB作为HCMV疫苗。 近期的实验提供实验证据证明DB可以在其抗原含量(antigenic content)方 面改进[21；22]。这是通过由重组HCMV表达融合蛋白实现，所述融合蛋 白由主要DB-成分pp65和来自病毒IE1-蛋白的异源MHC类别I呈递肽。 这导致在感染的人包皮成纤维细胞(HFF)中形成重组DB(recDB)。包含融 合蛋白的recDB由感染的HFF释放[21]。将这些颗粒应用于HLA-A2转基 因HHD-小鼠诱导了CD8+T淋巴细胞应答，这在分离的T细胞的体外肽 刺激后变得明显[22]。然而，当通过Elispot分析直接离体(ex vivo)测试 CD8+T细胞级分时，不能立即检测到HCMV特异性T细胞。这说明尽 管原则上适合于治疗性应用，但是使用这些颗粒时引发(priming)不如所需 的那么显著。此外，来自感染的HFF培养物的这些recDB的产率低。

因此，本发明涉及的问题是提供适合于作为疫苗的病毒密体，其中所 述病毒密体包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或 多个部分以及至少一种异源肽，且其中优选地，所述疫苗能够引发针对所 述至少一种异源肽的免疫应答。

本发明涉及的另一个问题是提供病毒密体，其中所述病毒密体包含融 合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少 一种异源肽，且其中优选地，所述密体能够诱导中和抗体的形成和/或CD8⁺T淋巴细胞应答。

本发明涉及的另一个问题是提供病毒密体，其中所述病毒密体包含融 合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少 一种异源肽，且其中所述密体可以以高产率制备。

这些和其他问题通过所附独立权利要求的主题解决。优选的实施方案 可以获自同样后附的从属权利要求。

更明确地，本发明涉及的问题在第一方面(其也是所述第一方面的第 一实施方案)中，通过哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释 放的病毒颗粒来解决，其中

a)所述颗粒被其中内嵌有病毒糖蛋白的脂膜围绕，

b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且

c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一 个或多个部分以及至少一种异源肽，

且其中所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨基酸序列 的氨基酸位点W175或A534处。

在所述第一方面的第二实施方案(其也是所述第一方面的第一实施方 案的实施方案)中，所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨 基酸序列的氨基酸位点W175处。

在所述第一方面的第三实施方案(其也是所述第一方面的第一和第二 实施方案的实施方案)中，所述T细胞抗原pp65的氨基酸序列包含根据 SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在所述第一方面的第四实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二 和第三实施方案的实施方案)中，所述颗粒是高度抗原性的。

在所述第一方面的第五实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、 第三和第四实施方案的实施方案)中，所述颗粒能够诱导中和抗体的形成。

在所述第一方面的第六实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、 第三、第四和第五实施方案的实施方案)中，所述颗粒能够诱导CD8⁺T 淋巴细胞应答。

在所述第一方面的第七实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、 第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案)中，所述至少一种异源肽 是MHC类别I呈递抗原。

在所述第一方面的第八实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、 第三、第四、第五、第六和第七实施方案的实施方案)中，所述至少一种 异源肽包括一种或多种与pp65不同的蛋白的一个或多个部分或由一种或 多种与pp65不同的蛋白的一个或多个部分形成。

在所述第一方面的第九实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、 第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所述至 少一种异源肽包括HCMV糖蛋白的一个或多个部分或是HCMV糖蛋白的 一个或多个部分。

在所述第一方面的第十实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、 第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的实施方案)中， 所述至少一种异源肽包括HCMV糖蛋白gB的一个或多个部分或是HCMV 糖蛋白gB的一个或多个部分。

在所述第一方面的第十一实施方案(其也是所述第一方面的第一、第 二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的实施方案) 中，所述至少一种异源肽包括HCMV糖蛋白gH的一个或多个部分或是 HCMV糖蛋白gH的一个或多个部分。

在所述第一方面的第十二实施方案(其也是所述第一方面的第一、第 二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的实施方案) 中，所述至少一种异源肽包括至少两种HCMV糖蛋白或由至少两种 HCMV糖蛋白组成，所述HCMV糖蛋白是来自不同HCMV毒株的特定糖 蛋白的变体。

在所述第一方面的第十三实施方案(其也是所述第一方面的第十二实 施方案的实施方案)中，所述特定糖蛋白的至少两个变体中的一个是 HCMV Towne毒株的变体且所述特定糖蛋白的至少两个变体中另一个是 HCMV Ad169毒株的变体。

在所述第一方面的第十四实施方案(其也是所述第一方面的第十二和 第十三实施方案的实施方案)中，所述糖蛋白是HCMV的gB蛋白。

在所述第一方面的第十五实施方案(其也是所述第一方面的第一、第 二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所 述至少一种异源肽包括HCMV蛋白IE1的一个或多个部分或是HCMV蛋 白IE1的一个或多个部分。

在所述第一方面的第十六实施方案(其也是所述第一方面的第一、第 二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所 述至少一种异源肽包括HCMV糖蛋白的一个或多个部分和HCMV蛋白 IE1的一个或多个部分，或是HCMV糖蛋白的一个或多个部分和HCMV 蛋白IE1的一个或多个部分。

在所述第一方面的第十七实施方案(其也是所述第一方面的第一、第 二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所 述至少一种异源肽是下述蛋白的一个或多个部分，所述蛋白是作为除 HCMV以外的人病原体的一部分。

在所述第一方面的第十八实施方案(其也是所述第一方面的第十七实 施方案的实施方案)中，所述作为除HCMV以外的人病原体的一部分的 蛋白是这样的蛋白，在人受到除HCMV以外的人病原体的自然感染后在 人中形成针对所述蛋白的细胞毒性T淋巴细胞。

在所述第一方面的第十九实施方案(其也是所述第一方面的第十八实 施方案的实施方案)中，所述除HCMV以外的人病原体是选自包括HIV-1、 HBV、HCV和流感的组的人病原体。

在所述第一方面的第二十实施方案(其也是所述第一方面的第一、第 二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十 二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八和第十九实施方 案的实施方案)中，所述融合蛋白是包括全长T细胞抗原pp65和至少一 种异源肽的融合蛋白。

在所述第一方面的第二十一实施方案(其也是所述第一方面的第一、 第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第 十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九和第 二十实施方案的实施方案)中，所述病毒颗粒、或多个所述颗粒用于制备 治疗和/或预防疾病的药物。

在所述第一方面的第二十二实施方案(其也是所述第一方面的第一、 第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第 十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九和第 二十实施方案的实施方案)中，所述病毒颗粒、或多个所述颗粒用于在治 疗和/或预防疾病的方法中使用。

在所述第一方面的第二十三实施方案(其也是所述第一方面的第二十 一和二十二实施方案的实施方案)中，所述疾病是可以通过形成针对所述 至少一种异源肽或其衍生物的中和抗体，或通过诱导针对所述至少一种异 源肽或其衍生物的CD8⁺T淋巴细胞应答来治疗和/或预防的疾病。

在所述第一方面的第二十四实施方案(其也是所述第一方面的第一、 第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第 十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九和第 二十实施方案的实施方案)中，所述病毒颗粒、或多个所述颗粒用于制备 疫苗。

在所述第一方面的第二十五实施方案(其也是所述第一方面的第二十 四实施方案的实施方案)中，所述疫苗用于治疗和/或预防HCMV感染。

在所述第一方面的第二十六实施方案(其也是所述第一方面的第二十 四实施方案的实施方案)中，所述疫苗用于治疗和/或预防移植的副作用。

在所述第一方面的第二十七实施方案(其也是所述第一方面的第二十 六实施方案的实施方案)中，所述移植是实体器官或造血干细胞的移植。

在所述第一方面的第二十八实施方案(其也是所述第一方面的第二十 六和第二十七实施方案的实施方案)中，所述副作用是HCMV感染引起 的或与HCMV感染伴生。

本发明涉及的问题在第二方面(其也是所述第二方面的第一实施方案) 中，通过使用根据所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、 第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、 第十六、第十七、第十八、第十九和第二十实施方案中任一项的病毒颗粒 用于制备治疗和/或预防疾病或副作用的药物来解决，由此所述疾病或副作 用是如每一项和任一项前述实施方案和每一和任一方面中定义的疾病或 副作用。

本发明涉及的问题在第三方面(其也是所述第三方面的第一实施方案) 中，通过使用根据所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、 第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、 第十六、第十七、第十八、第十九和第二十实施方案中任一项的病毒颗粒 用于制备治疗和/或预防疾病或副作用的疫苗来解决，由此所述疾病或副作 用是如每一项和任一项前述实施方案和每一和任一方面中定义的疾病或 副作用。

基于这样的领悟，即异源肽序列进入pp65的插入位点对于随后的DB 形成效率很关键，本发明人已经意外地发现：包含在本发明病毒颗粒中并 包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽的融合蛋白 赋予DB有利的特性，条件是所述异源肽在pp65氨基酸序列的氨基酸位 点W175或氨基酸位点A534处插入。这些融合蛋白的有利特性包括诱导 针对所述异源肽的中和抗体，诱导针对所述异源肽的CD8⁺T淋巴细胞应 答和以高产率生成这样的DB。此外，pp65中的这两个基因座容许有效地 形成和释放包含所述融合蛋白的DB。关于这两种融合蛋白观察到的CD8+ T淋巴细胞应答引发CD8T细胞应答，这可以通过CD8T细胞级分的离体 Elispot分析容易地检测。

T细胞抗原pp65，本领域中也称为UL 83，已经通过Pande，H.等(Pande， H，Lee，T.D.，Churchill，M.A.和Zaia，J.A，″Structural analysis of a 64-kDa major structural protein of human cytomegalovirus(Towne)：identification of a phosphorylation site and comparison to pp65 of HCMV(AD169)(人巨细胞病 毒(Towne)的64-kDa主要结构蛋白的结构分析：识别磷酸化位点和与 HCMV(AD169)的pp65比较)；Virology(病毒学)178(1)，6-14(1990))记 述。

关于pp65的功能和关于对该蛋白的功能和正确折叠重要的结构域了 解甚少。因此，不存在肯定会留下pp65内功能相关区域的插入位点的选 择的基本原理。插入位点的选择以这样的方式进行，即避免在β-疱疹病毒 中保守的区域，并还预测二级结构(α-螺旋和β-折叠)。这是在假设保守区 域、α-螺旋和β-折叠可以在结构上和功能上很重要并不应该被破坏的条件 下进行的。然而，大多数这些突变体未能有效地形成recDB，从而显示该 策略不能鉴定合适的插入位点。鉴于此，本发明人意外地发现RV-SB3和 RV-SB6中的插入位点被证明更适合于recDB形成。

如在本申请中所示，通过DB-SB3和DB-SB6将嵌合pp65外源引入至 HFF导致pp65NLV和IE1TMY的有效呈递。将这些颗粒应用于HLA-A2 转基因HHD小鼠引发针对两种肽的CD8T细胞应答，其在体外扩展这些 T细胞后可以用关连肽检测到。在以前的实验中，利用在pp65的位置548 处插入IE1-肽的recDB，已经获得了类似的结果[21；22]。然而，利用后者 recDB，针对两者中任一肽的CD8T细胞不可离体地直接检测到，这提示 引发是无效的。相反，应用DB-SB3导致可容易检测到的频率的pp65NLV- 特异性和IE1TMY-特异性CD8T细胞。这说明这些recDB具有高免疫原 性并诱导针对内源和异源肽二者的T细胞。

在本发明的实施方案中，所述异源肽是抗原肽，且更优选地，抗原异 源肽。

在本发明的实施方案中，所述异源肽与HCMV的IE1蛋白或其一部分 不同。

在本发明的实施方案中，肽的长度是约4-40个氨基酸残基，优选约 6-25个氨基酸残基和更优选约8-15个氨基酸残基和最优选约8-12个氨基 酸残基。

如优选使用地，指定范围边界的任何词语诸如，例如“1-5”意指从1 至5的任何整数，即1、2、3、4和5。换言之，由两个整数定义的任何范 围包括限定所述定义边界的两个整数和由所述范围包括或所述范围内包 含的任何整数。

在本发明的实施方案中，本发明的病毒颗粒的抗原性与现有技术的密 体相比，更具体地，与其中密体包含包括全长T细胞抗原pp65的融合蛋 白的那些密体相比，有所增加。

在本发明的实施方案中，本发明的病毒颗粒的形成与如[25]中所述密 体的形成相比，有所增加。

本领域中技术人员应该承认，优选地，HCMV蛋白IE1也称为ppUL123。

还应该承认，所述颗粒中包含的融合蛋白在优选的实施方案中是嵌合 蛋白。

本发明现在进一步通过参考下图和实施例来举例说明，由其可以获得 其他优点、特征和实施方案，其中

图1显示受HCMV重组体感染的HFF的间接免疫荧光分析的结果；

图2显示免疫印迹分析的结果(A)、作为图表指示关于多种融合蛋白的 基因组拷贝/ml作为时间(d.p.i)的函数的定量DNA-PCR分析结果(B)，和另 一个免疫印迹分析的结果(C)；

图3显示IFN-γ-Elispot分析结果，其作为图表指示利用pp65NLV-CTL (A)或IE1TMY-CTL(B)作为效应器细胞的、关于多种融合蛋白的应答 CD8⁺细胞的百分比；

图4显示IFN-γ-Elispot分析结果，其作为图表指示利用RMA-S细胞 作为刺激器细胞的、关于多种融合蛋白的应答CD8⁺细胞的百分比；和

图5显示全长pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图1显示受HCMV重组体感染的HFF的间接免疫荧光分析的结果。 使用指定的病毒感染细胞四天，并随后进行免疫荧光分析。由各病毒表达 的重组体pp65构造在显微照片下显示。标示pp65的N端氨基酸，其侧邻 插入位点。

图2显示pp65-融合蛋白的表达、重组病毒的复制和融合蛋白包装到 病毒体和DB中的效率。(A)，2-和4-天感染的HFF的免疫印迹分析。细 胞以m.o.i.为2来感染并在指定时间收集以用于分析。使用pp65-特异性单 克隆抗体65-33探查滤器。各泳道中的蛋白量针对β-肌动蛋白进行标准化。 (B)，感染的HFF的细胞培养物上清中病毒基因组的定量DNA-PCR分 析。细胞以10个基因组/细胞的m.o.i.来感染。培养物上清在指定时间点收 集并冷冻。在相同测定中平行进行PCR分析。(C)，包装在recDB或病毒 体中的pp65的免疫印迹分析。用重组病毒或用wt RV-HB5感染细胞6-7 天。对上清进行甘油-酒石酸盐梯度离心，以收集病毒体-和DB-级分。这 些级分通过使用单克隆抗体65-33或，作为内标，使用针对病毒性gB的 单克隆抗体的免疫印迹法来分析。

图3显示由用recDB处理的HLA-A2阳性HFF引起的MHC-类别I呈 递的IFN-γ-Elispot分析结果。细胞使用指定的DB来处理，并随后用作使 用pp65NLV-CTL(A)或IE1TMY-CTL(B)作为效应器细胞的IFN-γ-Elispot 分析中的刺激器细胞。

图4显示来自用recDB免疫的HHD-小鼠的富含CD8+的脾细胞的离 体IFN-γ-Elispot分析结果。使用负荷有关连肽的RMA-S细胞作为刺激器 细胞。柱尺寸代表分泌IFN-γ的CD8T细胞的最概然频率，其通过由 等[37]所述的线性回归分析确定。误差棒表示95％置信区间。

实施例1：材料和方法

1.细胞

初级人包皮成纤维细胞，即CTL品系和T2细胞如以前所述培养[23]。 RMA-S细胞[24]在增补了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、50mg庆大霉素 L-1和5μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基(PAA实验室(PAA Laboratories)，德国)中培养。

2.质粒和病毒

为了诱变病毒DNA，使用HCMV细菌人工染色体(BAC)pHB5[25]。 pHB5的诱变根据如别处[21]所述的galK阳性/阴性选择程序[26]进行。插 入至UL83可读框中的DNA序列编码HLA-A2呈递的肽IE1TMY [IE1297-305]，其侧邻另外的氨基酸以容许准确的蛋白酶体加工。与pp65 融合的另外的多肽读作TSDACMMTMYGGISLLSEFC，其中HLA-A2呈 递的九肽带下划线。根据Hobom等[27]进行从BAC克隆重建病毒。

生成、滴定病毒原液并通过在p.i.48小时对IE1阳性细胞计数或通过 胞外病毒基因组TaqMan DNA PCR分析来量化病毒原液，如[28]所述。将 HFF感染7天。以0.1的moi感染导致数量大约为10个的胞内病毒基因 组。

3.密体纯化、间接免疫荧光分析和免疫印迹法

通过最初由Irmiere和Gibson[29]发表的甘油-酒石酸盐梯度超速离心 法并如以前所述[20]由晚期感染的HFF纯化DB。间接免疫荧光分析如[30] 所述进行。使用单克隆抗体65-33(由W.Britt，University of Alabama(阿 拉巴马大学)，Birmingham(伯明翰)，阿拉巴马，美国，友情提供)和FITC 缀合的次级抗体(DAKO，汉堡，德国)标记pp65。用DAPI复染细胞核。利 用放大倍数为1000倍的Axiophot-1显微镜(Zeiss)来收集来自免疫荧光分 析的数据。对于免疫印迹法，将蛋白样品在还原条件下变性，通过 SDS-PAGE分离并通过以400mA进行电印迹1小时45分钟而转移到硝化 纤维膜(Millipore，Schwalbach，德国)上。所述膜与针对pp65的抗体，针对 β-肌动蛋白的抗体(Rockland，Gilbertsville，PA，美国)和针对糖蛋白B(gB) 的抗体[31]温育。蛋白质印迹使用与ALEXA Fluor 680(Invitrogen， Karlsruhe，德国)或IRdye 800(Rockland)缀合的抗小鼠或抗兔次级抗体来 探查。利用Odyssey红外成像系统(LI-COR，Lincoln，Nebraska，美国)来检 测和量化印迹的蛋白。

2.4与recDB温育的HFF的干扰素γ-Elispot测定

如前所述进行酶联免疫斑点(Elispot)测定[23；32]。特异于HLA-A0201 (A2)限制的HCMV-来源的肽pp65495-503(pp65NLV-CTL)[33；34]和 IE1297-305(IE1TMY-CTL)[35]的CTL品系被用于这些分析中。CTL品系 已经通过免疫HLA-A2/huCD8双转基因(tg)小鼠产生[23]。

2.5HLA-A2转基因小鼠模型

分别使用RV-HB5(DB-HB5)、RV-SB3(DB-SB3)或RV-SB6(DB-SB6) 的6μgDB，或使用PBS，腹膜内免疫8-12周龄的HLA-A2转基因小鼠 (HHD小鼠，[36])。免疫后第7天，由脾制备淋巴细胞。通过MACS分选 富集CD8T细胞，并且使用负荷肽的RMA-S HHD或T2刺激器细胞，直 接通过Elispot离体分析分泌IFN-γ的细胞的频率。在该设置下，使用来自 Millipore(Schwalbach/Ts.，德国)的Elispot板。Elispot测定根据制造商建议 进行。应答细胞的频率通过如等[37]所述的线性回归分析来确定。

实施例2：插入位点选择对于形成胞质DB很关键

如将在本实施例中举例说明地，异源肽的插入位点的选择对于形成胞 质DB很关键。

待进一步开发的疫苗候选者的潜力关键取决于进一步扩大规模所能获 得的产量。在以前的工作中，可以提供这样的证据，即DB可以通过使异 源肽序列融合于间层蛋白pp65而在其抗原含量方面改进[21]。然而，使用 HCMV的各种重组体感染的细胞仅释放有限量的recDB。因此，测试这样 的假说，即在pp65内其他位点处插入异源序列诸如异源肽的氨基酸序列 将提高recDB的产率。

选择该分子不同部分中的五个位点进行插入(图1)。插入的肽由20 个氨基酸组成，其包含来自HCMV IE1蛋白的HLA-A2呈递的九肽 TMYGGISLL(IE1TMY)[35]。利用基于galK的选择程序[21；22]，通过改 造HCMV BAC质粒pHB5[25]，生成重组病毒。通过插入位点的限制性内 切酶消化和核苷酸测序分析重组BAC-质粒的准确性(数据未显示)。随后 通过将BAC-质粒转染至HFF中进行重组病毒的重建。测试由此产生的病 毒的DB形成。HFF的HCMV感染的一个标志是DB的胞质累积，这可 以通过间接免疫荧光分析(IFA)显现。因此，使用新生成的突变体感染HFF 并在感染后4天(4d.p.i.)时，利用pp65-特异性抗体进行IFA(图1)。只有 使用突变体RV-SB3和RV-SB6感染的细胞以与亲代病毒感染细胞中DB 形成相当的方式显示出胞质DB的形成。相反，在RV-SB2、RV-SB4和 RV-SB5感染的细胞中未看到或仅看到很少的DB形成。注意，在这些细 胞中，典型见于晚期感染的HFF中的pp65的核质易位被削弱。这些结果 说明pp65内插入异源肽序列的位点选择对于recDB形成很关键。基于IFA- 结果，选择病毒RV-SB3和RV-SB6进行进一步的分析。

实施例3：将RV-SB3和RV-SB6与亲代毒株进行比较

如将在本实施例中所示地，重组病毒RV-SB3和RV-SB6在pp65-表达、 病毒体释放和pp65包装到颗粒中方面，与亲代毒株相当。

RV-SB3-和RV-SB6-感染的HFF中的pp65表达水平通过免疫印迹分析 来测试。分别使用两者中任一病毒或使用亲代RVHB5感染细胞2或4天。 利用Odyssey红外成像系统，对细胞裂解物进行定量免疫印迹分析。细胞 肌动蛋白的量取作内标(图2A)。与亲代RV-HB5感染的细胞中的pp65 水平相比，在RV-SB3-和RV-SB6-感染的细胞中的pp65-融合蛋白的表达水 平在p.i.2天时降低。然而，在p.i.4天时，两种融合蛋白的水平似乎甚至 高于RV-HB5感染的细胞中的pp65的水平。这说明在RV-SB3-和RV-SB6- 感染的细胞中合成充足的蛋白，从而指导recDB的合成。

为了测试重组毒株在HFF中复制的能力，将细胞以0.1的m.o.i.感染， 由此导致10个基因组拷贝/细胞并以每日间隔收集培养物上清直至p.i.7 天。利用定量PCR分析量化释放至上清中的病毒DNA(图2B)。RV-SB3 和RV-SB6二者都证明复制的水平与亲代RV-HB5相似。

最后，通过纯化的病毒体和DB的免疫印迹分析来分析融合蛋白的包 装，所述纯化的病毒体和DB通过甘油梯度离心从感染的HFF上清收集。 这样，利用病毒被膜糖蛋白B(gB)作为内标进行标准化。当重组毒株与其 亲代毒株相比较时，没有发现在pp65包装到病毒体或DB中这方面的差 异(图2C)。总汇这些结果说明：RV-SB3和RVSB6二者在pp65的表达 和包装方面以及在感染细胞中复制方面与RV-HB5相当。

实施例4：由DB-SB3-或DB-SB6-处理的HFF表达pp65NLV和IE1TMY 二者

本实施例显示DB-SB3-或DB-SB6-处理的HFF呈递pp65NLV和 IE1TMY二者。

使用recDB进行疫苗开发的一个目标应该是支持移植后患者中的细胞 毒性T细胞重建。这些细胞已经显示对预防病毒再活化和疾病至关重要 ([16]中综述的[13；15])。由此测试recDB是否能够将pp65-衍生的pp65NLV 和IE1-衍生的IE1TMY二者引入至HFF的MHC-类别I呈递途径中。

因此，细胞使用recDB来处理并随后进行干扰素-γElispot分析(图3)。 作为效应器细胞，使用针对两种肽(pp65NLV-CTL；IE1TMY-CTL)的CTL 克隆[23]。DB-SB3-和DB-SB6-处理的细胞均呈递IE1TMY和pp65NLV。 pp65NLV-呈递在recDB和wt-DB之间是相当的，这说明IE1-衍生序列的 插入不削弱HFF中的pp65-呈递。使用DB-SB3处理细胞导致应答的 IE1TMY-CTL的数量水平与pp65-特异性应答相当。然而，使用DB-SB6 处理细胞在IE1-特异性测定中导致明显减少数量的阳性斑点。这说明DB 温育后HFF呈递IE1-肽的能力对肽插入pp65的位点敏感。

实施例5：使用重组DB(recDB)免疫导致IE1TMY-特异性和pp65NLV- 特异性CD8T细胞

本实施例显示使用重组DB(recDB)免疫引发显著频率的IE1TMY-特 异性和pp65NLV-特异性CD8T细胞。

以前的实验已经显示recDB在小鼠中可以诱导IE1TMY-特异性CD8T 细胞。然而，这些细胞仅在体外刺激来自免疫的小鼠的CD8T细胞级分后 用关连肽可检测到。没有直接离体检测到应答性CD8T细胞，这说明特异 性细胞总量，及由此针对那些recDB的总体应答很低[21]。为了评估新构 建的recDB的免疫学潜力，在缺乏佐剂的条件下，使用不同的DB免疫 HLA-A2转基因HHD-小鼠。如所预期地，特异于IE1TMY或pp65NLV的 应答性CD8T细胞在体外刺激后是可检测的(数据未显示)。

来自免疫小鼠的细胞也直接离体测试。为此，将脾细胞的CD8⁺级分通 过MACS-分选分离并利用负荷有肽的抗原呈递细胞在Elispot分析中测试。 特异于IE1TMY的CD8T细胞可以在使用DB-SB3和DB-SB6二者免疫后 检测到(图4)。由DB-SB3引发的IE1-特异性应答似乎比由DB-SB6诱导 的应答更强，但是二者均达到明显可检测水平。在使用DB-SB3免疫后， 与wt-DB相比，可以检测到的针对pp65NLV起反应的CD8T细胞达到大 约三倍水平。

然而，令人意外地，该应答在使用DB-SB6免疫后选择的实验设置中 不可检测，且不可离体检测到pp65NLV-特异性应答。该结果在第二个实 验中证实，并说明通过使用DB-SB6免疫、针对免疫显性pp65NLV-肽引 发的CD8T细胞应答是效率低的(图4)。当选择T2细胞进行抗原呈递时 获得相似的结果(数据未显示)。此外，这说明这些细胞仅以低于测定检 测极限的低频率诱导。由此，与IE1TMY-特异性细胞相比，体外pp65NLV- 特异性T细胞的再刺激被延迟。

总之，这些实验特别地证明DB-SB3引发针对异源抗原肽的CD8T细 胞应答的潜力。

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在本申请中，参考如下各种参考文献：

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本说明书、权利要求书、序列表和/或附图中公开的本发明的特征可以 独立地和以其任何组合的形式作为实现本发明各种形式的材料。