一株牛蒡内生细菌WY035、含有该内生细菌的牛蒡专用微生物菌剂及应用

摘要

本发明公开了一株牛蒡内生细菌WY035、含有该内生细菌的牛蒡专用微生物菌剂及应用，该菌株的分类命名为Bacillus siamensis WY035，属于暹罗芽孢杆菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2017年11月8日，保藏编号为GDMCC 60275，该牛蒡专用微生物菌剂包括作为有效成分的上述牛蒡内生细菌WY035；所述牛蒡内生细菌WY035和牛蒡专用微生物菌剂可用于促进牛蒡种子萌发与育苗、幼苗生长中。本发明提供的牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035能够产生铁载体、植物生长激素吲哚乙酸、氨，分泌纤维素酶与蛋白酶，并具有广谱抑菌活性，能够显著促进牛蒡幼苗的生长。

说明书

技术领域

本发明属于内生菌技术领域，涉及一株牛蒡内生细菌，具体涉及一株牛蒡内生暹罗芽孢杆菌WY035、含有该内生细菌的牛蒡专用微生物菌剂及应用。

背景技术

药食植物牛蒡(Arctium lappa L.)，为两年生草本植物，又名大力子，属于桔梗目、菊科、牛蒡属植物，牛蒡子是中药药方中一味重要的药材，而牛蒡根是中国人餐桌上的一味常见佳肴。牛蒡的根、茎、叶、种子中均含有大量的木脂素、挥发油、多酚等化学成分，这些物质具有降血压、降血糖、抗肿瘤、抗衰老等重要的药理活性和生理活性。牛蒡特有的牛蒡苷元、牛蒡寡糖以及多酚类物质，如咖啡酸、绿原酸、异绿原酸等具有抗癌抗突变作用。牛蒡根含有的多炔类物质具有抗真菌活性，牛蒡根和叶的提取物发现具有可修复镉诱导的受损肾细胞功能，而从牛蒡根中分离得到的牛蒡寡糖作用于小鼠后，影响小鼠的体液免疫和巨噬细胞吞噬功能，具有防止肿瘤发生的功效。牛蒡因具有良好的药用食用价值，具有极高的推广食用价值以及研究价值，市场需求逐年增加。

目前牛蒡种植时，其培苗阶段多为春季，育苗的成活率有待提高。而在后期牛蒡种植过程中仍存在肥料尤其是氮肥需求量大的问题，尤其以肉质根生长期对营养元素的吸收量最大，目前种植中主要采用施用化学肥料的方法。但是长期施化学氮肥会导致土壤酸化以及大量的氮损失，容易造成土壤板结，改变土壤中正常细菌和真菌群落的结构、造成土传病害的发生，对土地环境造成危害，以及引起连作障碍等，从而限制了牛蒡的规模化种植与产量。因此，目前牛蒡种植过程中亟需无污染的高效生物肥料的应用。

植物内生菌广泛定殖于健康植物的体内，具有高度的生物多样性。研究表明，植物内生菌具有促进植物生长、提高植物抗病，以及提高植物抵抗生物与非生物胁迫的能力。植物内生菌已经在植物育种、植物生长与保护等农林业领域展现出巨大的应用潜力。目前，有关从牛蒡中获得其内生细菌资源，并应用于牛蒡幼苗生长促进的报道较为少见。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株具有广谱抑菌能力，同时又具有促进牛蒡幼苗生长能力的牛蒡内生细菌WY035。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一株牛蒡内生细菌WY035，其分类命名为Bacillus siamensis WY035，其是从牛蒡植株的肉质根中分离得到的内生细菌，经形态学和分子生物学鉴定，该菌属于暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2017年11月8日，保藏编号为GDMCC 60275。

所述的牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035的16S rRNA碱基序列长度为1439bp，如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二是提供一种含有上述牛蒡内生细菌的牛蒡专用微生物菌剂。

为实现上述目的，本发明提供一种牛蒡专用微生物菌剂，包括作为有效成分的牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035，活菌数大于1.0×10⁸cfu/mL。

本发明还提供上述牛蒡专用微生物菌剂的制备方法，具体步骤为：

(1)菌株活化：将分离的牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035菌株斜面或冻存管保藏物接种到含有LB固体培养基的斜面上，30℃培养1-3天，从而活化菌株；

(2)种子液培养：从活化后的LB固体培养基斜面上接种环挑取少许菌体接入到LB液体培养基中，于30℃，160-180rpm转速在摇床上震荡培养24-72小时，获得内生细菌WY035的种子液；

(3)菌剂制备：将培养到对数期的WY035种子培养液以5％的接种量接入到LB液体发酵培养基中，充分搅拌混匀后在30℃培养2-3天，10000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度OD₆₀₀为0.5-1.0的菌剂。

本发明的目的之三是提供上述牛蒡专用微生物菌剂在促进牛蒡幼苗生长中的应用。

为实现上述目的，本发明提供上述牛蒡专用微生物菌剂在促进牛蒡种子萌发与育苗中的应用。

本发明提供上述牛蒡专用微生物菌剂在促进牛蒡幼苗生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明提供的牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035能够产生铁载体、植物生长激素吲哚乙酸(IAA)、氨、分泌纤维素酶与蛋白酶，并具有广谱抑菌活性，对多种植物病原真菌，如西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、苹果轮纹病菌、茄子黄萎病菌和小麦赤霉病菌等具有不同程度的拮抗作用。

2.通过菌株Bacillus siamensis WY035制备的微生物菌剂处理牛蒡种子育苗，以及盆栽幼苗灌根处理，均能够显著促进牛蒡幼苗的生长，能够使其幼苗在土壤中生长更快，在根长与根重上尤为突出。因此，该牛蒡内生细菌研制的微生物菌剂可以在牛蒡育苗期得到应用，起到防治真菌病害并促进幼苗生长的效果，从而减少化学肥料的使用，是一种化肥减施增效的技术，具有较好的应用前景。

3.本发明提供的含有牛蒡内生细菌WY035的牛蒡专用微生物菌剂制备工艺简单，效果显著，绿色无污染，使用简单，易于推广。

附图说明

图1是基于16S rRNA基因序列构建的菌株WY035系统发育树；

图2是平板对峙法检测菌株WY035的拮抗病原真菌活性；

图3是菌株WY035菌剂浸种与不浸种处理后生长的牛蒡幼苗盆穴中生长的比较；

图4是菌株WY035菌剂浸种与不浸种处理后生长的牛蒡幼苗表型数据的比较，(A)鲜重；(B)植株长度；(C)根长；

图5是菌株WY035菌剂灌根与不灌根处理后生长的牛蒡幼苗在盆中生长的比较；

图6是菌株WY035菌剂灌根与不灌根处理后生长的牛蒡幼苗根形态的比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1菌株WY035的分离、鉴定

1.1菌株WY035的分离

选择江苏省徐州市沛县河口镇地区田间健康生长且长势良好的牛蒡植株，将肉质根从土中挖出，抖去表面浮土后，根装入自封袋中密封，带回实验室进行菌株分离。用流水冲洗干净植物根样品表面，将植物样品剪成合适大小后用无菌的0.01％Tween20浸泡1min，再用有效氯含量5％的NaClO浸泡样品根3min，再用无菌的2.5％Na₂S₂O₃处理10min，无菌水清洗5次，用75％的乙醇浸泡样品，处理时间2min，最后用无菌水清洗3-5次。吸取牛蒡根表面消毒最后一步清洗的无菌水，将其均匀涂布在培养基上，于28℃培养箱中培养1周，观察培养基上是否有菌落长出，若无说明表面消毒彻底。用无菌的粉碎机将表面消毒的植物样品粉碎，无菌水将植物样品稀释到10^-2、10^-3、10^-4三个梯度，分别吸取各梯度稀释液100μL均匀涂布在分离培养基上(胰蛋白胨15.0g；大豆蛋白胨5.0g；琼脂20.0g；水1000mL；pH>

1.2菌株鉴定

(1)菌株形态学鉴定：菌株接种在LB固体平板上，30℃培养3天后观察菌落特征，发现菌落呈白色、圆形、光滑，具有典型芽孢杆菌属的形态特征。

(2)WY035菌株16S rRNA基因测序与系统发育分析：从LB固体平板上刮取菌体并提取菌体基因组DNA，用细菌通用引物27f5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.2)和1492r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(SEQ ID NO.3)进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA2μL，10×buffer 5μL，MgCl₂(25mmol)3μL，dNTP(10mmol/L)1μL，27f(10μmol/L)1μL，1492r(10μmol/L)1μL，Taq酶(5u/μL)0.5μL，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工(上海)有限公司测序。测序结果在NCBI上比对初步鉴定具体的属，然后在EzBio>

经测序，WY035菌株的16S rRNA碱基序列长度为1439bp，如SEQ ID NO.1所示。16SrRNA基因序列比对发现该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)的成员，EzBio Cloud网站上调取该属相似性最接近的典型种，比对发现与该属有效发表种暹罗芽孢杆菌Bacillussiamensis的相似性最高，为99.5％，且聚在一个独立的进化分支上(图1)。因此，菌株WY035属于芽孢杆菌属的成员，初步鉴定为暹罗芽孢杆菌WY035(Bacillus siamensis WY035)。

实施例2菌株WY035促生长特征与抑菌活性检测

产铁载体活性检测：将菌株WY035点接于CAS检测培养基上，30℃环境下培养3-5天后，观察菌落周围是否有黄色透明圈，若呈现，则证明该菌株具有产铁载体活性，即呈阳性。定性检测发现菌株WY035能够产生铁载体。

产植物生长激素吲哚乙酸(IAA)检测：配制2.5mg/mL色氨酸溶液，在超净工作台中用0.22μm滤膜过滤除菌。配制液体有氮培养基并进行试管分装，115℃、30min高压灭菌。向已灭过菌的有氮培养基中分别加入1mL色氨酸溶液，使色氨酸浓度为0.5mg/mL，接入待测菌株后放于30℃摇床中培养3天。培养后分别吸取菌液1mL与Salkowski’s显色剂2mL混匀，进行暗反应20min，若试管中溶液呈粉红色则证明该菌株具有产IAA活性。定性检测发现菌株WY035产IAA。

产氨活性检测：挑少量的待测菌株接种于5mL蛋白胨液体培养基中，三次重复，放于30℃120r/min摇床培养3天，每个试管中加入0.5mL Nessler’s试剂，若出现黄褐色沉淀则说明菌株具有产氨活性，若无沉淀则不具有产氨活性。定性检测发现菌株WY035产氨。

纤维素酶活性检测：挑取少量WY035新鲜菌体，将菌株接种于纤维素筛选培养基培养30℃7天，用0.5％刚果红溶液染色10min，然后用1moL/L NaCl溶液冲洗，根据菌落周围是否有黄色透明圈的形成判断是否产纤维素酶。定性检测发现菌株WY035产纤维素酶。

蛋白酶活性检测：挑取少量的菌体用点植法接种到淀粉酶检测培养基上，30℃培养7天，观察菌株生长情况，当菌落生长良好时，将碘液滴加到平板上，若菌落周围出现透明圈则为阳性，反之则为阴性。定性检测发现菌株WY035产蛋白酶。

菌株WY035对植物病原真菌生长的抑制作用测定：采用平板对峙法，用6mm打孔器在病原真菌平板上打取菌饼，用接种针挑取病原菌菌饼(菌丝面朝下)接种至PDA平板，在菌饼周围30mm处接种菌株WY035，接三点。置于28℃培养5-7d，测量菌落直径，拍照。每个处理设置3个平行样，计算对真菌生长的抑制率。由平板对峙法测定所得实验结果可以看出(图2)，内生细菌WY035对多种植物病原真菌均有抑制程度不同的拮抗作用，对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、苹果轮纹病菌、茄子黄萎病菌和小麦赤霉病菌的抑制率分别为25.64％、28.66％、36.56％、35.92％和35.50％，说明该牛蒡内生细菌WY035对植物病原真菌具有广谱抑菌活性。

实施例3含有菌株WY035的牛蒡专用微生物菌剂的制备方法

(1)菌株活化：将分离的牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035菌株斜面或冻存管保藏物接种到含有LB固体培养基(10g蛋白胨，5g麦芽浸膏，10gNaCl，15g琼脂，1000ml水，pH 7.0)的斜面上，30℃培养1-3天，从而活化菌株；

(2)种子液培养：从活化后的LB固体培养基斜面上接种环挑取少许菌体接入到LB液体培养基中，于30℃，160-180rpm转速在摇床上震荡培养24-72小时，获得内生细菌WY035的种子液；

(3)菌剂制备：将培养到对数期的种子培养液以5％的接种量接入到LB液体发酵培养基(10g蛋白胨，5g麦芽浸膏，10gNaCl，pH 7.0，1000ml水)中，充分搅拌混匀后在30℃培养2-3天，10000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，获得菌体浓度OD₆₀₀为0.5-1.0(活菌数大于1.0×10⁸cfu/mL)的菌剂，用于接种牛蒡种子与幼苗实验。

实施例4菌株WY035菌剂的应用试验

4.1在牛蒡种子萌发与育苗上的应用

对牛蒡种子进行表面消毒，首先用有效氯含量为5％的NaClO浸泡2-3min后，用无菌水漂洗5次；然后用75％的酒精浸泡3min，用无菌水漂洗数次去除种子表面残留的的NaClO与酒精后备用。制备上述浓度的内生细菌WY035菌悬液，然后将种子浸在该菌悬液中处理20小时，同时以清水浸种20小时的种子为对照。浸种后的种子移种至含有基质的盆穴中(营养土与蛭石以体积比4:1，灭菌后分装，每盆约200g土壤)，每个盆穴一粒种子，放置于温室中生长(温度为25℃，每天光照12h，无光照12h交替)，正常补水。30天后比较萌发出的幼苗生长状况。

比较结果发现，通过内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035液体菌剂浸种处理后的牛蒡种子发芽后的幼苗长势更好(图3)，幼苗的鲜重、株高、根长分别提高了300％、72.2％、102％(图4)，说明牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌WY035制备的液体菌剂在牛蒡种子萌发与育苗上具有显著促进作用，可以达到壮苗的目的。

4.2在牛蒡幼苗土壤环境生长中的应用

将牛蒡种子种植于育苗土中，10天后选择长势一致的幼苗重新移栽至含已经灭菌(121℃，2h)营养土的高盆穴中(18cm宽×45cm高)，放于温室中生长(温度为25℃，每天光照16h，无光照8h交替)，5天后用30mL上述制备的暹罗芽孢杆菌WY035液体菌剂分别灌根牛蒡幼苗，每隔3天灌根一次，持续灌根3-4次，以浇无菌水的牛蒡幼苗作为对照，45天后观察比较牛蒡苗的长势。

盆栽测量结果统计发现，经暹罗芽孢杆菌WY035液体菌剂灌根处理的牛蒡幼苗生长更加茁壮(图5)，主根更长、更加粗壮(图6)，株高、鲜重、根长、根重、叶面积、须根数目均有显著提高(表1)。其中根长与根重分别提高了1.62、2.67倍，叶面积增加了1.75倍。可见牛蒡内生细菌暹罗芽孢杆菌WY035的菌剂对宿主幼苗的生长具有显著促进作用。

表1.接种内生细菌暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)WY035对牛蒡幼苗生长的影响

表中，字母a,b表示接菌组与对照组相比较在统计学上具有显著性差异。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一株牛蒡内生细菌WY035、含有该内生细菌的牛蒡专用微生物菌剂及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

<400> 1

gagtcgcagc tatacatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60

gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120

cggggctaat accggatggt tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 180

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cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccttat gagccagccg ccgaaggtg 1439

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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