使用分类学的层级分类鉴定和/或表征微生物菌剂

摘要

用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法包括下列步骤：从微生物菌剂获得分析测试数据（例如，获得在发射波长的范围内的内在荧光值）。该分析测试数据被变换，从而最小化生物组内的菌株间变化。借助于编程计算机，执行被编码为对经变换的分析测试数据操作的一组处理指令的多级别分类算法。多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。

说明书

背景

本申请涉及用于自动表征和/或鉴定存在于储存在样品容器中的样本 例如血液或其它生物样本中的微生物菌剂的方法的领域。作为例子，本公 开的方法快速和自动地提供关于微生物菌剂的革兰氏（Gram）类型（阳性 或阴性）、形态学、种的信息或其它相关的临床信息。

目前在美国的市场上存在检测血液样本中的微生物的生长和因而检 测微生物的存在的仪器。一种这样的仪器是本受让人bioMérieux公司的 BacT/ALERT 3D仪器。该仪器接收包含例如来自人类患者的血液样本的血 液培养瓶。该仪器培养该瓶。在培养箱中的光学检测单元在培养期间定期 地分析合并到瓶中的比色传感器，以检测微生物生长是否出现在瓶内。在 专利文献中描述了光学检测单元、样品容器和传感器，见美国专利 4,945,060、5,094,955、5,162,229、5,164,796、5,217,876、5,795,773和 5,856,175，每个专利的全部内容通过引用被并入本文。通常涉及生物样本 中的微生物的检测的所关注的其它现有技术包括下面的专利：U.S. 5,770,394、U.S.5,518,923、U.S.5,498,543、U.S.5,432,061、U.S.5,371,016、 U.S.5,397,709、U.S.5,344,417、U.S.5,374,264、U.S.6,709,857和U.S. 7,211,430。

在检测仪器例如BacT/ALERT 3D和类似的仪器中，一旦血液培养瓶 被测试为对于微生物存在是阳性的，由于血液成分的干扰和包含样本的一 次性系统（例如，瓶）的假象，获得微生物菌剂的高水平的表征或微生物 菌剂的种的鉴定很难。因此，当前的方法使用如上所述的用于样本中的微 生物的自然生长和检测的瓶或其它适当的一次性容器和有关仪器。一旦仪 器指示瓶对于微生物菌剂的存在是阳性的，根据当前方法“阳性”瓶就从 仪器被人工取回，且样本的一部分从瓶被人工移出并在琼脂平板上被人工 培养。在本领域中存在使样本介质在培养平板上的划线分离和平板的培养 自动化的仪器。在美国专利6,617,146中描述了一种这样的仪器。在划线 分离之后，平板被人工放置在培养箱中并被定期检查微生物的传代培养物 的生长。在传代培养物充分生长之后，培养物的样本从平板获取并被放置 在试管中。试管接着被插入又一仪器中用于经由具有多个单独的孔的一次 性测试样本卡进行鉴定测试。一次性测试卡在专利文献中是已知的，见例 如美国专利4,118,280、3,963,355、4,018,65；4,116,775和4,038,151、 5,609,828、5,746,980、5,766,553、5,843,380、5,869,005、5,916,812、5,932,177、 5,951,952和6,045,758，这些专利的全部内容通过引用被并入本文。

接着在受让人的在本领域中被称为VITEK 2仪器的分析仪器中处理 测试样本卡。VITEK 2仪器培养并使用阅读器单元（reader unit）定期地读 取测试样本卡的孔。在卡的一个或多个孔中的样本的生长导致微生物菌剂 的鉴定。在专利文献中描述了VITEK 2仪器，见美国专利5,762,873和 6,086,824，其内容通过引用被并入本文。

从将样本引入到血液收集瓶中的时间起到通过VITEK 2仪器进行微 生物的培养、微生物存在的检测和接着微生物的鉴定的这整个过程一般花 费2-5天。发生在阳性瓶检测之后的单独的鉴定步骤一般占这些天中的1-3 天。

如果血液样本中的微生物菌剂的检测和鉴定以及将结果报告给临床 医生所花费的时间可从当前的2-5天减小到少于一天，则对患者的相当大 的和可能救命的临床益处是可能的。本文件公开了用于使用分类学的层级 分类方法来快速鉴定和/或表征生物样本例如血液样本中的微生物菌剂的 方法。

概述

在第一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂 （microbialagent）的方法。该方法包括从微生物菌剂获得在发射波长的范 围内的内在荧光（intrinsic fluorescence）值的步骤。荧光值在多个激发波 长处被获得。内在荧光测量结果（intrinsic fluorescence measurement）经受 变换操作，从而最小化生物组（organism group）内的内在荧光测量结果的 菌株间变化（strain to strain variation）。变换操作的例子包括自然对数变换 和一阶导数运算。借助于编程计算机，该方法包括执行被编码为对经变换 的内在荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法（multi-level classification algorithm）的步骤。多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物 菌剂的在分类层级（taxonomic hierarchy）中的不同级别。

在一个实施方式中，多级别分类算法以分类层级中的较高级别到分类 层级中的较低级别的顺序单调地进行。例如，多级别分类算法首先按革兰 氏类别、接着按科并接着按种对微生物菌剂分类。

在一个实施方式中，多级别分类算法对于算法中的每个级别包括下列 步骤：（a）对一组预定的激发/发射对的经变换的荧光值和协方差矩阵的逆 矩阵（inverse）执行距离计算；（b）使用距离计算的结果以及最小距离阈 值和低区别阈值（low discrimination threshold）执行分类解释；以及（c） 产生分类结果。这组预定的激发/发射对在激发和发射值的整个范围内从来 自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结果得到，这组预定的激发/发射对针 对其区分开不同的微生物菌剂的能力而被选择。

在另一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂 的方法，其包括下列步骤：在激发和发射值的整个范围内从已知的微生物 菌剂实验地获得内在荧光测量结果，并针对区分开不同的微生物菌剂的能 力从这样的测量结果中选择一组激发／发射对；按照这组激发／发射，从 未知的微生物菌剂获得内在荧光测量结果；变换来自未知的微生物菌剂的 内在荧光测量结果，从而最小化在生物组内的内在荧光测量结果的菌株间 变化；以及使用经变换的内在荧光测量结果和从已知的微生物菌剂实验地 获得的内在荧光测量结果、借助于执行分类算法的编程计算机来鉴定和/ 或表征未知的微生物菌剂。

在优选实施方式中，分类算法包括被编码为对经变换的内在荧光测量 结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在样 本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。

方法通常可应用于微生物菌剂和样本。在一个可能的实现方式中，样 本是人类或动物血液的样本，且微生物菌剂是存在于血液中的菌剂（例如， 细菌）。

分类学的层级分类方法（taxonomic hierarchical classification method） 除了内在荧光数据以外还可与不同的分析数据一起使用。概括本公开，公 开了用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，其包括下 列步骤：获得微生物菌剂的分析测试数据（例如，质谱或拉曼散射数据）； 变换该分析测试数据，从而最小化在生物组内的分析测试数据的菌株间变 化；以及借助于编程计算机，执行被编码为对经变换的分析测试数据操作 的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在样本中的微 生物菌剂的在分类层级中的不同级别。

在又一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂 的方法，其包括下列步骤：从已知的微生物菌剂实验地获得分析测试数据， 并针对区分开不同的微生物菌剂的能力从这样的测试数据选择测试数据 的子集；从未知的微生物菌剂获得与分析测试数据的子集相关的分析测试 数据；变换来自未知的微生物菌剂的分析测试数据，从而最小化在生物组 内的内在荧光测量结果的菌株间变化；以及使用经变换的分析测试数据和 从已知的微生物菌剂实验地获得的分析测试数据、借助于执行分类算法的 编程计算机来鉴定和/或表征未知的微生物菌剂。

附图的简要说明

图1是测量装置的示意图，在该测量装置中可使用本公开的方法。

图2A-2C是示出一系列处理指令的流程图，所述指令使用内在荧光测 量结果来执行浓缩的微生物菌剂的鉴定和/或表征。

图3-8是内在荧光（IF）测量结果及其变换的曲线，其示出在最小化 生物组内的菌株间变化方面图2A的预处理指令的益处。

图9和10是IF测量结果的自然对数变换的一阶导数的曲线，其示出 对315nm和415nm的激发波长在种的子集之间的可能区别。

详细描述

本文描述了用于鉴定和/或表征微生物菌剂的方法。在优选实施方式 中，对与样本中的其它成分分离的浓缩的微生物菌剂执行该鉴定和/或表 征。可在浓缩的微生物菌剂储存在用于微生物菌剂的分离和浓缩的一次性 设备中时执行该方法；可选地，可在微生物菌剂从一次性设备移出之后执 行该方法。在标题为“System for rapid identification and/or characterization of a microbial agent in a sample,e.g.,blood”、律师档案号为09-271-B的共同未 决的申请序列号_________中描述了用于样本例如血液中的微生物菌剂的 分离和浓缩的方法、仪器和设备的例子，该申请通过引用被并入本文。这 样的方法、仪器和设备对本公开的方法不是特别重要，且因此不提供详细 描述，以便不使本公开不清楚。

现在将结合图1描述检测布置和一次性设备的一个代表性例子。图1 是测量装置的示意性图示，在该测量装置中本公开的方法可被使用。该装 置包括一次性分离和浓缩设备10，包含未知微生物菌剂的样本14放置在 该设备10中。利用样本中的非微生物菌剂成分（例如，血细胞）的任选 的选择性裂解、存在于设备10中的致密垫（density cushion）和离心作用 将微生物菌剂浓缩成团粒沉淀状块（pellet-like mass）12。密度梯度和离心 作用在存在于设备10中的毛细管15的底部浓缩微生物菌剂。

测量装置包括在激发波长处发射光18的光源16，以刺激内在荧光从 微生物菌剂12产生。发射辐射20被导至任选地耦合到光谱仪24的传感 器阵列22上。在波长波段中的荧光发射数据被发送到计算机26。计算机 耦合到存储器30，其存储程序代码（包括执行图2A-2C所示的处理指令的 序列的代码）、在模块中使用的常数、以及包括很多预期微生物菌剂和在 特定的激发和发射对中的实验地获得的荧光数据的模型，所述激发和发射 对以下面描述的方式区分开微生物。计算机26借助于存储在存储器30中 的信息和代码来处理数据，并产生显示在所连接的工作台显示器28或其 它适当的输出设备上的分类结果，其细节并不重要。

在下面的申请中更详细地描述了分离、浓缩和探询方法：2009年10 月30日提交的标题为“Methods for the isolation and identification of microorganisms”的美国序列号12/589,929、2009年10月30日提交的标题 为“Separation device for use in the separation,identification and/or characterization of microorganisms”的美国序列号12/589,969、2009年10 月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”的美国序列号 12/589,952、2009年10月30日提交的标题为“Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using mass spectrometry”的美国序列号12/589,936、2009年10月30日提交的标题为 “Method for separation and characterization of microorganisms using identifier agents”的美国序列号12/589,985、2009年10月30日提交的标 题为“Method for detection,identification and/or characterization of microorganisms in a sealed container”的美国序列号12/589,968、2009年10 月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using Raman spectroscopy”的美国序列号 12/589,976，这些申请的内容通过引用被并入本文，本发明的方法不限于 这些技术。

一旦存在于样本中的微生物或其它微生物菌剂在分离设备10中被分 离和/或成团粒，分离的样本或团粒沉淀就如下所述的被探询（例如，利用 光谱方法、使用内在荧光测量结果），以表征和/或鉴定样本或团粒沉淀中 的微生物。探询可以以非侵入式方式发生，也就是说，当团粒沉淀保留在 用于分离和浓缩微生物菌剂的设备10中时，团粒沉淀可以被探询。以非 侵入方式鉴定微生物的能力，任选地与在整个分离和表征/鉴定过程中保持 设备10密封以及自动化该程序结合，避免了污染和/或感染的样本的持续 处理，并极大增加了整个过程的安全性。此外，通过直接探询来表征和/ 或鉴定微生物而不进一步处理样本或团粒沉淀12（例如，菌落的重新悬浮、 接种和生长）的能力极大地增加了可进行鉴定/表征的速度。

在一个实施方式中，光谱方法可用于分析微生物的一种或多种固有特 性，例如当没有额外的剂例如着色剂、染料、载色剂等时存在于微生物中 的特性。在其它实施方式中，光学光谱学方法可用于分析微生物的一种或 多种非固有特性，例如只可借助于额外的剂检测的特性。使用荧光光谱法 来执行优选形式的探询。例如，前端面荧光（其中激发光和发射光进入并 离开同一光学表面，且如果样本通常是光学上厚的，激发光穿透一段非常 短的距离进入样本中）（见例如Eisinger,J.和J.Flores的"Front-face fluorometry of liquid samples,"Anal.Biochem.94:15(1983)）可用于鉴定团 粒沉淀中的微生物。

一般，光源16或激发源导致样本的激发，后面是在预定的时间点或 连续地测量样本的荧光20的发射。类似地，来自激发源与样本的交互作 用的反射光可被测量，以提供用于鉴定和/或表征的相关数据。可通过光谱 鉴别的任何适当的方式、最优选地使用光谱仪24来测量来自样本的发射。

在目前优选的实施方式中，进行对照测量（例如，荧光光谱），以获 得存储在存储器30中的已知的微生物和数据，因而允许使用本领域中的 技术人员已知的各种数学方法来将所测量的测试数据与所关注的微生物 的表征相关联。来自已知的微生物的所测量的测试数据存储在机器可读存 储器30中，例如在实现本方法的仪器内或在相关的数据处理设备例如所 连接的工作台内。这些方法可用于基于现有的命名法将正被测试的样本中 的所关注的未知微生物分类到相关的组（例如种）中，和/或在设计用于如 前所述监控、检测和/或表征生物的系统时基于生物的代谢、病原性和/或 毒性将未知微生物分类到自然出现的组中。

样本照明源（见图1）或激发源16可选自如本领域中的技术人员已知 的任何数量的适当光源。可使用产生可用的数据的电磁光谱的任何部分。 能够在紫外、可见光和/或近红外光谱以及电磁光谱的其它部分中发射的光 源可被利用并且是本领域中的技术人员已知的。例如，光源可以是连续光 谱灯（continuum lamp），例如用于产生紫外光的氘或氙弧灯和/或用于产生 可见光/近红外激发的钨卤素灯。这些光源提供宽的发射范围，且特定的激 发波长的光谱带宽可使用光学干涉滤波器、棱镜和/或光栅来减小，如本领 域中公知的。

可选地，多个窄带光源例如发光二极管和/或激光器可以在空间和/或 时间上被多路复用以提供多波长激发源。例如，从240nm到超过900nm 的发光二极管是可用的，且源具有20-40nm的光谱带宽（半高全宽）。激 光器在从紫外到近红外的分立波长（discrete wavelength）中是可用的，并 可使用本领域中的技术人员公知的多路复用方法来使用。

可通过使用光谱鉴别装置例如扫描单色仪来提高光源中的任一个的 光谱选择性。如本领域中的技术人员已知的，可利用其它鉴别方法，例如 声光可调谐滤波器、液晶可调谐滤波器、光学干涉滤波器的阵列、棱镜摄 谱仪等，以及以任何组合。在选择光谱鉴别器时的考虑因素考虑可调谐性 的范围以及选择性的水平。作为例证，例如鉴别器可以按10nm的选择性 来利用300-800nm的波长范围。这些参数通常确定实现可调谐性范围以及 选择性所必需的最佳技术。

来自光源16的照明导致样本的激发，后面是在预定的时间点或连续 地测量样本的荧光的发射。类似地，来自激发源与样本的交互作用的反射 光可被测量，以提供用于鉴定和/或表征的相关数据。

可通过光谱鉴别的任何适当的方式、最优选地使用光谱仪24来测量 来自样本的发射。光谱仪可以是检测特定的发射波长的扫描单色仪，由此， 来自单色仪的输出由光电倍增管检测，和/或光谱仪可配置为成像摄谱仪， 由此，输出由成像检测器阵列例如电荷耦合器件（CCD）检测器阵列检测。 在一个实施方式中，鉴别器允许通过光电检测装置（例如光电倍增管、雪 崩光电二极管、CCD检测器阵列和/或电子倍增电荷耦合器件（EMCCD） 检测器阵列）来观察荧光和/或散射信号。

光谱技术用于获得优选地被提供为激发-发射矩阵（EEM）测量的测量。 如本文使用的，EEM被定义为作为激发波长和发射波长的函数的荧光物质 的发光光谱发射强度，并包括全光谱或其子集，其中子集可包含单个或多 个激发/发射对。此外，具有固定的激发波长的EEM的横截面可用于显示 特定的激发波长的发射光谱，而具有固定的发射波长的EEM的横截面可 用于显示样本的激发光谱。在一个实施方式中，在多于一个特定的激发- 发射波长对处例如在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个特定的激发- 发射波长对处测量多个EEM。

已发现，前端面荧光光谱法在测量高度散射和高度淬火的样本的荧光 和/或反射特性时提供优点。在一个实施方式中，前端面方法可能是特别有 用的。例如，前端面荧光可能在高度吸收的样本中特别有用，因为激发和 发射光束不需要穿过样本的主体（bulk）传播，并因此可能较少受可能包 含在其中的干扰成分（例如，血细胞和微生物培养基）的影响。可在这样 的角处照射分离设备1904的光学表面，以便提供如本领域中的技术人员 已知的可接受的结果（例如，Eisinger,J.和J.Flores的"Front-face fluorometry of liquid samples,"Anal.Biochem.94:15-21(1983)）。在一个实施方式中，系 统被设计成使得光谱系统除了最少在一个固定角处测量发射荧光以外还 最少在一个固定角处测量漫反射光。

在一些实施方式中，在分离的样本或团粒沉淀中的微生物的表征和/ 或鉴定不需要涉及确切的种的鉴定。表征包括生物颗粒的广泛归类或分类 以及单个种的实际鉴定。来自分离的样本或团粒沉淀的微生物的分类可包 括微生物的表型和/或形态学特征的确定。例如，生物颗粒的表征可基于可 观测的差异例如成分、形状、尺寸、成簇（clustering）和/或代谢来实现。 在一些实施方式中，所关注的生物颗粒的分类可能不需要给定生物颗粒的 特征的预先知识，而只需要与经验测量结果的一致关联，因而使这种方法 比基于特定的结合事件或代谢反应的方法更通用和容易接受。如本文使用 的，“鉴定”意指确定以前未知的微生物属于哪个科、属、种和/或菌株。 例如，鉴定以前未知的微生物到科、属、种和/或菌株级别。

在一些实例中，表征包括对于将采取的行动提供足够的有用信息的分 类模型。如本文使用的，优选的分类模型包括分组到下列项中的一个或多 个中：（1）革兰氏组；（2）临床革兰氏组；（3）治疗组；（4）功能组；以 及（5）自然内在荧光组。

（1）革兰氏组：在革兰氏组分类之内，微生物可基于其革兰氏染色反 应和总尺寸被置于三种广泛的分类类别之一中，所述组选自下列项中的一 个或多个：（a）使用革兰氏染色染深蓝色的革兰氏阳性微生物；（b）使用 革兰氏染色染红色的革兰氏阴性微生物；以及（c）使用革兰氏染色染深蓝 色的酵母细胞，但其为按照其形态学特征和尺寸与细菌区分开的非常大的 圆细胞。

（2）临床革兰氏组：此革兰氏组可进一步分成代表区分形态学特征的 几个子类别。这些子类别包括由有经验的实验室技术专家报告的所有相关 临床信息，并因此比阳性或阴性革兰氏反应提供更高级别的鉴定。这个特 定的分类是非常有帮助的，因为它消除了关于依赖于革兰氏染料的质量和 /或技术人员的技能水平的忧虑，技术人员通过使用自动化系统提供等效的 临床相关信息来读取涂片。更具体地，基于这个分类模型的微生物的子类 别可选自下列项中的一个或多个：（a）球菌，其是小的圆细胞；（b）双球 菌，其是结合在一起的两个小圆细胞；（c）杆状菌（rod），其是矩形形状 的；以及（d）杆菌（bacilli），其是杆状的。可由额外的形态学信息确定 的这些子类别的例子包括：（i）革兰氏阳性球菌；（ii）成链的革兰氏阳性 球菌；（iii）成簇的革兰氏阳性球菌（即，“葡萄状”簇）；（iv）革兰氏阳 性双球菌；（v）革兰氏阳性杆状菌；（vi）具有内生孢子的革兰氏阳性杆状 菌；（vii）革兰氏阴性杆状菌；（viii）革兰氏阴性球杆菌；（ix）革兰氏阴 性双球菌；（x）酵母；以及（xi）丝状真菌。

（3）治疗组：此治疗组包括多个微生物种，其当从特定的样品类型 分离时使用同一类的抗生素或抗生素的混合物来治疗（例如，如在“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy2008”中所述的）。在很多情况下，临床医 师不需要种级别的鉴定来实现从初始经验治疗到更定向的治疗的改变，因 为多于一个种可使用相同的抗生素选择来治疗。这个分类级别正确地将这 些“相同治疗”微生物置于单个治疗类别中。这个表征级别的例子包括区 分开高度耐药的肠杆菌科（Enterobacteriacae，EB）的种与敏感的EB种（区 分开肠杆菌属的种与肠埃希氏菌），或区分开抗氟康唑的念珠菌属 （Candida）的种（光滑念珠菌（C.glabrata）和克柔念珠菌（C.kruzei）） 与敏感的念珠菌属的种（白色念珠菌（C.albicans）和近平滑念珠菌（C. parapsilosis）），等等。

（4）功能组：根据本发明，微生物还可基于代谢、毒性和/或表型特 征的混合来被置于几个组中。非发酵的生物可以清楚地与发酵的生物区分 开。此外，产生溶血素的微生物种可与非溶血的种分开地被分组。在一些 情况下，这些组代表比属级别宽的类别（例如，大肠杆菌类、革兰氏阴性 非发酵杆状菌），一些在属级别（例如，肠球菌属（Enterococcus）、念珠菌 属），而一些较接近于种级别区别（例如，凝固酶阴性的葡萄球菌、α-溶血 性链球菌、β-溶血性链球菌、凝固酶阳性的葡萄球菌，即，金黄色葡萄球 菌（S.aureus））。

（5）自然内在荧光（“IF”）组：微生物还可基于其自然倾向被置于类 别中以按照其固有和/或内在荧光特征分组在一起。这些组中的一些可能对 治疗和功能组类别是共同的。这些分组可包括具有特征IF标记的单独的种 例如粪肠球菌（E.faecalis）、化脓性链球菌（S.pyogenes）或绿脓杆菌（P. aeruginosa），和/或可包含具有相对保守的IF标记的小生物组，例如肺炎 克雷伯菌（K.pneumoniae）-产酸克雷伯菌（K.oxytoca）或产气肠杆菌（E. aerogenes）-阴沟肠杆菌（E.cloacae）组。

除了为了鉴定目的而测量微生物的内在特性（例如内在荧光）以外， 该方法可使用额外的鉴定用试剂来帮助分离和/或鉴定过程。结合到特定的 微生物例如亲和配体的菌剂可用于分离微生物，以鉴定微生物的类别或种 （例如，通过结合到唯一的表面蛋白质或受体）和/或鉴定微生物的特征（例 如，抗生素抗性）。有用的鉴定用试剂没有限制地包括单克隆和多克隆抗 体及其片段（例如，用于金黄色葡萄球菌鉴定的抗Eap）、核酸探针、抗生 素（例如盘尼西林、万古霉素、多粘菌素B）、适体、肽模拟物、噬菌体衍 生的结合蛋白、凝集素、宿主天然免疫生物标志（急性期蛋白质、LPS结 合蛋白、CD14、甘露糖结合凝集素、Toll样受体）、宿主防御肽（例如， 防御素、cathelicidin、proteogrin、爪蟾抗菌肽（magainin））、细菌素 （bacterocin）（例如羊毛硫抗生素（lantibiotic），如乳酸链球菌肽（nisin）、 杆菌肽（mersacidin）、表皮素、gallidermin和植物乳杆菌素C（plantaricin C） 以及II类肽）、噬菌体和对于核酸、脂质、碳水化合物、多糖、荚膜/黏液 或蛋白质选择性的染料、或其任何组合。如果菌剂本身不发出可检测的信 号，菌剂可被标记以例如通过将菌剂缀合到标志物（例如，可见的或荧光 的标志物）来提供可检测的信号。标志物没有限制地包括荧光的、发光的、 发磷光的、放射性的和/或比色的化合物。菌剂可在本发明的方法中的任一 步骤添加到微生物，例如当样本被获得时，在裂解期间和/或在分离期间。 在一些实施方式中，在团粒沉淀中的菌剂的存在可在团粒沉淀的探询期间 被确定。其它有用的鉴定用试剂包括微生物酶的底物、螯合剂、光增敏剂、 淬火剂、还原剂、氧化剂、缓冲剂、酸、碱、溶剂、固定剂、洗涤剂、表 面活性剂、消毒剂（例如，酒精、漂白剂、过氧化氢）和有毒化合物（例 如，叠氮化钠、氰化钾）和代谢抑制剂例如环已酰胺等。类似地，用于测 量微生物细胞生存力、代谢和/或膜电位的很多荧光化合物在本发明中可用 作鉴定用试剂。如本领域技术人员将容易认识到的，特定的微生物对影响 其物理状态或代谢的任何化合物例如抗生素的敏感性可通过将化合物添 加到样本、裂解缓冲液、致密垫或其任何混合物来快速确定。

现在将结合图2-10描述使用内在荧光和层级分类学的分类过程来执 行微生物菌剂的鉴定和/或表征的方法的实施方式。基本上，该方法可以体 现为存储在存储器中并使用常规数据处理器或计算机26执行的一系列处 理指令。处理指令执行图2A-2C所示的算法，其设计成：给定来自预定的 一组发射波长的对血液培养分离菌（浓缩的团粒沉淀）的内在荧光（IF） 扫描，提供对该分离菌的鉴定。该算法可适合于其它类型的分析测试数据 （例如，拉曼散射或质谱法）。

在优选实施方式中，该方法被编码为实现多级别鉴定算法的软件指 令。获取输入数据并确定微生物的鉴定的传统分类算法使用单个分类模 型。给定来自对未知生物以一组预定的波长进行的内在荧光扫描的数据， 多级别鉴定算法按照分类学的等级的分支——革兰氏类别、科和种——对 生物分类。唯一的特征是在每个鉴定步骤从最高革兰氏类别到最低种的单 独的分类模型的使用。此外，该方法合并并行分类模型的使用以评估结果 之间的一致性。因此，准确的鉴定和/或表征的概率被最大化，且不正确的 鉴定或表征结果的产生被最小化。

鉴定方法包括一组数据预处理步骤（被示为图2A的块5102、5104和 5106）和一组分析步骤（图2B、2C中的其余块5108、5110等）。该方法 确定在分类层级的多个级别处的生物的鉴定。预处理步骤设计成获取IF扫 描数据，并执行最小化在给定生物组或种内的微生物菌剂的不同菌株之间 的变化的数据变换。数据分析步骤使用并行的分类模型实现多级别鉴定， 如从下面的讨论中将理解的。

如上所述，优选实施方式提供在革兰氏、科和种级别的生物鉴定。通 常存在于血液培养物中的生物可由算法鉴定，包括但不一定限于表1中列 出的生物。很明显，对于不同的应用（例如，血液、水、环境样本等）， 生物可不同于表1中列出的生物，然而方法是相同的。

（a）表1：内在荧光算法鉴定生物列表

现在将详细描述图2A-C所示的处理步骤或模块。

预处理

步骤5102：获得荧光值n_ij,对于每个激发值，i=1,2，…,x，且对于每 个发射值，j=1,2，…,y，组合。比率，即发射值/激发值，必须落在区间（1.05, 1.95）内。

步骤5104：对于每个荧光值n_ij，计算自然对数值ln(n_ij)。

步骤5106：在给定的激发波长i，对于每个发射值，j=2,3，…,y-1， 计算自然对数值（来自步骤5104）的一阶导数。

使用步骤5104和5106变换原始荧光数据以最小化每个生物组内的菌 株间变化是有利的。此外，变换过程倾向于在整个生物组中产生类似的变 化（variance）。图3、4和5作为例子示出对在激发315处在整个发射范围 内评估的金黄色葡萄球的多个菌株菌执行所述预处理的效果。在图3中， 每条线代表来自单个菌株的荧光信号。线5202指示在每个发射值处的平 均荧光信号。图4示出在应用自然对数变换（步骤5104）之后荧光信号的 菌株间变化；注意，所有菌株的曲线一起靠拢。图5示出在计算自然对数 变换的一阶导数（步骤5106）之后在315nm的激发处的菌株间变化。再 次，注意，所有菌株的曲线一起靠拢得非常近，特别是在400-610nm的发 射范围处。

作为另一例子，图6示出在执行变换步骤之前在415nm的激发值处 近平滑念珠菌的荧光信号的菌株间变化。注意在400-650nm的范围内的发 射上的广泛变化。图7示出了在执行自然对数变换之后在415nm的激发 处这个生物的菌株间变化。图8示出了在执行一阶导数变换之后的菌株间 变化。注意，在图8中，菌株间变化减小很多。

分析

步骤5108：在执行预处理步骤之后在分析中的分类的第一级别是革兰 氏分类5108。在这个步骤，处理包括两个分支，一个由步骤5110和5112 表示，而另一个由步骤5114和5116表示。图2A并非意在暗示分支不能 够被连续地执行；分支可以连续地或并行地执行。

步骤5110：革兰氏分类距离计算。使用对一组预定的激发/发射对的 一阶导数变换，对于在模型中定义的每个革兰氏类别，计算距离，

d_a=[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2,3，表示在模型中定义的革兰氏类别

-m表示对每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数的计算值 m_ij的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵。这组激发 和发射对从已知微生物的荧光测量结果实验地确定（利用所执行的预处 理）（见图9和10以及下面的讨论）。

术语“模型”用于指一组已知的微生物菌剂，在预定的激发波长处对 所述微生物菌剂的IF测量结果（包括变换）以前被获得，且对于所述微生 物菌剂，样品是用于分类的候选物，例如表1中列出的菌剂。

步骤5112：革兰氏分类解释。

-让u_g表示最大距离阈值

-如果所有距离d₁、d₂和d₃都大于u_g，则分类结果是未知的

-否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂和d₃的最小值

-让w_g表示低区别阈值因子（low discrimination threshold factor）

-如果多于一个距离d₁、d₂和d₃小于（d_min*w_q），则分类结果是在具有 小于（d_min*w_q）的距离的革兰氏类别之间的低区别。

-如果只有一个距离d₁、d₂和d₃小于（d_min*w_q），则分类结果是相应的 革兰氏类别。

步骤5114：所有科分类距离计算

使用对一组预定的激发/发射对的一阶导数变换，对于在模型中定义的 每个生物科，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2，…,k，表示在模型中定义的所有生物科

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵（与如上所 述的相同，这组激发和发射对被实验地确定）。

-m表示对于每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数的计算 值m_ij的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

步骤5116：所有科分类解释

-让u_f表示最大距离阈值

-如果所有距离d₁、d₂，…,d_a都大于u_f，则分类结果是未知的

-否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂，…,d_a的最小值

-让w_f表示低区别阈值因子

-如果多于一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_f），则分类结果是在具 有小于（d_min*w_f）的距离的生物科之间的低区别

-如果只有一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_q），则分类结果是相应 的科。

步骤5118：对最终革兰氏分类结果合并革兰氏和所有科分类解释。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是单个选择，若科分类落在 革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是所指示的革兰氏类别。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是单个选择，若科分类未落 在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是未知的。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是低区别，若与最短距离相 关的科落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是所指示的革 兰氏类别。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是低区别，若与最短距离相 关的科未落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是未知的。

如果革兰氏分类是低区别且所有科分类是单个选择，则合并的分类结 果是如下革兰氏类别：其相应于在分类层级上科存在于之下的革兰氏类 别。

如果革兰氏分类是低区别且所有科分类是单个选择，若没有一个革兰 氏类别相应于在分类层级上科存在于其下的革兰氏类别，则合并的分类结 果是未知的。

如果革兰氏分类和所有科分类都是未知的，则合并的分类结果是未知 的。

处理接着继续进行到步骤5120，革兰氏科分类——在分类层级中第二 较低的分类级别。这个步骤由子步骤5122、5124和5126组成。

步骤5122：革兰氏科分类距离计算。

使用对于革兰氏分类结果特定的一组预定的激发/发射对的一阶导数 估计值，对于在模型中定义的每个生物科，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2，…,k，表示在模型中定义的生物科的数量

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵（如前面关 于那些对所述的相同）。

-m表示对于每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数的计算 值m_ij的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

步骤5124：革兰氏科分类解释

让u_t表示最大距离阈值

如果所有距离d₁、d₂，…,d_a都大于u_t，则分类结果是未知的

否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂，…,d_a的最小值

让w_t表示低区别阈值因子

如果多于一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_t），则分类结果是在具有 小于（d_min*w_t）的距离的生物科之间的低区别

如果只有一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_t），则分类结果是相应的 科。

步骤5126革兰氏科分类结果。

如果革兰氏科分类结果是未知的，则测试生物分类在革兰氏级别处结 束。

如果革兰氏科分类结果是低区别，则测试生物分类作为包括在低区别 中的革兰氏和科而结束。

如果革兰氏科分类结果是单个科，则来自测试生物的IF数据被进一步 分析以确定种级别鉴定是否可被确定。

步骤5128革兰氏科种分类。处理指令继续进行到革兰氏科种分类级 别——由子步骤5130、5132和5134组成的在分类层级中第三和甚至更低 的分类级别。

步骤5130革兰氏科种分类距离计算。

使用对革兰氏科分类结果特定的一组预定的激发/发射对的一阶导数 估计值，对于在模型中定义的每个生物种，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2，…,k，表示在模型中定义的生物种的数量

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵（与如前面 所述的相同）

-m表示对于每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数m_ij的计 算值的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

步骤5132：革兰氏科种分类解释。

-让u_s表示最大距离阈值。

-如果所有距离d₁、d₂，…,d_a都大于u_t，则分类结果是未知的。

-否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂，…,d_a的最小值。

-让w_s表示低区别阈值因子。

-如果多于一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_s），则分类结果是在具 有小于（d_min*w_s）的距离的生物种之间的低区别

-如果只有一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_t），则分类结果是相应 的种。

步骤5134革兰氏科种分类结果。

如果革兰氏科种分类结果是未知的，则测试生物分类在革兰氏和科级 别处结束。

如果革兰氏科种分类结果是低区别，则测试生物分类作为包括在低区 别中的革兰氏、科和种而结束。

如果革兰氏科种分类结果是单个种，则测试生物分类在革兰氏、科和 种级别处结束。

在步骤5136，在步骤5134、5118和5126确定的结果例如在鉴定仪器 的用户界面上返回并报告给用户，传输到所连接的工作台，返回到另一软 件模块，或以另外方式为用户产生。

关于生物鉴定（步骤5134），只有当（发射值的自然对数变换的）一 阶导数的值对至少一个激发波长在发射范围的某个部分处对模型中的每 个种是唯一的时，在种之间的区别才是可能的。图9和10示出对于激发 波长315nm（图9）和415nm（图10）在种的子集之间可能的区别。参 考图9，显然这些种中的几个可基于在激发波长315处的一阶导数与其它 种区分开。数学模型使用发射的（自然对数变换的）一阶导数值，其中视 觉差异作为输入而存在以区分开种。使用在整个发射范围内的值的选定部 分，下面的种可清楚地与其它种区分开：肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、绿 脓杆菌和肺炎链球菌。此外，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可与其它种 而不是与彼此区分开。在给定的激发波长处在整个发射范围内的值的部分 （section）是在如上所述的处理步骤中的距离计算中的逆矩阵∑^-1中的预定 对。这些对可例如是在315nm处的激发和由图9中所示的圆圈指示的发 射值的范围，即，(315/300-450)、(315,485-500)、(315/570-580)。

参考图10，显然在激发波长415nm处的发射具有区分开种的能力。 使用在整个发射范围内的值的选定部分，近平滑念珠菌（C.parasilopsis） 和铜绿假单胞菌（P.aurginosa）可明确地与其它种区分开。注意到出现在 大约发射450nm处的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的一阶导数值之间 的差异也是有意义的。当来自波长315和415（图9和10）的整个发射范 围内的值的选定部分的信息被组合时，模型中的所有种可以高比值（＞97% 可靠性）彼此区分开。

为了增强荧光信号，微生物可在离心/浓缩之前被涂有金和/或银纳米 粒子，和/或内部光学表面可被预先涂有特定尺寸和形状的金属胶体（参考 文献：关于荧光，Lakowicz,Anal.Biochem.337:171(2005)；关于SERS， Efrima等人,J.Phys.Chem.B.(Letter)102:5947(1998)）。在另一实施方式 中，纳米粒子在离心之前存在于在分离设备中存在的致密垫中并当微生物 穿过致密垫时与微生物相关联。

上面在图2-10的背景中解释的分类学的层级分类方法适用于从微生 物菌剂的探询得到的其它数据集。例如，在拉曼散射数据或质谱数据而不 是内在荧光数据从浓缩的微生物菌剂得到情况下，分类方法是同样有用 的。在拉曼散射的情况下，数据从已知的微生物菌剂获得，且这样的数据 被分析（一般在变换步骤被执行之后）以确定在革兰氏、科和种之间区分 开的数据的子集以及结果，即，所存储的有差别的子集。类似地，来自未 知的微生物菌剂的数据经受变换步骤以最小化种之间的菌株间变化；变换 可以是自然对数、一阶导数或其它变换，基于已知的微生物菌剂的数据的 检查，变换的选择和细节将在本领域中的技术人员的能力范围内。图 2A-2DC的处理（在革兰氏、科和种级别的层级分类）接着继续进行。用 于分类的最小距离计算的可选方案例如公知的K-最近邻分类算法 （K-Nearest Neighbor classification algorithm）可用于在每个分级级别处的 测试样本的分类。也将明显，可能需要在图2A-2C的流程图中未示出的额 外的预处理步骤，其对分析测试方法例如背景减除或标准化是唯一的，但 这些步骤在本领域中是已知的，且因此详细描述是不必要的。

概括前述内容，我们描述了用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微 生物菌剂的方法，其包括下列步骤：

获得微生物菌剂的分析测试数据；变换该分析测试数据，从而最小化 在生物组内的分析测试数据的菌株间变化；以及借助于编程计算机，执行 被编码为对经变换的分析测试数据执行的一组处理指令的多级分类算法， 多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级 别。在一些实施方式中，分析测试数据（例如，拉曼散射）被执行，同时 微生物菌剂浓缩在菌剂被分离和浓缩的测试设备内，如图1所示；在其它 实施方式中，浓缩的菌剂从测试设备移出，且通过单独的仪器例如质谱仪 来受到分析。在美国专利6,780,602中公开了可被使用的分析方法的另外 例子，该专利的内容通过引用被并入本文。

偏离所公开的实施方式的来自具体细节的变化当然是可能的，而不偏 离本发明的范围。涉及范围的所有问题应通过参考所附权利要求来回答。

使用分类学的层级分类鉴定和/或表征微生物菌剂

相关申请的交叉引用

本申请涉及下面的美国专利申请，其内容通过引用被并入本文：

2009年10月30日提交的标题为“Methods for the isolation and identification of microorganisms”的美国序列号12/589,929。

2009年10月30日提交的标题为“Separation device for use in the separation,identification and/or characterization of microorganisms”的美国序 列号12/589,969。

2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”的美国序列号 12/589,952。

2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using mass spectrometry”的美国序 列号12/589,936。

2009年10月30日提交的标题为“Method for separation and characterization of microorganisms using identifier agents”的美国序列号 12/589,985。

2009年10月30日提交的标题为“Method for detection,identification and/or characterization of microorganisms in a sealed container”的美国序列号 12/589,968。

2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using Raman spectroscopy”的美国 序列号12/589,976。

本申请还涉及在与本申请相同的日子提交的下面申请，其内容通过引 用被并入本文:

2010年5月14日提交的标题为“System for rapid identification and/or characterization of a microbial agent in a sample”、律师档案号为09-271-B的 美国序列号____。

2010年5月14日提交的标题为“System for rapid identification and/or characterization of a microbial agent in a sample”、律师档案号为09-271-A的 美国序列号____。

联邦资助的研究的声明

不适用。

背景

本申请涉及用于自动表征和/或鉴定存在于储存在样品容器中的样本 例如血液或其它生物样本中的微生物菌剂的方法的领域。作为例子，本公 开的方法快速和自动地提供关于微生物菌剂的革兰氏类型（阳性或阴性）、 形态学、种的信息或其它相关的临床信息。

目前在美国的市场上存在检测血液样本中的微生物的生长和因而检 测微生物的存在的仪器。一种这样的仪器是本受让人bioMerieux公司的 BacT/ALERT3D仪器。该仪器接收包含例如来自人类患者的血液样本的血 液培养瓶。该仪器培养该瓶。在培养箱中的光学检测单元在培养期间定期 地分析合并到瓶中的比色传感器，以检测微生物生长是否出现在瓶内。在 专利文献中描述了光学检测单元、样品容器和传感器，见美国专利 4,945,060、5,094,955、5,162,229、5,164,796、5,217,876、5,795,773和 5,856,175，每个专利的全部内容通过引用被并入本文。通常涉及生物样本 中的微生物的检测的所关注的其它现有技术包括下面的专利：U.S. 5,770,394、U.S.5,518,923、U.S.5,498,543、U.S.5,432,061、U.S.5,371,016、 U.S.5,397,709、U.S.5,344,417、U.S.5,374,264、U.S.6,709,857和U.S. 7,211,430。

在检测仪器例如BacT/ALERT3D和类似的仪器中，一旦血液培养瓶 被测试为对于微生物存在是阳性的，由于血液成分的干扰和包含样本的一 次性系统（例如，瓶）的假象，获得微生物菌剂的高水平的表征或微生物 菌剂的种的鉴定很难。因此，当前的方法使用如上所述的用于样本中的微 生物的自然生长和检测的瓶或其它适当的一次性容器和有关仪器。一旦仪 器指示瓶对于微生物菌剂的存在是阳性的，根据当前方法“阳性”瓶就从 仪器被人工取回，且样本的一部分从瓶被人工移出并在琼脂平板上被人工 培养。在本领域中存在使样本介质在培养平板上的划线分离和平板的培养 自动化的仪器。在美国专利6,617,146中描述了一种这样的仪器。在划线 分离之后，平板被人工放置在培养箱中并被定期检查微生物的传代培养物 的生长。在传代培养物充分生长之后，培养物的样本从平板获取并被放置 在试管中。试管接着被插入又一仪器中用于经由具有多个单独的孔的一次 性测试样本卡进行鉴定测试。一次性测试卡在专利文献中是已知的，见例 如美国专利4,118,280、3,963,355、4,018,65；4,116,775和4,038,151、 5,609,828、5,746,980、5,766,553、5,843,380、5,869,005、5,916,812、5,932,177、 5,951,952和6,045,758，这些专利的全部内容通过引用被并入本文。

接着在受让人的在本领域中被称为VITEK2仪器的分析仪器中处理 测试样本卡。VITEK2仪器培养并使用阅读器单元定期地读测试样本卡的 孔。在卡的一个或多个孔中的样本的生长导致微生物菌剂的鉴定。在专利 文献中描述了VITEK2仪器，见美国专利5,762,873和6,086,824，其内容 通过引用被并入本文。

从将样本引入到血液收集瓶中的时间起到通过VITEK2仪器进行微 生物的培养、微生物存在的检测和接着微生物的鉴定的这整个过程一般花 费2-5天。发生在阳性瓶检测之后的单独的鉴定步骤一般占这些天中的1-3 天。

如果血液样本中的微生物菌剂的检测和鉴定以及将结果报告给临床 医生所花费的时间可从当前的2-5天减小到少于一天，则对患者的相当大 的和可能救命的临床益处是可能的。本文件公开了用于使用分类学的层级 分类方法来快速鉴定和/或表征生物样本例如血液样本中的微生物菌剂的 方法。

概述

在第一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂 的方法。该方法包括从微生物菌剂获得在发射波长的范围内的内在荧光值 的步骤。荧光值在多个激发波长处被获得。内在荧光测量结果经受变换操 作，从而最小化生物组内的内在荧光测量结果的菌株间变化。变换操作的 例子包括自然对数变换和一阶导数运算。借助于编程计算机，该方法包括 执行被编码为对经变换的内在荧光测量结果操作的一组处理指令的多级 别分类算法的步骤。多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分 类层级中的不同级别。

在一个实施方式中，多级别分类算法以分类层级中的较高级别到分类 层级中的较低级别的顺序单调地进行。例如，多级别分类算法首先按革兰 氏类别、接着按科并接着按种对微生物菌剂分类。

在一个实施方式中，多级别分类算法对于算法中的每个级别包括下列 步骤：（a）对一组预定的激发/发射对的经变换的荧光值和协方差矩阵的逆 矩阵执行距离计算；（b）使用距离计算的结果以及最小距离阈值和低区别 阈值执行分类解释；以及（c）产生分类结果。这组预定的激发/发射对在 激发和发射值的整个范围内从来自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结 果得到，这组预定的激发/发射对针对其区分开不同的微生物菌剂的能力而 被选择。

在另一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂 的方法，其包括下列步骤：在激发和发射值的整个范围内从已知的微生物 菌剂实验地获得内在荧光测量结果，并针对区分开不同的微生物菌剂的能 力从这样的测量结果选择一组激发／发射对；按照这组激发／发射对，从 未知的微生物菌剂获得内在荧光测量结果；变换来自未知的微生物菌剂的 内在荧光测量结果，从而最小化在生物组内的内在荧光测量结果的菌株间 变化；以及使用经变换的内在荧光测量结果和从已知的微生物菌剂实验地 获得的内在荧光测量结果、借助于执行分类算法的编程计算机来鉴定和/ 或表征未知的微生物菌剂。

在优选实施方式中，分类算法包括被编码为对经变换的内在荧光测量 结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在样 本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。

方法通常可应用于微生物菌剂和样本。在一个可能的实现方式中，样 本是人类或动物血液的样本，且微生物菌剂是存在于血液中的菌剂（例如， 细菌）。

分类学的层级分类方法除了微生物荧光数据以外还可与不同的分析 数据一起使用。概括本公开，公开了用于快速鉴定和/或表征存在于样本中 的微生物菌剂的方法，其包括下列步骤：获得微生物菌剂的分析测试数据 （例如，质谱或拉曼散射数据）；变换该分析测试数据，从而最小化在生 物组内的分析测试数据的菌株间变化；以及借助于编程计算机，执行被编 码为对经变换的分析测试数据操作的一组处理指令的多级别分类算法，多 个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。

在又一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂 的方法，其包括下列步骤：从已知的微生物菌剂实验地获得分析测试数据， 并针对区分开不同的微生物菌剂的能力从这样的测量选择测试数据的子 集；从未知的微生物菌剂获得与分析测试数据的子集相关的分析测试数 据；变换来自未知的微生物菌剂的分析测试数据，从而最小化在生物组内 的内在荧光测量结果的菌株间变化；以及使用经变换的分析测试数据和从 已知的微生物菌剂实验地获得的分析测试数据、借助于执行分类算法的编 程计算机来鉴定和/或表征未知的微生物菌剂。

附图的简要说明

图1是测量装置的示意图，在该测量装置中可使用本公开的方法。

图2A-2C是示出一系列处理指令的流程图，所述指令使用内在荧光测 量结果来执行浓缩的微生物菌剂的鉴定和/或表征。

图3-8是内在荧光（IF）测量结果及其变换的曲线，其示出在最小化 生物组内的菌株间变化方面图2A的预处理指令的益处。

图9和10是IF测量结果的自然对数变换的一阶导数的曲线，其示出 对315nm和415nm的激发波长在种的子集之间的可能区别。

详细描述

本文描述了用于鉴定和/或表征微生物菌剂的方法。在优选实施方式 中，对与样本中的其它成分分离的浓缩的微生物菌剂执行该鉴定和/或表 征。可在浓缩的微生物菌剂储存在用于微生物菌剂的分离和浓缩的一次性 设备中时执行该方法；可选地，可在微生物菌剂从一次性设备移出之后执 行该方法。在标题为“System for rapid identification and/or characterization of a microbial agent in a sample”、律师档案号为09-271-B的共同未决的申请 序列号____中描述了用于样本例如血液中的微生物菌剂的分离和浓 缩的方法、仪器和设备的例子，该申请通过引用被并入本文。这样的方法、 仪器和设备对本公开的方法不是特别重要，且因此不提供详细描述，以便 不使本公开不清楚。

现在将结合图1描述检测布置和一次性设备的一个代表性例子。图1 是测量装置的示意性图示，在该测量装置中本公开的方法可被使用。该装 置包括一次性分离和浓缩设备10，包含未知微生物菌剂的样本14放置在 该设备10中。利用样本中的非微生物菌剂成分（例如，血细胞）的任选 的选择性裂解、存在于设备10中的致密垫和离心作用将微生物菌剂浓缩 成团粒沉淀状块12。密度梯度和离心作用在存在于设备10中的毛细管15 的底部浓缩微生物菌剂。

测量装置包括在激发波长处发射光18的光源16，以刺激内在荧光从 微生物菌剂12产生。发射辐射20被导至任选地耦合到光谱仪24的传感 器阵列22上。在波长波段中的荧光发射数据被发送到计算机26。计算机 耦合到存储器30，其存储程序代码（包括执行图2A-2C所示的处理指令的 序列的代码）、在模块中使用的常数、以及包括很多预期微生物菌剂和在 特定的激发和发射对中的实验地获得的荧光数据的模型，所述激发和发射 对以下面描述的方式区分开微生物。计算机26借助于存储在存储器30中 的信息和代码来处理数据，并产生显示在所连接的工作台显示器28或其 它适当的输出设备上的分类结果，其细节并不重要。

在下面的申请中更详细地描述了分离、浓缩和探询方法：2009年10 月30日提交的标题为“Methods for the isolation and identification of microorganisms”的美国序列号12/589,929、2009年10月30日提交的标题 为“Separation device for use in the separation,identification and/or characterization of microorganisms”的美国序列号12/589,969、2009年10 月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”的美国序列号 12/589,952、2009年10月30日提交的标题为“Method for separation, identification and/or characterization of microorganisms using mass spectrometry”的美国序列号12/589,936、2009年10月30日提交的标题为 “Method for separation and characterization of microorganisms using identifier agents”的美国序列号12/589,985、2009年10月30日提交的标 题为“Method for detection,identification and/or characterization of microorganisms in a sealed container”的美国序列号12/589,968、2009年10 月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using Raman spectroscopy”的美国序列号 12/589,976，这些申请的内容通过引用被并入本文，本发明的方法不限于 这些技术。

一旦存在于样本中的微生物或其它微生物菌剂在分离设备10中被分 离和/或成团粒，分离的样本或团粒沉淀就如下所述的被探询（例如，利用 光谱方法、使用内在荧光测量结果），以表征和/或鉴定样本或团粒沉淀中 的微生物。探询可以以非侵入式方式发生，也就是说，当团粒沉淀保留在 用于分离和浓缩微生物菌剂的设备10中时，团粒沉淀可以被探询。以非 侵入方式鉴定微生物的能力任选地与在整个分离和表征/鉴定过程中保持 设备10密封以及自动化该程序结合避免了污染和/或感染的样本的持续处 理，并极大增加了整个过程的安全性。此外，通过直接探询来表征和/或鉴 定微生物而不进一步处理样本或团粒沉淀12（例如，菌落的重新悬浮、接 种和生长）的能力极大地增加了可进行鉴定/表征的速度。

在一个实施方式中，光谱方法可用于分析微生物的一种或多种固有特 性，例如当没有额外的剂例如着色剂、染料、载色剂等时存在于微生物中 的特性。在其它实施方式中，光学光谱学方法可用于分析微生物的一种或 多种非固有特性，例如只可借助于额外的鉴定用试剂检测的特性。使用荧 光光谱法来执行优选形式的探询。例如，前端面荧光（其中激发光和发射 光进入并离开同一光学表面，且如果样本通常是光学上厚的，激发光穿透 一段非常短的距离进入样本中)(见例如Eisinger,J.和J.Flores的"Front-face fluorometry of liquid samples,"Anal.Biochem.94:15(1983)）可用于鉴定团 粒沉淀中的微生物。

一般，光源16或激发源导致样本的激发，后面是在预定的时间点或 连续地测量样本的荧光20的发射。类似地，来自激发源与样本的交互作 用的反射光可被测量，以提供用于鉴定和/或表征的相关数据。可通过光谱 鉴别的任何适当的方式、最优选地使用光谱仪24来测量来自样本的发射。

在目前优选的实施方式中，进行对照测量（例如，荧光光谱），以获 得存储在存储器30中的已知的微生物和数据，因而使用本领域中的技术 人员已知的各种数学方法来允许所测量的测试数据与所关注的微生物的 表征相关联。来自已知的微生物的所测量的测试数据存储在机器可读存储 器30中，例如在实现本方法的仪器内或在相关的数据处理设备例如所连 接的工作台内。这些方法可用于基于现有的命名法将正被测试的样本中的 所关注的未知微生物分类到相关的组（例如种）中，和/或在设计用于如前 所述监控、检测和/或表征生物的系统时基于生物的代谢、病原性和/或毒 性将未知微生物分类到自然出现的组中。

样本照明源（见图1）或激发源16可选自如本领域中的技术人员已知 的任何数量的适当光源。可使用产生可用的数据的电磁光谱的任何部分。 能够在紫外、可见光和/或近红外光谱以及电磁光谱的其它部分中发射的光 源可被利用并且是本领域中的技术人员已知的。例如，光源可以是连续光 谱灯，例如用于产生紫外光的氘或氙弧灯和/或用于产生可见光/近红外激 发的钨卤素灯。这些光源提供宽的发射范围，且特定的激发波长的光谱带 宽可使用光学干涉滤波器、棱镜和/或光栅来减小，如本领域中公知的。

可选地，多个窄带光源例如发光二极管和/或激光器可以在空间和/或 时间上被多路复用以提供多波长激发源。例如，从240nm到超过900nm 的发光二极管是可用的，且源具有20-40nm的光谱带宽（半高全宽）。激 光器在从紫外到近红外的分立波长中是可用的，并可使用本领域中的技术 人员公知的多路复用方法来使用。

可通过使用光谱鉴别装置例如扫描单色仪来提高光源中的任一个的 光谱选择性。如本领域中的技术人员已知的，可利用其它鉴别方法，例如 声光可调谐滤波器、液晶可调谐滤波器、光学干涉滤波器的阵列、棱镜摄 谱仪等，以及以任何组合。在选择光谱鉴别器时的考虑因素考虑可调谐性 的范围以及选择性的水平。作为例证，例如鉴别器可以按10nm的选择性 来利用300-800nm的波长范围。这些参数通常确定实现可调谐性范围以及 选择性所必需的最佳技术。

来自光源16的照明导致样本的激发，后面是在预定的时间点或连续 地测量样本的荧光的发射。类似地，来自激发源与样本的交互作用的反射 光可被测量，以提供用于鉴定和/或表征的相关数据。

可通过光谱鉴别的任何适当的方式、最优选地使用光谱仪24来测量 来自样本的发射。光谱仪可以是检测特定的发射波长的扫描单色仪，由此， 来自单色仪的输出由光电倍增管检测，和/或光谱仪可配置为成像摄谱仪， 由此，输出由成像检测器阵列例如电荷耦合器件（CCD）检测器阵列检测。 在一个实施方式中，鉴别器允许通过光电检测装置（例如光电倍增管、雪 崩光电二极管、CCD检测器阵列和/或电子倍增电荷耦合器件（EMCCD） 检测器阵列）来观察荧光和/或散射信号。

光谱技术用于获得优选地被提供为激发-发射矩阵（EEM）测量的测量。 如本文使用的，EEM被定义为作为激发波长和发射波长的函数的荧光物质 的发光光谱发射强度，并包括全光谱或其子集，其中子集可包含单个或多 个激发/发射对。此外，具有固定的激发波长的EEM的横截面可用于显示 特定的激发波长的发射光谱，而具有固定的发射波长的EEM的横截面可 用于显示样本的激发光谱。在一个实施方式中，在多于一个特定的激发- 发射波长对处例如在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个特定的激发- 发射波长对处测量多个EEM。

已发现，前端面荧光光谱法在测量高度散射和高度淬火的样本的荧光 和/或反射特性时提供优点。在一个实施方式中，前端面方法可能是特别有 用的。例如，前端面荧光可能在高度吸收的样本中特别有用，因为激发和 发射光束不需要穿过样本的主体传播，并因此可能较少受可能包含在其中 的干扰成分（例如，血细胞和微生物培养基）的影响。可在这样的角处照 射分离设备1904的光学表面，以便提供如本领域中的技术人员已知的可 接受的结果（例如，Eisinger,J.和J.Flores的"Front-face fluorometry of liquid samples,"Anal.Biochem.94:15-21(1983)）。在一个实施方式中，系统被设 计成使得光谱系统除了最少在一个固定角处测量发射荧光以外还最少在 一个固定角处测量漫反射光。

在一些实施方式中，在分离的样本或团粒沉淀中的微生物的表征和/ 或鉴定不需要涉及确切的种的鉴定。表征包括生物颗粒的广泛归类或分类 以及单个种的实际鉴定。来自分离的样本或团粒沉淀的微生物的分类可包 括微生物的表型和/或形态学特征的确定。例如，生物颗粒的表征可基于可 观测的差异例如成分、形状、尺寸、成簇和/或代谢来实现。在一些实施方 式中，所关注的生物颗粒的分类可能不需要给定生物颗粒的特征的预先知 识，而只需要与经验测量结果的一致关联，因而使这种方法比基于特定的 结合事件或代谢反应的方法更通用和容易接受。如本文使用的，“鉴定” 意指确定以前未知的微生物属于哪个科、属、种和/或菌株。例如，鉴定以 前未知的微生物到科、属、种和/或菌株级别。

在一些实例中，表征包括对于将采取的行动提供足够的有用信息的分 类模型。如本文使用的，优选的分类模型包括分组到下列项中的一个或多 个中：（1）革兰氏组；（2）临床革兰氏组；（3）治疗组；（4）功能组；以 及（5）自然内在荧光组。

（1）革兰氏组：在革兰氏组分类之内，微生物可基于其革兰氏染色反 应和总尺寸被置于三种广泛的分类类别之一中，所述组选自下列项中的一 个或多个：（a）使用革兰氏染色染深蓝色的革兰氏阳性微生物；（b）使用 革兰氏染色染红色的革兰氏阴性微生物；以及（c）使用革兰氏染色染深蓝 色的酵母细胞，但其为按照其形态学特征和尺寸与细菌区分开的非常大的 圆细胞。

（2）临床革兰氏组：此革兰氏组可进一步分成代表区分形态学特征的 几个子类别。这些子类别包括由有经验的实验室技术专家报告的所有相关 临床信息，并因此比阳性或阴性革兰氏反应提供更高级别的鉴定。这个特 定的分类是非常有帮助的，因为它消除了关于依赖于革兰氏染料的质量和 /或技术人员的技能水平的忧虑，技术人员通过使用自动化系统提供等效的 临床相关信息来读取涂片。更具体地，基于这个分类模型的微生物的子类 别可选自下列项中的一个或多个：（a）球菌，其是小的圆细胞；（b）双球 菌，其是结合在一起的两个小圆细胞；（c）杆状菌，其是矩形形状的；以 及（d）杆菌，其是杆状的。可由额外的形态学信息确定的这些子类别的 例子包括：（i）革兰氏阳性球菌；（ii）成链的革兰氏阳性球菌；（iii）成簇 的革兰氏阳性球菌（即，“葡萄状”簇）；（iv）革兰氏阳性双球菌；（v）革 兰氏阳性杆状菌；（vi）具有内生孢子的革兰氏阳性杆状菌；（vii）革兰氏 阴性杆状菌；（viii）革兰氏阴性球杆菌；（ix）革兰氏阴性双球菌；（x）酵 母；以及（xi）丝状真菌。

（3）治疗组：此治疗组包括多个微生物种，其当从特定的样品类型分 离时使用同一类的抗生素或抗生素的混合物来治疗（例如，如在“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy2008”中所述的）。在很多情况下，临床医 师不需要种级别的鉴定来实现从初始经验治疗到更定向的治疗的改变，因 为多于一个种可使用相同的抗生素选择来治疗。这个分类级别正确地将这 些“相同治疗”微生物置于单个治疗类别中。这个表征级别的例子包括区 分开高度耐药的肠杆菌（EB）的种与敏感的EB种（区分开肠杆菌属的种 与肠埃希氏菌），或区分开抗氟康唑的念珠菌属的种（光滑念珠菌和克柔 念珠菌）与敏感的念珠菌属的种（白色念珠菌和近平滑念珠菌），等等。

（4）功能组：根据本发明，微生物还可基于代谢、毒性和/或表型特 征的混合来被置于几个组中。非发酵的生物可以清楚地与发酵的生物区分 开。此外，产生溶血素的微生物种可与非溶血的种分开地被分组。在一些 情况下，这些组代表比属级别宽的类别（例如，大肠杆菌类、革兰氏阴性 非发酵杆状菌），一些在属级别（例如，肠球菌属、念珠菌属），而一些较 接近于种级别区别（例如，凝固酶阴性的葡萄球菌、α-溶血性链球菌、β- 溶血性链球菌、凝固酶阳性的葡萄球菌，即，金黄色葡萄球菌）。

（5）自然内在荧光（“IF”）组：微生物还可基于其自然倾向被置于类 别中以按照其固有和/或内在荧光特征分组在一起。这些组中的一些可能对 治疗和功能组类别是共同的。这些分组可包括具有特征IF标记的单独的种 例如粪肠球菌、化脓性链球菌或绿脓杆菌，和/或可包含具有相对保守的IF 标记的小生物组，例如肺炎克雷伯菌-产酸克雷伯菌或产气肠杆菌-阴沟肠 杆菌组。

除了为了鉴定目的而测量微生物的内在特性（例如内在荧光）以外， 该方法可使用额外的鉴定用试剂来帮助分离和/或鉴定过程。结合到特定的 微生物例如亲和配体的菌剂可用于分离微生物，以鉴定微生物的类别或种 （例如，通过结合到唯一的表面蛋白质或受体）和/或鉴定微生物的特征（例 如，抗生素抗性）。有用的鉴定用试剂没有限制地包括单克隆和多克隆抗 体及其片段（例如，用于金黄色葡萄球菌鉴定的抗Eap）、核酸探针、抗生 素（例如盘尼西林、万古霉素、多粘菌素B）、适体、肽模拟物、噬菌体衍 生的结合蛋白、凝集素、宿主天然免疫生物标志（急性期蛋白质、LPS结 合蛋白、CD14、甘露糖结合凝集素、Toll样受体）、宿主防御肽（例如， 防御素、cathelicidin、proteogrin、爪蟾抗菌肽）、细菌素（例如羊毛硫抗生 素，如乳酸链球菌肽、杆菌肽、表皮素、gallidermin和植物乳杆菌素C以 及II类肽）、噬菌体和对于核酸、脂质、碳水化合物、多糖、荚膜/黏液或 蛋白质选择性的染料、或其任何组合。如果菌剂本身不发出可检测的信号， 菌剂可被标记以例如通过将菌剂缀合到标志物（例如，可见的或荧光的标 志物）来提供可检测的信号。标志物没有限制地包括荧光的、发光的、发 磷光的、放射性的和/或比色的化合物。菌剂可在本发明的方法中的任一步 骤添加到微生物，例如当样本被获得时，在裂解期间和/或在分离期间。在 一些实施方式中，在团粒沉淀中的菌剂的存在可在团粒沉淀的探询期间被 确定。其它有用的鉴定用试剂包括微生物酶的底物、螯合剂、光增敏剂、 淬火剂、还原剂、氧化剂、缓冲剂、酸、碱、溶剂、固定剂、洗涤剂、表 面活性剂、消毒剂（例如，酒精、漂白剂、过氧化氢）和有毒化合物（例 如，叠氮化钠、氰化钾）和代谢抑制剂例如环已酰胺等。类似地，用于测 量微生物细胞生存力、代谢和/或膜电位的很多荧光化合物在本发明中可用 作鉴定用试剂。如本领域技术人员将容易认识到的，特定的微生物对影响 其物理状态或代谢的任何化合物例如抗生素的敏感性可通过将化合物添 加到样本、裂解缓冲液、致密垫或其任何混合物来快速确定。

现在将结合图2-10描述使用内在荧光和层级分类学的分类过程来执 行微生物菌剂的鉴定和/或表征的方法的实施方式。基本上，该方法可以体 现为存储在存储器中并使用常规数据处理器或计算机26执行的一系列处 理指令。处理指令执行图2A-2C所示的算法，其设计成：给定来自预定的 一组发射波长的对血液培养分离菌（浓缩的团粒沉淀）的内在荧光（IF） 扫描，提供对该分离菌的鉴定。该算法可适合于其它类型的分析测试数据 （例如，拉曼散射或质谱法）。

在优选实施方式中，该方法被编码为实现多级别鉴定算法的软件指 令。获取输入数据并确定微生物的鉴定的传统分类算法使用单个分类模 型。给定来自对未知生物以一组预定的波长进行的内在荧光扫描的数据， 多级别鉴定算法按照分类学的等级的分支——革兰氏类别、科和种——对 生物分类。唯一的特征是在每个鉴定步骤从最高革兰氏类别到最低种级别 的单独的分类模型的使用。此外，该方法合并并行分类模型的使用以评估 结果之间的一致性。因此，准确的鉴定和/或表征的概率被最大化，且不正 确的鉴定或表征结果的产生被最小化。

鉴定方法包括一组数据预处理步骤（被示为图2A的块5102、5104和 5106）和一组分析步骤（图2B、2C中的其余块5108、5110等）。该方法 确定在分类层级的多个级别处的生物的鉴定。预处理步骤设计成获取IF扫 描数据，并执行最小化在给定生物组或种内的微生物菌剂的不同菌株之间 的变化的数据变换。数据分析步骤使用并行的分类模型实现多级别鉴定， 如从下面的讨论中将理解的。

如上所述，优选实施方式提供在革兰氏、科和种级别的生物鉴定。通 常存在于血液培养物中的生物可由算法鉴定，包括但不一定限于表1中列 出的生物。很明显，对于不同的应用（例如，血液、水、环境样本等）， 生物可不同于表1中列出的生物，然而方法是相同的。

表1：内在荧光算法鉴定生物列表

现在将详细描述图2A-C所示的处理步骤或模块。

预处理

步骤5102：获得荧光值n_ij，对于每个激发值，i=1,2，…,x，且对于每 个发射值，j＝1,2，…,y，组合。比率，即发射值/激发值，必须落在区间（1.05, 1.95）内。

步骤5104：对于每个荧光值n_ij，计算自然对数值ln(n_ij)。

步骤5106：在给定的激发波长i，对于每个发射值，j＝2,3，…,y-1， 计算自然对数值（来自步骤5104）的一阶导数。

使用步骤5104和5106变换原始荧光数据以最小化每个生物组内的菌 株间变化是有利的。此外，变换过程倾向于在整个生物组中产生类似的变 化。图3、4和5作为例子示出对在激发315处在整个发射范围内评估的 金黄色葡萄球菌的多个菌株菌执行所述预处理的效果。在图3中，每条线 代表来自单个菌株的荧光信号。线5202指示在每个发射值处的平均荧光 信号。图4示出在应用自然对数变换（步骤5104）之后荧光信号的菌株间 变化；注意，所有菌株的曲线形状一起靠拢。图5示出在计算自然对数变 换的一阶导数（步骤5106）之后在315nm的激发处的菌株间变化。再次， 注意，所有菌株的曲线形状一起靠拢得非常近，特别是在400-610nm的发 射范围处。

作为另一例子，图6示出在执行变换步骤之前在415nm的激发处近 平滑念珠菌的荧光信号的菌株间变化。注意在400-650nm的范围内的在发 射上的广泛变化。图7示出了在执行自然对数变换之后在415nm的激发 处这个生物的菌株间变化。图8示出了在执行一阶导数变换之后的菌株间 变化。注意，在图8中，菌株间变化减小很多。

可使用额外的数据变换。一种数据变换是对于特定的激发波长将每个 发射点处的荧光值标准化为所有发射对的平均值。

在另一预处理方法中，荧光值到沿着每个发射和/或激发波长线的最大 信号的标准化可鉴定光谱的附近非峰值区域，其提供使用非标准化数据不 可能的相当大的分类益处。在一些情况下，在应用其它标准化和/或分析策 略之前，将荧光值首先标准化为较不可变的细胞荧光团，例如色氨酸，可 能更准确。此外，瑞利散射（漫反射）数据可潜在地用于补偿分离设备中 的表面变化和/或在微生物细胞团粒沉淀和/或光学系统内的变化。

分析

步骤5108：在执行预处理步骤之后在分析中的分类的第一级别是革兰 氏分类5108。在这个步骤，处理包括两个分支，一个由步骤5110和5112 表示，而另一个由步骤5114和5116表示。图2A并非意在暗示分支不能 够被连续地执行；分支可以连续地或并行地执行。

步骤5110：革兰氏分类距离计算。使用对一组预定的激发/发射对的 一阶导数变换，对于在模型中定义的每个革兰氏类别，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2,3，表示在模型中定义的革兰氏类别

-m表示对每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数的计算值 m_ij的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵。这组激发 和发射对从已知微生物的荧光测量结果实验地确定（利用所执行的预处 理）（见图9和10以及下面的讨论）。

术语“模型”用于指一组已知的微生物菌剂，在预定的激发波长处对 所述微生物菌剂的IF测量结果（包括变换）以前被获得，且对于所述微生 物菌剂，样品是用于分类的候选物，例如表1中列出的菌剂。

步骤5112：革兰氏分类解释。

-让u_g表示最大距离阈值

-如果所有距离d₁、d₂和d₃都大于u_g，则分类结果是未知的

-否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂和d₃的最小值

-让w_g表示低区别阈值因子

-如果多于一个距离d₁、d₂和d₃小于（d_min*w_q），则分类结果是在具有 小于（d_min*w_q）的距离的革兰氏类别之间的低区别。

-如果只有一个距离d₁、d₂和d₃小于（d_min*w_q），则分类结果是相应的 革兰氏类别。

步骤5114：所有科分类距离计算

使用对一组预定的激发/发射对的一阶导数变换，对于在模型中定义的 每个生物科，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2，…,k，表示在模型中定义的所有生物科

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵（与如上所 述的相同，这组激发和发射对被实验地确定）。

-m表示对于每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数的计算 值m_ij的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

步骤5116：所有科分类解释

-让u_f表示最大距离阈值

-如果所有距离d₁、d₂，…,d_a都大于u_f，则分类结果是未知的

-否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂，…,d_a的最小值

-让w_f表示低区别阈值因子

-如果多于一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_f），则分类结果是在具 有小于（d_min*w_f）的距离的生物科之间的低区别

-如果只有一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_q），则分类结果是相应 的科。

步骤5118：对最终革兰氏分类结果合并革兰氏和所有科分类解释。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是单个选择，若科分类落在 革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是所指示的革兰氏类别。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是单个选择，若科分类未落 在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是未知的。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是低区别，若与最短距离相 关的科落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是所指示的革 兰氏类别。

如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是低区别，若与最短距离相 关的科未落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是未知的。

如果革兰氏分类是低区别且所有科分类是单个选择，则合并的分类结 果是如下革兰氏类别：其相应于在分类层级上科存在于之下的革兰氏类 别。

如果革兰氏分类是低区别且所有科分类是单个选择，若没有一个革兰 氏类别相应于在分类层级上科存在于其下的革兰氏类别，则合并的分类结 果是未知的。

如果革兰氏分类和所有科分类都是未知的，则合并的分类结果是未知 的。

处理接着继续进行到步骤5120，革兰氏科分类——在分类层级中第二 较低的分类级别。这个步骤由子步骤5122、5124和5126组成。

步骤5122：革兰氏科分类距离计算。

使用对于革兰氏分类结果特定的一组预定的激发/发射对的一阶导数 估计值，对于在模型中定义的每个生物科，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2，…,k，表示在模型中定义的生物科的数量

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵（如前面关 于那些对所述的相同）。

-m表示对于每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数的计算 值m_ij的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

步骤5124：革兰氏科分类解释

让u_t表示最大距离阈值

如果所有距离d₁、d₂，…,d_a都大于u_t，则分类结果是未知的

否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂，…,d_a的最小值

让w_t表示低区别阈值因子

如果多于一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_t），则分类结果是在具有 小于（d_min*w_t）的距离的生物科之间的低区别

如果只有一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_t），则分类结果是相应的 科。

步骤5126革兰氏科分类结果。

如果革兰氏科分类结果是未知的，则测试生物分类在革兰氏级别处结 束。

如果革兰氏科分类结果是低区别，则测试生物分类作为包括在低区别 中的革兰氏和科而结束。

如果革兰氏科分类结果是单个科，则来自测试生物的IF数据被进一步 分析以确定种级别鉴定是否可被确定。

步骤5128革兰氏科种分类。处理指令继续进行到革兰氏科种分类级 别——由子步骤5130、5132和5134组成的在分类层级中第三和甚至更低 的分类级别。

步骤5130革兰氏科种分类距离计算。

使用对革兰氏科分类结果特定的一组预定的激发/发射对的一阶导数 估计值，对于在模型中定义的每个生物种，计算距离，

d_a＝[(m-m_a)^t∑^-1(m-m_a)]^1/2

其中

-a=1,2，…,k，表示在模型中定义的生物种的数量

-∑^-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵（与如前面 所述的相同）

-m表示对于每个激发/发射对i，j的自然对数变换的一阶导数m_ij的计 算值的矢量

-m_a表示在每个激发/发射对i，j处来自对每个类别a的分布的平均值 m_a(ij)的矢量

-t表示矢量的转置

-(m-m_a)表示对于每个激发/发射对i，j，差值m_ij-m_a(ij)的矢量

步骤5132：革兰氏科种分类解释。

-让u_s表示最大距离阈值。

-如果所有距离d₁、d₂，…,d_a都大于u_t，则分类结果是未知的。

-否则，确定d_min的值，即，d₁、d₂，…,d_a的最小值。

-让w_s表示低区别阈值因子。

-如果多于一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_s），则分类结果是在具 有小于（d_min*w_s）的距离的生物种之间的低区别

-如果只有一个距离d₁、d₂，…,d_a小于（d_min*w_t），则分类结果是相应 的种。

步骤5134革兰氏科种分类结果。

如果革兰氏科种分类结果是未知的，则测试生物分类在革兰氏和科级 别处结束。

如果革兰氏科种分类结果是低区别，则测试生物分类作为包括在低区 别中的革兰氏、科和种而结束。

如果革兰氏科种分类结果是单个种，则测试生物分类在革兰氏、科和 种级别处结束。

在步骤5136，在步骤5134、5118和5126确定的结果例如在鉴定仪器 的用户界面上返回并报告给用户，传输到所连接的工作台，返回到另一软 件模块，或以另外方式为用户产生。

关于生物鉴定（步骤5134），只有当（发射值的自然对数变换的）一 阶导数的值对至少一个激发波长在发射范围的某个部分处对模型中的每 个种是唯一的时，在种之间的区别才是可能的。图9和10示出对于激发 波长315nm（图9）和415nm（图10）在种的子集之间可能的区别。参 考图9，显然这些种中的几个可基于在激发波长315处的一阶导数与其它 种区分开。数学模型使用发射的（自然对数变换的）一阶导数值，其中视 觉差异作为输入而存在以区分开种。使用在整个发射范围内的值的选定部 分，下面的种可清楚地与其它种区分开：肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、绿 脓杆菌和肺炎链球菌。此外，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可与其它种 而不是与彼此区分开。在给定的激发波长处在整个发射范围内的值的部分 是在如上所述的处理步骤中的距离计算中的逆矩阵∑^-1中的预定对。这些对 可例如是在315nm处的激发和由图9中所示的圆圈指示的发射值的范围， 即，(315/300-450)、(315,485-500)、(315/570-580)。

参考图10，显然在激发波长415nm处的发射具有区分开种的能力。 使用在整个发射范围内的值的选定部分，近平滑念珠菌（C.parasilopsis） 和铜绿假单胞菌（P.auruginosa）可明确地与其它种区分开。注意到出现在 大约发射450nm处的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的一阶导数值之间 的差异也是有意义的。当来自波长315和415（图9和10）的整个发射范 围内的值的选定部分的信息被组合时，模型中的所有种可以高比值（＞97% 可靠性）彼此区分开。

为了增强荧光信号，微生物可在离心/浓缩之前被涂有金和/或银纳米 粒子，和/或内部光学表面可被预先涂有特定尺寸和形状的金属胶体（参考 文献：关于荧光，Lakowicz,Anal.Biochem.337:171(2005)；关于SERS， Efrima等人,J.Phys.Chem.B.(Letter)102:5947(1998)）。在另一实施方式 中，纳米粒子在离心之前存在于在分离设备中存在的致密垫中并当微生物 穿过致密垫时与微生物相关联。

上面在图2-10的背景中解释的分类学的层级分类方法适用于从微生 物菌剂的探询得到的其它数据集。例如，在拉曼散射数据或质谱数据而不 是内在荧光数据从浓缩的微生物菌剂得到情况下，分类方法是同样有用 的。在拉曼散射的情况下，数据从已知的微生物菌剂获得，且这样的数据 被分析（一般在变换步骤被执行之后）以确定革兰氏、科和种之间区分开 的数据的子集以及结果，即，所存储的有差别的子集。类似地，来自未知 的微生物菌剂的数据经受变换步骤以最小化种之间的菌株间变化；变换可 以是自然对数、一阶导数或其它变换，基于已知的微生物菌剂的数据的检 查，变换的选择和细节将在本领域中的技术人员的能力范围内。图2A-2C 的处理（在革兰氏、科和种级别的层级分类）接着继续进行。用于分类的 最小距离计算的可选方案例如公知的K-最近邻分类算法可用于在每个分 级级别处的测试样本的分类。也将明显，可能需要在图2A-2C的流程图中 未示出的额外的预处理步骤，其对分析测试方法例如背景减除或标准化是 唯一的，但这些步骤在本领域中是已知的，且因此详细描述是不必要的。

概括前述内容，我们描述了用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微 生物菌剂的方法，其包括下列步骤：

获得微生物菌剂的分析测试数据；变换该分析测试数据，从而最小化 在生物组内的分析测试数据的菌株间变化；以及借助于编程计算机，执行 被编码为对经变换的分析测试数据执行的一组处理指令的多级分类算法， 多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级 别。在一些实施方式中，分析测试数据（例如，内在荧光、拉曼散射）被 执行，同时微生物菌剂浓缩在菌剂被分离和浓缩的测试设备内，如图1所 示；在其它实施方式中，浓缩的菌剂从测试设备移出，且通过单独的仪器 例如质谱仪来受到分析。在美国专利6,780,602中公开了可被使用的分析 方法的另外例子，该专利的内容通过引用被并入本文。

虽然公开了样本是人类或动物血液的实施方式，显然本发明通常适用 于可以是临床或非临床样本的样本。方法还可以用于鉴定从平板或其它形 式的微生物培养设备中取出的微生物菌落，且在这种情况下，这样的菌落 生长所来自的样本同样可以是临床或非临床样本，且因此不一定是血液。 例如，样本可以是被怀疑包含一种或多种微生物菌剂的临床或非临床样 本。临床样本例如体液包括但不限于血液、血清、血浆、血液成分（blood fraction）、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊髓液、胃内容物、阴 道分泌物、组织匀浆、骨髓抽出物、骨匀浆、痰、抽出物、拭子和拭子漂 洗液（swab rinsate）、其它体液等。可被测试的非临床样本包括但不限于食 品、饮料、药品、化妆品、水（例如，饮用水、非饮用水、以及废水）、 海水压舱物（seawater ballast）、空气、土壤、污水、植物物质（例如，种 子、叶、茎、根、花、果实）、血液产品（例如，血小板、血清、血浆、 白细胞成分等）、捐赠器官或组织样本、生物战样本（biowarfare sample） 等。

偏离所公开的实施方式的来自具体细节的变化当然是可能的，而不偏 离本发明的范围。涉及范围的所有问题应通过参考所附权利要求来回答。