高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

摘要

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2( glaA::pmeA).基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL.进一步敲除重组菌株TH-2( glaA::pmeA )中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2( glaA::pmeA?pyrG?asaA).该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失.但是与纯合重组菌株TH-2( glaA ::pmeA )相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL.重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 °C,适合的温度范围是40～80 °C,在80 °C下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0～5.0,最适pH为4.0.最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌.