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华东六省一市生物化学与分子生物学会2015年学术交流会

华东六省一市生物化学与分子生物学会2015年学术交流会

  • 召开年：2015
  • 召开地：福建宁德
  • 出版时间： 2015-12-05

主办单位：中国生物化学与分子生物学会

会议文集：华东六省一市生物化学与分子生物学会2015年学术交流会论文集

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  • 摘要：为了进一步揭示日本鳗鲡(Anguilla japonica)消化道蛋白酶的消化生理,为日本鳗鲡饲料的科学研制提供理论依据.通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-100和SephadexG-75两凝胶柱层析分离纯化鳗鲡肠道蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE检定蛋白酶为单一纯,测定蛋白酶亚基分子量为65.3kDa,利用凝胶层析法测定酶的分子量为260.3kDa,等电聚焦电泳法测定酶的等电点pI为8.23.以酪蛋白为底物，研究蛋白酶催化反应的动力学参数。结果表明:蛋白酶的最适pH、最适温度、米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为8.2、55℃、4.832mg/mL和0.269U/min;酶在pH6.6-9.0酸碱区域内稳定，在20℃-55℃之间具有较好的热稳定性，但酶在60℃以上稳定性迅速下降。100mmol/L的Mg2+,Ca2+,Co2+,Ba2+,Mn2+,Cu2+和Zn2+可分别使日本鳗鲡肠道蛋白酶活力丧失3.64%28.80%、43.30%、45.80%、57.04%、92.42%和96.20%;Fe2+对酶活力有较强的激活作用，5mmol/L Fe2+可使酶活力提高134.53%，Hg2+对蛋白酶有强烈的抑制作用，1mmol/LHg2+可使酶活力丧失87.63%。进一步以甲醇、乙醇和乙二醇3种有机溶剂和服、盐酸肌和十二烷基磺酸钠((SDS)3种变性剂为效应物，研究其对蛋白酶催化活力的影响。结果显示:甲醇、乙醇和乙二醇对鳗鲡肠道蛋白酶均具有失活作用，甲醇对蛋白酶的失活作用是一个可逆的反应过程，该失活作用是属于非竞争性类型。变性剂脉、盐酸肌和SDS对鳗鲡肠道蛋白酶也均有失活作用，SDS对蛋白酶的失活作用也是一个可逆的反应过程，其失活效应为竞争性机制。应用荧光发射光谱研究鳗鲡肠道蛋白酶经甲醇和SDS微扰后的分子构象变化情况，鳗鲡肠道蛋白酶经甲醇作用后荧光强度呈现减小现象，而经SDS作用后荧光强度呈增大现象，但荧光发射光谱的波长均没有发生变化，说明甲醇和SDS都是通过影响日本鳗鲡肠道蛋白酶的空间构象而使酶催化活力下降的。
  • 摘要：短裸甲藻毒素为小分子海洋毒素,主要引起神经症状,因此又称为神经性贝类毒素.BTX具有胚胎毒性、发育毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌作用等毒性效应,一般的高温加热的方法较难破坏其毒性.短裸甲藻引起的短裸甲藻赤潮危害严重,短裸甲藻产生的毒素可导致鱼类以及其他生物中毒甚至死亡,并通过食物链逐级传递和积累,最终传递给人类。并且短裸甲藻分布极为广泛，主要分布在墨西哥湾，尤其是佛罗里达西南沿海地区，以及美国的大西洋东南沿岸，在我国东南沿海地区广泛分布。短裸甲藻毒素对水产养殖业的影响较大，经常造成非常严重的经济损失，对食品安全和人民的生命健康构成了一定的威胁，引起了广泛的关注。ELISA方法相对于其它方法具有灵敏度高、特异性强、快速便捷易于操作、适合现场大规模检测等特点，因此被广泛应用于小分子贝毒素的检测。由于短裸甲藻毒素为小分子物质不具有免疫原性，本研究以短裸甲藻毒素与载体蛋白HSA和OVA分别交联并分别作为免疫原和检测原。将多次免疫的抗血清效价较高的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。通过多次亚克隆筛选得到阳性杂交瘤细胞株。该研究为建立基于免疫学检测BTX方法和开发生产高质量的胶体金试剂盒奠定坚实的基础。
  • 摘要：淀粉酶是指能水解淀粉和糖原一类酶的总称,可应用于面包烘焙、酿造、果汁、糖浆等多种食品的生产,也可应用于纸张上胶、纺织品退浆、洗涤剂以及药片压制等行业.本课题从不同来源的环境中筛选产淀粉酶微生物并进行基因克隆、表达和酶学性质研究.具体研究结果如下:rn 从腾冲温泉、大布苏盐湖、红树林等11个样品中共筛选到38株产淀粉酶菌株.结合菌株的形态特征和16S rDNA序列分析对38株菌株进行鉴定,结果显示所筛选的产淀粉酶微生物主要有芽孢杆菌属、弧菌属、节杆菌属和发光杆菌属等.其中菌株WQJ-1和WQJ-60所产淀粉酶的最适反应pH和温度分别为6.0,75℃和3.5,80℃,分别鉴定为地芽孢杆菌属(Geobacillus)和脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus).rn 对菌株WQJ-60进行产酶培养基及发酵条件的优化。优化后的产酶培养基配方为:麦芽糖1.0%，花生饼粉1.5% ，NaCl 0.5%, KzHPO4 50 mM，吐温-80 0.06%，初始pH3.0;优化后的发酵条件为:培养温度60℃,摇床转速200 r/min，装液量50 mL/250 mL，接种量为4%,发酵周期42 h;优化后酶活力达到4.8 U/mL比优化前(0.4 U/mL)提高了12倍。该淀粉酶的最适反应pH和温度分别为3.5和80℃，在pH3.0～5.0范围内稳定且有较好的耐酸性;Hg2+、SDS, Pb2+和Fe2+对该酶具有抑制作用，Mn2+、cu2+和β-巯基乙醇对该酶有促进作用;其最适作用底物是可溶性淀粉。rn 以38株菌株的基因组DNA为模板，利用简并引物克隆得到14条与NCBI数据库中已知淀粉酶最高一致性为70%～100%的淀粉酶基因片段。基于获得的片段序列，从菌株WQJ-1中克隆得到α-淀粉酶全长基因amyWQJ。该基因全长1614bp，编码537个氨基酸和一个终止密码子，其蛋白质N端22个氨基酸为预测的信号肽。该淀粉酶基因成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。镍柱纯化后重组酶rAmyWQJ的最适反应pH和温度分别为6.0和70℃，在pH5.0～10.0范围内稳定且具有较宽的pH耐受范围;添加10mM,15mMCa2+能显著提高酶的热稳定性;Hg2+、EDTA和SDS对该酶有显著的抑制作用，Co2+、Na+和β-Mercaptoethanol对酶有促进作用;其最适作用底物是木薯淀粉，其次是可溶性淀粉、玉米淀粉和马铃薯淀粉;以可溶性淀粉为底物，该酶的Vmax为2197.80μmol/(min·mg)，Km为6.62mg/mL;通过薄层层析分析，该酶水解淀粉的产物主要为寡聚糖，推测为糊精。
  • 摘要：本文对福建古田红曲米中分离得到的产红曲色素和糖化酶的菌株进行诱变选育,分别获得了高产红曲色素和高产糖化酶的突变菌株,研究其固液态发酵工艺条件,初步探讨了红曲色素稳定性和糖化酶酶学性质,主要研究结果如下:rn 1、采用单孢子分离法从红曲米中分离筛选得到产红曲色素和糖化酶的红曲霉菌株C26和A1,结合形态学观察与ITS序列分析,鉴定菌株C26和A1为紫色红曲霉(Monascus purpureus).通过孢子悬浮液的紫外---氯化锂复合诱变,选育得到一株稳定高产红曲色素的突变菌株183-3,一株稳定高产糖化酶的突变菌株G6.rn 2、红曲色素稳定性研究结果表明:色素溶液对光敏感，在避光、室内自然光以及太阳光下放置10d，色素保存率分别为76.20%, 63.42%和3.98%;高浓度色素溶液稳定性不如低浓度色素溶液，在80℃下保温5h，色素残存率为27.80%;红曲色素在pH 2-10之间稳定性良好。糖化酶酶学性质研究表明:最适反应温度为55℃，最适pH为4.5，在40℃以下和酸性pH范围内(特别是4-5 )较为稳定。rn 3、突变菌株183-3产红曲色素固液态发酵条件研究表明，液态发酵条件为:可溶性淀粉12%,蛋白胨1%， MgSO4 0.05%，MnSO4 0.015%，ZnSO4 0.01%，培养基初始pH值5.0，接种龄48h，接种量8%（V/V），装液量50mL/250mL，转速180r/min,温度32℃，在该条件下发酵至第12d红色价达到350.8U/mL:固态浅盒(25cmX 17.5cmX8cm)内的发酵工艺为:装米量400g，添加1%蛋白胨、0.01 % ZnSO4，接种量10% ( v/w )，初始基质含水率40%于温度32℃,湿度80%的恒温恒湿箱内培养13d，所制备红曲米的红色价达到7210U/g，色调为0.85。rn 4、突变菌株G6产糖化酶固液态发酵条件研究表明，液态发酵条件为:大米粉8%,蛋白胨1%, ZnSO4 0.01 %, FeSO4 0.005%, MnSO4 0.015%, KCl 0.1 %,培养基初始pH值4.0,接种龄48h，接种量12% ( v/v )，装液量50mL/250mL，转速150r/min,温度32℃，该条件下培养至第10d糖化酶活力达到1652.36U/mL;固态发酵工艺为:装米量400g，添加2%蛋白胨，接种量12%（v/w），初始基质含水率40%，于温度32℃、湿度80%的恒温恒湿箱内培养12d，所制备红曲米的糖化酶活力达到5399U/g。
  • 摘要：脂肪酶是一类酯键水解酶.微生物脂肪酶在应用酶类有巨大的价值,广泛用于食品、医药、洗涤剂、皮革和造纸等工业领域.本研究从Serratia marcescens BOB中克隆得到两条脂肪酶基因,并对其进行异源表达分析.rn 从北极冻土样品中筛选获得高效降解橄榄油的菌株BOB,由形态学和16S rRNA方法,初步鉴定为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens,将菌株BOB命名为Serratia marcescens BOB.野生菌发酵液通过超滤和硫酸铵沉淀方法进行浓缩，酶学性质研究表明:野生菌BOB脂肪酶在最适作用温度30℃和最适作用pH7.0时，降解对硝基苯棕搁酸酯C16的酶活力为25.93U/mL;rn Serratia marcescens BOB存在两条脂肪酶相关编码基因，通过PCR方法克隆得到其中一条酯酶/脂肪酶基因lip6，全长801bp,编码266个氨基酸和1个终止密码子。构建重组菌E.Coli BL21-pET 28a(+)-lip6并优化重组菌的诱导条件:在菌体OD600约为0.5时，添加终浓度0.5mmol/L的IPTG,30℃诱导20h后，菌体经过超声波破碎获得大量可溶性蛋白LIPA，催化底物p-NPP的酶活力为520U/L。经过亲和层析柱纯化，SDS-PAGE检测在30kD处得到单一条带，比酶活为22.29U/mg;PCR克隆得到另一条脂肪酶基因1ip18，全长1842bP，编码614个氨基酸。构建重组菌E.Coli BL21-pET-28a(+)-1ip18，重组酶LIPC的酶活力为5.29 U/mL。通过诱导条件优化，LIPC酶活提高1.7倍。经过亲和层析方法纯化后，SDS-PAGE在65 kD处检测到单一条带。酶学性质研究表明:重组酶LIPC是低温中性脂肪酶，最适作用pH和温度分别为7.0和30℃,热稳定性差，具有低温高催化活性(Km值为0.634 mmol/L,Vm值为1.131 mmol/L/min);对有机溶剂(甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇等)有较好的耐受性，尤其对50%(v:v)丙三醇溶液的耐受性高达到130%;同时，重组酶高效水解中、长链脂肪酸((C10-C16);rn 构建pPIC9k-lip18重组表达载体，导入毕赤酵母P.pastoris GS115中，重组酶LIPE降解p-NPP的活力为19.75U/mL，经过诱导条件优化和硫酸铵沉淀，重组酶酶活提高3.89倍。酶学性质研究表明:重组酶LIPE的最适作用pH和温度分别为7.5和35℃，在pH6.0-9.0和温度低于40℃时，LIPE蛋白稳定性较好;LIPE蛋白的有机溶剂耐受性以及底物特异性和LIPC蛋白较为相似。
  • 摘要：热机械浆(TMP)树脂成分是一种包含脂肪酸、树脂酸、固醇酯、甘油三酸酯在内的复杂混合物,这些物质会形成树脂障碍,对制浆造纸过程造成严重危害.以马尾松TMP为原料,分别利用白腐菌漆酶-HBT(1-羟基苯并三唑)介体和Escherichia coli BL21(DE3)菌株 过水解酶对纸浆进行处理,然后用索式提取法提取纸浆中的树脂,利用GC-MS分析酶液处理前后纸浆中树脂含量的变化,并测定酶液处理前后的纸浆卡伯值及白度.研究表明:漆酶-HBT和过水解酶均能使不同种类的树脂发生不同程度的降解,且漆酶-HBT能使纸浆卡伯值降低11.11％,白度提高7.1％,过水解酶能使纸浆卡伯值降低10.46％,白度提高9.7％.
  • 摘要：本课题利用16S rRNA V3高变区测序和传统微生物分离纯培养方法分析日本鳗鲡小肠共生微生物的多样性.两种方法均表明在日本鳗鲡小肠黏膜和内含物中,细菌占整个小肠共生微生物的98％以上.主要的优势菌群为变形菌门Proteobacteria和厚壁杆菌门Firmicutes,这两个门的细菌占日本鳗鲡小肠细菌总量的70％以上,此外,还有酸杆菌门Acidobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、梭杆菌门Fusobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、浮霉菌门Planctomycetes、蓝藻门Cyanobacteria、硝化螺旋菌门Nitrospirae.变形菌门由气单胞菌属Aeromonas、希瓦氏菌属Shewanella、克雷伯氏菌属Klebsiella、肠杆菌属Enterobacter、柠檬酸杆菌属Citrobacter、埃希氏杆菌属Escherichia不动杆菌属Acinetobacter组成.厚壁菌门Firmicutes,包括乳球菌属Lactococcus、肠球菌属Enterococcus.比较两种方法,传统分离纯培养方法所分离到的单克隆菌属类似高通量测序结果,它对日本鳗鲡小肠共生微生物的分离鉴定进一步支持了高通量测序分析的结果,暗示结合两种方法将能够更全面、深入的分析日本鳗鲡肠道微生物多样性.rn 其次，日本鳗鲡在养殖过程中由于密度大、产量高，容易导致其受到病害的威胁。为了解决这个问题以及不使用副作用大的抗生素，我们结合微生物传统分离培养结果以及益生菌乳酸菌的生理功能和抗氧化活性，将分离到的乳酸菌同基础饲料混合饲喂日本鳗鲡，利用血液生化分析仪进行血液生化指标的测定。结果表明，日本鳗鲡能够通过提高总蛋白(totalprotein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globulin,GLO),葡萄糖(glucose,GLU)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等指标来增强机体的免疫力，揭示肠道潜在益生菌对日本鳗鲡抗病力的影响。同时，所获得的菌种能开发成高效微生态制剂、有利于我省特色品种一鳗鲡的绿色高效养殖。
  • 摘要：漆酶是一种木质素降解酶,因具有广泛的底物特异性,在各种工业应用上具有巨大潜力.以实验室前期获得的高产漆酶的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)HYB07菌株为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR,qPCR)对其中8条漆酶基因(Lac1-Lac8)的表达调控进行研究.主要研究结果如下:rn 1、HYB07菌株在PDY和YSJ培养基中发酵4-5天,漆酶产量达到最高,分别为194.8U/mL和280.0U/mL.Lac7和Lac2分别是PDY培养基中发酵前期和后期主要表达的基因.在YSJ培养基中,Lac7是主要表达的基因.rn 2、Cu2+和Zn2+通过调控漆酶基因表达提高漆酶产量。主要表达基因Lac7受Cu2+和Zn2+诱导，以Cu2+效果尤为显著。rn 3、烟酸和香草酸会降低HYB07菌株的漆酶产量，ABTS和愈创木酚会提高漆酶产量。PDY培养基中，Lac1转录受烟酸抑制最显著，而Lac2受香草酸抑制最显著.YSJ培养基中，Lac1和Lac6表达受ABTS上调，Lac4转录受愈创木酚诱导。rn 4、HYB07菌株在高氮高碳培养基中漆酶产量最高，在低氮低碳培养基中产量最低。Lac1和Lac7被低碳和低氮条件抑制;Lac2和Lac5受低碳条件诱导;Lac3和Lac4受低氮条件诱导;Lac6同时受低碳和低氮条件诱导。rn 5、在YSJ产酶培养基中，糊精是最适合HYB07菌株产漆酶的碳源。葡萄糖和蔗糖会微弱抑制漆酶基因表达。以甘油取代糊精会诱导Lac2和Lac5表达，抑制Lac1和Lac7表达，从而使产酶量下降。rn 6、以麦芽提取物取代酒石酸铵会微弱诱导Lac3表达;以酵母提取物取代酒石酸铵会诱导Lac8表达;以NH4NO3取代蛋白肽在促进Lac3和Lac4转录的同时抑制Lac7表达，从而降低漆酶产量。
  • 摘要：选取分离自健康茶叶的菌株CSN-4和和分离自普洱茶、茯砖茶和六堡茶的金花菌菌株LB-1、LB-6、LB-8.对CSN-4、LB-1、LB-6、LB-8等4株菌发酵液中复合酶作检验分析,验证4个菌株的代谢产物酶类活性,并利用UPLC检测具有相对较高谷氨酸脱羧酶活力的菌株.试验以麸皮为基础的产酶发酵培养基,对氧化酶和水解酶进行平板检测;在以麸皮、麸皮加谷氨酸钠、YPD、YPD+茶水等不同发酵培养基中,经过4d发酵后,检测各菌株产酶情况,并重点筛选谷氨酸脱羧酶活力较高的菌株,通过UPLC分析检测产r-氨基丁酸水平.结果表明:在以麸皮为主要成分的产酶发酵培养基上，菌株CSN-4的发酵液中检测到单宁酶、多酚氧化酶、漆酶、纤维素酶、脂肪酶等5种酶活性;菌株LB-1,LB-6,LB-8分别检测到纤维素酶和脂肪酶活性，说明菌株CSN-4菌株在麸皮发酵培养基中能产种类较多的复合酶。UPLC检测结果显示，在发酵产酶培养基中添加谷氨酸钠，谷氨酸脱羧酶酶活性最高，最优麸皮发酵培养基配方为:蛋白肽2.25g/L、麸皮30.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁·7H2O 0.2g/L、硫酸锰·H2O 0.5g/L、茶叶6g/L。其中，菌株LB-8产酶活性最高，检测的GABA含量为0.63mg/mL，产酶平板检测和UPLC分析的结果，为后续试验提供了更好的优势菌株LB-8，为进一步为生产r-氨基丁酸茶奠定了基础。
  • 摘要：几丁质(chitin)又名甲壳素,是乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)单糖脱水缩合通过β-1,4糖苷键聚合而成的大分子多糖.几丁质酶可将大分子的几丁质催化水解成小分子的几丁寡糖或乙酰-D-氨基葡萄糖.通过酶法降解贝壳类废弃物生产几丁寡糖能够实现废弃物的高价值利用,增加经济效益.本文从15个环境样品中筛选得到40株产几丁质酶微生物，获得了25条几丁质酶基因片段，克隆其中两条基因全长，并对这两条基因进行表达和性质研究，研究结果如下:rn 1、从一些特殊环境(如广西北海红树林、大布苏盐碱湖等)采集样品，从中筛选得到40株能够分解几丁质产生透明圈的菌株。经分子生物学鉴定，筛选到的产酶微生物主要有弧菌属(Vibrio Sp.)，产微球茎菌属(Microbulbifer sp.)，气单胞菌属((Aeromonas sp.)等。对几丁质酶粗酶性质研究表明，其最适反应温度普遍在40℃-60℃之间，最适pH在5.0-6.0之间。rn 2、选择酶活力较高或酶学性质特异的菌株，设计简并引物，扩增几丁质酶基因片段，通过测序分析，共得到25条基因片段。序列分析表明这些基因片段与已知序列的一致性在67%-100%。其中，chiG31-2基因的一致性只有67%，属于比较新颖的基因。rn 3、利用TAIL-PCR方法从菌株Vibrio sp. GR52中克隆得到两个几丁质酶全长基因chiGR52-1和chiGR52-2。序列分析表明这两个基因全长分别为2553 bp与2385 bp，各编码850与794个氨基酸。Blastp分析表明这两个几丁质酶蛋白均与Vibrio fluvialis来源的几丁质酶一致性最高，分别为80%和78%属于比较新颖的酶蛋白。rn 4、几丁质酶基因chiGR52-1和chiGR52-2分别在大肠杆菌中实现了异源表达，并利用镍柱对重组蛋白进行纯化。重组蛋白rChiGR52-1最适反应pH和温度分别为6.0和50℃，在45℃以下及pH5.0-10.0稳定性良好：以胶体几丁质为底物时Vmax为4.829 μmol/(mg·min), Km为1.302 mg/mL。 rChiGR52-2最适反应pH和温度分别为6.0和50℃，以胶体几丁质为底物时Vmax为0.9606μmol/(mg·min), Km为2.777 mg/mL。rn 本课题通过从不同环境中筛选产几丁质酶微生物，并进行基因克隆表达以及酶学性质的研究，旨在为寻找新的几丁质酶基因和几丁质酶的开发应用奠定基础。
  • 摘要：琼胶是存在于红藻细胞壁多糖间的粘性多糖,是目前世界上应用最广泛的三大海藻胶之一.琼胶酶(Agarase)是可催化水解琼胶的一类多糖降解酶的总称,在海水养殖业、食品、医药、分子生物学研究等方面中具有非常重要的应用价值.本课题从不同环境中筛选得到40株产琼胶酶微生物,从中获得16条琼胶酶基因片段,且克隆得到一条全长基因并在大肠杆菌中实现异源表达,随后对其酶学性质进行研究.具体实验结果如下：rn 从南日岛鲍鱼养殖场、广西红树林及舟山群岛等地采集的样品中筛选得到40株产琼胶酶微生物;通过形态观察和分子生物学鉴定，这些产酶菌株主要分布在Pseudoalteromonas sp.,Vibiro sp.以及Streptomyces sp.等种属中。rn 设计6对简并引物从25株产琼胶酶菌株中扩增得到16条不同的琼胶酶基因片段。其中包括9条GH50的琼胶酶基因片段，7条GH 16的琼胶酶基因片段;从中选取1条来源于Vibirosp.ZC-1的GH50琼胶酶基因片段序列用于扩增全长基因。利用TAIL-PCR的方法扩增得到Vibrio sp. ZC-1来源的琼胶酶基因，该基因全长2853bp，编码950个氨基酸，其中1-25位氨基酸为预测的信号肽。rn 成功构建了表达载体pET-agaZC-1，并在大肠杆菌BL21中实现了重组表达。利用亲和层析法纯化重组酶rAgaZC-1，并对其酶学性质进行研究，结果表明:其最适反应pH为7.0,在pH6.0-8.0的范围内稳定;最适反应温度为40℃,45℃时该酶不稳定，处理10min以上就完全失活，而低于35℃时则比较稳定;Ca2+、Mg2+,β-ME对该酶活力具有明显的促进作用。酶的动力学研究表明，rAgaZC-1对琼脂底物的Km、 Vmax和kcat,分别为2.428mg/mL,36.90μmol/(mg·min)和62.847s-1。底物特异性研究表明该酶对琼胶底物具有很强的专一性，其降解琼胶的主要产物是新琼二糖和新琼四糖。rn 本课题通过从不同环境中筛选产琼胶酶微生物，并进行基因克隆表达以及酶学特性的研究，旨在寻找新的琼胶酶基因和为琼胶酶的开发应用奠定基础。
  • 摘要：酯酶是一种催化酯键水解和合成的酶的总称,具有α/β折叠结构,是一类丝氨酸水解酶.微生物酯酶具有来源广、种类多、反应条件温和、稳定性好、底物专一、催化活性高等特点,是工业用酯酶的主要来源.本文从不同环境中筛选产酯酶微生物并进行基因克隆、表达和酶学性质研究,具体研究结果如下:rn 采用三丁酸甘油酯琼脂平板法对来自盐碱湖、红树林、湿地公园等不同环境样品中的产酯酶微生物进行筛选.通过菌株形态观察及分子生物学鉴定,共鉴定了60株产酶菌株,主要为芽孢杆菌属、假单胞菌属与不动杆菌属.rn 对筛选得到的酶学性质较好的产酯酶菌株进行酯酶基因的克隆，共获得18个酯酶基因片段，与己知的酯酶的蛋白序列一致性在67%至100%之间。基于获得的片段序列，采用同源克隆技术与TAIL-PCR方法克隆得到2个酯酶基因全长。来源于盐湖嗜盐嗜碱菌SL3与来源于舟山群岛巨大芽胞杆菌ZB7-11的酯酶基因全长分别为636bp与774bp，各编码211与257个氨基酸。Blastp分析表明这两个酯酶与Alkalibacterium sp. AK22和Bacillus megaterium来源的酯酶蛋白一致性最高分别为69%与98%。rn 将estSL3、estZB7-11两个基因分别在大肠杆菌中进行异源表达，并对重组酯酶rEstSL3与rEstZB7-11进行纯化和酶学性质研究。rEstSL3与rEstZB7-11最适作用底物分别为对硝基苯乙酸酯(pNPC2)和对硝基苯丁酸醋(pNPC4)，比活分别为256.86U/m和104.57U/mg;最适作用pH分别为9.0与8.0，在pH 6.0-10.0均具有良好的稳定性;最适作用温度均为30℃，且rEstSL3与rEstZB7-11分别在0℃与20℃可保持68%与80%左右的酶活，在低于60℃时均具有良好的热稳定性。在最适条件下，rEstSL3与rEstZB7-11对底物pNPC2与pNPC4的Vmax分别为769.23μmol/(mg`min)与96.15μmol/(mg`min),Km分别为0.15 mmol/mL与0.10mmol/mL;同时两者对Mn2+、CO2+、Ni2+等金属离子，Tween 80、EDTA及甲醇、乙醇等溶剂均具有一定抗性。而且rEstSL3对高浓度NaCl具有良好的耐受性，为耐盐耐碱性的低温碱性酯酶。
  • 摘要：以实验室保藏的一株产L-色氨酸的大肠杆菌KC102为出发菌株,采用摇瓶方法,对其进行发酵培养基的优化.本文应用数据软件Design-Expert.8.05b,利用响应面法将培养KC102的原始培养基进行组分优化.首先,利用液体完全培养基进行菌株活化;然后,利用250ml有挡板的三角瓶进行最后的发酵培养,发酵周期为40h.完成单因素实验,应用P-B筛选出对基础发酵培养基的发酵液中L-色氨酸产量影响显著的因素,进一步通过最陡爬坡实验、B-B实验对影响显著的因素进行优化.利用单因素实验,确定了有利于L-色氨酸的最佳培养基组分包括葡萄糖,酵母浸粉,硫酸铵,柠檬酸三钠二水物,硫酸镁,磷酸二氢钾以及硫酸亚铁.最后,运用软件中的Box-Benhnken的响应面分析及中心组合设计,对KC102产L-色氨酸的的发酵培养基组分进行了多形式回归模型建立及最优化,以此建立产L-色氨酸菌株的最优培养基组成:每1L的培养基:葡萄糖20g,酵母浸粉5.0g,硫酸铵6.0g,柠檬酸三钠二水物3.0g,硫酸镁3.0g,磷酸二氢钾11.5g,硫酸亚铁66mg.利用基础培养基培养KC102,L-色氨酸的产量可达到1.45g/L,与优化前的培养结果相比,L-色氨酸的产量达到2.64g/L,优化结果提高了82.07％.利用响应面法对培养基组分进行优化可显著提高L-色氨酸产量,是一种快捷有效的优化方法.
  • 摘要："金花"菌是茯砖茶等黑茶发酵过程中发生的优势真菌,对黑茶品质形成起到关键作用.为探明"金花"菌在不同培养基上的生长特性及菌株胞外产酶情况,本研究从4种不同的黑茶如湖南茯砖茶、西双版纳普洱茶、广西六堡茶、湖南千两茶中分离到18株不同形态的"金花"菌,将菌株分别接种到PDA培养基、麦芽汁培养基、改良查氏培养基、氯硝胺18％甘油琼脂(DG18)培养基等4种平板培养基上,于28℃生化培养箱中培养7d后,观察各个菌株的生长形态并测量菌落直径,比较"金花"菌在四种培养基中的生长速度.在此基础上,采用平板初筛的方法从这18株菌分别筛选出产单宁酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶的菌株.结果表明:rn 1、18株菌在氯硝胺18%甘琼脂(DG18)固体培养基上的生长速度最快，其中菌株LB-8和菌株PE-1在DG18培养基上培养7d后长满整个平板;菌株在改良查氏培养基上的生长速度也相对较快，且在改良查氏培养基中菌株LB-5的生长速度明显优于其他菌株。菌株在PDA培养基上和麦芽汁培养基上的生长速度差异不大。但是菌株QL-2在PDA培养基上和麦芽汁培养基上生长速度比在DG18培养基上和改良查氏培养基上的生长速度快。而且生长在这4种培养基上的菌株，其菌落的形态特征存在较大的差异。rn 2、18株菌中能产单宁酶的菌株有8株，平板上有长菌落的地方出现透明菌圈，可以初步证明菌株产的单宁酶属于胞内酶;能产淀粉酶的菌株有10株，其中菌株FZ-2,LB-7,LB-8有长菌落的地方才出现透明菌圈，而菌株PE-3菌落周围出现了特别明显的透明菌圈。说明有些菌株产的淀粉酶是胞内酶有些菌株产的是胞外酶。能产脂肪酶的菌株有6株，其中菌株LB-7和XP-5整个平板都由蓝色变成浅黄色，初步说明这两株菌产能脂肪酶的能力比较强。产纤维素酶的菌有10株，能产蛋白酶的菌株有9株。rn 以上初步的研究显示18株菌在DG18培养基上生长速度最快，由此得出DG18培养基比较适合菌株生长，这对于后期进一步的实验研究有着重要的意义;金花菌能够产生多种胞外酶，在微生物利用茶叶进行固态发酵的过程中，茶叶内各种成分就是在微生物的酶促作用下发生一系列的化学变化，从而改善茯砖茶的品质。因此金花菌的存在对于茶叶的风味和品质起着重要的作用。
  • 摘要：成骨不全症(osteogenesis imperfect)又称脆骨症,是一种Ⅰ型胶原合成障碍引起的遗传性疾病,临床上出现骨质疏松和骨的脆性增加、蓝巩膜、牙质形成不全、早熟性耳硬化,满足其中两项,尤其是前两项一般可诊断为成骨不全.而许多证据都表明Wnt信号通路的失调与xv型成骨不全的发生发展密切相关。MicroRNAs(miRNA)是调控基因表达的重要因子，在此不仅总结了以往文献报道中靶向Wntl的miRNAs，还进一步用生物信息学预测了新的靶向Wntl的mi1ZNAs。本文从Wnt信号通路的组成，Wnt信号通路的分子机制，Wntl基因结构、功能以及与中枢神经系统、成骨不全的发生发展等方面关系的最新研究进展作一综述。
  • 摘要：生物医用可降解材料因其良好的生物相容性、适当的生物可降解性、材料本身和降解产物均无毒,是当下生物材料研究的热点.生物医用可降解材料的评价是其进入实用化阶段的关键环节.但目前并没有针对生物医用可降解材料的评价标准,本文针对国内外生物材料的评价标准和生物医用可降解材料、组织工程医疗产品、可降解药物载体材料的评价进行综述,旨在为生物医用可降解材料的评价提供一定的思路.
  • 摘要：葛根为豆科植物野葛的干燥块根,在我国分布较广泛,因其具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤等特殊功效而备受关注.胰蛋白酶抑制剂为一类对蛋白酶有抑制作用的多肽或蛋白质,其能与相应的蛋白水解酶形成动态平衡,调节生物体内许多重要的生命活动.本文从天然植物葛根中分离获得一种具有生物活性的胰蛋白酶抑制剂,其安全性毋庸置疑,通过观察抑制剂的生物学活性判断是否具有抗肿瘤效果,为进一步实验提供基础.rn 实验利用阴离子交换色谱High Q、SDS-PAGE、质谱、等电聚焦等方法分离纯化获得葛根蛋白，命名为RPTI。经质谱分析其相对分子量为20731.6Da,等电点值为6.34,N-端氨基酸序列检测结果为:DFVYDMCGNVLNGGTYYIL，通过NCBI比对推测其为植物胰蛋白酶抑制剂。抑制活性实验以BANPA为底物，测得RPTI对底物具有明显的抑制性。选取30-100℃温度范围测试RPTI对温度的稳定性，结果表明 RPTI具有较高耐热性，70℃条件下完全失活。调节pH范围4-7，检测RPTI对pH变化的稳定性，结果表明酸碱对RPTIi并无显著影响，pH8为相对最大活性值。rn 文献中提及胰蛋白酶抑制剂具有抗癌功效，因此本实验选取正常肝细胞L-02与肝癌细胞Hep-G2做对比实验，体外细胞实验结果表明，RPTI对正常肝细胞L-02并无毒性，而RPTI对肝癌细胞Hep-G2却有明显的抑制生长作用，最大抑制率达到85%，此时RPTI浓度为0.5mg/mL.因此本实验验证RPTI对肝癌细胞Hep-G2具有抑制作用，但并不适用于所有癌细胞，对RPTI的抗癌效果还需选取多类型癌细胞株进一步实验验证。rn 葛根为家喻户晓的药食同源物质，本实验成功从天然植物葛根中分离纯化获得一种具有生物学活性的胰蛋白酶抑制剂，为葛根入药及其药用功能提供基础依据，中医上葛根多用于复方中，因此对复方新用提供一定依据。
  • 摘要：担子菌圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是一种产油能力非常强的油脂酵母,其油脂最高产量可达细胞干重的60％以上.而且油脂中的不饱和脂肪酸含量丰富,分别有油酸、亚油酸、亚麻酸等,尤其是亚麻酸,它在人体代谢中其非常重要的作用.我们利用Rhodosporidium toruloidesA CCC 20341和前期用常温常压等离子突变(ARTP)技术得到的R.toruloides突变株M18进行研究,首先鉴定出R.toruloidesA CCC 20341胞内合成亚麻酸的类型是α-亚麻酸.然后对R.toruloides生产α-亚麻酸的条件(碳源、氮源、碳氮比、发酵条件)等因素进行了优化，以利于提高α-亚麻酸的产量。优化条件为:碳源(葡萄糖)、氮源(胰蛋白胨)，高碳氮比(200:1)，在15L补料发酵条件下，R.toruloidesACCC 20341和R. toruloidesM18可以分别得到占总脂肪酸产量5.01%和5.33%的α-亚麻酸，与在其他条件下得到的α-亚麻酸的产量相比有很大的提高，为目前报道的产油酵母生产α-亚麻酸的最高值。
  • 摘要：哺乳动物不育系20样激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinase1/2,MST1/2)是哺乳动物中Hippo信号通路的核心成员,具有调节器官大小、细胞增殖、凋亡及抑制肿瘤生长等功能.近期研究表明,Hipoo通路活性异常与结直肠癌的发生发展密切相关,在结直肠癌组织和结直肠癌来源的细胞系中YAP蛋白过表达,而通过激活MST1和MST2蛋白激酶,其可以通过抑制YAP蛋白的过表达来阻止肠道干细胞的增殖和结直肠癌的发生.然而，有关调控Mst1表达对结直肠癌细胞增殖与凋亡影响的研究尚未见报道。本研究通过分别转或靶向沉默结直肠癌SW480细胞Mst1基因，旨在观察调控Mst1表达对结直肠癌细胞增殖与凋亡的影响及其初步机制，为结直肠癌的靶向治疗提供实验依据。我们实验室采用PolyJetTM体外DNA转染试剂介导pEGFP-N1-MST1转染入结直肠癌细胞SW480，用LipofectamineTM2000转染MST1特异性-siRNA靶向沉默MST1.MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡，RT-qPCR和Western blot分别检测细胞MST1,PUMA,P73,P53,YAP及caspase-3 mRNA和蛋白水平。结果显示:与Control组比较，转染p-EGFP-MST1质粒组、5-FU组和p-EGFP-MST1+5-FU组细胞48h生长抑制率明显比Control组或转染p-EGFP-N1质粒组细胞高，具有显著性差异(P<0.01).此外，与转染p-EGFP-MST1质粒组或5-FU组相比较，p-EGFP-MST1+5-FU组对SW480细胞增殖抑制作用更强，统计学有显著性差异(P<0.01)：p-EGFP-MST1组、p-EGFP-MST1+5-FU组细胞凋亡率均呈显著性升高(p<0.05),MST1,Phospho-YAP1(Ser127)、p73、p53、PUMA和caspase-3蛋白水平均呈显著性升高(P<0.05)、CTGF、AREG蛋白水平呈显著性降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示，与Control组或NC-siRNA组细胞比较，转染MST1-siRNA3处理后，SW480细胞的总凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率均降低，均具有统计学意义(P<0.01)，说明沉默MST1可抑制SW480细胞凋亡。rn 结论:靶向调控MST1表达可较好调控结直肠癌细胞增殖与凋亡，MST1很有可能成为人结直肠癌防治的新靶点。
  • 摘要：冠心病是当今世界最常见的心血管事件死因之一.随着血管再通技术的广泛应用,心肌I/R损伤已成为影响或阻碍缺血性心脏病治疗的主要原因之一.心肌I/R损伤是指I/R心肌在恢复血运液供应后原损伤反而加重,通常在再灌注后24小时内发生.如何减轻H/R损伤成为医学届急需解决的问题.降低心肌I/R损伤在提高心血管疾病临床治疗效果中具有重要意义.目前认为心肌I/R的发生机制较为复杂，主要与再灌注后Ca2+超载、炎性反应、氧自由基大量释放及代谢紊乱等有关，并涉及多种信号通路的激活。心肌I/R不仅影响了心功能，且也限制了多种临床再灌注治疗如冠状动脉溶栓术、介入术及搭桥术等的疗效。近年来研究发现细胞凋亡是心肌I/R损伤的一个重要病理特征，下调或抑制心肌细胞凋亡，就可显著减少心肌I/R损伤。p53上调凋亡调制物(p53up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)是线粒体凋亡通路中的重要成员，在线粒体凋亡中又发挥了重要作用，PUMA是迄今发现的促凋亡作用最强的BH3-only蛋白。牛磺酸(Taurine,Tau)是正常存在于体内且结构简单的含硫氨基酸，是人体的一种条件必需氨基酸。牛磺酸具有抗氧化、清除自由基、维持细胞膜稳定性和细胞渗透压、调节胞内钙稳态、抑菌及抗炎等功能，能抑制细胞凋亡，对心肌I/R损伤有较好的保护作用，但牛磺酸的心肌保护作用是否与PUMA有关目前尚不清楚。本研究利用心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型，转染外源PUMA基因及siRNA靶向基因沉默等技术方法，以PUMA表达及其活性变化和细胞凋亡为重点观察指标，旨在探讨牛磺酸对心肌H/R损伤的保护作用及其分子机制，为心肌H/R损伤的靶向治疗及药物开发提供依据。结果显示:与H/R组比较，3个牛磺酸保护组(牛磺酸终浓度分别为10、20、30mmol/L)的心肌细胞凋亡率均有显著下降(P<0.05);随着牛磺酸终浓度的增加，H/R心肌细胞中Bcl-2蛋白表达逐渐升高(P<0.05).而PUMA,CHOP,Bax,GRP78和Caspase-3蛋白表达则逐渐下降(P<0.01);牛磺酸对心肌细胞中PUMA过表达有较强的下调作用;靶向沉默PUMA后细胞凋亡率呈显著下降，Bcl-2蛋白升高，Bax蛋白则下降(P<0.05);靶向沉默CHOP后PUMA表达下调(P<0.05).rn 结论:牛磺酸对心肌细胞H/R导致的凋亡有较好的抑制作用，其机制可能与下调PUMA,CHOP表达有关。
  • 摘要：米曲霉作为美国食品药品管理局认证的GRAS级别菌种,在传统工业中常被用于酱油,米酒,豆瓣酱等食品调料的生产,近年来随着分子生物学技术的发展以及米曲霉基因组的破译公开,加之其本身具有的向胞外分泌大量不同蛋白的能力使得其在现代农业,食医药行业也得到了广泛的开发应用.米曲霉本身能产生含有一个及以上数目的核的菌丝体及分生孢子,米曲霉中多核现象的产生是生物长期进化的结果,这种复杂的核型使得对米曲霉遗传学上具有多型性;这种多核现象一直被认为可以弱化对米曲霉基因的改造,从而对传统突变育种以及现代分子育种遗传稳定性问题提出了挑战.本文拟通过对米曲霉的核型分析及孢子萌发时间等基础研究探讨米曲霉的遗传多型性及其生长过程中核型变化的调控机理.rn 米曲霉分生抱子是直接能够获得的单个细胞个体，更利于核型分析及后续的遗传学研究。本试验以本实验室分离获得的一株米曲霉为出发菌株，经察氏培养基30℃培养数天，收集并过滤获得分生孢子悬液。采用DAPI核染色分析，经荧光显微镜观察并计数了440个分生孢子中核数目分配情况，发现10%左右为单核孢子，36%左右为双核，25%为三核，其他为四核以上孢子。采用膜过滤技术分离富集单核与多核孢子，进一步研究液体培养条件下孢子萌发时间和萌发率，结果表明本发酵条件下培养4.5h孢子普遍萌发，萌发率在80%以上。以上结果为深入探讨米曲霉生长过程核型变化的调控机制打下基础。
  • 摘要：研究以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)作为辅酶Q10生产出发菌株,根据摇瓶发酵结果确定罐上温度、Ph控制参数.采用补料分批发酵的方法,研究溶氧量、转速、通气量、补糖及补磷对类球红细菌罐上产辅酶Q10的影响.结果表明:类球红细菌生长对溶氧量的要求较高,但过高的溶氧对辅酶Q10的积累起抑制作用.转速、通气量单因素实验确定最适发酵转速、通气量分别为为500rpm、2vvm,辅酶Q10产量达到1664mg/L.根据低转速、低通气类球红细菌单位产量较高的结果,对发酵后期采取降低转速、通气的措施使辅酶Q10产量进一步提升至1794mg/L,是摇瓶发酵的9.6倍.发酵过程中将葡萄糖浓度控制在3～10 g/L对Q10发酵有利,采用磷源分补方式将发酵周期由原来的120h缩短至96h.
  • 摘要：酚类化合物是许多有毒废物中常见的有害成分,也是农业废弃物中常见的一类抗营养因子,极大限制了对那些富含蛋白质、碳水化合物和矿物质的农业废弃物的资源化利用,因此,抗营养因子的清除一直是饲料化利用农业废弃物中亟待解决的主要问题.例如,菜粕(RSM)是一类较有价值的动物饲料蛋白质来源,其含有的抗营养因子包括酚类化合物芥子酸(SA)和芥子碱(SNP).最近，很多措施己被用于降解菜粕中的SA和SNP，包括植物育种、机械处理、化学处理、微生物发酵及酶处理。相比其它方法，酶处理是较为温和的过程，不易引起蛋白质变性、营养损失、适口性变差及二次污染，是较为理想的降解菜粕中抗营养因子的方法。但酶处理的较高成本限制了其在菜粕脱毒中的应用，因此，为了降低酶处理的成本，酶的固定化是目前较为可行的途径。最近，基于芽孢无可比拟的稳健性，其已被开发为固定酶的优良平台，其中芽孢衣层是固定酶的理想锚点。而芽孢衣上的某些蛋白如YjqC和CotA是一类天然的固定于芽孢表面的酶，包含CotA的芽孢早己被直接用于化学合成染料的降解。SA和SNP可被多酚氧化酶、漆酶、过氧化物酶及具有过氧化物酶活性的过氧化氢酶有效转化降解。据报道CotA可以高效催化氧化芥子酸，生成单内酯或双内酯的二聚物，但是并没有利用含有CotA的芽孢去催化氧化芥子酸或芥子碱。此外，芽孢衣蛋白YjqC是一种锰过氧化氢酶，尚未有报道研究YjqC是否具有氧化降解SA和SNP的催化活力。rn 本研究中，芽孢衣蛋白CotA和YjqC位于Bacillus altitudinis SYBC hb4的芽孢衣中。CotA能有效地催化氧化SA和SNP。与SA相比，CotA对SNP的亲和力较高，但两者的催化效率相当。同时，YjqC具有典型的过氧化氢酶活性，也具有氧化SA和SNP的过氧化物酶活力。与CotA相比，YjqC对SA和SNP的亲和力较低，而且催化效率也较低。然而，YjqC和CotA共定位于芽孢衣，其在催化氧化SA和SNP时，具有互补的作用。而且这两个酶定位于芽孢衣中，并赋予芽孢明显的催化氧化SA和SNP的活性，但是相比游离酶，其Km值有所升高，但其稳定性也明显升高，是一种天然的固定化的芽孢CotA和YjqC，很适合用于处理菜粕，降解其中的SA和SNP。研究证明，利用B.altitudinis SYBC hb4的芽孢在45℃处理菜粕18h后，菜粕中的SA和SNP的含量明显降低。
  • 摘要：干扰素家族(IFNs)是一类对抗病毒活性有标志功能并与细胞因子结构相关的小分子蛋白质,具有生物功能的多样性.作为诱生蛋白的IFN,其相关基因在正常生理条件下处于抑制状态.当外来微生物如病毒、细菌等入侵时,IFN基因被激活,转录合成IFN.Ⅰ型IFN通过特异性结合到病毒感染和非感染细胞表面的干扰素受体(Interferon receptor,IFNR),诱导数百个干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs)的表达,而干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane proteins,IFITMs)是产物中较为重要的一种.据现有文献表明己经5种IFITM基因己经被人类发现，IFITM1，2，3和5集中分布于人11号染色体短臂对着端粒区的26Kb区域。IFITM5不是干扰素诱导的，它参与骨骼钙化。第15个基因IFITM10位于朝向着丝粒的1.4Mb区域，其作用还未明确。IFITM是干扰素刺激基因(ISG)的一组表达产物，它通过多种途径抑制病毒入侵。在IFITM家族中，主要有IFITM1,IFITM2,IFITM3参与抵抗病毒入侵的过程。IFITM蛋白定位于细胞膜和内涵体膜，是许多病毒入侵的通道。生化和膜融合研究显示IFITM蛋白可能通过调控细胞膜的流动性抑制病毒入侵。病毒在细胞表面融合或穿透时，主要由IFITM1发挥限制作用。病毒由内吞作用进入细胞器时，主要由IFITM2和IFITM3发挥限制作用。在抑制大多数囊膜病毒早期感染过程中，IFITM3发挥着主要作用。过表达IFITM3能够抑制病毒感染，敲低或敲除IFITM3后，病毒对细胞的敏感性显著增强，IFITM3系干扰素发挥抗病毒活性所必需。急性呼吸道感染是全球公共卫生的主要负担。呼吸道感染患者绝大多数是病毒感染。为了更好的检测呼吸道病毒，我们先由生物信息学分析得出miR486,miR1207,miR2763共同靶向IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5。其次通过合作医疗单位获取呼吸道感染样本，并进行病毒检测及病原谱系统计分析，分析出呼吸道感染样本中IFITMs的表达情况。旨在分析出IFITMs在感染和非感染呼吸道病毒患者中及其在轻症和重症患者中的表达差异。然后在此基础上分析靶向IFITMs的miRNA在呼吸道感染患者中的表达差异，以便找到新的可以标志呼吸道病毒的miRNA。
  • 摘要：γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid)能够转化为2-吡咯烷酮,是一种重要的工程塑料尼龙4的前体,具有巨大的工业应用前景.本文基于大肠杆菌基盘细胞,利用Red重组技术敲除其基因组上谷氨酸/γ-氨基丁酸转运酶C端的塞子结构(C-plug),构建了大肠杆菌C-plug缺失菌株,以期克服其细胞膜屏障,从而达到提高GABA产量的目的.以醋酸钠-醋酸缓冲液调初始pH为4.5,以谷氨酸钠为底物,经全细胞催化后,通过高效液相色谱测量产物GABA的含量,结果1h内大肠杆菌C-plug缺失菌株转化效率比出发菌株提高了23％.
  • 摘要：吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是继黄素核苷酸(FMN、FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD、NADP)之后发现的第三种氧化还原酶辅酶,作为多种细菌的脱氢酶辅因子,在食品和医药保健领域具有重要的开发前景.生丝微菌FJNU-6(Hyphomicrobium denitrificans FJNU-6)是实验室前期筛选获得的一株PQQ产量较高、胞外蛋白分泌较低的甲基营养菌.该菌株含有PQQ生物合成所必须pqqABCDE基因簇外,还含有一个pqqADE簇以及三个独立pqqA基因.转录本实验分析表明pqqABCDE和pqqADE基因簇中只有pqqD和pqqE为同一个转录本,其余基因均为单独转录.荧光定量PCR实验表明,作为PQQ的合成前体的pqqA表达量最高,pqqC次之,pqqE表达最低.5个pqqA基因中,pqqA3的表达水平最高,大肠杆菌的异源表达结果也表明pqqA3最有利于PQQ的合成.
  • 摘要：辅酶Q10作为呼吸链的主要成分,在电子传递链上起着重要的作用,在医药、化妆品行业的应用越来越广泛.辅酶Q10的生物合成非常复杂,至少涉及14种酶催化的反应.本研究中,使用λred重组技术,将来自类球红细菌的十聚异戊二烯合成酶(RsddsA)置于T5替换大肠杆菌内源性的八聚异戊二烯合成酶(IspB),使大肠杆菌BW25113成为辅酶Q10生产菌株.将△IspB::T5-ddsA性状成功导入IPP和DMAPP强化的大肠杆菌菌株PG1(△pgi T5-dxs;T5-idi;T5-ispDF;ptsG::P119-glk;△galR;△lacI).进一步用P1转导将Q10合成途径的竞争途径—甲基萘醌合成途径关键的menB基因敲除,新菌株PG1MB其Q10产量达到1.75mg/g(干重).分别过表达来自类球红细菌的ddsA,crtE,ubiE,ubiA,ubiDX,ubiH,ubiB和ubiG基因，对Q10产量有正效果。通过对ddsA密码子优化，并将来自类球红细菌的ddsA和ubiE置于阿拉伯糖启动子下游，在中等拷贝质粒pXB1a中共表达，其Q10产量可达3.06mg/g(干重)。然而，将ddsA和ubiE与ubiA,ubiDX,ubiB和ubiG共表达，Q10产量却没有明显的提高。过表达来自醋酸杆菌的对羟基苯甲酸内排泵pcak基因，以及来自类球红细菌的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK，并且添加0.2% L-阿拉伯糖、2mM对羟基苯甲酸、5mM甲硫氨酸，大肠杆菌Q10产量可达3.3mg/g(干重)。
  • 摘要：目的:结核病是目前我国居民健康构成严重威胁的一类呼吸道传染病,具有较大的危害性,由于结核分枝杆菌生物学特性及目前较高耐药性的特点,给治疗构成了较大的困难,因此快速检测结核菌尤其是耐药结核菌的新方法显得尤其重要,本文通过反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性.rn 方法:根据结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因设计5条寡核普酸探针，并点在硝酸纤维素膜上，同时设计生物素标记的PCR引物扩增结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因片断，与膜探针进行反向杂交，并同细菌学药敏试验、PCR-SSCP方法进行比较。rn 结果:52株结核分枝杆菌临床分离株，经细菌学药敏试验其中32株耐利福平和20株敏感株，PCR-SSCP分析，结果20株敏感株的SSCP图谱与标准菌株完全一致，32株RFP耐药株有30株与标准株不同(93.75% )，膜反向斑点杂交结果显示20株敏感株20株均为阳性，特异性100%,32株耐药株中有3株未出现突变，敏感性90.6%。突变位点分别在:531,533位14株，526位10株，513位4，株516,519位1株，与PCR-SSCP分析结果符合率为96.7%.rn 结论:膜反向斑点杂交技术有可能成为检测结核分枝杆菌耐利福平基因的简便、快速的方法。
  • 摘要：环状RNA(circular RNA,circRNAs)是广泛存在于各种生物体中一类区别于传统线性RNA的新型形式.它首次在RNA病毒中被发现.近年来,研究人员在人,鼠,线虫,植物,古生菌生物体内发现存在大量circRNAs.在真核生物体中,circRNAs富集在胞浆中并具有牢固的环状结构,大量存在于真核转录组中,大部分circRNAs是由外显子构成.circRNAs具有良好的物种保守性以及组织特异性,不同于线性RNA不易被核酸酶裂解.根据存在形式及其功能，circRNAs的可分为以下三类。第一类是在病毒、类病毒中作为基因组和反基因链的形式存在的circRAN，该类circRANs发现于一些人类以及植物的病原体中。通过3'-5'末端连接。在植物病原体中其片段大小～250-400nt左右。在人类病原体主要发现于HDV病毒中的circRAN片段大小为1.7kb左右。第二类是内含子来源的circRANs，这些circRAN是RNA或者mRNA, tRNA, rRNA的副产物或者最终产物，又或者是RNA加工反应的中间体。该类的circRNAs在真核生物，细菌，病毒以及古生菌中都有存在。一般以2'-5'键或者3'-5’末端连接相连。其片段大小各异，并且稳定存在。第三类是外显子来源的circRANs，主要存在于真核生物体内，是通过反向剪接产生的Pre-mRNA副产物或最终产物，片段大小各异，发挥着miRNA海绵功能。研究人员发现，外显子构成的circRNAs可以作为一类新型的ceRNA调节物，发挥RNA海绵功能，竞争性抑制miRNAs的表达，阻断miRNAs对其靶基因表达的抑制作用。目前发现circRANs在肿瘤、阿兹海默症等疾病发生上扮演着重要角色，它作为新型临床诊断标记物具有着明显的优势。
  • 摘要：漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种的多酚氧化酶,属蓝多铜氧化酶家族成员,其作用底物较为广泛,能够催化酚类、生物色素、羧酸类和许多其他非酚类物质的氧化,因此被应用于环保、造纸工业、食品工业、生物监测、有机合成等众多领域,具有较高的经济应用价值.rn 本文以一色齿毛菌(Cerrena unicolor)Y-G07作为生产菌株,通过对其生产培养基成分的优化,5L发酵罐溶氧相关条件的控制及发酵罐生产工艺的优化等方面进行了研究,实验结果如下:rn 1、通过优化生产培养基成分,确定摇瓶发酵培养基最佳碳、氮源配方(w/v):碳源为6％工业级麦芽糊精,氮源为1.5％蛋白胨和0.2％酒石酸铵,25℃下摇瓶发酵的漆酶活力可达514.3U/mL,比采用课题组前期研究的培养基方案活力提高70％,同时降低生产成本.通过5L发酵罐放大培养后,最终确定其发酵培养基的初始碳、氮源分别为7％工业级麦芽糊精和1.5％蛋白胨+0.2％酒石酸铵.rn 2、对5L立式发酵罐溶氧相关控制条件进行研究得出，若不考虑转速产生的负面影响而将溶氧控制在10士5%和20士5%两水平，漆酶活力峰值分别仅为454.5U/mL和417.8U/mL;通过玻璃珠剪切力实验证实Y-G07菌株对搅拌产生的剪切力作用敏感;进一步实验确定最佳搅拌速度为300r/min,酶活力可达573.0U/mL，相比摇瓶发酵最高水平(514.3U/mL)提高11.4%;综合考虑耗氧丝状真菌对剪切力的敏感性及提高漆酶产量等因素，研究进一步在控制低转速、高通气量(300r/min,2vvm)的条件下，采取5组不同搅拌器组合进行发酵试验，最终得出六折叶DT602式搅拌器效果最好，酶活最高可达690.3U/mL.rn 3、对发酵罐生产工艺不同条件进行优化，考察其对Y-G07菌株生长和产酶的影响。确定8%为最佳接种量，漆酶活力维持在较高水平，665.3U/mL;确立分批发酵产漆酶的温度控制方案:0-48h控制为30℃,48h后控制为25℃。相对恒定30℃和25℃条件下，酶活分别提高27%和10%，峰值达730.4U/mL;控制不同pH进行发酵产酶，发现pH4.0条件下，酶活力峰值可达761.1U/mL;考察2种分批补料方案对漆酶产量的影响，以10% (w/v)麦芽糊精作为补料液，使还原糖维持在不同浓度(20士2g/L和10士2g/L )。当浓度为10士2g/L时，酶活力最高可达830.2U/mL;而维持浓度为20士2g/L时，延长了菌体快速生长期，漆酶活力最高可达862.3U/mL.
  • 摘要：鲭鱼是我国重要的经济鱼类之一,常被人们当作主要的蛋白质来源.沿海地区鲭鱼产量丰富,每年捕捞大量鲭鱼制作罐头,在罐头加工过程产生的大量蒸煮液一般采取直接排放,不仅造成严重的环境污染,也浪费资源.本课题采用生物酶解方法,从四种蛋白酶中选取了碱性蛋白酶和胰蛋白酶,优化其单酶制备活性肽的工艺,再以单酶的优化条件进行复合分段酶解制备生物活性肽,以期实现鲭鱼罐头蒸煮液的高值化利用.具体研究结果如下:rn 1、采用响应曲面设计对碱性蛋白酶的酶解工艺进行优化，得出最佳酶解条件为:酶解温度58.59℃，酶解pH8.45,酶添加量6752.46U/g，反应时间3h;在此条件下，羟自由基抑制率为39.59%。rn 2、采用响应曲面设计对胰蛋白酶的酶解工艺进行优化，得出最佳酶解条件为:酶解温度54.48℃ ,酶解pH7.12，酶添加量7450.54U/g，反应时间4h;在此条件下，羟自由基抑制率为19.94%。rn 3、采用四种不同方案对碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行复配，得出最佳的复合酶解工艺条件为:先添加胰蛋白酶，在酶添加量7450.54U/g，温度54.48℃,pH8的条件下反应4h;再添加碱性蛋白酶，在酶添加量6752.46U/g，温度58.91℃，pH8的条件下继续反应3h,得到的酶解产物对羟自由基抑制率可达61%;采用TSK-gel G3000sw色谱柱分析，复合酶解液中小分子肽(MW<1000Da)占总体蛋白水解物的百分比高达50% 。rn 4、使用超滤膜对复合酶酶解液进行分离，得到不同分子量范围的三个组分:P1组分(MW<1KDa)、P2组分(MW=1KDa-3KDa)、P3组分(MW=3KDa-10KDa )。三个组分的抗氧化活性测定结果表明，P1组分的抗氧化效果较好;三个组分的ACE抑制活性测定结果也表明P1组分的ACE抑制效果最好。rn 综上所述，使用复合酶分段酶解大大提高了制备抗氧化肽的能力，并且获得了大量小分子肽段(MW<1KDa);结果表明小分子肽段具有良好的抗氧化活性和ACE抑制活性。
  • 摘要：果胶酶是一类能作用于果胶质的酶的总称,在食品、饲料、环保和纺织等行业具有重要应用价值.利用微生物发酵生产是果胶酶的主要来源,具有非常重要的意义.本文通过对果胶酶产生菌的筛选、诱变,发酵条件和酶学性质的研究,以期为果胶酶的工业生产与应用提供理论依据.研究结果如下:rn 1、采用透明圈法初筛、液态发酵复筛,从腐烂的苹果中分离筛选获得一株产果胶酶能力较强的菌株YQ-13.结合形态学观察与ITS rDNA序列分析,鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger).对其进行紫外--氯化锂复合诱变,确定了最佳诱变剂量为紫外照射5min、诱变筛选培养基氯化锂含量0.3％.通过5轮的反复诱变,最终获得能够稳定遗传的黑曲霉YQY-36突变菌株,其果胶酶酶活力为67.6U/mL,较诱变前的19.6U/mL提高了2.44倍.rn 2.通过单因素实验和响应而设计，确定黑曲霉YQY-36的最佳摇瓶培养基成分为桔皮粉4.2%,葡萄糖0.5%、蛋白胨2.8%,(NH4)2SO4 1.5%,Na2HPO4·12H2O 0.17%,KH2PO4 0.14%,ZnSO4·7H2O 0.05%,pH4.0;培养条件为接种量10%、装液量70mL/250mL、于200r/min的旋转式摇床中28℃培养84h。优化后果胶酶活力最高可达132.8U/mL.rn 3、对黑曲霉YQY 36进行5L发酵罐小试生产研究，通过实验发现溶解氧、培养基碳氮比以及补料策略对产果胶酶能力都有显著的影响。最终确定发酵方案为:5L发酵罐初始装料3L，培养基成分为桔皮粉1.42%、蛋白胨1.40%,葡萄糖0.50%,(NH4)2SO4 0.70%、Na2HPO4·12H2O 0.17%,KH2PO4 0.14%,ZnSO4·7H20 0.05%,pH4.0，发酵起始转速650r/min,通气量200L/h，接种量10%，发酵温度28℃，发酵过程中调节转速与通气量使发酵液DO不低于30;发酵至24h后开始以40mL/h的速度进行补料，补料总量为1L:补料培养基成分为桔皮粉8.50%、蛋白胨1.80%,(NH4)2SO4 0.90%,Na2HPO4·12H2O 0.17%,KH2PO4 0.14%,ZnS04·7H2O 0.05%，pH4.0。经优化后，5L发酵罐产果胶酶的最高峰出现在60h时，酶活力为263.9U/mL，发酵周期比摇瓶发酵缩短了24h,酶活力提高了98.7%.rn 4、对果胶酶进行酶学性质研究，结果表明:黑曲霉YQY 36所产果胶酶最适反应pH为4.0;最适反应温度为60℃;pH稳定性良好，在pH为4.0-7.0,30℃条件下处理3h后酶活力保持在80%以上;在温度低于40℃时热稳定性较好，保温3h酶活力基本没变，当温度高于50℃后酶活力急剧下降。
  • 摘要：虫草及其无性型含有丰富的生理活性物质,具有广泛的药理作用,是名贵的中药材.因而进行虫草的生产开发具有非常重要的意义.而冬虫夏草受本身生长特性和资源环境的制约,目前并未实现有效的子实体人工培养和规模化生产,年产量低,市场价格极高.有大量研究表明,冬虫夏草的同属姐妹—蛹虫草所含功效成分和药效与野生冬虫夏草相同,可以作为野生冬虫夏草的有效替代品.而现有研究证明,蛹虫草的药用价值甚至比冬虫夏草更为丰富.自从上世纪80年代发现野生蛹虫草以来,经过几十年的发展,成功的实现了蛹虫草的人工规模化生产,不仅如此,蛹虫草的无性型的鉴定及其深层发酵的研究也大大拓宽了蛹虫草作为新资源食品的研究及使用范围.rn 迄今为止，有大量研究已检测或分离到蛹虫草含有的多类活性成分，如核苷类物质、虫草酸(D-甘露醇)、虫草多糖、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、麦角甾醇、不饱和脂肪酸、蛋白质、氨基酸、微量元素等。其中虫草素、腺苷、蛋白质、多糖、和虫草酸等是研究最多的有效成分。研究数据显示，蛹虫草菌丝体中含有的不饱和脂肪酸如γ-亚麻酸、亚油酸等，其含量极其微量(总油脂含量小于3%，而油脂中的不饱和脂肪酸的含量占总油脂含量低于50%)。而多不饱和脂肪酸作为人体必需的营养成分，对降低血液粘稠度，改善血液微循环以及维持机体细胞膜的相对流动性，保证细胞的正常生理功能方面具有显著生理功效，但人体不能自行合成，必须从膳食中补充。开展蛹虫草菌株合成与积累不饱和脂肪酸的研究，实现蛹虫草资源生物活性物质的有效补充是一个全新的课题。rn 很多研究表明，外部的环境条件是影响微生物代谢途径乃至代谢产物合成的关键，微生物在不同的生长环境下产生的代谢产物有差异，在野生环境中的微生物产生的代谢产物种类丰富，而在实验室培养时代谢产物的种类会降低或是积累不同类型的产物，这给我们一个这样的启示:通过人为的控制微生物培养的营养源、条件及选择压力等条件，有可能会改变其代谢途径，产生或积累某些特殊的代谢产物。rn 基于代谢控制育种的原理，采用低温常压等离子体诱变技术对蛹草拟青霉菌株进行诱变处理，选育呼吸酶抑制剂(丙二酸)抗性和异柠檬酸脱氢酶抑制剂敏感的突变株，结合低温和不同氧化剂浓度的胁迫培养，并通过高浓度γ-亚麻酸和亚油酸的类似物进行耐受性选育，获得高效积累油脂的突变株-蛹草拟青霉菌株Paecilomyces militaris FG1488，其脂质合成能力明显增强。经培养基及培养条件优化，30L发酵罐中，初始温度20℃,pH6.3-6.5，搅拌速度160rpm,通风量1.21m3/h，发酵80h，发酵菌丝体干重达56.6g/L，油脂含量最高可达46.5%其中不饱和脂肪酸占比达75%以上，实现了蛹草拟青霉FG1488中油脂的大量合成与积累，达到了选育目标。
  • 摘要：高等真菌可作为丰富的天然产物以及具有生物活性的新化合物的来源而受到极大的关注.灵芝,是中医药学宝库中的珍品,现代医学研究发现灵芝中的灵芝酸具有抗肿瘤和抗艾滋病毒等重要生物学功能,灵芝酸含量的高低作为评价灵芝等级的标准.灵芝酸作为灵芝的次级代谢物,目前对它的生物合成途径和调控过程还知之甚少.在丝状真菌中,许多次级代谢物的合成受到表观遗传调控.DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰是主要的表观遗传调节方式,其中,组蛋白乙酰化主要发生在组蛋白H3和H4的N-端尾部比较保守的赖氨酸残基上,主要依靠组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)维持乙酰化的平衡.HDACs在灵芝的细胞生长、分化及次级代谢过程中可能扮演着重要的角色.本研究使用伏立诺他(SAHA)作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,在培养基中添加0-250μm/L的SAHA,经过静置培养,考察了组蛋白去乙酰化修饰对灵芝细胞的生长、菌丝形态、孢子的生成和灵芝酸合成的影响.随着抑制剂浓度的增加,上层灵芝细胞生长速度减慢,且灵芝的菌丝体发生断裂现象.在50μm/LSAHA条件下培养12天,表层灵芝菌丝层呈白色,灵芝酸的产量受到明显抑制.
  • 摘要：目的:确认miR-375基因表达相关的关键CpG位点,建立甲基化特异性PCR定性与定量分析方法;通过在临床标本中验证其对乳腺癌发生、发展的作用，探索miR-375基因甲基化作为分子标志物应用于临床诊断的可能。rn 方法:qRT-PCR与亚硫酸氢钠克隆测序方法分别检测四株乳腺癌细胞BT549,MCF-7,MDA-MB-231与T47D中miR-375的表达和其CpG岛中CpG位点的甲基化，筛选miR-375基因表达相关的关键CpG位点:设计靶向miR-375基因关键CpG位点的MSP引物，建立miR-375基因甲基化特异性PCR分析方法，并对乳腺癌及其癌旁组织标本进行定性与定量甲基化特异性PCR检测。rn 结果:qRT-PCR结果显示，BT549与MDA-MB-231细胞中miR-375的表达明显低于MCF-7与T47D细胞;克隆测序结果显示，miR-375高表达细胞中，其编码基因上游750bp序列中CpG位点几乎均为非甲基化，而miR-375低表达细胞中该区域存在5-40%不同程度的甲基化;靶向该区域的甲基化特异性引物能定性区分非修饰、非甲基化和甲基化模板;定性MSP分析结果显示，乳腺癌组织中miR-375基因的甲基化频率高于其癌旁组织(57.89%vs40%)，但无统计学意义;定量MSP分析结果显示，乳腺癌组织中miR-375基因的甲基化程度高于其癌旁组织，具有统计学意义(p<0.01)。rn 结论:miR-375基因编码序列上游750bp区域为表达相关CpG区域，该区域的CpG位点申基化状态与miR-375基因的表达相关;miR-375基因定量甲基化特异性PCR分析可以辅助区分乳腺恶性病变。
  • 摘要：Dickkopf1(DKK1)是经典wnt信号通路的拮抗剂,它可以与Lrp5/6受体蛋白结合,对wnt信号通路产生竞争性抑制作用.此外,DKK1在多种非小细胞细胞系、组织中均具有特异性、高水平表达的特点,可作为一种肺癌诊断的血清标志物.我们之前的研究发现DKK1启动子在肺癌中的活性并不是很高,因此我们认为仍可能存在其他转录调控元件(Transcriptional regulatory elements,TREs)增强子协同调控启动子活性.鉴于目前涉及DKK1增强子等调控元件的研究较少,主要集中在DKK1启动子片段上,筛选鉴定DKK1增强子片段可用于进一步的DKK1调控机制研究.参与基因转录调控的这些转录调控元件主要包括启动子、增强子、绝缘子等，与启动子元件一般位于调控基因的5’端不同，增强子等调控元件在散布在基因组中，位置并不固定。本研究的关键难点在于对DKK1基因增强子等转录调控元件在基因组中预测及定位。研究通过UCSC人类基因组浏览器获取A549细胞中DKKI基因位点的DNase1超敏性、组蛋白修饰等表观遗传信息，对这些信息进行分析，得到12条候选增强子元件序列，用于下一步高活性增强子片段筛选。rn 鉴于DKK1启动子全长片段较大，因此需要筛选一段具有较高活性且片段较小的近端启动子片段。首先本文先将四段不同长度的DKK1启动子片段构建到pGL3-basic载体中，选择其中一段作为DKK1基因近端启动子片段。将构建得到的重组载体转染A549,H460,H446,Eca-109,Chang liver和HEK293细胞，并通过双荧光素酶报告基因系统检测不同长度DKK1启动子片段活性，最终我们确定DKK1-5片段活性较好，可作为DKK 1基因近端启动子片段。rn 最后我们将这12条候选片段分别插入到DKK1-5近端启动子上游，成功构建重组质粒，并通过双荧光素酶报告基因检测系统检验相关候选元件的增强子活性。本文在细胞水平得到六段候选元件:在A549细胞中TRE3、TRE4、TRE6、TRE7、TREB、TRE12对DKK1启动子具有显著增强作用。TRE3、TR4、TRE12在H460中具有显著增强作用。而且TRE3、TRE4、TRE7、TRE8对DKK1启动子的增强作用具有非小细胞肺癌特异性。
  • 摘要：本综述着重介绍灵芝,这种真菌类担子菌种草本药物在免疫调节方面的最新研究进展.常见的灵芝种类有赤芝,松杉灵芝,薄盖树芝和平盖灵芝.从灵芝中可以提取到几种有较强免疫调节作用的物质,包括多糖(主要是β-D-葡聚糖),蛋白质(如灵芝-8)及三萜类,其主要作用包括:调节免疫效应细胞(如T细胞,巨噬细胞和自然杀伤细胞)的有丝分裂及其活性,进而影响它们相关的细胞因子(如白介素,肿瘤坏死因数-α和干扰素)表达.有证据表明:从药用真菌分离得到的β-D-葡聚糖是通过与免疫效应细胞膜上的3型补体受体(CR3,αmβ2整联蛋白,或CD11b/CD18)结合,进而诱发生物反应.这种配体受体复合物被摄入细胞后,引发一系列分子事件(如核因子NF-κB的活化),同时我们也观察到了灵芝提取成分具有一定免疫抑制作用.灵芝所表现出的抗癌,抗炎症等疗效都与其免疫调节作用有关.然而,其分子机理还有待进一步的研究.
  • 摘要：本文讨论甘诺宝力(R)(灵芝提取物)及甘诺宝力(R)C+(70％甘诺宝力(R)+30％甲壳素)对老鼠受cisplastin引导的肾毒性调查.在先以盐水、甘诺宝力(R)和甘诺宝力(R)/C+处理七天后,老鼠给予单一cisplastin(5mg/kg)腹腔注射.肾毒性与肾脏的功能可由体重、血压、尿液和血浆的生化变化及溶解物中得到见证.在经过CDDP(cis-dichlorodiamineplatinum)治疗后,肾脏重量、血清尿素、肌酸酐、24小时排尿量、尿液中的含镁量明显提高,以及体重、血压、肌酸清除、尿溶积渗克分子浓度等大幅度减轻或减少.肾毒性进一步由尿液与肾匀浆、GSH,麸胺基硫过氧化酶(GSH-Px)的麸胱甘硫转移及肾组织中的过氧化氢大幅度减少得到证实。与此同时肾匀浆中的脂质氧化相应大幅增加。这些肾毒性因注射CDDP前七天及其后连续14天的予以甘诺宝力(R)及甘诺宝力(R)/C+治疗而得到改善。肾毒性改善由血清尿素、肌酸配浓度及其它肾功能指针改善得到证明。老鼠的肾组织中的抗氧化酶活动经注射CDDP及给予甘诺宝力(R)及甘诺宝力(R)/C+治疗部份恢复。此研究结果表明cisplastin引导的肾毒性是因为近曲肾小管坏死增强肾小管再吸收系统的损坏，甘诺宝力(R)及甘诺宝力(R)/C+对于CDDP引导的肾毒性有局部的保护效果。灵芝多糖可改善CDDP引导的肾毒性的治疗指标。不过，仍需要进一步阐明证实治疗效果之机制。
  • 摘要：泛滥的水葫芦(Eichhornia crassipes)往往引起河道堵塞,对水产养殖、航道运输、水利发电以及农林灌溉等造成严重影响,破坏生态环境.水葫芦的防治方法有物理防除、化学除草剂及生物防治等,但目前我国消除水葫芦最有效的办法还是靠机械或人工打捞,可是需要花费大量人力物力,甚至还会出现打捞速度跟不上水葫芦爆发繁殖速度的状况.面对水葫芦的爆发，人工、机械防除或化学除草剂虽然能解决一时之需，但难以根治水葫芦的泛滥，采用对环境友好，成本低廉，选择性强的微生物和微生物代谢物来进行生物防除是重要的解决途径。实际上水葫芦爆发的真正原因在于水体的富营养化，许多研究表明水中的营养物质，尤其氮磷等元素对水葫芦的生长有相关关系，减少环境污染是抑制水葫芦生长较为有效的措施。为了获得能抑制水葫芦生长的微生物或其代谢产物，本研究采用氨氮平板和水葫芦琼脂平板，从水葫芦病株及其生长环境中分离到既可降解氨氮又能利用水葫芦生长的菌株，将这些菌株点种于水葫芦茎部，得到使水葫芦茎部病变黑斑的菌株，考察其培养液对水葫芦的生长抑制效果，获得代谢产物对水葫芦生长有抑制作用的菌株，选取其中的菌株S63进行菌种鉴定，为假单胞菌属。模拟水葫芦自然生态的露天培养试验结果表明:加入菌液的试验组发病率为41.1%-100%，病情指数为30.9%-96.4%，不加菌的对照组发病率19.4%-33.3%，病情指数为7.4%-20.2%;试验组叶片的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶((POD)、过氧化氢酶(CAT)的酶活均显著高于对照组。表明该菌的代谢产物有一定的除草活性。菌株S63对富营养化水质的净化试验中也表现出较好的去除氨氮和降解COD的特性，因此该菌株及其代谢产物对水葫芦泛滥具有标本兼治的防治作用，提供了一个水葫芦生物防除的新思路。
  • 摘要：木聚糖酶是木聚糖降解酶系中最为关键的酶,在食品、饲料和造纸等多个行业中都有着重要的应用.从特殊环境筛选产酶菌株并得到优良性质的酶,现已成为木聚糖酶研究的重要手段之一.本课题从特殊环境来源菌株中一共克隆得到13条木聚糖酶基因片段,通过TAIL-PCR方法获得其中2个基因的全长,对其中的基因xynSL4进行异源表达和重组酶的酶学特性分析.研究结果如下:rn 1、以木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从大布苏盐碱湖、广西红树林、云南温泉、长富牧场堆肥和南海底泥这5个特殊环境中共筛选得到20株有透明圈且形态各异的菌株;从中克隆得到8条GH10和5条GH11木聚糖酶基因片段,其中6个片段的一致性在70～90％之间,3个GH10木聚糖酶基因片段的一致性小于80％.rn 2、通过TAIL-PCR方法得到2个盐碱湖分离菌来源的GH10木聚糖酶基因全长xynSL3和xynSL4，并对两个全长基因进行分析:①xynSL3共2259bp，编码752个氨基酸，包括预测信号肽、催化结构域和CBM结构域，与已知木聚糖酶的最高一致性为55%;②xynSL4共1143bp，编码380个氨基酸，包括预测信号肽和催化结构域，与已知木聚糖酶的最高一致性为77%。选择xynSL4作为下一步表达、纯化及性质研究的目的基因，并对XynSL4蛋白进行了氨基酸序列比对、三维结构预测及系统发育分析。rn 3、新木聚糖酶基因xynSL4在大肠杆菌中成功实现异源表达。经中空纤维浓缩、硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析对酶液进行浓缩纯化，对纯化的XynSL4进行酶学性质测定:①XynSL4最适反应pH为7.0，最适反应温度为70℃，在pH11.0下具有较好的稳定性(剩余酶活大于60% )，为嗜热耐碱木聚糖酶;②XynSL4在70℃下不稳定，木聚糖底物能够保护该酶在高温下所引起的构象改变;③XynSL4对高浓度NaCl具有很好的耐受性，在4 mol/L的NaCl溶液中稳定。β-巯基乙醇、Ca2+对酶活性有明显促进作用，而重金属离子和SDS对XynSL4具有显著抑制作用;④XynSL4对榉木木聚糖的Km、Vmax和Kcat分别为1.450.08 mg/mL,362.74±8.55μmol/(mg·min)和262.62±6.19 s-1;⑤产物分析表明:XynSL4是内切木聚糖酶，其主要水解产物是木糖和木二糖。
  • 摘要：纤维素酶是一个水解纤维素的复杂酶系,主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,在饲料、食品、纺织和生物能源等领域具有巨大的市场潜力.在纤维素酶的工业化生产过程中,纤维素酶活力水平及成本问题是制约其实际应用的一个重要因素.rn 本文对里氏木霉T306进行传统诱变及全基因组重排育种,并对选育获得的纤维素酶高产菌株进行5L罐发酵工艺条件研究,研究结果如下:rn 1、优化了高产纤维素酶突变菌株的筛选培养基,确定初筛培养基中添加0.1％(w/v)乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选;摇瓶培养基碳、氮源及添加量(w/v)为:乳糖1.50％,硫酸铵0.14％,尿素0.05％,蛋白胨0.10％,初始pH自然,添加0.6％(v/v)吐温-80有利于产酶;最适发酵条件为:发酵7d,装液量30mL/150mL,转速180r/min,接种量50μL/30mL.通过紫外和微波诱变，筛选获得6株酶活力较高的突变菌株0409,0505,0506,0516,W0103和W0608。rn 2、里氏木霉原生质体制备和再生的最佳条件为:3.5%溶壁酶，菌丝菌龄22h,酶解时间4h,酶解温度30℃，采用pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，以高渗筛选培养基为再生培养基，再生培养基中渗透压稳定剂为0.8mol/L NaCl。在此条件下，里氏木霉原生质体量可达1.44×107个/mL，再生率为2.64%.rn 3、对里氏木霉原生质体的融合条件进行了研究，最佳融合条件为:将紫外照射90s或微波辐射200s两种方式灭活后的原生质体混合，在30%PEG,30mmol/LCa2+、30℃条件下处理12min，原生质体融合率可达0.5%。以突变菌株0409,0516,W0103和W0608为亲本菌株进行两轮基因组重排实验后，获得一株遗传稳定、产酶能力较强的融合子G2-0832，其CMC酶活力达86.40U/mL，较出发菌株提高了57.08%。融合子G2-0832的胞外蛋白表达量与出发菌株相比明显增强了。rn 4、对里氏木霉进行 5L发酵罐实验，初步确定适宜的纤维素酶发酵工艺为:发酵培养基主要氮源为玉米浆干粉;补料速率不宜太快，培养24-40h，补料速率控制在12mL/h左右，40h后为18mL/h左右;接种量10%;初始搅拌速度400r/min。在此条件下，出发菌株和融合子G2-0832的CMC酶发酵水平分别可达450U/mL及600U/mL,G2-0832产酶能力比出发菌株提高约30%.
  • 摘要：α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开α-1,4糖苷键,生成糊精和还原糖,耐高温α-淀粉酶具有较好的耐热性,在酿造、食品、纺织等工业中应用广泛.本文以由麦丹生物有限公司福州研究院筛选、保藏的耐高温α-淀粉酶高产菌BL-H19为研究材料,探索产酶的主要影响因素,确定最佳培养条件,并对补料分批发酵工艺进行研究.rn 为了提高该菌株的产酶量，本文采用单因素法确定最佳碳源、氮源以及各培养基组成对产酶的影响。结果表明糊精对该菌株产酶有诱导作用，采用高温淀粉酶水解玉米淀粉制备糊精，并确定最适宜的水解条件，以DE值为20-26的糊精为碳源时菌株有较高产酶。利用响应面法对多种影响产酶量的因素进行统计分析，并最终得出摇瓶最佳产酶的培养条件，最佳培养基组成为:豆饼粉2.6%，棉籽粉2.1%，硫酸铵0.5%,氯化钙0.045%，玉米浆3%,磷酸氢二钾1.4%，磷酸二氢钾0.6%，柠檬酸钠0.2%，糊精(DE值为20-26 )12%,起始pH为6.5左右，温度37℃，转速260rpm条件下发酵7天，耐高温α-淀粉酶产量由1970U/mL提升至4630U/mL，约是培养基优化前酶活的2.35倍。rn 在10L全自动发酵罐小试验证并对补料分批发酵工艺进行了研究，菌体生长阶段控制pH稳定在6.5，产酶阶段pH上升，控制pH在7.0，并补加糊精维持还原糖浓度为20-30g/L,此条件下该菌株有较高产酶，酶活可达10300U/mL，可进行进一步放大生产研究。
  • 摘要：安丝菌素(Ansamitocin)是能从橙色束丝放线菌(Actinosynnema mirum)发酵液中分离的安莎类产物,具有显著抗肿瘤作用,因其细胞毒性较强,将其与单克隆抗体连接成抗体靶向药物,用于肿瘤治疗.根据安丝菌素C-3侧链的碳链长度不同,有二十多种衍生物,如:P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4,其中AnsamitocinP-3(AP-3)的产量最高,活性最强.然而，当前安丝菌素发酵产量极低，通过高产菌株选育和发酵工艺优化仍是提高产量的关键。本文以珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565为出发菌株，利用原生质体制备与再生技术，结合活性产物快速筛选模型，选育高产菌株，并对获得的突变株进一步进行培养基优化、发酵流加工艺优化。首先，采用抑菌活性、薄层层析法(TLC)对突变株发酵液中AP-3进行了定性和半定量检测，建立简便高效率的半定量检测方法。初筛获得少量高产菌株再通过超高效液相色谱(UPLC)复筛定量检测，结果获得P-102,P114,P-127,P-133等四株高产菌株，其中P-102菌株的产量达48.74μg/ml，比原始菌株提高了3.6倍。
  • 摘要：蛹虫草中含有多种生理活性物质如虫草素、虫草酸、虫草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷等,其对促进机体新陈代谢,提高机体免疫功能等具有积极意义,此外,蛹虫草还含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素及微量元素等成分.2009年原卫生部批准蛹虫草为新资源食品,认定其作为新保健食品,为冬虫夏草的良好替代品.蛹虫草的生理活性成分中不饱和脂肪酸成分主要为γ-亚麻酸及亚油酸,但其含量非常低(含量低于1％),难以达到其应有的生理功效.rn 本研究旨在获取蛹虫草本身腺苷类活性物质高含量的基础上，创新性的开展蛹虫草菌株合成与积累油脂的研究，并突出油脂中不饱和脂肪酸，特别是提高γ-亚麻酸和亚油酸的量，实现蛹虫草资源生物活性物质的有效补充，达到蛹虫草生理活性功能物质多效叠加的目的。在分别实现高产腺苷类活性物质的蛹虫草菌株FY-1421和高产油脂蛹虫草菌株FG-1488的原生质体的制备及再生条件优化的基础上，采用紫外及加热的方式对原生质体进行单体灭活，以PEG为促融剂，多轮次的细胞融合，结合高通量TTC快速筛选以及摇瓶复筛，获得了种内杂交融合株36株，其中蛹虫草FX-1521杂交菌株，菌丝体腺苷类含量达500μg/g干重，油脂含量达26.5%，经培养液组成及培养条件的优化，其菌丝体腺苷类含量提高达1121μg/g干重以上，油脂含量提高到30.1%，而且遗传性状稳定。目前为止，种内杂交的融合子其单体性状(主要活性成分如腺苷类或油脂类)均未有超过双亲的融合子，但也真正实现了产脂型蛹虫草的选育目标，并成功对融合变株—蛹虫草FX1521进行了菌丝体深层发酵积累腺苷类及油脂的研究，获得了强化多不饱和脂肪酸(特别是γ-亚麻酸)的新型蛹虫草产品。
  • 摘要：木聚糖酶是一类能催化水解木聚糖的酶的总称,广泛应用于饲料、食品、造纸和能源等行业.木聚糖酶来源广泛,但目前发现的产酶菌株大部分来源于陆地,对海洋微生物的研究还比较少.本课题从不同来源的海洋样品中筛选出具有较高产木聚糖酶能力的菌株B659,通过诱变育种得到正突变菌株W1-40,并对其进行发酵条件优化以及木聚糖酶的酶学性质研究,研究结果如下:rn 1、以自制的甘蔗渣木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从福州市平潭海域的水样和泥样、松原市大布苏湖的泥样、宁德市三都澳海域的泥样和海藻、鲍鱼内脏以及北极的泥样中共筛到74株有透明圈且形态各异的菌株,摇瓶发酵结果显示,74株菌中45株具有产木聚糖酶能力,其中B659菌株产酶能力最高,酶活力为525.3U/mL.rn 2、对B659菌株进行紫外诱变，筛选得到酶活提高13.9%且稳定遗传的突变菌株G3-17;对G3-17菌株进行微波诱变，筛选得到酶活比G3- I 7菌株高出11.6%且稳定遗传的突变菌株W1-40。对B659菌株和W1-40菌株进行发酵试验，72h时W1-40菌株的酶活力达到645.2U/mL，比B659菌株(517.9U/mL)提高24.6%.rn 3、对W1-40菌株进行产酶培养基及发酵条件的优化。确定产酶培养基为:麸皮6%(w/v)，自制甘蔗渣木聚糖1%(w/v)，豆饼粉1%(w/v), K2HP04 10mmol/L，吐温-80 0.03%(w/v)，初始pH6.0。确定发酵条件为:温度30℃，摇床转速230r/min，装液量25mL/250mL，接种量8%(v/v)。优化后木聚糖酶活力达到2838.3 U/mL，比优化前(645.2U/mL)提高3.4倍，发酵周期由72h缩短至30h.rn 4、对W1-40菌株所产的木聚糖酶进行酶学性质研究。该酶的最适反应温度和pH分别为55℃和6.5，在37℃、pH 8.0-10.0的条件下保温2h仍具有78.3%的酶活力，具有较好的耐碱性。10mmol/L K+和1mmol/L Fe2+对该酶具有促进作用，Mn2+, Cu2+和Co2+对其具有明显的抑制作用。酶的底物特异性实验结果显示，该酶有微弱的纤维素酶活性，其最适作用底物是山毛榉木聚糖。酶的动力学反应试验得知，该酶的Km值是4.57mg/mL, Vmax为1886.8U/mL。
  • 摘要：柚皮苷作为黄酮类化合物的主要代表物质之一,主要存在于未成熟的柑橘类果皮中.柑橘类果汁中往往含有大量的柚皮苷物质,使得果汁产生较重的苦味.柚苷酶主要用于除去柑橘类果汁中的柚皮苷.利用微生物产生的柚苷酶进行脱苦是一种理想、经济的方法,且已成为此行业的关注焦点.本文采用紫外和微波联合诱变方法对从自然界筛选得到的柚苷酶产生菌进行诱变育种;研究诱变后菌株的产酶特性以及粗酶酶学性质,并对柚苷酶进行分离纯化;最后探究其对柑橘类果汁脱苦的应用效果.rn 从自然界中筛选获得15株产柚苷酶的菌株，选择其中一株酶活力最高的菌株进行形态学以及18S rDNA鉴定，确定为黑曲霉并命名为Asperillus niger N-01。以此为出发菌株，采用紫外-微波联合诱变技术处理，突变菌株A.niger N-132产酶能力达到81.50U/mL，酶活力较原始菌株提高4.7倍，且具有较好的遗传稳定性。rn 对突变菌株A.niger N-132的产酶条件进行优化。确定A.niger N-132的液体产酶培养基配方为:桔皮粉(30目-120目)2.7%，豆渣0.5%，酵母膏2.0%, KH2PO4 1.0%, Na2HPO4 0.1%，MgSO4`7H2O1.0mmol/L,FeC13 1.0mmol/L，CaCl2 1.0mmol/L，培养基初始pH5.0-6.0;培养温度30℃，接种量5.0%，装液量30mL/250mL，在上述条件下产酶水平可达到114.68U/mL。固态发酵基质中，确定桔皮粉与豆渣的最适比例为2:1;接种量20%，培养基初始pH为6.5，培养温度30℃。在上述条件下发酵，菌株在108h-168h处于产酶高峰期，最高酶活力可达到2163.74U/g干曲;同时确定从湿曲提取柚苷酶的最佳固液比与浸提时间分别为1:6和5.5h.
  • 摘要：超氧化物歧化酶(SOD)能特异性清除氧自由基,对保护细胞免受氧化损伤具有重要的作用.目前市场上大多数SOD产品主要来源于动物血液、内脏等,由于原材料有限、纯化困难等原因,导致SOD的纯度低、产量少;而天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表达量低、酶分子量大,与动物及人体内SOD的同源性低,使得其难以得到广泛的应用.rn 在前期研究中，课题组已经克隆得到了源于梅花鹿的Cu/Zn-SOD基因，构建了表达重组SOD的毕赤酵母工程菌GS115。本论文在此基础上，继续开展重组工程菌GS115的发酵工艺条件优化、重组SOD的分离纯化和酶学性质等方面的研究。具体实验结果如下:rn 1.对毕赤酵母工程菌的生长和产酶条件进行优化，优化后的工艺条件为:毕赤酵母种子培养采用YPD培养基(pH6.0),30℃,200r/min培养15h;发酵培养基为pH6.0的BMMY(含500μmol/L硫酸铜溶液和1000μmol/L硫酸锌溶液);诱导产酶条件为:接种量5%，初始甲醇添加量1%，每隔24h补充1%甲醇，200r/min,30℃培养96h时，重组SOD活力为1876U/mL，相较于优化前BMMY培养基发酵96h的酶活力(483.9U/mL)提高了3.88倍。rn 2.结合毕赤酵母发酵手册和发酵实验优化结果，确定毕赤酵母工程菌的5L发酵罐生产工艺为:BSM培养基，pH6.0，接种量5%，发酵温度35℃，转速900r/min，保持发酵过程溶氧(DO)于20%左右。发酵142h最高酶活力可以达到102789U/mL，相比优化前提高了4.5倍，相比摇瓶提高了54倍。rn 3.通过超滤、弱阴离子交换色谱(DEAE)、高效凝胶色谱(TSK gel G63000 SW)分离纯化，重组Cu/Zn-SOD的比活力为17647.1U/mg、回收率为36.84%.rn 4.对重组Cu/Zn-SOD的酶学性质研究表明，最适反应pH为8.0，最适反应温度为30℃;在pH5-9之间较为稳定，保温1h后仍能保留80%以上酶活力;60℃下保温1h酶活保持在90%以上，在70℃下保温20min残余酶活力仍有70%以上。重组Cu/Zn-SOD在中性条件下对蛋白酶耐受性较好，但易受到胃酸的酸解导致酶活力丧失。
  • 摘要：N-CWS即红色诺卡氏菌细胞壁骨架,是一种免疫调节剂,国内已获准生产该免疫调节剂作为抗肿瘤的药品.张祝兰等通过研究分析得出N-CWS是由三类主要的成分构成,即类脂、多糖、肽聚糖,通过国内外的文献检索表明肽聚糖PG具有激活免疫功能的作用.因此,本文对N-CWS中的肽聚糖单体N-CWS-PG进行分离鉴定,并进一步通过研究其动物抑瘤试验,探讨其对机体的免疫调节作用.rn 目的:初步探究N-CWS-PG经过酶解过后对小鼠机体的抑瘤作用.rn 内容:rn 1.N-CWS-PG制备:培养收集的红色诺卡氏菌菌体，通过超声波法破碎获得该菌细胞壁，经过酶解、有机溶剂提取，去除色素获得细胞壁骨架N-CWS，再经过去脂、酸解、离心、干燥，获得浅黄色的水不溶性肽聚糖N-CWS-PG。rn 2.N-CWS-PG纯度鉴定:(1)对实验得到的N-CWS-PG进行溶菌酶实验，发现在溶菌酶作用72h左右，N-CWS-PG大颗粒水解为乳白色悬液，初步验证为肽聚糖。(2)对该提取物进行氨基酸分析，其所含的氨基酸种类与肽聚糖基本一致。因而，证实本提取目标物为肽聚糖(N-CWS-PG)。(3)对所获得的肽聚糖单体进行蛋白质含量、总糖含量、氨基己糖含量、总脂含量的测定等纯度验证实验。rn 3.N-CWS-PG抑瘤实验:对实验获得的N-CWS-PG进行溶菌酶水解，然后分别进行体外血清学实验和小鼠皮下注射抑瘤实验。结果体外血清学证实N-CWS-PG具有抑制肿瘤细胞增殖的作用;小鼠抑瘤实验显示其有比较好的抑瘤效果。rn 结论:基于以上的实验结果表明，N-CWS-PG确实有一定的抑瘤效果。因此，可以通过分离获得N-CWS-PG有可能作为抗肿瘤的免疫制剂。
  • 摘要：本文主要介绍了工业微生物发酵技术国家工程研究中心多年来坚持走发展工业生化产业的产学研的之路，实践了项目带动学科，学科促进产业的过程，主要项目为灰黄霉素耐前体变株F-208的定向选育及其产业化、金霉素产生菌F-303的选育及其产业化、碱性脂肪酶产生菌F-1884的选育及其产业化、普鲁兰酶产生菌的分子育种及其产业化、辅酶Q10产生菌F-8606的选育及其产业化、产脂虫草的总类杂交育种及其产业化和高产酸氨基酸产生菌的分子育种，在工业生化产业化的实践过程中，科技创新是实现工业生化企业产品稳产高产的关键所在，也是提高在国内外市场竞争的主要对策之一，只要坚持和协发展，防止无序竞争，我国工业生化产业必定会带来更大的发展空间，为我国实行经济的发展作出应有的贡献。业生化产业涉及抗生素工业、生化药物工业、氨基酸工业、有机酸工业、酶制剂工业、核苷酸工业、食品工业以及环保工程等诸多领域,由于生物化学与分子生物学的科技进步和创新,使上述产业在技术水平和产品质量都取得巨大的提高,促进了实体经济的发展.当前,工业生化中小企业面临着产品转型、资金缺乏无序竞争等带来的诸多困境,严重地影响了工业生化产业的深度发展,根本的对策在于必须走和谐发展、科技创新之路.
  • 摘要：微生物介导的氨氧化过程在全球氮循环中起着至关重要的作用.该过程主要由氨氧化细菌(AOB)及氨氧化古菌(AOA)两类菌群主导.虽然此前很多研究报到了不同生境中中氨氧化微生物的群落组成及丰度情况,但是关于入海口环境中氨氧化微生物的群落结构与丰度对环境因子的响应变化研究鲜有报道.本研究以人类活动频繁,碳氮污染严重的黄河入海口为切入点,采集入海口附近沉积物样品,针对氨氧化微生物特有的氨单加氧酶(amoA)基因,利用荧光定量PCR (qPCR)及克隆文库的方法对样品中AOA及AOB的丰度群落及结构多样性进行检测.qPCR结果显示,黄河入海口环境中AOA丰度高于AOB,其中,AOA的amoA基因拷贝数范围从6.53±0.67×104to1.06±0.11×106copies g-1,AOB的的amoA基因拷贝数范围从1.61±0.28×104到6.07±0.18×105copies g-1.皮尔森相关性研究显示,AOA的amoA基因丰度与氨氮,总碳和总有机碳显著相关(p＜0.05),而AOB的amoA基因丰度只与氨氮显著相关(p＜0.05).系统发育研究显示,在AOA可以分为三个cluster,其中Nitrososphaera cluster最为优势,占到AOA全部序列的64.98％;与此同时,AOB可以分为五个cluster,其中Nitrosospira和Nitrosomonas是有优势类群,分别可以占到AOB全部序列数的66.40％与33.60％.α多样性分析显示,AOB较AOA而言有更高的多样性,推测可能与入海口地区沉积物pH值偏碱有关.结合环境因子的冗余分析(RDA)表明,AOA的群落结构类群与总碳显著相关(p＜0.05),而对AOB而言,总碳是对其群落结构有最大影响的环境因子.本研究有力的证实了氨氧化微生物在黄河入海口的存在,增加了对温带河口环境中氨氧化微生物分布及其影响因子的认识.
  • 摘要：E-钙黏蛋白是一种上皮细胞标志蛋白,在上皮细胞的链接作用非常重要,在上皮细胞向间质细胞转化过程的过程中其表达水平改变显著,但是翻译后修饰对于E-钙黏蛋白的调节是否也会影响到上皮细胞向间质细胞转化并不明确.翻译后修饰是一种很重要的调节方式,为了探索核心岩藻糖修饰的E钙黏蛋白的功能改变,以及所引发的细胞信号传导,用一对分别具有低、高转移潜能的肺癌细胞95C和95D转染FuT8基因,建立起一对核心岩藻糖基转移酶高低表达的细胞模型.结果表明，在95C中过表达核心岩藻糖基转移酶能使E钙黏蛋白核心岩藻糖基化，抑制该细胞的迁移能力，而在95D中，干扰了核心岩藻糖基转移酶使E钙黏蛋白核心岩藻糖基化水平低下，但能促进细胞迁移，同时，β连环蛋白654位酪氨酸以及SRC激酶416位酪氨酸磷酸化水平加强，在E钙黏蛋白免疫沉淀复合物中磷酸化的SRC激酶结合也增多，而β连环蛋白的结合增加，同时细胞中AKT第315、326位酪氨酸以及GSK-3β第9位丝氨酸磷酸化水平增多，但β连环蛋白第37位丝氨酸磷酸化水平降低，在过表达核心岩藻糖基转移酶的95C细胞中则相反。N-钙黏蛋白和Snail1蛋白水平在干扰核心岩藻糖基转移酶的95D细胞中升高，在过表达核心岩藻糖基转移酶的95C细胞中降低。SRC激酶抑制剂PP2和SU6656的作用后，由核心岩藻糖基转移酶所引起的上述调节作用受到抑制。另外，E-钙黏蛋白的核心岩藻糖基修饰也能影响半乳糖凝集素-3和GSK-3β的相互作用。我们的结果表明E-钙黏蛋白的核心岩藻糖基修饰能够通过调节β连环蛋白以及SRC/Akt/GSK-3β信号通路来调节细胞迁移。
  • 摘要：在酒精引起损伤的多种途径中,自由基的过量产生导致的氧化应激状态,被认为起到关键作用而受到格外关注.其中乙醇代谢过程产生的乙醛可作为黄嘌呤氧化酶的底物激活黄嘌呤氧化酶,使超氧阴离子自由基生成增加,引起脂质过氧化,细胞膜磷脂溶解,破坏膜的结构和通透性等一系列滞后性损伤,进而损坏细胞的结构和功能,甚至引起细胞死亡.本研究以清除细胞内自由基为途径，通过体外细胞培养，研究具有跨膜转导能力的PTD-SOD对酒精损伤肝细胞的保护能力。实验结果显示，在一定损伤条件下，保护时间为3h时，浓度为3000U/ml的PTD-SOD对酒精损伤肝细胞的保护率达到了42.5%，而野生型SOD的保护率仅为8.5%，延长保护时间对两者的保护效果均没有显著提高作用。本文结果表明，PTD-SOD对细胞的保护作用正是通过PTD及时地将SOD跨膜转导进入细胞，清除酒精代谢产生的自由基，降低自由基对细胞的滞后性损伤，保护率达到40%以上。野生型SOD由于缺少能够将蛋白导入细胞的PTD，不能及时进入细胞，但在损伤后期能通过部分受损细胞膜及线粒体通透孔进入线粒体，清除部分自由基，起到延缓损伤的作用，使检测出的细胞表现为暂时具有活力，但随着时间延长，细胞最终走向死亡，保护效果不明显，保护率不足10%。PTD-SOD保护酒精对肝细胞的损伤具有显著的效果，为后期应用开发奠定基础。
  • 摘要：采用包埋法的细胞固定化技术,以聚乙烯醇(PVA)与海藻酸钠互配作为载体对FS1026包埋进行固定化发酵,对其最佳的固定条件进行优化,得到的最佳固定化条件:PVA10.8g/L,海藻酸钠1.5g/L的固定化材料,2％CaCl2和50g/L硼酸混合的固定液,以12％菌体包埋量固定8h后,取得较理想固定化细胞效果.通过Plackett-Burman实验设计筛选培养条件中的6个成分,结果表明葡萄糖、蛋白胨和pH是对丙酸产量影响最大的3个显著因素.接着采用Box-Behnken设计对这3个因素进行组合优化,获得最适发酵培养基成分为:葡萄糖75.41g/L,酵母粉30g/L,蛋白胨16.31g/L,K2HPO424g/L,MgSO40.7g/L.以最佳的固定条件和发酵条件为基础,分别采用10％的氨水和Ca(OH)2调控此过程中的pH值,发现氨水的效果突出.且补糖对分批发酵的丙酸产量的提高具有积极作用,将发酵液中的葡萄糖补充到35g/L的补糖方式,可以使丙酸的产量达到42.76g/L.以每个96h更换新鲜的发酵培养基,考察此种批次发酵的稳定性,发现批次发酵10批次后丙酸产量依旧稳定.
  • 摘要：在TMP纸浆造纸工艺中,树脂障碍成为影响生产效率的关键因素.纸浆树脂中,胆固醇酯含量的高低直接影响并决定了树脂沉积量的大小.利用脂肪酶控制纸浆树脂障碍已取得较好的应用效果,并得到广泛推广.通过蛋白质工程手段,进一步提高脂肪酶的胆固醇酯酶活性,有助于增强脂肪酶控制树脂障碍的应用效果.脂肪酶活性中心上方的"盖子结构",对脂肪酶水解胆固醇酯的活性有着重要的影响.已有文献报道,仅有皱褶假丝酵母脂肪酶Lip2和Lip3,Ophiostoma piceae胆固醇酯酶(OPE)表现出较高的胆固醇酯酶活性.rn 本项目以伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)重组脂肪酶LipA为出发材料，利用重叠延伸PCR技术，分别将LipA的盖子结构域(134LSSSVIAAFVNVFGILT150)置换为:(1)OPE对应的盖子结构域(79ELLFQLVGNLINIPLF94)/(79ELLFQLV GNLINIPLFQTAT98) ;(2)皱褶假丝酵母脂肪酶Lip2对应的盖子结构(69FEDTLPKNARHLVLQS84);和(3)皱褶假丝酵母脂肪酶Lip3对应的盖子结构(75KTALDLVMQSKVFQAV90)/(72NLGKTALDLVMQSKVFQAVL91)等5个突变体(BCL-LOPE1,BCL-LOPE2,BCL-LLip2,BCL-LLip31和BCL-LLip32)。上述突变基因，经E.coli BL21(DE3)异源表达，纯化及酶活分析表明:突变体BCL-LOPE1,BCL-LOPE2及BCL-LLip2依然具有较好的脂肪酶水解酶活性，而BCL-LLip31和BCL-LLip32基本无脂肪酶活性。上述突变体的胆固醇酯酶活性还有待进一步深入研究。
  • 摘要：本文采用反相硅胶、正相硅胶和Sephadex LH-20凝胶等层析技术对羊肚菌的次级代谢产物进行研究.经1H、13C、DEPT、HSQC、HMBC、1H,1H-COSY核磁共振波谱和ESI-MS、HR-EI-MS质谱解析鉴定,从羊肚菌固体发酵产物分离到环(苯丙,甘)二肽.化合物环(苯丙,甘)二肽首次从食用菌中分离到,并具有多种生物活性,对羊肚菌的药用价值开发具有一定意义.
  • 摘要：本文采用反相硅胶、正相硅胶和Sephadex LH-20凝胶等层析技术对鸡枞菌的次级代谢产物进行研究.经1H、13C、DEPT、HSQC、HMBC、1H、1H-COSY核磁共振波谱和ESI-MS、HR-EI-MS质谱解析鉴定,从鸡枞菌液体发酵产物中分离到的两个化学物:对氨基苯甲酸和4-氨基-2-甲氧基苯甲酸.通过薄层层析-生物自显影法检测表明两个化合物都具有抗氧化活性.其中化合物4-氨基-2-甲氧基苯甲酸首次从鸡枞菌中分离到,对鸡枞菌的药用价值开发具有一定意义.
  • 摘要：土壤微生物是森林生态系统中重要的组成部分之一,在林地凋落物的分解及土壤物质代谢和能量循环过程中起着重要作用,是土壤中各种生化过程的重要调节者.土壤微生物类群的多样性和生物量可以直接影响土壤理化性质、土壤肥力和森林的生长发育.因此,常常把土壤微生物分布及活动作为森林生态环境综合评价指标.而太湖是我国第三大淡水湖,流域面积36895km2.太湖流域经济发达,人口稠密,是我国经济、社会发展和投资增长最快的地区.近年来,随着区域工业化和城市化的迅速推进,太湖水体及环太湖地区的生态环境受到了严重的污染.森林能够对流入河、湖泊、水库的水具有良好的净化作用,对于防止水资源污染,改善水质,消除污染,具有十分重要的意义.rn 本研究利用宏基因组技术检测环太湖地区林木根际微生物群落结构组成、多样性及优势细菌门，探讨林木根际微生物与林木的互利共生关系，从而更好的保护及修复环太湖地区的森林生态系统，为改善环太湖地区的生态环境提供借鉴。试验采用3点采样法，采集了环太湖地区代表性的大型乔木(桂花，银杏，桧柏，苦褚和紫薇)的根际土样，提取土样中细菌16srRNA基因，通过PCR扩增共获得104430条有效序列，通过与RDP数据库比对发现这些微生物分属31门，68纲，86目，211科，737属，其中序列丰度大于1%的门为:变形菌门(Proteobacteria)，酸杆菌门(Acidobacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，疵微菌门(Verrucomicrobia)，放线菌门(Actinobacteria),浮霉菌门(Planctomycetes),TM7菌门，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),硝化螺旋菌门((Nitrospira)和绿弯菌门(Chloroflexi)，而变形菌门，酸杆菌门，厚壁菌门，拟杆菌门和放线菌门五个门属于优势微生物，占总测序丰度的78.22～90.61%。研究发现植物的根际微生物与土壤的pH值和土壤中总磷含量存在明显的相关性，而与植物的种类相关性不明显，太湖周边乔木的根际土壤pH值为3.64～7.82，在酸性pH值((pH<7.0)环境下，酸杆菌门，芽单胞菌门，变形菌门和疵微菌门为优势菌，在中性和碱性pH值((pH≥7.0)环境下，拟杆菌门和变形菌门为优势菌。研究结果揭示，环太湖地区林地土壤根际细菌群落结构组成、多样性及优势细菌门的相对丰度受土壤pH和土壤总磷含量的双重影响，且土壤pH的作用强度大于土壤总磷。
  • 摘要：脑硫脂作为一种糖脂能在肝细胞中表达,但在肝癌细胞中的表达显著升高,高于癌旁的肝组织.然而,这种升高的脑硫脂在肝癌中的作用并不清楚,尤其与肝癌细胞迁移的关系还不清楚.为了探讨脑硫脂在肝癌细胞迁移过程中的作用及分子机制,我们收钱观察了脑硫脂对肝癌细胞迁移的影响,结果显示,脑硫脂不仅能够促进肝癌细胞的迁移,而且促进了肝癌细胞骨架的重排.为了研究其中的分子机制，我们检测了整合素多个亚基（β1，β3，β5，β6，β8，αV）的mRNA水平和蛋白质表达水平，发现脑硫脂能促进肝癌细胞中整合素αV的表达，并且能够引起整合素αV在细胞膜的聚集现象。为了进一步研究此现象涉及到的信号通路，我们检测了整合素相关的信号分子，结果发现，脑硫脂作用后，整合素β3,FAK,Src磷酸化水平升高。为了确定信号通路的传递机制，我们使用RGD肤段、Src抑制剂、FAK抑制剂，结果发现脑硫脂首先激活整合素β3，然后激活FAK-Y397，然后活化Src-Y416，最后进一步激活FAK-407、FAK-861、FAK-925等。为了探讨脑硫脂是如何促进肝癌细胞迁移和激活FAK-Src信号通路的，用基于免疫荧光共定位的方法和具有荧光活性的BODIPY标记的脑硫脂检测脑硫脂和整合素亚基是否存在直接的相互作用，结果发现，脑硫脂可以和整合素αV亚基而不是β3亚基在体外直接相互作用，并且存在共定位现象。最后，为了确定脑硫脂是通过哪个分子磷酸化激活整合素β3亚基，将IGF1R和IGF2R干扰之后发现，脑硫脂就不能诱导整合素β3的磷酸化，后者的磷酸化水平下降，说明可能是IGFR分子激活了整合素β3。综上所述，脑硫脂通过和整合素αV相互作用，促进整合素αVβ3聚集，并且通过IGFR激活整合素β3，然后激活FAK-Src信号通路。最终，促进整合素αV的表达和肝癌细胞迁移。
  • 摘要：竹黄菌主要寄生于箭竹属和短穗竹属竹子植物.可用于治疗虚寒胃病、风湿性关节炎、气管炎、百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤及贫血头痛等病症.竹黄菌素主要从天然竹黄中提取,与金丝桃素结构相似,许多学者对其比较研究表明,两者具有类似的作用机理,均是通过光照激活产生活性氧从而达到治的目的,在医领域具有抗肿瘤的功能和抗HIV、HSV等病毒的功能.因在竹黄菌Shiraia sp.SUPERH-168中缺乏有效的表达系统,使得该菌仍停留在发酵优化、纯化及其医药应用领域,然而其合成竹红菌素的代谢机理研究甚少.另一方面,随着高通量技术的快速发展,竹黄菌全基因组序列已测序,合成竹红菌素代谢基因簇也相应的被注释.因此,目前有必要在竹黄菌中建立有效表达系统,为解析竹红菌素代谢途径奠定分子基础.rn 本研究运用聚乙二醇/CaCl2转化技术，在竹黄菌SUPERH-168建立了含潮霉素与绿色荧光蛋白筛选标记的慢病毒表达系统。该过程主要包括原生质体制备、聚乙二醇/CaC12转化及阳性克隆子筛选。从酶种类、酶量、酶解温度、和渗透压稳渗剂及浓度等5个方面优化原生质体制备条件。结果表明:“81.25U/ml破壁酶+5mg/mL崩溃酶+5mg/mL葡聚糖酶”酶组合，抱子菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度30℃,酶液pH5.8、以0.6mol/L MgS04·7H2O为渗透压稳定剂制备原生质体最好，原生质体产率为5×106/g。表达质粒经聚乙二醇/CaCl2转化后，在含500μg/mL潮霉素PDA，挑选克隆子，荧光显微镜下，观测到较强的绿色荧光型号，野生菌SUPER-H168无此信号。
  • 摘要：糖苷酶亦称糖苷水解酶(EC3.2.1.-),是作用于各种糖苷或寡糖苷键水解的酶类的总称.α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)为淀粉水解酶类中的一种,他可以从多糖的非还原末端水解底物的α-1,4-糖苷键产生游离的葡萄糖,并且广泛存在于微生物,植物和动物之中.本实验将竹黄菌Shiraia sp. SUPER-H168固态发酵所得的固态基质进行粉碎，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液在4℃下浸提12h，经过滤和离心后将上清液进行冷乙醇沉淀蛋白，复溶后经由阴离子交换层析和凝胶过滤层析得到电泳纯的α-糖苷酶。纯化倍数为12.90,酶活力回收率为34.19%，比活力为1598.66 Umg-1.rn 对α-糖苷酶的酶学性质进行研究:以α-pNPG为底物时，最适反应温度为60℃,最适pH4.5，与对照组相比，10mM的SDS,Fe2+,Cu2+和Ag+分别抑制到0.71%,7.58%,26.00%和6.23%,Fe3+和Mg2+分别增加酶活至116.98%和142.27%,α-糖苷酶的Km,Vmax和kcat/km分别为0.52mM,3.76Umg-1，和1.3x104Ls-1mol-1.rn 胰蛋白酶作用后进行质谱分析，得到GSPYESASHGVYYR和WASVAEASR两条肤段，由此设计简并引物，利用PCR, RT-PCR以及RACE技术克隆得到α-糖苷酶的DNA和cDNA序列，并对序列进行分析。基因序列中有长度为2997bp的阅读框，编码998个氨基酸，其中有一条22个氨基酸组成的信号肤，序列中含有一个长度为48bp的内含子:预测蛋白分子量为108.2kD，等电点大约为5.08;氨基酸序列与其它真菌α-糖苷酶相似度不高，与Bipolaris maydis C5的相似度最高为76%;氨基酸序列中有9个潜在的糖基化位点( Asn-Xaa-Ser/Thr)和14个活性位点，其中包含两个催化位点;进化树分析说明竹黄菌α-糖营酶属于子囊菌α-糖苷酶。
  • 摘要：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的催化作用下形成的一种非蛋白质氨基酸,它广泛存在于动植物和微生物细胞中.GABA作为一种抑制性神经递质具有多种生理功能,能够降低血氨,抗抑郁,治疗糖尿病,促进酒精代谢和消臭,以及促进生殖等,在食品、医药及养殖行业中应用广泛.目前获得GABA的途径主要有三种:生物提取法、化学合成法、微生物发酵法，而微生物发酵法因其相对环保、耗能低、产量高等优势逐渐获得了人们的青睐。本文通过将不同来源的gadB分别克隆到大肠杆菌中，构建了四株产GABA的大肠杆菌工程菌:E.cgadB-PYB1s/BW25113、LbgadB-PYB1s/BW25113、LigadB-PYB1s/B W25113LpgadB-PYB1s/BW25113。并对这四株菌转化谷氨酸产GABA效率进行了对比，最终选择了LigadB-PYB1s/B W25113。后期以这株菌为出发菌株，对其培养条件及全细胞催化条件进行了优化，GABA最终产量能够达到300g/L以上。在50L发酵罐上进行放大实验，并以10g/L的湿菌体进行全细胞催化实验，效果显著。6-7小时之内可以把2M的底物转化完全，且菌体能够重复利用。
  • 摘要：Kigamicins是从防线菌中分离到的具有抗细菌和抗肿瘤活性的天然产物.其独特的生物学活性表现为能够抑制营养饥饿状态的肿瘤细胞,而对正常营养生长状态的细胞没有影响.因此,Kigamicins可以做为开发特异性抗癌药物的重要来源.本论文通过对Kigamicins的生物合成途径的研究,而研究过程中着重阐明kigamicin合成过程中新物质的化学结构.从而为进一步了解Kigamicins这类聚酮化合物的结构与功能关系提供依据.本论文采用PCR-Targeting技术在构建好的含有kigamicin生物合成基因簇完整骨架的整合型质粒的pLL59上敲除基因orf60并命名为pLL200，然后通过结合转移将质粒pLL200以及质粒pLL68(含有激活因子)转入天蓝色链霉菌ML154，得到突变菌株ML20068。用HPLC-MS对ML20068发酵产物进行检测，发现了荷质比为538的次级代谢产物。随后50L液体发酵、大孔树脂的吸附与解吸、反相硅胶柱分离、HPLC制备纯化出538新组分12.6mg。然后把纯化得到的新组分做核磁共振对其结构进行解析用来试阐述orf60的基因功能。
  • 摘要：宽宿主质粒pBBR1MCS-2是应用性很广的载体,该质粒含有2个重要的元件:rep基因和mob基因.其中rep基因编码REP蛋白,参与质粒的复制;mob基因编码移动基因,参与质粒的接合和转移.质粒pBBR1MCS-2同样含有一个卡那霉素(kan)抗性筛选标记,同时它的大小仅有5145bp.这些特性使该质粒适用于DNA克隆、蛋白表达,广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作.虽然pBBR1MCS-2已经实现商业化,但目前却未见温度敏感的改造和应用的报道.开发温度敏感型质粒载体可以扩大pBBR1MCS-2质粒的应用范围.温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在.当温度比较低时,质粒可以存在宿主中,表达想要的性状,而当温度提高后,温度敏感型质粒载体将因无法复制而丢失或整合到染色体上.本研究利用易错PCR将pBBR1MCS-2质粒上的rep基因及其启动子、终止子进行了随机突变,再通过温度变化筛选获得1个突变的质粒载体.该在大肠杆菌Escherichia coli T1、DH5α、BW25113、S17-1以及类球红细菌Rhodobacter sphaeroides中表现出温度敏感性状.对测序表明,rep基因的-43位置发生了一个T-A的突变,73和436位置各发生了一个A-G突变,导致REP蛋白发生了K24G、I145V的突变.进一步的单点突变实验表明,是K24G的突变,使得该质粒变成温度敏感型质粒.在pYB1s质粒中分别表达突变前后的REP蛋白,圆二色谱表明突变蛋白二级结构发生了明显的变化,其Tm值降低了4.9℃.
  • 摘要：棉花是我国重要的经济作物,培育优质、高产和抗病的新品种是棉花遗传性状改良的重要目标之一.棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的土传性维管束病害,已成为当前严重影响我国棉花高产稳产的重要真菌性病害,被称为棉花的"癌症".目前国内外在黄萎病防治以及抗病育种方面尚未取得显著进展,深入理解植物抗黄萎病的机制,对生产上持久有效防控棉花黄萎病的发生具有重要意义.本实验以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉22)为实验材料，对侵菌和未侵菌的棉花叶片进行转录组测序分析，结果表明黄萎病菌侵染后有5062个基因发生变化，2091个基因上调，2971个基因下调。这些蛋白主要包括防卫应答相关蛋白，初级与次级代谢相关蛋白，脂质运输与细胞骨架相关蛋白等。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是植物中重要的信号转导通路组分，参与植物多种防卫反应。通过对差异表达2倍以上的蛋白分析，黄萎病菌显著诱导多个MAPK家族基因的表达，三个MAPK基因(MAPK3,MAPK6,MAPK7 )的表达明显上调，其中GhMAPK7表达量的变化最为显著。近年来MAPK级联信号转导途径在植物抗病调控中的功能研究倍受关注。本文从陆地棉中分离了GhMAPK7基因的基因组序列，对GhMAPK7的启动子序列分析，发现许多与生物胁迫相关的应答元件。qRT-PCR分析表明该基因表达受大丽轮枝菌、水杨酸(SA)、乙烯(ACC)和茉莉酸(JA)诱导，同时超表达GhMAPK7的转基因本生烟植株对病原真菌具有抗性。为了进一步研究GhMAPK7参与调控黄萎病胁迫的机理，分别获得GhMAPK7超表达和沉默的转基因棉花，GhMAPK7沉默的转基因棉花降低了对黄萎病菌的抗性。然后以棉花为材料，采用酵母双杂交技术，分离了49个与GhMAPK7互作的上游级联组分和下游底物蛋白，初步建立GhMAPK7参与调控植物抗病的信号转导途径。这些研究结果为了解GhMAPK7的功能及其在棉花黄萎病抗性分子育种中的应用提供了实验依据和思路.
  • 摘要：漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,作用底物广泛,能够催化酚类、羧酸、生物色素、芳胺类、甾体类激素、金属有机化合物等.其在环境保护、造纸工业、食品加工以及生物传感器等领域具有广阔的应用前景.rn 本文从菌株Cerrena unicolor Y-1出发,通过原生质体诱变选育出漆酶高产菌株Y-G07,再对Y-G07发酵产酶条件、5L发酵罐试验、漆酶的酶学性质以及在工业染料脱色中的应用等方面进行了研究,研究结果如下:rn 1、通过原生质体氯化锂-紫外诱变,筛选得到一株产漆酶能力高、遗传稳定的突变菌株Y-G07.发酵第6d漆酶活力达166.68U/mL，提高了38.22%。对该菌株漆酶的酶学性质研究结果表明:最适反应pH为3.0，最适反应温度为30℃，在40℃以下和pH4.0-10.0范围内较稳定。Cu2+、Zn2+对酶活有促进作用，而Fe2+,Cl-则具有较强的抑制作用。rn 2、对菌株Y-G07产酶培养基和发酵条件进行优化。确定培养基中微量元素为CuS04·5H2O 62.5 mg/L，ZnS04·7Hz0 18mg/L，并添加VB1 15mg/L，培养基pH自然。确定最佳发酵条件为:温度25℃，转速180r/min，接种量8%(v/v)。优化后酶活可达381.84U/mL，比优化前提高1.29倍。rn 3、对5L发酵罐工艺条件进行初步探索。结果表明，pH控制对产酶影响不显著;溶氧控制在40-50，酶活达436U/mL，相比溶氧控制在20-30时提高了12%;通过补料，最高酶活力达448U/mL，且产酶峰值出现时间缩短了12h。rn 4、对四种常见工业染料靛蓝、金橙Ⅱ、活性艳蓝KN-R、结品紫的脱色条件(介体、温度、pH、酶浓度、介体浓度)进行研究。结果表明，经优化后，50mg/L靛蓝在漆酶/不加介体和漆酶/乙酞丁香酮系统中，脱色率均可达97%; 25mg/L金橙Ⅱ在漆酶/不加介体和漆酶/乙酞丁香酮系统条件下，脱色率分别可达89%和94%;100mg/L活性艳蓝KN-R在漆酶不加介体条件下，脱色率达93%;10mg/L结晶紫在漆酶/丁香醛系统中，脱色率达83%。
  • 摘要：漆酶是多酮氧化酶家族的成员之一,它含有四个典型铜离子,Ⅰ型铜用于将多酚类底物还原的电子传递给Ⅱ和Ⅲ型铜组成的三铜核心簇,氧气进入漆酶后在三铜核心簇与传递而来的质子和电子反应形成水,整个过程不含其他副反应,因而是环境友好型多酚氧化酶.同时,因为漆酶底物特异性较低,小分子介体可进一步拓宽漆酶作用的底物范围,使得漆酶受到工业应用领域,特别是染料脱色应用的青睐.rn 本文从实验室前期筛选菌株Cerrena sp. HYB07出发，克隆得到多条漆酶基因(包括启动子)及cDNA序列，并进行了生物信息学分析;3条漆酶基因在毕赤酵母中进行异源表达，并对高效表达策略进行初步探讨;对表达的重组漆酶进行酶学性质表征和脱色应用研究，具体研究结果如下:rn 1、通过简并PCR，TAIL-PCR和Site-Finding PCR共克隆出6条新的漆酶同工酶基因，与己知的4条漆酶基因共同构成HYB07漆酶同工酶家族，都具有担子菌漆酶的典型结构特征，上游启动子序列包含了多个顺式作用元件，根据内含子特点、氨基酸组成比例、序列比对、保守性和进化分析，预测Lac3, Lac6和Lac8将具有特殊的生理生化特性。rn 2、共构建了7个pPICZa-Lac载体，将其中的pPICZa-Lac3,Lac6和Lac8转入毕赤酵母X33中进行异源表达和筛选，并通过培养基优化、密码子优化、信号肽选择等高效表达策略的探索，使rLac6在28℃发酵16d达到最高表达量6.33U·mL-1，并将其进行分离纯化和反应动力学测定。rn 3、通过比较HYB07漆酶和重组漆酶的酶学性质可以发现，HYB07家族的漆酶最适pH为3.0-3.5，最适温度为30-55℃，当pH≧4和≦50℃时稳定，对7种常见的水互溶性有机溶剂具有较强的耐受性，Cu2+, Al3+和Mn2+对部分漆酶有促进作用，对EDTA、曲酸和Triton X-100有较强的耐受能力，纯化后的漆酶对多种有机溶剂、金属离子和抑制剂耐受能力得到提高。rn 4、HYB07漆酶发酵液对两种来源的工业废水脱色率达80.3%和58.8%，并可对偶氮类、三苯甲烷类、蕙醒类、靛类等19种染料具有良好的脱色效果，因而具有广泛的工业应用前景。
  • 摘要：琼胶酶是一类能够降解琼胶,生成琼胶寡糖的糖苷水解酶.它降解琼胶产生的琼胶寡糖,具有多种生理活性,在食品、药物、化妆品等领域具有广泛的应用前景.rn 本课题从实验室保藏的海洋来源菌株中筛选到产琼胶酶菌株BY、BN,并结合形态学鉴定和16S rRNA分析,确定菌株BY为弧菌(Vibrio sp.),菌株BN为产微球茎菌(Microbulbifer sp.).菌株BY、BN产琼胶酶活性分析表明:菌株BY的产酶最适温度和pH分别为50℃和6.0;菌株BN产琼胶酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0.rn 利用Touch down PCR与染色体步移技术相结合的方法，从菌株BY的基因组中克隆得到新的琼胶酶基因Vibrio sp.BY，该基因全长2232bp，编码744个氨基酸，理论分子量为85.4kD，构建重组表达载体pET22a-Vibrio sp.BY，并成功在E.coli BL21(DE3)诱导表达，DNS法测得重组琼胶酶活力为71.73 U/mL。酶学性质研究表明该重组琼胶酶最适反应温度和pH分别为50℃和7.0，在温度30-50℃及pH5.0-7.0条件下较稳定。Na+、K+、Mg2+、Ca2+等金属离子对重组琼胶酶具有促进作用，Zn2+、Fe2+、Mn2+、SDS、EDTA等对重组琼胶酶具有抑制作用。rn PCR扩增获得菌株BN的琼胶酶基因N3，该基因全长924bp，编码308个氨基酸，理论分子量为34.3 kD。构建重组表达载体pET28a-N3，并在E.coli BL21(DE3)中实现了异源表达，DNS法测得重组琼胶酶活力为228.3U/mL，是原始菌株BN琼胶酶活力的3.04倍。对重组琼胶酶的诱导条件进行优化，优化后的诱导条件为:超声波破碎时间15min、诱导时间16h、诱导温度30℃,IPTG终浓度1mM，是优化前的1.35倍。通过镍离子亲和层析，对重组琼胶酶进行分离纯化，得到电泳纯的重组蛋白，比酶活为700.59 U/mg。该重组琼胶酶的酶学性质研究表明，最适温度及最适pH分别为50℃,pH6.0，具有较好的热稳定性和pH稳定性。Na+,K+,Mg2+金属离子对重组琼胶酶具有促进作用，Ca2+，Zn2+,Fe2+,Mn2+,SDS,EDTA等对重组琼胶酶具有抑制作用。动力学方程研究表明，重组酶的Vm值为10.82umoL/min/mL，Km值为13.41mg/mL。该重组琼胶酶的降解产物以二糖和四糖为主。
  • 摘要：纳米银是指粒径为1-100nm的金属银单质,因其表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应,在光、电、热和磁等方面表现出特殊优异性质,在超导、化工、光学、生物、医药、环保和能源等诸多领域有广阔的应用前景,特别是用作抗菌剂和治疗剂,具有广谱抗菌、强效抗菌、抗菌持久、安全无毒、无耐药性、无交叉药物干扰等特点,在无机抗菌剂中占主导地位.rn 本文利用Acinetobacter sp.YQ-11生物法胞外合成纳米银，对Acinetobacter sp.YQ-11培养基进行优化，并对银纳米粒子的形成机理进行探讨。生物法胞外合成方法是将发酵上清液与1mmol/L硝酸银按1:2的体积比孵化22h。通过单因子试验来筛选最优碳源、氮源，当以0.08mol/L墟拍酸钠为碳源、以0.03mol/L尿素氮源时，纳米银产量达到1.625 (OD450)提高了2.78倍。优化后培养基的发酵上清液中硝酸还原酶酶活力为5.311U，是初始培养基(2.057U)的2.58倍，可见发酵液中的硝酸还原酶在银离子的还原反应中起重要作用。对浓缩的发酵液进行SDS-PAGE电泳，优化培养基发酵上清液中存在一个相对分子质量约为23kD的蛋白质。同时，对纳米银溶胶直接SDS-PAGE电泳，呈现多条较为清晰的蛋白质条带，表明蛋白质通过吸附到银纳米粒子表面赋予纳米银稳定性。抑菌实验结果显示所制备的纳米银对大肠杆菌和枯草芽抱杆菌都具有很强的抑菌效果。
  • 摘要：阿维菌素是由阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)产生的一类16元环大环内酯类抗生素.最初由日本学者大村智和美国默克公司研究组在日本静冈土壤中发现并分离,经鉴定发现其为一个新种,并且其发酵液对动物寄生虫及多种农业害虫有极强的杀灭效果.它由8个组分(Ala、A2a、Bla、B2a、A1b、A2b、B1b和B2b)组成,其中尤以B1a的驱虫活性最强.rn 本文先对出发菌株A3进行复壮，得到编号为A19的菌株，其Bla的产量为3050ug/ml。然后用二乙烯亚胺对A19进行诱变处理，并结合链霉素抗性筛选，获得到Bla突变株A453其阿维菌素Bla的产量为4190ug/ml，较A19提高37.3%。再对A453菌株原生质体二乙烯亚胺诱变，再生菌株中筛选到Bla突变株A1102，其Bla产量为4509ug/ml，较A453提高7.6% o.选取原生质体诱变筛选所得到的优良菌株A1102,A1116,A1124,A1142,A1119和A1022作为基因组改组亲本，分别用紫外照射5min，0.3%乙烯亚胺作用15分钟，50℃热灭活5min等方法灭活，将不同方法灭活的6种亲本原生质体等比例混合，40%的PEG6000静置处理15min，诱导多亲本间原生质体融合和基因组改组，将融合子涂布含阿维菌素Bla的平板上，筛选抗反馈抑制的菌株。rn 利用基因工程的方法，将高产菌株的基因组DNA上的阿维菌素合成基因簇进行了改造。将该基因簇中的aveD基因通过同源重组进行敲除，导致产物中的A组分消失，筛选突变菌株结果得到的aveD敲除菌株较出发菌株提高约10%。同时由于阿维菌素的聚酮合成酶aveA1基因中第二个module的DH为部分活性，即部分催化碳23位上的羟基脱水反应。而下游的合成酶各个domain不能区分此位置上的脱水发生与否，就直接进行下游反应，因此，在产物中组分1和组分2相当。通过基因同源重组的方法，将已经证实的具有完整功能的红霉素DH替换原始的DH结构，实现DH的完全脱水功能，从而减少或完全消除羟基组分。
  • 摘要：蛹虫草又称北冬虫夏草,是重要的药食用真菌,已有研究表明其主要活性成分具有与野生冬虫夏草极同的药理作用,甚至某些活性成分含量还高于冬虫夏草,可作为冬虫夏草的代替品.自蛹虫草的无性型分离以来,人们对蛹虫草无性型的液体发酵条件、菌丝体有效成分、活性物质的分离纯化及部分生理功能等进行了广泛的研究,蛹虫草无性型菌丝体含有与有性型子实体相似的生理活性物质及药用价值,可利用发酵生产蛹虫草无性型菌丝体来进行相关产品的开发.然而由于蛹虫草分布比较广泛,不同产地、不同寄主的蛹虫草的生长条件、活性成分种类以及相对含量等也有不同,其无性型—蛹草拟青霉的液体发酵条件、活性物质种类及含量也存在较大差别.在野生虫草资源日益匮乏的情况下,研究开发人工虫草,选育优良虫草菌株,探讨液体发酵条件、研究菌丝体活性成分、含量及生理功能对进一步利用和开发虫草资源具有重要的理论意义和深远的现实意义.rn 本研究以提高蛹虫草无性型深层发酵的菌丝体中腺苷含量为目标，以分离自长白山的一株蛹草拟青霉为出发菌株，在优化原生质体的形成和再生条件的基础上，以原生质体诱变的方法选育高产腺苷的蛹草拟青霉菌株。rn 以培养5d菌龄的菌丝体为基体，用1.0%纤维素酶和1.0%蜗牛酶作为复合酶，选择0.6mo1/L蔗糖为最佳的渗透压稳定剂，最佳酶解pH为6.3-6.5温度23℃，40rpm条件下，酶解3.5h，原生质体的制备率可达1.5x108个/ml，再生率为1.3%。制备的原生质体经紫外线诱变、微孔板初筛及摇瓶复筛，获得了一株的高产腺苷蛹草拟青霉菌株FY1421，经单因素及多因素的培养基及培养条件的综合优化，30L发酵罐中，其生物量(菌体干重)较出发菌株提高了26.5%,菌丝体中腺苷含量5480ug/g干重，较出发菌株提高9.36%，达到选育目标，也为进一步开发利用蛹虫草资源奠定了基础。
  • 摘要：从药用真菌中鉴定出安全、有效的成分来预防和治疗癌症受到了越来越多的关注.灵芝作为一种药用真菌,单用或联合其他药物(草药或化学合成药)时,都表现出令人满意的效果.灵芝多糖(尤其是β-D-葡聚糖和糖蛋白)和三萜类物质是灵芝发挥化学保护和抗癌活性的主要成分,这已经被动物模型(大鼠和小鼠)实验证实.但是,随机、安慰剂对照的多中心临床研究却罕见报导.在我们进行的一个随机、安慰剂对照的多中心临床研究中,143名研究对象接受为期12周甘诺宝力(一种灵芝多糖提取物)治疗,方案为每天三次,每次口服1800mg.其中有38名患者病情稳定12周以上(12-50周).许多病人肿瘤相关症状,如出汗和失眠得到不同程度改善.甘诺宝力耐受性较好,在给药过程中,总共只观察到了5个轻度不良反应事件.这些初步结果表明灵芝是一种很有希望的防癌抗癌药物.但还需要进一步的研究以确定最佳使用剂量以及其安全性和有效性.
  • 摘要：稻瘟病菌能够侵染以水稻为主的重要农作物,同时也是研究丝状真菌的重要模式生物.Rab GTPase是Ras超家族的成员之一,它作为分子开关在囊泡的形成、运输、融合等过程中发挥着至关重要的作用.酿酒酵母有三类Rab5家族蛋白,分别为Ypt51,Ypt52,Ypt53,它们参与早期内吞途径.在稻瘟病菌中,MoRab5A和MoRab5B是酿酒酵母中Ypt51和Ypt52的两个同源蛋白.我们的前期研究表明MoRabSA和MoRabSB是稻瘟病菌的生长发育及致病性所必须的，并与稻瘟病病的胞吞作用相关。为初步筛选其下游效应蛋白，本研究对MoRab5组成型激活的菌株MoRab5A-CA, MoRab5B-CA进行了转绿组测序(RNA-seq),结果表明只在MoRab5A-CA状态下上调表达的基因有1351个，而只在MoRab5B-CA状态下上调表达有317个，对其中的一些基因进行了荧光定量PCR验证，其结果与RNA-seq中的上调是相一致的，对其中已在稻瘟病菌数据库注释的基因利用GO(gene ontology)分类进行分析，发现大部分基因与细胞的发育，新陈代谢，细胞内组分运输等过程相关。进一步将结合其他生物信息学分析和同源比对，筛选假定效应蛋白，并利用基因敲除、酵母双杂交及Pull down等方法研究这些基因的功能及验证他们与MoRab5A和MoRab5B的互作关系，从而寻找出调控MoRab5蛋白通路中下游效应因子，为深入了解该病菌的致病机制提供依据。
  • 摘要：草药已经重新引起了西方国家的关注,而且传统药物疗法和现代药物疗法的结合也开始普及.因此,草药药物相互作用的药效和药代动力学研究就变得很有潜力.例如,细胞色素P450系统(CYP)就特别容易受到草药的多种活性成分调节的影响.众所周知,外源物质容易诱导或抑制CYP系统.体外、体内实验和计算机模拟研究发现，许多草药和草药中分离出的天然化合物是CYP的底物、诱导剂或抑制剂。例如，贯叶连翘是CYP3A4的有效诱导剂，通过启动单孕烷X的受体来调节的。贯叶连翘的一些成分能够抑制CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A4。其他许多常见草药对CYP系统也表现出诱导和抑制作用，后者又分为竞争性、非竞争性和结构依赖性。草药对CYP系统的调节很复杂，取决于草药的类型、服用剂量、途径、靶器官及其种类。由于草药活性成分比较难确定，因此也较难预测草药-药物相互作用。但是，草药-药物的相互作用具有重要的临床和毒理学意义。例如，虽然贯叶连翘对CYP3A4的诱导作用可能是一些药物(如CYP3A4底物环孢素和茚地那韦)血浆清除加快的部分原因，但是其他作用机制也不能排除，如胃吸收和药物转化的调节。相比而言，一些有机硫化物，如从大蒜中提取的二丙烯二硫化物(DAS)可有效抑制CYP2E1，而后者可启动许多诱变剂，这就为大蒜具有化学预防作用提供了解释。虽然草药-CYP相互作用已经有部分了解，但还需进一步研究以确定其临床和毒理学作用。随着越来越多的人使用草药制剂，而这些制剂可能含有调节CYP的成份，因此有待于采用高通量筛选技术以研究草药-CYP之间相互作用。
  • 摘要：2015年,全世界发表的芽胞杆菌新种有33种,其中中国科学家发表的有11种,占30％.中国有8个机构发表了芽胞杆菌新种,他们是华中农业大学(1种),上海海洋大学(1种),湖南农业大学(1种),福建省农业科学院(4种),台湾中兴大学(1种)北京生命科学院(1种),浙江大学(1种),中国海洋大学(1种).本年度发表芽胞杆菌最多的单位是福建省农业科学院.
  • 摘要：应用DPPH自由基清除法、羟自由基清除法、超氧阴离子清除法、ABTS+·清除法等四个抗氧化指标对不结球白菜的5个不同极性部位石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部的抗氧化能力进行评价,同时考察了总酚和总黄酮的含量与抗氧化能力的关系,并对活性最强部位进行了脂质抗氧化研究.结果表明,除水部外,不结球白菜其它4个极性部位均表现出一定的抗氧化能力.总酚和总黄酮的含量与各部位的抗氧化能力具有显著相关性.乙酸乙酯部清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子、ABTS+的EC50值分别为(0.64±0.05)、(1.17±0.12)、(1.02土0.15)、(0.78±0.07)mg/mL;乙酸乙酯部的抗氧化能力最高,其总酚的含量为(151.32±1.87)mg没食子酸当量/gDW,总黄酮含量为(32.97±0.56)mg rutim/g DW;10mg/mL的乙酸乙酯部对H2O2诱导红细胞氧化的抑制率达到62.11％,对H2O2诱导小鼠肝脏脂质过氧化的抑制率为51.26％.实验结果表明,不结球白菜乙酸乙酯部具有较强的抗氧化活性,是天然抗氧化活性物质的良好来源,这可望为不结球白菜的进一步开发利用提供科学的理论依据,为深入挖掘不结球白菜资源在食品及医学等领域的应用提供参考.
  • 摘要：黄绿青霉素(Citreoviridin,CIT)是一种具有毒性的小分子真菌毒素,由黄绿青霉菌(Penicillum Citreoviridin,PCV)在低温高湿度等的恶劣环境中分泌产生的,其广泛存在于谷类农作物和农副产品中.CIT毒素具有神经毒性作用,可抑制中枢神经系统,严重的甚至会引起死亡.很多研究表明CIT是引起心脏性脚气病主要病因。到目前为止，中国和其他国家的相关监管机构并未建立CIT在食品中的安全限制范围，同时基于液相色谱等常规检测方法通常是耗时的、昂贵的，并不适合检测大量的样品。因此，建立一个快速、简便和灵敏的基于免疫学方法检测CIT毒素是势在必行的。本研究主要利用基因工程手段，通过错易PCR构建了一个库容量为2.0X108cfu/ml抗CIT的突变体单链抗体库，并结合噬菌体淘选技术最终获得了一株高亲和力scFv抗体。将抗体基因克隆到含有可溶性标签麦芽糖结合蛋白的pBD-mbp-his-linker载体上，从而获得了可溶的高亲和力抗体。通过将纳米金标记在scFv抗体上，并建立基于单链抗体黄绿青霉素胶体金检测平台，为实现体外黄绿青霉素高灵敏度，高特异性胶体金检测奠定坚实的基础。
  • 摘要：平足蛋白(Podoplanin,PDPN)首次被发现在患有嘌呤霉素所诱导的肾病鼠模型的肾小球足突细胞表面上,是一种跨膜O-链接的糖蛋白,由162个氨基酸组成,大小为38kD.平足蛋白特异性表达于淋巴管内皮,不表达于血管内皮,特异性较好,可作为肿瘤诊断和判断预后的淋巴管化学标记物.而PDPN的生理功能目前还不是很清楚。但有研究表明，PDPN在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中发挥了重要作用，且与肿瘤预后密切相关。因此，制备高亲和力和高特异性的抗平足蛋白的单克隆抗体有助于区分淋巴管和血管，有助于对肿瘤的恶性程度、侵袭能力和预后进行判断，为临床病情评估及进一步治疗提供指导。rn 本研究通过合成PDPN的胞外功能区优化后的DNA片段，而后克隆到原核表达载体PET-28a(+)和PGEX-6P-1上，转到Transetta（DE3)菌株，经IPTG诱导表达、纯化得到可溶性的蛋白PDPN-GST和PDPN-HIS，并用ELISA和WB鉴定。PDPN-GST和PDPN-HIS分别作为免疫原和检测原。将多次免疫的抗血清效价达到融合要求的Balb/c小鼠的脾细胞与状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。通过多次亚克隆筛选得到阳性杂交瘤细胞株。而后进行腹水诱生抗体，纯化并鉴定抗体。该研究为建立基于免疫学检测PDPN方法和开发生产高质量的肿瘤标记物检测试剂盒奠定坚实的基础。
  • 摘要：甘露聚糖酶是一类能够水解β-1,4-甘露糖苷键的内切半纤维素水解酶类,其在饲料、石油、洗涤行业中已经得到了实际应用,并在造纸、食品、纺织等领域具有巨大的应用潜力.本文对产甘露聚糖酶的海洋微生物进行筛选、鉴定、诱变育种、产酶条件和酶学性质的研究,具体研究结果如下:rn 1.以从台湾海峡采集的海水、海泥等样品为实验材料,采用4种分离培养基,分离得到细菌127株,霉菌5株,放线菌3株;采用点种、平板透明圈法从中筛选到16株产甘露聚糖酶的菌株;再通过发酵复筛,采用DNS法测酶活力,从中筛选出一株甘露聚糖酶活力较高的菌株B555.rn 2.经过形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析，鉴定菌株B555为芽孢杆菌属(Bacillus sp. )。rn 3.以菌株B555为出发菌株，通过紫外、紫外-氯化锂、微波-氯化锂诱变得到菌株LW9,其产酶活力提高到209.9 U/mL，为出发菌株B555酶活力的7.04倍;经过6代传代，证明其遗传性质稳定。rn 4.采用单因子实验、Plackett-Burman设计和响应曲面法对菌株LW9产甘露聚糖酶的培养基和培养条件进行了优化。优化后培养基配方为:魔芋粉7.4g/L，蛋白胨11.5g/L，KH2P041 g/L, NaCl 20 g/L, MgCl2·6Hz0 2mmol/L, pH 7.0;优化后培养条件为:摇床转速200 r/min,装液量50 mL/250 mL，培养温度30℃，接种量3%。在上述条件下培养30 h，菌株LW9的酶活力达到了435.7 U/mL，是优化前酶活力的2.07倍，为原始出发菌株B555的15.5倍。rn 5.利用硫酸铵盐析对芽孢杆菌LW9所产甘露聚糖酶进行了初步纯化，纯化倍数为1.59倍，回收率为6.94 %。菌株LW9所产甘露聚糖酶的最适作用pH为7.0;在pH 6.0，相对酶活力为最大酶活力的87.3%;在pH 5.0～9.0，相对酶活力可保持40%以上;在pH 5.0～10.0,30℃保温2h后仍可保持最大酶活力的50%以上。最适作用温度为55℃，在60℃～65℃，相对酶活力可保持80%以上;在55℃，半衰期为150 min。金属离子Ni+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、 Na+、K+、Fe3+、Ba2+对酶活力均有抑制作用。以槐豆胶为底物时，Km值和Vm分别为4.7mg/mL和588.23μmol/(mL·min)，以魔芋粉为底物时，Km值和Vm分别为3.33mg/mL和476.19μmol/(mL·min)。
  • 摘要：肝纤维化是基于各种肝损伤因子长期作用于肝脏,肝脏损伤之后的组织自我修复过程中发生的代偿性反应,是机体从慢性肝炎到肝硬化甚至是肝癌的发生过程中的枢纽环节.随着分子生物学学科对肝纤维化发生机制的深入探索,已经证实了肝纤维化是一个动态可逆的过程,所以阻断、抑制或者逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个十分重要的目标,这积极的推动力抗肝纤维化药物的研究,然而由于肝纤维化发病机制的多因子、多环节的复杂性,单一作用机制或者单一靶向给药系统的西药已然不能满足临床用药的需求;加之患者长期服用西药而产生的耐药性和对机体的毒副反应,使得开发一种具有多环节、多靶向且毒副作用小的新型药物已经迫在眉睫了.中药含有多种成分，具有多靶点、多途径的用药特点，毒副作用小，对病理复杂的疾病可以发挥整体用药的优势，其治疗以人为本，在保肝降酶、抗肝纤维化、调节免疫等方面，可以弥补现代医学的不足，近年来成为国内研究抗肝纤维化药物的焦点，目前己经由较成熟的动物实验研究转向临床用药的研究。rn 在祖国医学中，并没有肝纤维化这个病名，在中医学理论中，其属于“黄疽、胁病、积聚”等范畴，是各种肝病共用的发病机制，多是由于湿热阻滞，情志郁结，饮食不节等损伤肝、肾和脾以致气滞血癖而发生此病。中医治发应当活血化痪、疏肝理气、清热凉血、健脾利湿。中医药治病讲求“统筹兼顾，标本兼治”，其作用的多靶点、多层次的整体给药系统与肝纤维化发生的多因素、多环节的治疗需求有高度的吻合性，中医药抗肝纤维化是我国的独特优势。现在就近年来中药抗肝纤维化的功效和药理作用进行简要的综述。

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