LMNAR527C基因突变纯合型小鼠表型及其组织、细胞衰老相关蛋白表达观察

摘要

cqvip:目的观察LMNAR527C基因突变纯合型小鼠体型、体质量、繁殖能力和生存期等表型,其组织、细胞衰老相关蛋白的表达情况,以探讨LMNAR527C基因突变对衰老的影响。方法LMNA基因杂合型小鼠6只,通过杂交方式得到LMNAR527C基因突变纯合型小鼠,比较野生型(基因型LMNAWT/WT)、杂合型(基因型LMNAWT/R527C)、纯合型(基因型LMNAR527C/R527C)小鼠体型、体质量、繁殖能力和生存期,采用Western blotting法检测不同基因型小鼠尾组织γH2Ax蛋白、免疫组化法检测皮肤组织γH2Ax蛋白。采用TRIzol提取正常和LMNA基因突变小鼠尾组织总RNA,PCR扩增小鼠LMNA和LMNAR527C突变基因,并与pEGFP-N1质粒重组获得pEGFP-N1-LMNA和pEGFP-N1-LMNA R527C重组质粒,然后转染293T LMNA敲除细胞(转染pEGFP-N1空质粒为空白组,转染pEGFP-N1-LMNA质粒为对照组,转染pEGFP-N1-LMNA R527C质粒为实验组),Western blotting法检测各组γH2Ax蛋白。将293T细胞设为正常组,免疫荧光法观察实验组LaminA蛋白的分布和定位。体外培养野生型和纯合型小鼠肺原代成纤维细胞,进行衰老相关β-半乳糖苷酶活性染色实验。结果三种不同基因型小鼠体型、体质量、繁殖能力和生存期比较,P均>0.05。设野生型小鼠γH2Ax蛋白相对表达量为1,纯合突变、杂合突变、野生型小鼠γH2Ax蛋白相对表达量分别为2.40±0.0432、1.72±0.0353,纯合突变、杂合突变型小鼠高于野生型小鼠(P均<0.05)。纯合突变型小鼠、野生型小鼠γH2Ax阳性细胞百分比分别为38%±2.25%、17%±1.68%,二者比较,P<0.05。与空白组比较,对照组和实验组γH2Ax蛋白水平升高(P均<0.05)。实验组细胞Lamin A蛋白容易在核膜处形成点状聚集,部分蛋白从核纤层转移至核内。纯合型、野生型小鼠肺原代成纤维细胞中β-半乳糖苷酶活性染色阳性细胞率分别为11.0%±1.96%、2.5%±0.78%,二者比较,P<0.05。结论LMNAR527C基因纯合突变小鼠未发现明显衰老表型。LMNAR527C基因纯合突变小鼠组织及细胞中衰老标志物γH2Ax表达升高;Lamin A蛋白在转染LMNAR527C突变基因后的293T LMNA敲除细胞的核膜处形成点状聚集,部分蛋白从核纤层转移至核内;LMNAR527C基因纯合突变小鼠肺成纤维细胞中β-半乳糖苷酶活性增强。