兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

摘要

【目的】旨在克隆兔豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor)Stefin基因(CpStefin),原核表达并纯化兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,制备多克隆抗体并测定其效价。【方法】根据GenBank登录的猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列设计引物,以提取的兔豆状囊尾蚴总RNA为模板,运用RT-PCR方法克隆兔豆状囊尾蚴Stefin基因,构建克隆载体pMD-19TCpStefin,分析Cpstefin蛋白氨基酸序列的二级结构、理化性质、结构域,并分析其与其它绦虫Stefin基因的亲缘关系,构建系统进化树。以克隆载体pMD-19T-CpStefin为模板扩增兔豆状囊尾蚴Stefin基因,回收纯化的扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-CpStefin,双酶切、测序结果与预期结果一致。重组质粒pGEX-4T-CpStefin转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达获得重组蛋白。应用亲和层析法纯化可溶性CpStefin重组蛋白,进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,运用ELISA方法测定其效价。【结果】首次克隆兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,基因大小约为290 bp,成功构建克隆载体pMD-19T-CpStefin;菌液PCR和双酶切鉴定结果表明重组质粒pGEX-4T-CpStefin构建正确,通过IPTG诱导表达获得分子质量大小约为35 kU的可溶性融合蛋白,亲和层析法纯化获得纯度较高的CpStefin重组蛋白,制备出的多克隆抗体效价达到1∶25600。【结论】本研究首次克隆出豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,运用原核表达系统可溶性表达豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,纯化获得纯度较高的豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin重组蛋白,制备的多克隆抗体效价达到1∶25600。