组织蛋白酶B过表达质粒和特异性siRNA表达质粒的构建与转染及对血管平滑肌细胞作用初步探讨

摘要

构建并转染pcDNA3.1-cathepsin B和pSilencer2.1-cathepsin B质粒,建立组织蛋白酶B过表达细胞株与基因沉默细胞株,初步探讨组织蛋白酶B对血管平滑肌细胞凋亡的作用.通过RT-PCR法扩增获得组织蛋白酶B全基因序列并构建pcDNA3.1-cathepsin B表达质粒,同时设计针对组织蛋白酶B靶序列的siRNA,按shRNA表达质粒的克隆策略,设计针对该序列的双链DNA序列并构建pSilencer2.1-cathepsin B质粒,通过脂质体转染人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC),经过筛选鉴定建立组织蛋白酶B过表达株与基因沉默株.通过TNF-α/act D(放线菌素D)诱导细胞凋亡,从细胞活性分析、流式细胞术观察组织蛋白酶B对血管平滑肌细胞的作用,并加入组织蛋白酶抑制剂(E64d)和组织蛋白酶B特异性抑制剂(CA-074ME),观察细胞活性改变.实验结果表明转染pcDNA3.1-cathepsin B细胞组织蛋白酶B蛋白水平明显高于对照组,而转染pSilencer 2.1-cathepsin B细胞组织蛋白酶B蛋白水平明显低于对照组.噻唑蓝分析经TNF-α/actD诱导后细胞活性明显降低,与对照组(14.60%±1.34%)比较,沉默组(21.30%±2.37%)活性增加,而过表达组(9.98%±1.04%)较对照组明显下降,加入E64d、CA-074ME组(18.23%±1.05%,17.40%±1.13%)较过表达组活性增加,流式细胞术定量检测得到相似结果.表明组织蛋白酶B对TNF-α/act D诱导的血管平滑肌细胞凋亡具有促进作用.