RRM2基因过表达卵巢癌细胞株SKOV3的构建及对顺铂敏感性观察

摘要

目的 构建核糖核苷酸还原酶亚基M2(RRM2)基因过表达的卵巢癌细胞株SKOV3,并观察RRM2基因过表达的SKOV3细胞对顺铂的敏感性.方法 提取SKOV3细胞总RNA,反转录得到cDNA,以其为模版进行PCR反应,获得RRM2基因.通过酶切(XhoⅠ、BamHⅠ)连接的方法,将RRM2基因插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1中,得到重组质粒pLVX-IRES-RRM2.利用脂质体将重组质粒转染293FT细胞,包埋病毒.将SKOV3细胞分为实验组和对照组,实验组转染pLVX-IRES-RRM2慢病毒,96 h后测算慢病毒感染效率.对照组不进行转染.采用Western blotting法检测两组细胞中的RRM2蛋白;流式细胞仪检测两组凋亡细胞与死亡细胞,反映细胞对顺铂的敏感性.结果 重组质粒pLVX-IRES-RRM2经限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ双酶切验证,各片段大小符合预期,测序结果显示RRM2基因序列正确.实验组、对照组细胞中RRM2 mRNA相对表达量分别为0.280±0.055、0.102±0.022,RRM2蛋白相对表达量分别为0.582±0.049、0.228±0.032,实验组高于对照组,说明RRM2基因过表达的SKOV3细胞构建成功.实验组、对照组凋亡细胞比例分别为0.39%±0.08%、9.60%±1.20%,死亡细胞比例分别为26.65%±2.20%、44.96%±2.80%,实验组凋亡细胞比例和死亡细胞比例均低于对照组(P均<0.01).结论 成功构建了RRM2基因过表达的SKOV3细胞,RRM2基因过表达的SKOV3细胞对顺铂的敏感性降低.