米老排的组织培养方法

摘要

本发明公开了米老排的组织培养方法，通过选取优树萌条，建立组织培养无性繁殖体系，在短期内培育出大量优质苗木，实现规模化提供优质无性系米老排苗木的目的，以满足市场的需求，这不仅大大缩短了米老排的育种年限，同时为进一步利用基因工程方法开展遗传改良提供了理论和技术依据。

说明书

技术领域

本发明属于热带珍贵树种的栽培及移植技术领域，特别涉及米老排的培育方法。 

背景技术

米老排( Mytilaria laosensis Lecomte）别名壳菜果、三角枫，属金缕梅科常绿阔叶大乔木，树高达30m以上，胸径达100cm。天然分布于我国广东、广西和云南及越南、老挝等地。上世纪80年代后，引种到我国福建、江西、浙江等地获得成功。米老排是我国南亚热带地区的名贵乡土阔叶树种，1974年，云南省将米老排推选为云南热带地区经济价值较高、有发展前途的优良用材树种。随着米老排人工林种植年限的增加和种植面积的扩大，米老排的生长规律、经济效益及生态效益、木材性质及利用等方面的特性不断被研究认识。米老排优良速生、树干通直，枝条细，材质好，色泽美观，经久耐用，适于制作家具、胶合板、客车车箱、纸浆等，米老排用作防火路生土带及长期的火烧山土壤造林的先锋树种，造林成功率高，改善土壤理化性质及防火效果显著，米老排与杉木混交林、米老排与红锥、格木混交林可作为我国南亚热带和中亚热带林业可持续经营模式推广应用，米老排叶子肥大嫩绿，营养成分含量高，牛、羊、猪、兔等牲畜喜食，是一种饲料资源，米老排分泌树脂的化学成分主要是脂类物质，其种仁含油量高达36.8％，也是重要的油脂资源。

米老排为我国及越南、老挝特有的树种，目前未见国外对米老排的研究报道，国内对米老排的研究主要集中在引种、育苗、造林、生态和防火效益、木材性质及利用等方面，未见米老排无性繁殖和组织培养的报道。

我国米老排人工林都采用种子苗培育造林，种子苗分化大，人工林难以获得最大产量。突破无性繁育技术是米老排实现优良无性苗木造林，获得最大遗传增益的最有效途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有不足，提供了一种米老排的组织培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

米老排的组织培养方法，包括以下步骤： 

⑴    外植体的采集及消毒

采集米老排当年生萌条顶梢25～30cm，剪去叶片，切成4～5cm长、带1～2个腋芽的茎段，经表面清洗、除杂后，进行消毒处理，得到无菌外植体；

⑵    增殖培养

将无菌外植体接种至增殖培养基，控制培养条件为：25±1℃、光照8～10h﹒d^-1、光照强度2500～3500lx，以27～33天为周期进行继代培养，得到增殖芽； 

⑶    壮苗培养

将增殖芽转接至壮苗培养基，培养条件同步骤⑵，以27～33天为周期进行继代培养，将芽高大于0.5cm的增殖芽单个切下，转接至生根培养基诱导生根；

⑷    生根培养及炼苗

生根培养条件同步骤⑵，培养18～22天后，把已生根的瓶苗转移到日光温室中进行炼苗； 

⑸    苗木移植及管理

将完成炼苗的苗木从生根培养基中取出，洗净苗木根部的培养基，移植至苗圃的营养袋中，进行全天候强化管理15～20天，控制光照强度、湿度和温度，然后实行全光照苗圃管理。

优选的，步骤⑴中，消毒处理后，将茎段两端各切去1.5±0.3cm，留下含腋芽的中间段作为无菌外植体。

优选的，增殖培养基的成分为：MS+6-BA 0.9～1.1mg﹒L^-1+IBA0.4～0.6mg﹒L^-1。

优选的，步骤⑵中，增殖培养6个周期以上。

优选的，壮苗培养基的成分为：MS+6-BA0.3～0.5mg﹒L^-1+IBA0.4～0.6mg﹒L^-1 +GA₃0.6～0.9mg﹒L^-1。

优选的，步骤⑶中，壮苗培养1～2个周期。

优选的，生根培养基的成分为：1/2MS+ IBA0.2～0.8mg﹒L^-1+活性炭0.05～0.15g﹒L^-1。

优选的，步骤⑷中，炼苗的培养条件控制为：25～35℃，光照强度4000～10000lx。

优选的，炼苗时间为15～20天。

优选的，步骤⑸中，苗木移植后，实行如下管理操作：10天内，在苗床上盖薄膜，并覆盖遮荫网，控制相对湿度为90～95%、温度为25～30℃；10天后，晚上在苗床上盖薄膜，白天则加盖遮荫网，控制相对湿度为80～85%；15～20天后，无需盖薄膜和遮荫网，实行全光照常规苗圃管理。

本发明的有益效果是：

本发明从野外采集米老排外植体建立无菌无性系，开展组培增殖培养和生根培养，在短期内培育出大量优质苗木，实现规模化提供优质无性系米老排苗木的目的，以满足市场的需求，这不仅大大缩短了米老排的育种年限，同时为进一步利用基因工程方法开展遗传改良提供了理论和技术依据。

具体实施方式

米老排的组织培养方法，包括以下步骤： 

⑴    外植体的采集及消毒

采集米老排当年生萌条顶梢25～30cm，剪去叶片，切成4～5cm长、带1～2个腋芽的茎段，经表面清洗、除杂后，进行消毒处理，得到无菌外植体；

⑵    增殖培养

将无菌外植体接种至增殖培养基，控制培养条件为：25±1℃、光照8～10h﹒d^-1、光照强度2500～3500lx，以27～33天为周期进行继代培养，得到增殖芽； 

⑶    壮苗培养

将增殖芽转接至壮苗培养基，培养条件同步骤⑵，以27～33天为周期进行继代培养，将芽高大于0.5cm的增殖芽单个切下，转接至生根培养基诱导生根；

⑷    生根培养及炼苗

生根培养条件同步骤⑵，培养18～22天后，把已生根的瓶苗转移到日光温室中进行炼苗； 

⑸    苗木移植及管理

将完成炼苗的苗木从生根培养基中取出，洗净苗木根部的培养基，移植至苗圃的营养袋中，进行全天候强化管理15～20天，控制光照强度、湿度和温度，然后实行全光照苗圃管理。

为了提高组织培养的成功率，选择在树木旺盛生长的季节（最好为5～9月），连续晴天5天以上，早上8～9点，采集优良植株当年生萌条的顶梢。萌条的选择标准为：生长健康、无病虫害、枝条粗壮、表皮光滑、叶片嫩绿。采集时，及时剪去叶片，并放入保鲜密实袋中，确保萌条干爽、鲜活。若条件允许，将保鲜密实袋放在装有冰袋的泡沫保鲜箱中，当天带回实验室进行消毒处理。

由于萌条采自野外树林，其表面尘埃和杂菌较多，消毒前先用洗衣粉或清洗液溶液浸洗茎段20～30min，并用医用棉轻轻清洗其表面，再用自来水冲洗干净，若未经清洗，后续很难成功消毒，在清洗时切忌擦伤皮层，否则在消毒时药液容易杀伤外植体；接着在超净工作台上先用70～75%（v/v）的酒精处理1～1.5min，再用0.08～0.12%（w/v）升汞消毒5～7 min，期间不断摇动；然后用无菌水洗4～5次，每次3～4min；最后将茎段两端各切去1.5±0.3cm，留下中间含腋芽的茎段作为无菌外植体，接种到增殖培养基上。以下实施例中选用75%酒精、0.1%升汞分别进行消毒处理，但不限于此。作为优选的，消毒处理后，将茎段两端各切去1.5±0.3cm，留下含腋芽的中间段作为无菌外植体。

优选的，增殖培养基的成分为：MS+6-BA 0.9～1.1mg﹒L^-1+IBA0.4～0.6mg﹒L^-1。更优的，其成分为：MS+6-BA1.0mg﹒L^-1+IBA0.5mg﹒L^-1。优选的，增殖培养6个周期以上。

优选的，壮苗培养基的成分为：MS+6-BA0.3～0.5mg﹒L^-1+IBA0.4～0.6mg﹒L^-1 +GA₃0.6～0.9mg﹒L^-1。更优的，其成分为：MS+6-BA0.4mg﹒L^-1+IBA0.5mg﹒L^-1 +GA₃0.8mg﹒L^-1。优选的，壮苗培养1～2个周期。

优选的，生根培养基的成分为：1/2MS+ IBA0.2～0.8mg﹒L^-1+活性炭0.05～0.15g﹒L^-1。更优的，其成分为：1/2MS+ IBA0.4mg﹒L^-1+活性炭0.1g﹒L^-1。

优选的，步骤⑷中，炼苗的培养条件控制为：25～35℃，光照强度4000～10000lx。优选的，炼苗时间为15～20天。

优选的，步骤⑸中，苗木移植后，实行如下管理操作：10天内，在苗床上盖薄膜，并覆盖遮荫网，控制相对湿度为90～95%、温度为25～30℃；10天后，晚上在苗床上盖薄膜，白天则加盖遮荫网，控制相对湿度为80～85%；15～20天后，无需盖薄膜和遮荫网，实行全光照常规苗圃管理。

以下实施例中，苗圃营养袋以质量比为80：20的黄泥和泥炭土为基质，但不限于此。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。以下为较佳实施例，但本发明的实施方式不限于此。

本实施例中MS培养基的成分如表1所示：

6-BA是6-苄基氨基嘌呤、IBA 为吲哚丁酸，GA₃为赤霉素。培养基中均加入蔗糖3%，卡拉胶7.0 g﹒L^-1，用NaOH或HCL调pH至5.6。1/2MS表示MS中所有含量减半。

实施例1

申请人在2011年8月从广东省广州市广汕一路682号热带林业研究所米老排试验林采集外植体，经组织培养繁殖，到2012年7月实现产苗2000株，供热带林业研究所经济林栽培与利用理论与技术研究首席专家组营造无性系示范林。具体步骤如下： 

⑴   外植体的采集

2011年8月3日，采集优良植株当年生萌条顶梢，长25～30cm，含4～7对叶，采集当时剪去叶片，放入保鲜密实袋中，当天带回实验室进行消毒处理。

⑵   外植体消毒

在实验室中把枝条切成4～5cm长、中间带1～2个腋芽的茎段，得到茎段共60个，放在洗衣粉溶液中浸洗20～30min，并用医用棉清洗材料表面，再用自来水冲洗干净；接着在超净工作台上先用75%的酒精处理1～1.5min，再用0.1%升汞消毒5～7min，期间不断摇动；消毒后，用无菌水洗4～5次，每次3～4min，然后将茎段两端各切去1.5±0.3cm，留下中间约2.0cm长的含腋芽的茎段，接种至增殖培养基。

⑶  增殖培养

增殖培养基为MS+6-BA1.0 mg﹒L^-1+IBA0.5 mg﹒L^-1，外植体接种数量为1个/200mL培养瓶，共60瓶，放入培养室培养，控制培养条件为：温度25±1℃、光照8～10h﹒d^-1、光照强度2500～35000lx。培养30天后，获得34个无污染、已萌发腋芽的茎段，消毒成功率为56.7%。

把获得的萌发腋芽作为增殖芽继代转接，转接周期为30天，增殖转接时以3～4个为1丛，每200mL培养瓶接种4～5丛。根据生产规模，在增殖培养基上连续培养6个周期以上，即半年后，将获得的增殖芽转入壮苗培养基。

经对比试验，发现本发明增殖培养基中的6-BA浓度是影响增殖倍率的关键因子：设计6-BA0.5 mg﹒L^-1、1.0 mg﹒L^-1、1.5 mg﹒L^-1、2.0 mg﹒L^-14个浓度，各浓度每次处理3瓶，每瓶接种增殖芽15个，培养30天后，统计增殖结果。以上操作重复3次，即每个浓度共处理9瓶增殖芽。转接培养后，平均每次获得增殖芽数量分别为86个、131个、86个、63个。由表2可见，当6-BA浓度为1.0 mg﹒L^-1时，月增殖倍率最高，可达2.9倍。按此倍率预算，经过1年的培养，将获得10多万个芽，完全可达到快速繁殖的要求。

⑷  壮苗培养

2012年2月3日，将部分继代培养得到的增殖芽转接入壮苗培养基，壮苗培养基为MS+6-BA0.4 mg﹒L^-1+IBA0.5 mg﹒L^-1 +GA₃0.8 mg﹒L^-1，培养条件同⑶，培养周期30天，壮苗培养转接时以2～3个增殖芽为1丛，每200mL培养瓶接种3～4丛。根据苗木生长情况，壮苗培养1～2个周期。第1个周期，壮苗培养30天后，把芽高>0.5cm的增殖芽单个切下，接入生根培养基，芽高<0.5cm的增殖芽丛继续接种在壮苗培养基上，第2个壮苗周期，将芽高>0.5cm的增殖芽单芽批量接入生根培养基生产苗木。

本发明中壮苗培养是不可缺少的环节，未经壮苗时获得芽高>0.5cm的单芽平均为8.3个/瓶，经过壮苗培养后获得芽高>0.5cm的单芽平均为12.8个/瓶，平均多生产4.5个/瓶。

⑸   生根培养及炼苗

于2012年3月3日和4月3日，从壮苗培养基中把芽高>0.5cm的单芽切下，接入生根培养基，生根培养基为1/2MS+ IBA0.4 mg﹒L^-1+AC（活性炭）0.1 g﹒L^-1，接种数量为6株/200mL培养瓶，在培养室培养20天，培养条件同⑶。20天后，转移至日光温室中进行炼苗，温室温度控制在25～35℃，光照强度4000～10000lx，炼苗时间为20天。

经过生根培养20天和炼苗20天后，苗木的平均生根率为81.8%，苗高1.2cm，平均根数7.8条/苗，总根长10.4cm/苗。生根苗根系发达，苗木粗壮，苗茎硬朗，叶色嫩绿，适合直接移植在苗圃的营养袋中。

经对比试验，发现本发明生根培养基中，IBA浓度为0.2～0.8 mg﹒L^-1不影响生根率，但对苗高生长有显著影响：IBA浓度分别取0.2 mg﹒L^-1、0.4 mg﹒L^-1、0.6 mg﹒L^-1、0.8mg﹒L^-1，每个浓度处理5瓶，每瓶接种6株，共计30株，经过生根培养20天、炼苗20天后，平均苗高分别为1.06cm、1.2cm、1.06cm、1.1cm。因此IBA以0.4 mg﹒L^-1为最佳浓度。

⑹  移植及管理

将完成炼苗的有根苗木小心从培养瓶中取出，用清水漂洗净苗木基部的培养基，当天移植入含质量百分比为80%黄泥+20%泥炭土基质的营养袋中，营养袋规格为6×11cm。首先进行全天候强化管理，具体操作如下：苗木移植10天内，苗床加盖薄膜，苗床光照超过4000lx时，在薄膜上加盖1层90%遮荫网，超过10000lx时，加盖2层90%遮荫网，每天淋水1～2次，控制相对湿度90～95%；温度高时，在遮荫网上淋降温水，控制苗床温度为25～35℃。苗木移植10～20天，晚上盖薄膜；白天盖遮荫网，晴天时，苗床光照超过4000lx时，覆盖1层90%遮荫网，超过10000lx时，覆盖2层90%遮荫网；若是雨天，则全天仅盖薄膜；每天淋水2～4次，控制相对湿度80～85%。苗木移植20天后，实行全光照正常苗圃管理（不用盖薄膜和遮荫网）。

2012年4～5月，移植生根苗木3500株，移植20天时统计成活苗木为2982株，苗木移植成活率为85.2%。米老排组培苗移植对苗圃管理要求不高，移植强化管理20天后即可实行正常全光照苗圃管理。实现了当年采集外植体，第2年有批量优良无性系苗木供应市场的目的。

⑺   出苗

至2012年7月，共获得可供造林苗木2000株。

实施例2

申请人在2012年7月采集广东省西江林场米老排人工林优良单株外植体，共采集10株优良单株萌条外植体，到2012年10月统计，其中9个优良无性系获得增殖芽，无性系组培成功率达90%。组培成功率=获得增殖芽无性系数/接种无性系个数×100%。经过3个月的增殖培养，9个无性系共获得278个增殖芽。为2013年批量生产苗木打下坚实基础。具体步骤如下：

⑴   外植体的采集

2012年7月12日，采集10株优良单株当年生萌条顶梢，长25～30cm，含4～7对叶，采集当时剪去叶片，放入保鲜密实袋中，用装有外敷冰袋的泡沫保鲜箱及时带回实验室。

第⑵ 步及第⑶步同实施例1。

2012年10月统计，共获得9个优良无性系278个增殖芽。

本发明通过选取优树萌条，建立组织培养无性繁殖体系，用于优良品种的繁殖，在短期内培育出大量优质苗木来满足市场的需求，这不仅大大地缩短了米老排的育种年限，同时为进一步利用基因工程方法开展遗传改良提供理论和技术依据。