轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中志贺杆菌的分离、鉴定及其对人克隆结肠腺癌细胞中紧密连接蛋白表达的影响

摘要

目的:探讨密封蛋白1(Claudin-1)和闭合蛋白(Occludin)在志贺杆菌感染的人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)中的表达情况,阐明志贺杆菌对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞的影响及其相关机制.方法:将10窝SPF级昆明系5日龄乳鼠分为对照组乳鼠5窝和实验组乳鼠5窝,对照组乳鼠每天每只灌胃PBS缓冲液100μL,实验组乳鼠每天每只灌胃病毒滴度为1×106 PFU·mL-1 SA11株轮状病毒100μL,采集乳鼠粪便标本通过生化实验、血清学检测及16S rRNA测序,进行志贺杆菌的分离和鉴定.将Caco-2细胞分为对照组和志贺杆菌感染组,采用不同浓度梯度的志贺杆菌感染Caco-2细胞不同时间后,台盼蓝染色检测各组细胞存活率,Real-time PCR和Western blotting法检测各组细胞中Claudin-1和Occludin mRNA及蛋白表达水平.结果:细菌生化鉴定可观察到双糖铁培养基斜面不变色,底部为黄色,且穿刺线明显,疑似致病性肠道菌.该菌对乳糖呈阴性,对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇呈阳性.16S rRNA测序,与志贺杆菌序列同源性为99％,确定为志贺杆菌.与对照组比较,志贺杆菌感染组志贺杆菌感染4 h内细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05):与1×106 CFU·mL-1志贺杆菌共培养3 h时,Caco-2细胞中Claudin-1和Occludin mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05).结论:通过轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中分离的志贺杆菌可降低人克隆Caco-2中Occludin和Claudin-l的表达水平,提高肠上皮细胞的通透性,从而影响肠上皮细胞的正常屏障功能.