一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法

摘要

本发明涉及一种软骨藻酸类毒素检测方法，尤其是涉及一种免疫亲和柱净化‑液相色谱‑串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，其利用高性能、强识别的DA毒素免疫亲和柱，并结合高灵敏性和精确性的液相色谱‑串联质谱检测不同海洋生物中DA毒素的分析测定，能有效解决前处理中样品净化不理想的问题，并减少样品基质干扰，缩短分析时间，提高方法回收率，填补免疫亲和技术在软骨藻酸类毒素检测领域的空白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种软骨藻酸类毒素检测方法，尤其是涉及一种免疫亲和柱净化 -液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法。

背景技术

记忆缺失性贝毒(ASP)是有毒赤潮硅藻分泌产生的毒素，其主要活性成分软骨藻酸(domoic acid，DA)是一种神经性氨基酸类毒素。该毒素最早是在1987 年加拿大爱德华王子岛东海岸因食用紫贻贝而造成的中毒死亡事件中被发现的。中毒者主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，并伴有严重的头痛、记忆丧失、意识混乱、昏迷等症状。研究发现，DA主要由多列拟菱形藻产生。贝组织中软骨藻酸含量达到40mg/kg时可引起食用者中毒，150mg/kg时有致死危险，人类通过进食可耐受的最大限量为20mg/kg，加拿大首先制定了安全限量标准为20μg/g贝肉，欧洲、日本也相继将该种毒素列为贝类常规检测项目。中国对DA的研究还属于起步阶段，尚缺乏有效的检测手段和监控网络。虽然目前在我国检出DA的报道还很罕见，但在中国沿海已经检测到多种产毒的拟菱形藻藻株。考虑到该毒素毒性大、反应快、无解毒剂，开展海洋生物中DA毒素的检测研究对确保水产品安全及人体健康极为重要。

免疫亲和柱(IAC)是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用特异性抗体对目标毒素的亲和识别和可逆结合特性制作而成，具有高度的选择专一性和良好的吸附净化性能。目前国内尚未有以免疫亲和柱作为前处理净化手段检测DA 毒素的相关报道。

发明内容

本发明的发明目的是为了提供一种灵敏度高，精密度和回收率均能满足检测分析的要求的免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，本方法利用高性能、强识别的DA毒素免疫亲和柱，并结合高灵敏性和精确性的液相色谱-串联质谱检测不同海洋生物中DA毒素的分析测定，能有效解决前处理中样品净化不理想的问题，并减少样品基质干扰，缩短分析时间，提高方法回收率，填补免疫亲和技术在毒素检测领域的空白。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min， 7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中，得一次提取液；再往剩余残渣中加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，重复提取一次，得二次提取液；合并一次提取液和二次提取液后定容至20mL，得提取液；移取1mL提取液至另一50mL离心管中，加入5mL PBS缓冲液进行稀释，得待净化的样品液；

(2)免疫亲和柱净化：取一DA单克隆抗体免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液；上样结束后，用6mL体积浓度50％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有质量浓度2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后供液相色谱-质谱进行分析。

作为优选，步骤(1)中，所述PBS缓冲液通过以下方法制得：分别称取二水合磷酸二氢钠2.18g，十二水合磷酸氢二钠12.90g，氯化钠8.50g，用水溶解并定容至1000mL。

作为优选，步骤(2)中，所述DA单克隆抗体免疫亲和柱通过以下方法制得：

(a)合成免疫原

在小烧瓶中依次加入10mg的牛血清白蛋白，2mL 0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌 48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得免疫原DA-BSA。

(b)合成检测原

在小烧瓶中依次加入10mg的鸡卵清白蛋白，2mL 0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得检测原DA-OVA。

(c)单克隆抗体制备及纯化

取5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射DA-BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用免疫原DA-BSA 与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用免疫原DA-BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变；

第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被检测原DA-OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔加强免疫一次，取效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得杂交瘤细胞；

BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，8天后向小鼠腹腔内注射1×10⁷个杂交瘤细胞，10天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，离心，收集上清液，采用饱和硫酸铵法纯化上清液，再用ProteinG>

(d)亲和柱制备

称取0.5g CNBr活化的溴化氢活化琼脂糖凝胶4B干粉用100mL 1M的HCl 溶液溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液洗涤得凝胶；

取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的DA单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，抽滤，加入10mL封闭缓冲液，室温振荡反应2h，抽滤，再用100mL 0.01M、pH7.3的PBS缓冲液洗涤凝胶，并转移到5mL柱管中，加入含有质量浓度分别为0.05％硫柳汞、0.05％牛血清白蛋白的0.01M、pH7.3的PBS溶液，于2～8℃储存。

作为优选，步骤(d)中，所述偶联缓冲液的配方为：0.1mol·L^-1NaHCO₃，>-1NaCl，pH8.3。

作为优选，所述封闭缓冲液的配方为：0.1mol·L^-1Tris-HCl，pH8.0。

作为优选，所述液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱>

作为优选，所述质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描(Electrosprayionization，ESI-)；检测方式：多反应监测模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：600℃；锥孔气流量： 150L/h；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔电压：12V；碰撞能量：16eV；分析物定性离子对：m/z 312.2>248.2；分析物定量离子对：m/z 312.2>266.2。

因此，本发明具有如下有益效果：提供了一种灵敏度高，精密度和回收率均能满足检测分析的要求的免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，本方法利用高性能、强识别的DA毒素免疫亲和柱，并结合高灵敏性和精确性的液相色谱-串联质谱检测不同海洋生物中DA毒素的分析测定，能有效解决前处理中样品净化不理想的问题，并减少样品基质干扰，缩短分析时间，提高方法回收率，填补免疫亲和技术在软骨藻酸类毒素检测领域的空白。

附图说明

图1是软骨藻酸(DA)标准溶液二级质谱全扫描图。

图2是0.025μg mL^-1的软骨藻酸(DA)标准品溶液MRM图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

(一)仪器和试剂

ACQUITY超高效液相色谱-串联质谱仪Xevo TQ-S(美国Waters公司)； MS2漩涡混合器(德国IKA公司)；氮气吹干仪(美国Organomatio公司)； Centrifuge5810高速离心机(德国Eppendorf公司)；12通道固相萃取装置(美国 supelco公司)。

软骨藻酸(DA)标准品(纯度≥98.0％，加拿大国家研究委员会)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸铵、甲酸(美国Sigma公司)；十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氨水(上海国药集团)；实验用水均为超纯水。

(二)PBS缓冲液配制

分别称取二水合磷酸二氢钠2.18g，十二水合磷酸氢二钠12.90g，氯化钠 8.50g，用水溶解并定容至1000mL。

(三)25μg/mL软骨藻酸(DA)标准溶液

准确移取适量的软骨藻酸标准品溶液，用甲醇稀释定容至50mL，-20℃避光保存，保存期限为3个月。

(四)方法参数优化

1.色谱和质谱条件选择

ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱对软骨藻酸(DA)保留性强，且较好的色谱峰形，完全满足软骨藻酸(DA)液相色谱分析的需要。本发明研究比较了多组不同体积分数甲酸及不同浓度乙酸铵溶液对色谱分析的影响。结果表明，以0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液与乙腈为流动相具有良好的色谱分离效果，且峰形尖锐对称。

本发明选择在正离子扫描模式下用蠕动泵以3.0μg/mL的软骨藻酸(DA) 标准溶液进行流动注射分析，对质谱参数进行优化。通过一级质谱扫描分析得到 DA的分子离子，调试选择最佳锥孔电压和毛细管电压，其中[M+H]⁺(m/z>

2.提取试剂的选择

DA是一种非蛋白氨基酸，溶于水，微溶于甲醇。考虑到甲醇作为常用的提取试剂，能迅速穿透组织，沉淀蛋白质，实验选择甲醇水溶液(体积浓度50％～ 90％)作为提取试剂，比较各提取试剂对阴性加标样品的提取效率。结果如表1 所示，当提取一次时，比较90％甲醇水溶液，采用50％和75％甲醇水溶液进行提取的样品DA回收率分别提高了11.2％和17.2％；对样品进行二次提取后， DA回收率可进一步提高9.5％～16.3％，考虑到50％甲醇水溶液提取物上样耗时较长，最终选择75％甲醇水溶液作为DA提取试剂。

表1甲醇含量和提取次数对DA回收率的影响

3.免疫亲和柱条件优化

免疫亲和柱的亲和结合作用与上样液的有机试剂含量直接相关，过量的有机试剂会使亲和作用减弱或破坏。比较不同比例(1:9、1:3和1:1)的甲醇-PBS混合溶液发现，当甲醇含量在10％～25％之间，DA回收率接近100％；而当甲醇含量上升到50％后，DA回收率显著下降；最后选择将提取液中的甲醇比例稀释至25％后上样。

贝类组织成分复杂各异，常因基质干扰影响质谱定量，实验选用甲醇水溶液 (体积10％～70％)为淋洗液，比较其对贝类提取液中DA的净化效果。结果发现，当甲醇比例达到60％～70％时，DA回收率下降18％～80％；相比10％和30％甲醇水溶液，50％甲醇水溶液净化效果最佳，扇贝、牡蛎、贻贝和泥蚶样品中的 DA回收率分别为91.8±7.4％,90.5±2.3％,88.2±5.2％,94.0±2.1％。最终选择采用6 mL 50％甲醇水溶液作为淋洗液。

考虑到DA在酸性条件下容易分解，实验比较了含有质量浓度1％甲酸的甲醇溶液、含有质量浓度1％氨水的甲醇溶液、含有质量浓度2％氨水的甲醇溶液对DA的洗脱效果。结果发现(表2)，含有质量浓度2％氨水的甲醇溶液洗脱下， DA回收率可达97.1％，且最适宜洗脱体积为3mL。

表2不同洗脱条件下DA的回收率

4.线性范围和定量限

用DA标准使用液配制浓度为0.005、0.025、0.125、0.5、1.0、2.0和5.0μg/mL 标准工作溶液，以DA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，其线性回归方程：y＝7611X+1952.57(R²＝0.999)，DA在0.005～5.0μg/mL内线性良好。以3倍信噪比确定本方法的检出限(LOD)为0.02μg/g，以10倍信噪比确定本方法的定量限(LOQ)为0.05μg/g，如图2所示。

5.回收率和精密度

准确称取2.00g阴性贝类样品，添加水平为0.25、2.5和25μg/g的DA标准溶液，每个添加水平平行测定5次，计算回收率和精密度，结果见表3。DA在 0.25-25μg/g添加水平的回收率为92.71-103.62％，其日内和日间RSD分别为 5.92-7.16％和4.81-5.91％。

表3 DA的平均回收率和相对标准偏差(n＝5)

添加水平日内RSD日间RSD回收率±SD(ng/g)(％，n＝5)(％，n＝3)(％,n＝5)107.165.9192.71±6.39505.923.2994.01±4.725006.574.81103.62±5.57

实施例

(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min， 7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中，得一次提取液；再往剩余残渣中加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，重复提取一次，得二次提取液；合并一次提取液和二次提取液后定容至20mL，得提取液；移取1mL提取液至另一50mL离心管中，加入5mL PBS缓冲液进行稀释，得待净化的样品液；

(2)免疫亲和柱净化：取一DA单克隆抗体免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液；上样结束后，用6mL体积浓度50％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有质量浓度2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后供液相色谱-质谱进行分析；液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，>

质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描(Electrospray ionization，ESI-)；检测方式：多反应监测模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；毛细管电压： 3.0kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：600℃；锥孔气流量：150L/h；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔电压：12V；碰撞能量：16eV；分析物定性离子对： m/z 312.2>248.2；分析物定量离子对：m/z312.2>266.2；

其中，DA单克隆抗体免疫亲和柱通过以下方法制得：

(a)合成免疫原

在小烧瓶中依次加入10mg的牛血清白蛋白，2mL 0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得免疫原DA-BSA；

(b)合成检测原

在小烧瓶中依次加入10mg的鸡卵清白蛋白，2mL 0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌 48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得检测原DA-OVA；

(c)单克隆抗体制备及纯化

取5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射DA-BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用免疫原DA-BSA 与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用免疫原DA-BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变；

第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被检测原DA-OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔加强免疫一次，取效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得杂交瘤细胞；

BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，8天后向小鼠腹腔内注射1×10⁷个杂交瘤细胞，10天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，离心，收集上清液，采用饱和硫酸铵法纯化上清液，再用ProteinG>

(d)亲和柱制备

称取0.5g CNBr活化的溴化氢活化琼脂糖凝胶4B干粉用100mL 1M的HCl 溶液溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液洗涤得凝胶，偶联缓冲液的配方为： 0.1mol·L^-1NaHCO₃，0.5mol·L^-1NaCl，pH8.3；

取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的DA单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，偶联缓冲液的配方为：0.1 mol·L^-1NaHCO₃，0.5mol·L^-1NaCl，pH8.3，抽滤，加入10mL封闭缓冲液，封闭缓冲液的配方为：0.1mol·L^-1Tris-HCl，pH8.0，室温振荡反应2h，抽滤，再用>

采用本方法对沿海城市贻贝、毛蚶、泥蚶、扇贝、牡蛎5个品种共计59份贝类进行分析检测。得到的结果如表3所示。DA检出率10％，包括5批次扇贝和1批次牡蛎，其中扇贝检出率最高，且DA污染水平在0.9-11.8μg/g不等；牡蛎检出率7％，DA含量为0.07μg/g。

表3阳性样品中DA的污染水平

品种DA浓度(μg/g)扇贝11.8扇贝14.9扇贝0.7扇贝9.3扇贝0.9牡蛎0.07

从表3的分析结果表明，本方法回收率高，精密度和灵敏度均能满足软骨藻酸类毒素的检测需要。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。