一种判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性的方法

摘要

本发明公开了一种判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性的方法。本发明所述方法是通过非标记探针的高分辨率溶解曲线法进行SLE患者进行基因分型，进而判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性。目前已经明确环境因素和基因因素在SLE的发生发展中有重要的作用，因此，本发明的研究结果为更深入的了解SLE疾病提供了理论依据。

说明书

技术领域

    本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性的方法。

背景技术

    系统性红斑狼疮（SLE）是一种可累及多器官包括皮肤、关节、浆膜、肾脏、心血管系统和中枢神经系统的慢性自身免疫性疾病。本病的主要特征是自身抗体的产生和免疫复合物的形成，以及随之产生的多器官组织炎症反应。尽管对SLE已有大量研究，但目前对其病因仅有部分的了解。目前已经明确，环境因素和基因因素在SLE的发生发展中有重要的作用。近期，对高加索人口进行全基因组关联分析研究发现SLE的几个易感基因，包括MHC，BLK，ITGAM，STAT4，IRF5，BANK1和ETS1，且其与SLE的相关性已经通过后续的基因分型研究得以证实。这些研究为更深入的了解SLE这个复杂的疾病提供了理论。

B淋巴细胞酪氨酸激酶（BLK）是Src激酶家族的一个成员，主要参与B淋巴细胞受体信号的传递，对B淋巴细胞的生长及其功能的成熟有重要的作用。全基因组关联分析在高加索人口中首次发现了BLK基因遗传变异与SLE相关。此后，几项研究证实了亚洲人BLK基因的单核苷酸多态性（SNPs）与SLE相关。在BLK的SNPs中，启动子区域的rs13277113可影响BLK的表达，并与高加索和瑞典人SLE相关。这一基因座与SLE的相关性随后在日本、中国香港及泰国人中得到进一步的证实，而在中国大陆人中并未有报道（Ito I, Kawasaki A, Ito S et al. Replication of the association between the C8orf13-BLK region and systemic lupus erythematosus in a Japanese population. Arthritis Rheum 2009;60 2: 553-8.和Yang W, Ng P, Zhao M et al. Population differences in SLE susceptibility genes: STAT4 and BLK, but not PXK, are associated with systemic lupus erythematosus in Hong Kong Chinese. Genes Immun 2009;10 3: 219-26.）。除了rs13277113外，rs4840568与rs13277113的连锁不平衡与BLK的低表达相关。但是很少有证据支持亚洲人，尤其是中国大陆汉族人rs4840568与SLE也有类似的相关性。在此，我们拟通过新近发展起来的非标记探针高分辨率溶解曲线法，来研究中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE发病风险的相关性。

发明内容

    本发明的目的在于根据现有的对SLE研究中存在的不足，提供一种方法，可以用于判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE发病风险的相关性。

    本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

    一种判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性的方法，该方法是非标记探针的高分辨率溶解曲线法。

更进一步地，上述方法包括如下步骤：

（1）基因分型：取外周血基因组DNA，鉴定其基因型；

（2）统计学分析：单核苷酸多态性与疾病相关性分析通过SLE患者与正常人群次等位基因频率比较，以及用卡方检验或Fisher’s 精确概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析，P值小于0.05认为是有统计学意义；

（3）针对B淋巴细胞酪氨酸激酶启动子区域的rs1327711 3和rs4840568设计非标记探针，用于鉴别三种基因型的单核苷酸多态性，所述rs13277113的非标记探针序列如SEQ ID NO:1所示；所述rs4840568的非标记探针的序列为如SEQ ID NO:2所示。

    与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

    本发明所述方法是通过非标记探针的高分辨率溶解曲线法进行SLE患者进行基因分型，进而判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性。目前已经明确环境因素和基因因素在SLE的发生发展中有重要的作用，因此，本发明的研究结果为更深入的了解SLE疾病提供了理论依据。

附图说明

    图1为非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型，其中，A和C是包含探针区的非探针区的熔融曲线图，B和D是只包含探针区的熔融曲线图。

具体实施方式

    以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

    实施例

1. 研究对象

北京大学深圳医院的286名符合美国风湿学会有关SLE诊断标准（Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1997;40 9: 1725.）的SLE患者（男26人，女260人，中位年龄29岁，年龄跨度12-55岁）和352名人种匹配的健康对照人员（男30人，女322人，中位年龄为28岁，年龄跨度为17-46岁）参与了研究。所有健康对照组人员均无SLE家族史及相关性的临床症状。本研究获得深圳医院伦理委员会同意及所有参与者的知情同意。

2. 基因分型

采用Innogent的全基因组DNA提取试剂盒（Innogent，China），根据试剂盒说明书要求提取所收集的外周血基因组DNA。采用非标记探针高分辨率溶解曲线的方法鉴定样本的基因型。方法简述如下：首先进行不对称PCR，20 mL体系含基因组DNA模板20 ng，1′PCR缓存液（Takara，Japan），200 mM dNTPs，0.5 U rTaq DNA聚合酶（Takara，Japan），0.05 mM正向引物，0.5 mM反向引物和0.5 mM C3封闭的探针。PCR反应在Bio-Rad S1000 PCR仪上进行（Bio-Rad, 美国）。PCR扩增条件如下：94℃预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5 min。反应结束后，转移10 mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入1 mL LCGreen Plus染料（Idaho Technology, USA）后，最后以HRM in CFX96 实时荧光系统C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad，美国)进行检测。rs113277113引物序列为：正向SEQ ID NO:1，反向SEQ ID NO:2； rs4840568引物序列为：正向SEQ ID NO:3，反向SEQ ID NO:4。非标记C3封闭探针序列：SEQ ID NO:5~6。

3. 统计学分析

SNP与疾病相关性分析通过SLE患者于正常人群次等位基因频率（MAF）比较，以及用卡方检验或Fisher’s 精确概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析。相关性程度以让步比（OR）的95%置信区间（95%CI）表示。连锁不平衡及单倍型分析均在SHEsis软件上完成。P值小于0.05认为是有统计学意义。

4. 结果

不标记探针高分辨熔炼分析法（HRMA）

通过非标记探针的使用，HRMA的敏感性与精确度大大提高。在此，我们针对BLK启动子区域的rs13277113（A>G）及 rs4840568（A>G）设计了非标记探针，三种基因型的单核苷酸多态性（野生型、杂合突变及纯合突变）均可精确的鉴别（图1）。如图1所示，从探针区熔融曲线获得的基因型在PCR产物熔融中得到进一步的证实。之后，这种方法应用于对本研究的筛查。

rs13277113和 rs4840568单核苷酸多态性与SLE的相关性

表1所示为SLE患者和正常健康人群BLK rs13277113和rs4840568的基因型及等位基因频率。SLE患者和正常人群的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡。SLE患者rs13277113和rs4840568单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率与健康对照人群相比差异均有统计学意义。rs13277113 (P = 1.4E-03, OR 0.65, [95% CI 0.50-0.85]) 和rs4840568 (P = 3.1E-03, OR 0.67, [95% CI 0.52-0.87])次等位基因对SLE均有保护作用。

表1

我们发现，rs13277113和rs4840568单核苷酸多态性表现出强连锁不平衡。因此，我们对此进行单倍型分析（见补充内容表1）。我们发现，主要AA基因型在SLE患者中具有更高的频率(P = 8.1E-04, OR 1.56 [95% CI 1.20–2.03])，提示这种基因型与SLE显著相关。相反，次要GG基因型在健康对照人群中具有更高的频率(P = 4.9E-03, OR 0.68 [95% CI 0.52–0.89])，提示这种基因型对SLE具有保护作用。

rs13277113和 rs4840568单核苷酸多态性与SLE诊断指标的相关性

为进一步分析BLK单核苷酸多态性与SLE的相关性，我们比较了rs13277113和rs4840568基因型和等位基因频率与SLE的诊断指标之间的关系。结果发现只有蛋白尿与之的相关性具有统计学意义（补充内容部分表2）。同样，我们发现rs13277113 (P = 2.9E-03, OR 0.53, [95% CI 0.35-0.81]) 和rs4840568 (P = 1.3E-03, OR 0.50, [95% CI 0.33-0.77]) 次等位基因对蛋白尿异常具有保护作用。

表2

5. 讨论

HRMA是基因分型和筛查突变的一种廉价、简单、精确而快速的研究方法，但也有缺点，如对A/T或G/C的单核苷酸多态性（占全部人类基因多态性的16%）的鉴别较困难，因为这两种SNPs产生的溶解曲线偏移很小（通常小于0.4°C）。非标记探针高分辨率溶解曲线法是一种改良的HRMA，其以一段~30 bp的C3封闭的探针来匹配在熔融过程中感兴趣的SNP（15）。如此短的探针中，一个碱基对的差异都可引起显著溶解曲线偏移（如3-4℃）。因此，正如本研究所示，我们通过非标记探针的高分辨率溶解曲线法可以精确而可靠的检测几乎所有的SNPs。

BLK是Src激酶家族的一个成员，主要对来自B细胞受体的信号进行传导。BLK局限于B细胞系中表达，其在人类中的作用尚未清楚。近期，有两项对高加索人种进行全基因组关联分析的研究发现，BLK是SLE的一个易感基因。目前已经有研究关注BLK与SLE及其它自身免疫性疾病，如原发性抗心磷脂综合症、系统性硬化及I型糖尿病之间的相关性。到目前为止，已经发现有不少于10个定位于BLK基因的SNPs被发现与SLE相关。定位于BLK启动子区域的rs13277113 SNP是一个已经明确SLE标记，其与BLK基因的转录水平密切相关。尽管如此，目前并无证据支持这种相关性在中国大陆居住的汉族人口中也存在。本研究中，我们发现rs13277113 SNP与SLE显著相关，这与对其他亚种人如日本、中国香港机泰国人的研究的结果一致。值得一提的是，rs13277113 SNP基因型及等位基因分布在亚洲人与高加索人有明显不同：在亚洲人的纯合突变（AA）和主要等位基因（A）在高加索人中分别是杂合突变和次要等位基因。而等位基因A在这两种人口中均为危险等位基因。亚洲人中rs13277113 SNP具有较高的A等位基因频率，这可以部分解释为何亚洲人更易患SLE。

rs4840568 SNP与SLE的相关性在亚种人中并未有深入的研究。在本研究中，我们发现rs4840568 SNP在中国汉族人口中表现出与SLE有很强的相关性。单倍型分析发现，AA与GG分别为SLE的危险性和保护性的单倍型。BLK SNPs与SLE诊断指标的相关性进一步证实了其与SLE的相关性。蛋白尿异常在SLE中是一种反应自身免疫范围及严重性的指标，而rs13277113与 rs4840568次等位基因对其具有保护作用。

总之，我们的研究结果发现了中国汉族人口BLK多态性与SLE中间的相关性。BLK启动子区域的基因突变可以引起BLK表达的失调，从而导致SLE的发生与发展。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  深圳北京大学香港科技大学医学中心

 

<120>  一种判定中国大陆汉族人rs4840568和rs13277113单核苷酸多态性与SLE之间的相关性的方法

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.2

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  rs113277113正向引物序列

 

<400>  1

tcaggcaaga tgtccgtag                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  rs113277113反向引物序列

 

<400>  2

aaatgtttgt ttctgggtac tag                                             23

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  rs4840568正向引物序列

 

<400>  3

cccacaccca ctctcaag                                                   18

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  rs4840568反向引物序列

 

<400>  4

gctggttcct ttccactag                                                  19

 

 

<210>  5

<211>  30

<212>  DNA

<213>  rs113277113探针序列

 

<400>  5

aacacttatc agatcattgt ctgcttttgg                                      30

 

 

<210>  6

<211>  29

<212>  DNA

<213>  rs4840568探针序列

 

<400>  6

tccaagacta tgaagagaga agagagagc                                       29