2'-氟取代对T7 DNA连接酶连接效率的阻滞

摘要

为更好地理解连接酶的接合机制,研究了2'-氟取代核苷酸(2'-fluorinated nucleotide,FN)对T7 DNA连接酶接合特性的影响。利用分子信标的荧光信号变化来检测连接酶接合活性。结果显示,在连接酶作用的分子信标缺口处的5'端和3'端分别进行F取代时,对T7 DNA连接酶的接合效果分别阻滞(48. 7±6. 7)%和(70. 6±4. 0)%。在取代同时发生在5'端和3'端时,接合效果被阻滞(76. 6±1. 3)%。动力学参数的回归显示,FN取代会导致连接反应最大速率(V_(max))降低,同时导致米氏常数K_m增大,说明酶和底物之间的亲和力在取代后减小。缺口两端的碱基错配也对酶接合反应效果产生一定的阻滞效应。本研究的结果和结论使对氟取代后,T7 DNA连接酶的接合特性有了更进一步的认识,为更好地应用T7 DNA连接酶接合活性提供有力的实用依据。